KR20070100413A

KR20070100413A - 면역 부활용 조성물

Info

Publication number: KR20070100413A
Application number: KR1020077020013A
Authority: KR
Inventors: 이따루 모로; 타까시 이와세; 쿠니야수 오치아이; 마사꼬 야지마; 마사끼 테라하라; 요시타까 나까무라; 마모루 토츠까; 키요시 야마다
Original assignee: 메이지 데어리즈 코포레이션
Priority date: 2005-02-02
Filing date: 2006-02-01
Publication date: 2007-10-10
Also published as: AU2006215205A1; AU2006215205B2; EP1854467B1; JPWO2006087913A1; EP1854467A1; EP1854467A4; HK1116667A1; JP5001830B2; US20090142374A1; US7943124B2; KR101234435B1; EP1854467B8; CN101151041A; CA2596680A1; WO2006087913A1; CN101151041B; CA2596680C

Abstract

본 발명은 분비 성분 생산 유도능과 높은 IgA 생산 유도능을 구비한 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 비피더스균, 예를 들면 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주 또는 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주의 균주, 또는 그의 처리물을 단독으로 또는 다수개 조합하여 함유하는 점막 조직에서 IgA 및 분비 성분의 생산을 촉진하는 데에 유용한 면역 부활용 조성물에 관한 것이다.

면역 부활용 조성물, 비피도박테리엄 비피덤

Description

면역 부활용 조성물{COMPOSITION FOR IMMUNE ACTIVATION}

본 발명은 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum)에 속하는 비피더스균 및/또는 상기 비피더스균의 처리물을 함유하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역 부활용 조성물, 및 그것을 포함하는 면역 부활에 유용한 음식품 및 의약 조성물에 관한 것이다.

기관지, 소화관, 비뇨 생식기계 등의 점막면에는 세균, 바이러스 등의 미생물이나 음식물 단백질을 비롯한 많은 외래 항원에 대하여, 생체를 방어하기 위한 분비형 IgA를 주체로 하는 강력한 점막 면역 기구가 존재한다. 분비형 IgA는 혈청 중 IgA와는 달리 J쇄를 포함한 이량체 IgA(dimeric IgA: 2IgA·J)와 분비 성분(SC: secretory component, 또는 secretory piece)이 결합한 형태(2IgA·J·SC)로 존재하고 있어, 타액, 눈물, 콧물, 유즙, 또한 기관지나 장관 등으로부터의 분비액 중에 많이 포함되어 있다. 이러한 점막면에서의 림프 조직을 점막 관련 림프 조직이라 부르고, IgA 생산 유도에서 중심적인 역할을 하고 있다. 점막 면역에서는, 장관의 대표적인 점막 관련 림프 조직인 파이어판(Peyer's patch) 등으로 항원 자극을 받은 활성화 B 세포가 전신의 혈액 순환을 경유하여 재차 장관뿐만 아니라 외분비선이나 기관지·비뇨 생식기계의 점막면에 분포하고, IgA 생산 세포인 형질 세포 로 분화하여 이량체 IgA를 생산한다. 또한 이와 같이 하여 생산된 이량체 IgA는 점막 상피 세포에서 생산되는 분비 성분과 결합하여 분비형 IgA가 되고, 점막 내로부터 관강(管腔)이나 생체밖으로 분비된다. 분비 성분은 이량체 IgA를 관강이나 생체밖으로 분비하기 위해서 필수적인 성분인 것이 알려져 있다.

따라서, 기관지, 소화관, 비뇨 생식기계 등의 점막에서 이량체 IgA의 생산과 분비 성분의 생산을 유도하여 성립시키는 식품 성분 또는 조성물은 분비형 IgA의 생산량 또는 점막으로부터 관강이나 생체밖으로의 분비형 IgA의 분비량을 증가시키고 생체 방어능을 증강하는 것을 기대할 수 있다. 또한, 점막 면역에 의한 이러한 생체 방어능의 증강은 특히 병원체의 체내로의 침입 방지나 음식물 알레르기의 발증 예방 등에서 유용하다.

분비형 IgA의 생산을 항진하는 물질로서, 예를 들면 본 발명자들은 프락토 올리고당 및 그의 조성물(일본 특허 공개 제2003-201239호 공보)을 발견하였다. 이 프락토 올리고당은 분비 성분의 생산에 미치는 영향에 대해서 보고되어 있는 수가 적은 식품 성분 중 하나이다. 한편, 비피더스균 비피도박테리엄 롱검(Bifidobacterium longum)이나 비피도박테리엄 브레베(Bifidobacterium breve)는 파이어판 세포에서 IgA 생산을 유도하는 것이 종래부터 알려져 있다(일본 특허 공고 (평)7-106142호 공보). 또한 본 발명자들은 성인의 용변으로부터 분리한 비피도박테리엄 롱검 OLB 6001주가 IgA 생산 유도능을 갖는다는 것도 과거에 발견하였다(Takahashi T., Nakagawa E., Nara T., Yajima T. and Kuwata T. Biosci Biotechnol Biochem 62(1), (1998) p.10-15). 이 비피더스균 비피도박테리엄 롱검 OLB 6001주는 본 발명자들의 그룹에 의해 비피도박테리엄 롱검 No. 7(수탁 번호 FERM P-13610)로서 보고되어 있는 것과 동일하다(일본 특허 공개 (평)7-69907호 공보). 그러나 이들의 비피더스균도 상회하는, 보다 높은 면역 부활 효과를 갖는 면역 부활용 조성물의 추가적인 등장이 더욱더 요망되고 있다.

본 발명은 면역 부활용 조성물, 및 면역 부활에 유용한 음식품 및 의약 조성물을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 연구를 거듭한 결과, 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 비피더스균주 중으로부터, 분비 성분의 생산과 장관 점막계에서의 이량체 IgA 생산을 모두 촉진할 수 있는, 면역 부활에서 유용한 균주를 다수개 취득하는 것에 성공하여 본 발명을 완성시켰다. 즉 본 발명은 이하를 포함한다.

[1] 장관 상피 세포에서의 분비 성분 생산량을 적어도 1.2배로 증가시키는 분비 성분 생산 유도능을 갖는 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 비피더스균 및/또는 상기 비피더스균의 처리물을 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 부활용 조성물.

[2] 상기 [1]에 있어서, 상기 비피더스균이 항 CD3 항체 존재하에서의 파이어판(Peyer's patch) 세포 5×10⁵개당 IgA 생산량을 적어도 10 ㎍/㎖로 증가시키는 IgA 생산 유도능을 더 갖는 것을 특징으로 하는 면역 부활용 조성물.

[3] 상기 [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 비피더스균이 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주(수탁 번호 NITE BP-30) 또는 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주(수탁 번호 NITE BP-31)인 면역 부활용 조성물.

[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 상기 비피더스균의 처리물이 비피더스균의 현탁물, 배양물, 배양 상청액, 발효물, 가열 처리물, 파쇄물, 농축물, 페이스트화물, 건조물 및 희석물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상인 면역 부활용 조성물.

[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 면역 부활용 조성물을 포함하는 음식품.

[6] 상기 [5]에 있어서, 영아용 식품, 유아용 식품, 수유부용 식품, 고령자용 식품, 환자용 식품, 건강 보조 식품, 보충제, 발효유 및 유산균 음료로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음식품.

[7] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 면역 부활용 조성물을 포함하는 의약 조성물.

[8] 면역 부활용의 음식품 또는 의약 조성물을 제조하기 위한 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주(수탁 번호 NITE BP-30) 또는 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주(수탁 번호 NITE BP-31)의 사용.

[9] (a) 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주(수탁 번호 NITE BP-30) 또는

(b) 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주(수탁 번호 NITE BP-31)

의 비피더스균.

<발명의 효과>

본 발명의 면역 부활용 조성물은 상피 세포에서의 분비 성분의 생산을 촉진할 수 있고, 종래 면역 부활 작용이 보고되어 있는 비피더스균(비피도박테리엄 롱검이나 비피도박테리엄 브레베 등)에 비해 파이어판 세포에서의 IgA 생산을 상당히 강력하게 유도할 수 있다. 이 때문에 본 발명의 면역 부활용 조성물은 특히 점막 면역의 부활에서 매우 유용하다. 또한 본 발명의 음식품 및 의약 조성물은 식품으로서 인류가 오랜 세월 섭취하여 온 비피더스균에서 유래하는 면역 부활용 조성물을 유효 성분으로서 포함하기 때문에 부작용이 생길 우려가 적다. 본 발명의 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주(수탁 번호 NITE BP-30) 및 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주(수탁 번호 NITE BP-31)를 이용하면 분비 성분의 생산을 촉진할 수 있고, 종래의 비피더스균에 비해 몇배 더 강력히 IgA 생산을 유도할 수 있는 면역 부활용 조성물을 제조할 수 있다.

본 명세서는 본원의 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허 출원 2005-026631호 및 일본 특허 출원 2005-256835호에 기재된 내용을 포함한다.

[도 1] 마우스 파이어판 유래의 림프 세포군을 항 CD3 항체 존재하에서 각종 비피더스균과 함께 배양한 경우의 IgA 생산 유도능을 나타낸다. n=3, 값은 평균값±표준 편차로 나타내었다.

[도 2] 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주의 파쇄물이 HT-29로부터의 분비 성분 생산에 제공하는 효과를 나타낸다. 시료는 50 내지 500 ㎍/㎖가 되도록 배지에 첨가하여 48 시간 동안 배양하였다. *p<0.05 대 대조군, 스튜던트 t-검정. n=3. 값은 대조를 1로 했을 때의 상대값으로 하고, 평균값±표준 편차로 나타내었다.

[도 3] 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주의 파쇄물이 HT-29 세포로부터의 분비 성분 생산에 제공하는 효과를 나타낸다. 시료는 500 ㎍/㎖가 되도록 배지에 첨가하고 48 시간 동안 배양하였다. *p<0.05 대 대조군, 스튜던트 t-검정. n=3. 값은 대조를 1로 했을 때의 상대값으로 하고, 평균값±표준 편차로 나타내었다.

[도 4] 비피도박테리엄 비피덤 MEP 170212 및 비피도박테리엄 비피덤 MEP 170222의 파쇄물이 HT-29 세포로부터의 분비 성분 생산에 제공하는 효과를 나타낸다. 시료는 250 ㎍/㎖ 또는 500 ㎍/㎖가 되도록 배지에 첨가하여 48 시간 동안 배양하였다. 스튜던트 t-검정에 의해 어느 군 사이에서도 5 ％ 수준에서 유의차는 없다. n=3. 값은 대조를 1로 했을 때의 상대값으로 하고, 평균값±표준 편차로 나타내었다.

[도 5] 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주의 균체 파쇄물이 소장 및 대장에서의 분비 성분 유전자의 발현량에 미치는 효과를 나타낸다. 바는 평균값±SD(표준 편차)로 나타내는 상대값을 나타낸다.

[도 6] 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주가 HT-29 세포로부터의 분비 성분 생산에 제공하는 효과를 분비 성분 농도(ng/㎖)로 나타낸다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 사용하는 비피더스균 및 그의 스크리닝

본 발명에서는 분비 성분 생산 유도능과 높은 IgA 생산 유도능을 구비한 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 비피더스균을 이용하여 면역 부활용 조성물을 제조한다.

본 발명에서 사용하는 비피더스균이 속하는 "비피도박테리엄 비피덤"은 비피도박테리아속의 1균종이다. 본 발명에서 비피도박테리엄 비피덤으로 분류되는 비피더스균은 통상의 분류학상의 기준에 따라서 동정할 수 있지만, 최근 빈번히 이용되는 분자 생물학적인 수법, 예를 들면 비피도박테리엄 비피덤에 특이적인 DNA 프로브를 이용하는 방법(장내 플로라 심포지움 8 "장내 플로라의 분자 생태학적 검출 동정")이나, 표준 균주와의 DNA 상동성에 의해 동정할 수도 있다.

본 발명에서 "분비 성분 생산 유도능이란, 점막 상피 세포(예를 들면, 한정되는 것은 아니지만, 장관 상피 세포)로부터의 분비 성분의 분비를 촉진하는 능력을 말한다. 이 분비 성분 생산 유도능은, 예를 들면 비피더스균 또는 비피더스균 처리물과 접촉시킨 점막 상피 세포로부터 분비되는 분비 성분량을 비피더스균 등을 사용하지 않는 대조 실험군과 비교한 경우의 분비 성분 농도의 증가율 또는 분비 성분량의 상대값에 의해서 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로는 본 발명의 비피더스균이 갖는 "분비 성분 생산 유도능"은 장관 상피 세포에서의 분비 성분 생산량을 적어도 1.2배, 바람직하게 1.4배 이상, 일반적으로는 1.2 내지 10배, 통상은 1.2 내지 3배로 증가시키는 능력에 상당한다.

본 발명에서 이용하는 비피더스균은 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 비피더스균 중에서, 장관 상피 세포에서의 분비 성분 생산량을 적어도 1.2배로 증가시킬 수 있는 균을 선택한 것이 바람직하다. 분비 성분 생산량은, 예를 들면 후술하는 실시예에 기재와 같이 하여 시험관 내에서 측정할 수 있다.

이러한 비피더스균의 선택은, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 본원 명세서의 실시예에 기재한 분석법에 기초하여 행할 수 있다. 간단히 서술하면, 우선 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 비피더스균을 글루코스를 락토오스로 변경하여 제조한 혐기 EG 배지에서 배양하여, 얻어진 배양물 중 균체를 세정하고, 이어서 가열 처리와 초음파 파쇄를 행하여 균체 파쇄물을 얻는다. 이 균체 파쇄물을 인간 장관 상피 세포 유래 세포계(예를 들면, HT-29 세포)를 파종한 배지에 첨가하고, 바람직하게는 37 ℃에서 48 시간에 걸쳐 배양한 후, 배양 상청액 중 분비 성분 농도를 측정한다. 또는 균체 파쇄물 대신에 배양 균체의 PBS(-) 중 현탁액을 상기 배지에 직접 첨가할 수도 있다. 또한, 균체 파쇄물 대신에 PBS(-)[즉, Ca 및 Mg 이온을 제거한 둘베코 인산 완충 염수(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)]를 이용하는 것 이외에는 동일한 실험 조작에 의해서 대조 실험을 행하고, 배양 상청액 중 분비 성분 농도를 측정한다. 분비 성분 농도는 ELISA법으로 측정할 수 있다. 이어서, 실험군에서 얻어진 분비 성분 농도의 측정값을, 대조 실험군에서의 분비 성분 농도의 측정값을 1로 했을 때의 상대값으로 환산한다. 이와 같이 해서 얻어진 상대값을 장관 상피 세포에서의 분비 성분 생산량을 증가시키는 수준으로 간주할 수 있다. 즉, 이 상대값이 1.2 이상을 나타내는 비피더스균을 선택하면 된다. 예를 들면, 특정 비피더스균주를 이용하여 상기 분석을 행하여 얻어진 상대값이 1.5인 경우에는, 그 비피더스균주는 장관 상피 세포로부터의 분비 성분 생산량을 1.5 배로 증가시키는 능력을 갖는 것이라고 간주할 수 있고, 본 발명의 비피더스균으로서 선택될 수 있다. 또한, 이 분석법의 배양계에는 형질 세포(IgA 생산 세포)가 포함되지 않기 때문에, 이 분석계에서는 분비 성분은 IgA와 결합하지 않고 단독으로 배양 상청액 중에 분비되어 있다.

본 발명에서 이용하는 비피더스균의 분비 성분 생산 유도능은 장에서의 분비 성분 유전자의 발현량을 증가시키는 효과에 의해서도 뒷받침된다. 본 발명에서 이용하는 비피더스균은 바람직하게는 분비 성분 유전자의 발현량을 적어도 2.0배로 증가시킬 수 있다. 본 발명의 비피더스균에 의한 분비 성분 유전자의 발현량 증가는 구체적으로는 소장 또는 대장에서의 분비 성분 유전자인 pIgR 유전자(중합체성 면역글로불린 수용체 유전자; GeneID: 18703; [Shimada S. et al., J Immunol. 1999; 163(10): 5367-73[)로부터 발현된 mRNA(예를 들면 접수 번호 BC013556[국제 염기 서열 데이터 베이스])의 퍼센테이지(전체 mRNA량에 대한)의 증가로서 확인할 수 있다. pIgR 유전자 유래의 mRNA량은, 예를 들면 소장(예를 들면 회장, 공장 등) 또는 대장(예를 들면 근위대장 등)의 조직으로부터 추출한 전체 RNA를 주형으로서 올리고 dT 프라이머를 이용하는 역전사 PCR에 의해 cDNA를 제조하고, 얻어진 cDNA를 주형으로서 pIgR 유전자 특이적인 프라이머쌍을 이용하여 실시간 PCR(real time PCR)을 행함으로써, 검출된 증폭산물의 양으로부터 결정할 수 있다. pIgR 유전자의 발현량 측정에 제공되는 장 조직은 측정 조건을 균일화하기 위해서 기관 배양한 것일 수도 있다. 실시간 PCR의 내부 표준으로서 GAPDH 유전자, β액틴 유전자 등을 이용하는 것도 바람직하다. 이들의 유전자는 시판되고 있는 혼성화 프로 브(Applied Biosystems사, Stratagene사 등)로서 입수할 수도 있고, 이들은 내부 표준으로서 바람직하게 사용할 수 있다.

또한, 상기한 바와 같은 점막 상피 세포로부터의 분비 성분 생산량의 증강 수준을 판정함으로써, 높은 면역 부활 효과를 포함하는 유리한 기능성을 갖는 비피더스균을 스크리닝하는 비피더스균의 선발 방법도 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명에서 이용하는 비피더스균은 또한 상기한 바와 같은 분비 성분 유전자의 발현량 증가와 함께, 장에서의 인터페론 조절 인자 1 유전자(IRF-1 유전자)의 발현량도 증가시킬 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용하는 비피더스균은 바람직하게는 장 조직에서의 IRF-1 유전자의 발현량을 적어도 1.5배로 증가시킬 수 있다. 본 발명의 비피더스균에 의한 IRF-1 유전자의 발현량 증가는 구체적으로는 소장 또는 대장에서의 IRF-1 유전자(인터페론 조절 인자(interferon regulatory factor) 1; GeneID: 16362)로부터 발현된 mRNA(예를 들면 접수 번호 NM008390[국제 염기 서열 데이터 베이스])의 퍼센테이지(전체 mRNA량에 대한)의 증가로서 확인할 수 있다. IRF-1 유전자 유래의 mRNA량은, 예를 들면 소장(예를 들면 회장, 공장 등) 또는 대장(예를 들면 근위대장 등)의 조직으로부터 추출한 전체 RNA를 주형으로서 올리고 dT 프라이머를 사용하는 역전사 PCR에 의해 cDNA를 제조하고, 얻어진 cDNA를 주형으로서 IRF-1 유전자 특이적인 프라이머쌍을 이용하여 실시간 PCR을 행함으로써, 검출된 증폭산물의 양으로부터 결정할 수 있다. 또한, IRF-1 유전자 유래의 mRNA량의 변화를 전체 RNA를 주형으로서 제조한 cRNA를 이용한 DNA 마이크로 어레이에 의해서 해석하는 것도 가능하다. IRF-1 유전자의 발현량 측정에 제공되 는 장 조직은 측정 조건을 균일화하기 위해서 기관 배양한 것일 수도 있다. 본 발명에 관한 비피더스균 또는 그 처리물을 투여한 장 조직에서는 이러한 IRF-1 유전자의 발현량 증가가 세포 내 신호 전달 경로를 통해 분비 성분의 생산량을 증가시키는 것이라고 생각된다. 그러나 본 발명은 이러한 이론에 의해서 구속되는 것은 아니다.

한편, 본 발명에서 "IgA 생산 유도능"이란, 점막 관련 림프 조직(한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 장관 점막)에 존재하는 형질 세포로부터의 IgA의 분비를 촉진하는 능력을 말한다. 이 IgA 생산 유도능은, 예를 들면 비피더스균 또는 비피더스균 처리물과 접촉시킨 점막 관련 림프 조직에서 분비되는 IgA량을 비피더스균 등을 사용하지 않는 대조 실험군과 비교한 경우의 IgA 농도의 증가율에 의해서 나타낼 수 있다. 또한 이 IgA 생산 유도능은 어떤 특정한 분석계에서 점막 관련 림프 조직에서 유래하는 IgA 생산 세포로부터 생산되는 IgA 농도로 나타낼 수도 있다. 본 발명의 비피더스균은 IgA 생산 유도능이 종래 보고되어 있는 비피더스균과 비교하여 높은 IgA 생산 유도능을 갖는다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 비피더스균이 갖는 "높은 IgA 생산 유도능"이란, 시험관 내 실험계에서 항 CD3 항체 존재하에서의 파이어판 세포 5×10⁵개당 IgA 생산량을 적어도 10 ㎍/㎖, 일반적으로는 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 통상은 10 ㎍/㎖ 내지 30 ㎍/㎖의 수준까지 증가시키는 능력에 상당한다.

본 발명에서 이용하는 비피더스균은 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 비피더 스균 중에서, 예를 들면 하기 분석계에서 항 CD3 항체 존재하에서의 파이어판 세포 5×10⁵개당 IgA 생산량이 적어도 10 ㎍/㎖가 되는 균을 선택한 것이 바람직하다.

비피더스균의 선택을 위한 IgA 생산량에 기초하는 분석은, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 본원 명세서의 실시예의 기재에 기초하여, 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 간단히 서술하면 우선 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 비피더스균을, 글루코스를 락토오스로 변경하여 제조한 혐기 EG 배지에서 배양하고, 얻어진 배양물 중 균체를 세정한 후, 예를 들면 4 ％-포르말린-PBS 등에 의해 균체를 고정시킨다. 이 고정 균체를 포르말린 제거 등을 필요에 따라서 행한 후, 660 nm에서의 탁도가 1.6이 되도록 균액 농도를 조정한다. 한편, 마우스로부터 채취한 파이어판을 배지(예를 들면, 2 ％ 소태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지) 중에서 풀고, 150 게이지의 멸균 스테인레스강 체를 통과시키고, 세정한 후에 배지에 재현탁하여 T 세포 및 B 세포를 포함하는 림프 세포군을 제조한다. 본 분석에서는 이 림프 세포군을 파이어판 세포로서 이용한다. 그래서 이어서 이 림프 세포군을 미리 항 CD3 항체로 코팅 완료한 플레이트에 1웰당 5×10⁵개로 파종하고, 거기에 상기 균액(탁도=1.6) 5 ㎕를 첨가하고, 탄산 가스 배양기 내에서 37 ℃에서 5일간 배양한다. 배양물로부터 림프 세포를 제거하여 배양 상청액을 채취하고, 배양 상청액 중 TgA량을 측정한다. 이 배양 상청액 중 IgA량을 항 CD3 항체 존재하에서의 파이어판 세포 5×10⁵개당 IgA 생산량이라고 간주할 수 있다. 즉 이 배양 상청액 중 IgA량이 10 ㎍/㎖ 이상인 것이 나타난 비피더스균을 선택하면 된다. 또한, 비피더스균액을 첨가하지 않는 것 이외에는 상기와 마찬가지의 대조 실험을 행하여 배양 상청액 중 IgA량을 측정하고, 이 대조 실험군의 IgA량을 1로 하여, 실험군의 배양 상청액 중 IgA량을 상대값으로 환산할 수도 있다. 또한 본 분석법에서 측정되는 IgA는 대부분이 파이어판 세포에서 항 CD3 항체 존재하에서 분화한 형질 세포(IgA 생산 세포)로부터 세포밖으로 분비된 이량체 IgA인 것으로 생각된다.

본 발명에서 이용하는 비피더스균의 IgA 생산 유도능은 또한 종래부터 높은 IgA 생산 유도능이 보고되어 있는 비피더스균주의 비피도박테리엄 롱검 OLB 6001주(수탁 번호 FERM P-13610) 또는 비피도박테리엄 브레베주(수탁 번호 FERM BP-2824)의 IgA 생산 유도능을 기준으로서 규정할 수도 있다. 이들은 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본 이바라기껭 즈꾸바시 히가시 1 쪼메 1반지 1 쥬오 다이6)에 기탁되어 있는 균주이다. 예를 들면, 상기한 IgA 생산량에 기초하는 분석법에서 실험군의 비피더스균 대신에 비피도박테리엄 롱검 OLB 6001주 또는 비피도박테리엄 브레베주(수탁 번호 FERM BP-2824)를 이용하는 것 이외에는 동일한 조작에 의해 대조 실험을 행하고, 이 대조 실험군에서의 배양 상청액 중 IgA량을 1로 하여 실험군의 배양 상청액 중 IgA량을 상대값으로 환산함으로써, 그 상대값으로 표시하여, 해당 비피더스균이 항 CD3 항체 존재하에서 파이어판 세포에서의 IgA 생산을 촉진하는 능력으로서, 본 발명의 비피더스균의 IgA 생산 유도능을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 분석의 결과, 비피도박테리엄 롱검 OLB 6001주에서의 배양 상청액 중 IgA량을 1로 한 경우에 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 특정 비피더스균주의 IgA량의 상대값이 3이면, 그 비피더스균주는 비피도박테리엄 롱 검 OLB 6001주와 비교하여 항 CD3 항체 존재하에서 파이어판 세포에서의 IgA 생산량을 3배로 증가시킬 수 있는 IgA 생산 유도능을 갖는다. 본 발명에서 이용하는 비피더스균의 IgA 생산 유도능은, 예를 들면 비피도박테리엄 롱검 OLB 6001주와 비교하여 항 CD3 항체 존재하에서의 파이어판 세포에서의 IgA 생산량을 2 내지 10배, 바람직하게는 2.4 내지 5배로 증가시킬 수 있는 IgA 생산 유도능을 갖는다.

본 발명에서는 사용하는 비피더스균의 분비 성분 생산 유도능 및 IgA 생산 유도능에 대해서 상기한 바와 같은 분석법을 이용하여 확인할 수도 있다.

본 발명에서 특히 바람직하게 사용할 수 있는 비피더스균주는 본 발명자들이 영아의 용변으로부터 독자적으로 분리한 비피더스균 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주 및 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주이다. 이들 균주에 대해서는, 균종 특이적 DNA-프로브를 이용하여 검토함으로써, 모두 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 균주인 것이 동정되어 있다. 이들 균주는 2004년 10월 26일자(원기탁일)로 독립행정법인제품 평가기술기반기구 특허미생물기탁센터(일본 지바껭 기사라즈시 가즈사 가마따리 2-5-8)에, 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주에 대해서는 수탁 번호 NITE P-30으로서, 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주에 대해서는 수탁 번호 NITE P-31로서 기탁되었다. 이들 균주는 2006년 1월 18일자로 원기탁으로부터 부다페스트 조약에 기초하는 기탁에 이관되어, 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주에 대해서는 수탁 번호가 NITE BP-30으로, 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주에 대해서는 수탁 번호가 NITE BP-31로 변경되었다. 이들 균주는 또한 실시예에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 상기한 분석에 의해서 분비 성분 생산 유도능을 갖고, 종래의 비 피더스균과 비교하여 2 내지 5배 높은 IgA 생산 유도능을 갖는 것이 확인되어 있다. 또한 이들 균주로부터 얻어지는 변이주 등도, 분비 성분 생산 유도능과 높은 IgA 생산 유도능을 갖는 한, 본 발명에서 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명의 비피더스균을 배양하기 위해서는, 비피더스균의 배양에 통상 이용되는 배지를 사용할 수 있다. 즉 주탄소원 이외에 질소원, 무기물 그 밖의 영양소를 알맞게 함유하는 배지이면 어느 배지도 사용 가능하지만, 시스테인이나 시스틴 또는 메틸오닌 등의 황 함유 아미노산을 첨가시키면, 양호한 생육이 얻어진다. 탄소원으로는 락토오스, 글루코스, 수크로오스, 프락토오스, 갈락토오스, 폐당밀 등을 사용균의 자화성에 따라서 사용할 수 있다. 질소원으로는 카제인의 가수분해물, 웨이 단백질(whey protein) 가수분해물, 대두 단백질 가수분해물 등의 유기 질소 함유물을 사용할 수 있다. 그 밖에 증식 촉진제로서 육류 추출물, 어류 추출물, 효모 추출물 등이 사용된다.

본 발명의 비피더스균의 배양은 혐기 조건하에서 행하면 된다. 혐기 배양에는 탄소 가스를 미리 통기한 배지 중에서 배양하는 방법이나, 아네로팩이나 가스팩 등, 탈산소제를 밀봉한 혐기 병 등의 공지된 수법을 적용할 수 있다. 배양 온도는 일반적으로 35 내지 40 ℃가 바람직하지만, 균이 생육하는 온도이면 다른 온도 조건일 수도 있다. 배양 개시시 배지의 pH는 5.0 내지 8.0으로 유지하는 것이 바람직하다. 면역 부활용 조성물의 제조에 사용하는 배양물을 얻기 위한 배양 시간은 통상 10 내지 20 시간이 적당하다.

2. 면역 부활용 조성물

본 발명에서는 상기한 바와 같은 본 발명의 비피더스균을 함유하는 조성물을 면역 부활용 조성물로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 비피더스균에 추가하거나, 그 대신에 본 발명의 비피더스균의 처리물을 함유하는 조성물을 면역 부활용 조성물로서 이용할 수도 있다. 본 발명의 면역 부활용 조성물은 장관 상피 세포 등의 점막 상피 세포로부터의 분비 성분의 생산을 유도(촉진)하고, 파이어판 세포를 비롯한 점막 관련 림프 조직에서의 IgA 생산을 높은 수준으로 유도(촉진)한다.

본 발명의 면역 부활용 조성물은 적량을 첨가함으로써, 예를 들면 병원체의 감염 억제 등의 면역 부활 작용을 음식품이나 의약 조성물에 부여할 수 있다. 이 면역 부활용 조성물은, 한정되는 것은 아니지만, 액체상, 겔상, 분말상, 과립상, 고형상, 캡슐상, 또는 타블렛상 등의 임의의 형태일 수도 있다.

본 발명의 면역 부활용 조성물에 이용하는 본 발명의 비피더스균은 생균체이거나 사균체일 수도 있고, 습윤균이거나 건조균일 수도 있다. 또한 본 명세서에서용어 "비피더스균"은 비피더스균의 균주와 균체를 모두 의미한다.

본 발명에서 비피더스균의 "처리물"로는, 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 비피더스균의 현탁물(현탁액), 배양물(균체, 배양 상청액 및 배지 성분을 포함함), 배양 상청액(배양물로부터 고형분을 제거한 것), 발효물(생유, 탈지 분유 또는 두유 등을 비피더스균 발효시킨 것; 요구르트 등), 가열 처리물, 멸균 처리물(예를 들면, 방사선 살균한 것), 파쇄물(예를 들면, 초음파 파쇄물), 농축물, 페이스트화물, 건조물(예를 들면, 분무 건조물, 동결 건조물, 진공 건조물, 드럼 건조물 등)액상물, 및 희석물을 들 수 있다.

본 발명에서 비피더스균의 "처리물"은 또한 배양물 또는 발효물을 농축하여 농축물로 한 것이나, 그 농축물을 더욱 건조하여 균체 농도를 건조물 1 g 당 10¹⁰개 이상으로 한 것일 수도 있다. 이 농축물의 건조는 통상의 수법, 예를 들면 진공 건조, 분무 건조, 또는 동결 건조 등에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 비피더스균의 처리물에 포함되는 최고 균체수는 특별히 한정되지 않지만, 통상 농축물로 약 4×10¹⁰개/g, 건조물로 약 5×10¹¹개/g 정도이다.

본 발명의 비피더스균은 사균체도 파이어판 세포로부터의 IgA 생산을 현저히 유도할 수 있기 때문에(실시예 참조), 비피도박테리엄 비피덤의 비피더스균의 세포벽에 IgA의 생산 유도를 활성화하는 성분이 포함되는 것으로 생각되었다. 단 본 발명은 이러한 이론에 의해서 구속되는 것은 아니다.

그런데 소화관 내에 분비된 분비 성분은 단독으로 감염성 대장균이나 독소원성 클로스트리듐 균체에 결합하여 이들 병원균의 감염을 억제한다고 생각되고 있다(J. Med. Biol. 1995, 42:3-9; J. Med. Microbiol. 1998, 47:879-888). 따라서 본 발명의 면역 부활용 조성물은 분비 성분의 생산을 촉진함으로써, 감염성 대장균이나 독소원성 클로스트리듐균 등의 감염성 병원체의 감염 위험성을 감소시키는 효과를 갖는다.

한편, 장관 점막 상피 세포로부터 생체밖(장관강 내)으로의 분비형 IgA의 생산에는, 장관 점막에서의 형질 세포로부터의 IgA 생산과 장관 상피 세포에서의 분비 성분의 생산이 모두 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다. 실제로, 분비 성분 의 유전자를 결손시킨 실험 동물에서는, 본래 장관강에 분비되어야 하는 IgA가 혈청 중에 축적된다(J Exp Med 1999; 190:915-22). 분비 성분의 발현에 환경으로부터의 자극이 관여하는 것도 시사되어 있고, 영양 실조에 의한 분비 성분의 발현 저하가 보고되어 있다(Lab Invest 1998; 78:1255-66). 본 발명의 면역 부활용 조성물은 분비 성분 생산 유도능을 나타내고, 높은 IgA 생산 유도능을 갖기 때문에 예를 들면 간편한 경구 투여에 의해서 분비형 IgA의 생산을 촉진할 수 있다고 생각된다.

본 발명은 본원 발명에 관한 면역 부활용 조성물을 피검체에 투여(바람직하게는 경구 투여)함으로써, 피검체의 면역력을 향상시키는 방법에도 관한 것이다. 이 방법에서는 투여를 받은 피검체에서, 바람직하게는 분비 성분의 생산과 IgA의 생산이 모두 촉진되고, 그 결과 분비형 IgA의 생산이 촉진된다. 이 방법에서 면역 부활용 조성물을 투여하는 피검체는 후술하는 의약 조성물의 투여 대상과 동일하다. 바람직한 피검체의 예로는 임산부, 수유부, 영유아, 고령자, 면역 기능이 저하된 환자 등을 들 수 있다. 본원의 면역 부활용 조성물의 투여량은 후술하는 의약 조성물의 투여량에 따라 다를 수 있다.

3. 면역 부활용 조성물을 함유하는 음식품

본 발명은 또한 분비 성분 생산 유도능 및 높은 IgA 생산 유도능을 갖는 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 비피더스균 및/또는 그 비피더스균의 처리물을 함유하는 면역 부활용 조성물을 첨가한 음식품에 관한 것이다. 본 명세서에서 "음식품"은, 한정되는 것은 아니지만, 음료, 식품 및 기능성 식품을 포함한다.

본 발명의 면역 부활용 조성물을 포함하는 음식품은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 본 발명의 면역 부활용 조성물을 포함하는 음료로서, 발효유(요구르트 등), 유산균 음료, 유음료(커피 우유, 과일 우유 등), 차계열 음료(녹차, 홍차 및 우롱차 등), 과일·야채계 음료(오렌지, 사과, 포도 등의 과즙이나, 토마토, 당근 등의 야채즙을 포함하는 음료), 알코올성 음료(맥주, 발포주, 와인 등), 탄산 음료 및 청량 음료 등의 음료를 예시할 수 있다. 각종 음료의 제조법 등에 대해서는, 기존의 참고서, 예를 들면 "최신 소프트 드링크"(2003)(가부시끼가이샤 고린) 등을 참고로 할 수 있다.

또한 본 발명의 면역 부활용 조성물을 포함하는 식품은 특별히 한정되지 않으며, 생선 식품이거나, 가공 식품일 수도 있다. 예를 들면, 푸딩, 젤리, 아이스크림류, 케이크, 캔디, 파스타, 우동, 어묵, 햄, 간장, 드레싱, 마요네즈, 두부, 스프, 빵, 토막 생선, 가공육, 야채, 버섯 등의 여러 가지 식품을 예시할 수 있다. 본 발명에서 특히 바람직한 식품으로는 본 발명의 비피더스균을 살아 있는 상태로 장까지 보내는 것이 가능한 발효유나 유산균 음료를 들 수 있다.

본 발명의 면역 부활용 조성물을 함유하는 음식품으로서, 기능성 식품이 특히 바람직하다. 본 발명의 "기능성 식품"은 생체에 대하여 일정한 기능성을 갖는 식품을 의미하고, 예를 들면 특정 보건용 식품(조건부 [특정 보건용 식품]을 포함함) 및 영양 기능 식품을 포함하는 건강 보조 식품, 특별 용도 식품, 영양 보조 식품, 건강 보조 식품, 보충제(예를 들면, 정제, 피복정, 당의정, 캡슐 및 액제 등의 각종 제형의 것) 및 미용 식품(예를 들면 다이어트 식품) 등의 소위 건강 식품 전 반을 포함한다. 본 발명의 기능성 식품은 또한, 코덱스(FAO/WHO 합동 식품 규격 위원회)의 식품 규격에 기초하는 건강 강조 표시(Health claim)가 적용되는 건강 식품을 포함한다.

본 발명의 기능성 식품으로서 바람직한 보다 구체적인 예에는 환자용 식품, 임산부·수유부용 분유, 유아용 조제 분유, 고령자용 식품 등의 특별 용도 식품이 있다. 본 발명의 면역 부활용 조성물은 부작용의 우려가 거의 없고 광범위한 병원체 등에 대하여 비교적 비특이적인 면역 응답을 전신적으로 야기할 수 있는 장관 면역이 증강 가능하기 때문에, 면역 기능의 발달이 미숙한 유아를 위한 조제 분유 또는 액체 제조유에서의 사용(예를 들면, 통상의 유아용 제조유의 원료에 첨가됨)이나, 수유부용 분유 등의 임부용 또는 수유부용 식품 및 면역 기능이 저하된 고령자나 환자를 위한 고령자용 식품 및 환자용 식품에서의 사용은 특히 바람직하다.

본 발명의 바람직한 기능성 식품으로는, 추가로 면역 기능의 발달이 미숙한 유아를 위한 유아용 보충제, 및 면역 기능의 증강이나 회복을 목적으로 하는 임산부·수유부용 보충제, 고령자용 보충제 및 환자용 보충제를 들 수 있다.

본 발명의 면역 부활용 조성물을 함유하는 기능성 식품의 바람직한 예로서, 일본 법령에 기초하여 규정되는 건강 보조 식품을 들 수 있다. 건강 보조 식품 제도는 내외의 동향, 종래부터의 특정 보건용 식품 제도와의 정합성을 근거로 하여, 통상의 식품뿐만 아니라 정제, 캡슐 등의 형상을 한 식품을 대상으로서 구비되었다. 이 제도하에 건강 보조 식품은 특정 보건용 식품(개별 허가형)과 영양 기능 식품(규격 기준형)의 2종의 유형으로 이루어진다. 또한, 조건부 [특정 보건용 식 품] 등의 새로운 유형도 포함된다.

본 발명의 기능성 식품은 면역 부활에 유용한 것이 바람직하다. 본 발명의 기능성 식품은 면역 기능의 향상, 바람직하게는 장관 면역(점막 면역) 기능의 향상을 나타내는 지표(예를 들면, IgA 생산량의 증가, 분비 성분의 생산량의 증가, 분비형 IgA량의 증가, 림프구수의 증가 등)에 의해서 면역 부활에 유용한 것을 나타낼 수도 있다. 본 발명의 기능성 식품은 면역 부활 이외의 용도를 제1 목적으로 할 수도 있다. 본 발명의 기능성 식품(바람직하게는 특정 보건용 식품 또는 조건부 [특정 보건용 식품])은 면역 부활 효과를 갖는 취지 또는 면역 부활과 관련이 깊은 지표를 나타내는 취지(분비 성분의 생산량의 증가 등)에 대해서 기재 또는 표시한 것일 수도 있다. 면역 부활 효과를 갖는 취지의 기재 또는 표시는 건강 보조 식품 제도에서 정해진 규정에 기초하여 표시 승인된 것일 수 있다. 예를 들면 본 발명의 기능성 식품에서는 "저하된 점막 면역 기능을 개선한다", "감염 방어능을 높인다", "감기를 걸리기 어렵게 한다", "신체의 저항력을 높인다" 등의 기재가 고려된다.

본 발명의 기능성 식품은 정제, 과립제, 산제, 환제, 캡슐제 등의 고형 제제, 액제, 현탁제, 시럽제 등의 액체 제제, 또는 젤제 등의 제제의 형상일 수도 있고, 통상의 음식품의 형상(예를 들면, 음료, 분말차잎, 과자 등)일 수도 있다.

본 발명의 면역 부활용 조성물의 음식품에의 배합량은 특별히 한정되지 않으며, 경우에 따라서 여러 가지일 수도 있다. 구체적인 배합량은 음식품의 종류나 요구하는 맛이나 식감을 고려하여 당업자가 적절하게 결정할 수 있다. 그러나 통 상은 첨가되는 면역 부활용 조성물 중 비피더스균 및/또는 그 비피더스균의 처리물의 총량이 0.001 내지 100 질량％, 특히 0.1 내지 100 질량％가 된 면역 부활용 조성물의 배합량이 적당하다.

본 발명의 면역 부활용 조성물은 당업자가 이용 가능한 임의의 적절한 방법에 의해서 음식품에 함유시키면 된다. 예를 들면, 본 발명의 면역 부활용 조성물을 액체상, 겔상, 고체상, 분말상 또는 과립상으로 제조한 후, 그것을 음식품에 배합할 수도 있다. 또는 본 발명의 면역 부활용 조성물을 음식품의 원료 중에 직접 혼합 또는 용해시킬 수도 있다. 본 발명의 면역 부활용 조성물은 음식품에 도포, 피복, 침투 또는 분무할 수도 있다. 본 발명의 면역 부활용 조성물은 음식품 중에 균일하게 분산시키거나, 편재시킬 수도 있다. 본 발명의 면역 부활용 조성물을 넣은 캡슐 등을 조제할 수도 있다. 본 발명의 면역 부활용 조성물을 식용 필름이나 식용 코팅제 등으로 코팅할 수도 있다. 또한 본 발명의 면역 부활용 조성물에 적절한 부형제 등을 첨가한 후, 정제 등의 형상으로 성형할 수도 있다. 본 발명의 면역 부활용 조성물을 함유시킨 음식품을 추가로 가공할 수도 있고, 이러한 가공품도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 음식품의 제조에서는 음식품에 관용적으로 사용되는 각종 첨가물을 사용할 수도 있다. 첨가물로는, 한정되는 것은 아니지만, 발색제(아질산나트륨 등), 착색료(치자나무 색소, 적색 102 등), 향료(오렌지 향료 등), 감미료(스테비아, 아스테르팜 등), 보존료(아세트산나트륨, 소르브산 등), 유화제(콘드로이친 황산나트륨, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르 등), 산화 방지제(EDTA 2나트륨, 비타 민 C 등), pH 조정제(구연산 등), 화학 조미료(이노신산나트륨 등), 증점제(크산탄검 등), 팽창제(탄산칼슘 등), 소포제(인산칼슘) 등, 결착제(폴리인산나트륨 등), 영양 강화제(칼슘 강화제, 비타민 A 등), 부형제(수용성 덱스트린 등) 등을 들 수 있다. 또한, 인삼 추출물, 가시오가피 추출물, 유칼립투스 추출물, 두충차 추출물의 기능성 소재를 더욱 첨가할 수도 있다.

4. 면역 부활용 조성물을 함유하는 의약 조성물

본 발명은 분비 성분 생산 유도능 및 높은 IgA 생산 유도능을 갖는 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 비피더스균 및/또는 그 비피더스균의 처리물을 함유하는 면역 부활용 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물에도 관한 것이다.

본 발명의 의약 조성물에 의약 제제상 허용되는 담체 또는 첨가물을 배합할 수도 있다. 이러한 담체 및 첨가물의 예로서, 물, 의약적으로 허용되는 유기 용제, 콜라겐, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐 중합체, 알긴산나트륨, 수용성 덱스트란, 수용성 덱스트린, 카르복시메틸스타치나트륨, 펙틴, 크산탄검, 아라비아 고무, 카제인, 젤라틴, 한천, 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알코올, 스테아르산, 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 의약 첨가물로서 허용되는 계면활성제 등 이외에, 리포좀 등의 인공 세포 구조물 등을 들 수 있다. 사용되는 첨가물은 제제의 제형에 따라서 적절하게 또는 조합하여 선택된다. 본 발명의 의약 조성물은 또 다른 약리 성분을 함유할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물은 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수 있지만, 특히 경구적으로 투여하는 것이 바람직하다. 경구적으로 투여되는 본 발명의 의약 조성물은 정제, 과립제, 산제, 환제, 캡슐제 등의 고형 제제, 젤제, 또는 액제, 현탁제, 시럽제 등의 액체 제제 등의 제형일 수도 있다. 액체 제제로서 이용하는 경우에는 본 발명의 의약 조성물을 사용할 때에 재용해시킬 것이 의도되는 건조물로서 공급할 수도 있다.

상기 제형 중 경구용 고형 제제는 약학상 일반적으로 사용되는 결합제, 부형제, 활택제, 붕괴제, 습윤제 등의 첨가제를 함유할 수도 있다. 또한, 경구용 액체 제제는 약학상 일반적으로 사용되는 안정제, 완충제, 교미제, 보존제, 방향제, 착색제 등의 첨가제를 함유할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물은 면역 부활 작용을 발휘하는 것이 바람직하다. 본 발명의 의약 조성물은 다른 약리 물질을 포함하는 별도의 치료 용도를 위한 의약 조성물에 면역 부활 작용을 추가한 것일 수도 있다. 또는 본 발명의 의약 조성물은 바람직하게는 면역 부활제이다.

본 발명의 의약 조성물은 점막 면역계에서의 IgA 생산량을 각별히 증가시키거나, 분비 성분의 생산량을 증가시켜 면역계, 특히 점막 면역계를 강화할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 예를 들면 병원체의 감염에 대한 방어능을 높이는 것을 목적으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 투여량은 투여 대상의 연령 및 체중, 투여 경로, 투여 횟수에 따라 다르고, 당업자의 재량에 의해서 광범위하게 변경할 수 있다. 예를 들면, 경구적으로 투여하는 경우에는 의약 조성물 중 면역 부활용 조성물에 포함되는 비피더스균 및/또는 그 비피더스균의 처리물의 투여량은 1 내지 1000 mg/kg/day가 적당하다. 본 발명의 의약 조성물은 단회 투여일 수도 있지만, 6 내지 8 시간의 간격으로 반복적으로 투여될 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물을 투여하는 대상은 인간, 가축, 애완 동물, 실험(시험) 동물 등을 포함하는 포유 동물이다. 특히, 면역 기능이 미발달한 유아기의 포유 동물, 나이 또는 병 등에 의해 면역 기능이 저하된 포유 동물, 체질적 또는 환경적으로 면역 기능이 저하되기 쉬운 포유 동물이 본 발명의 의약 조성물을 투여하는 대상으로서 바람직하다. 본 발명의 의약 조성물은 부작용의 염려가 적기 때문에 계속적으로 이용하는 데에 매우 유용하게 사용할 수 있다.

본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 인용된다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 비피더스균의 IgA 생산 유도능의 측정

1. 비피더스균의 조제

비피도박테리엄 롱검 OLB 6001주(수탁 번호 FERM P-13610), 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주(수탁 번호 NITE BP-30), 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주(수탁 번호 NITE BP-31), 비피도박테리엄 브레베주(수탁 번호 FERM BP-2824) 및 비피도박테리엄 비피덤 MEP 170212(이전의 명칭: 비피도박테리엄 비피덤 #1(메이지)주; 본 균주는 메이지 뉴교 가부시끼가이샤(일본)가 보유하고 있음)를 각각 글루코스를 락토오스로 변경하여 제조한 혐기 EG 배지로 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 또한 혐기 EG 배지는 이하의 조성에 따라서 제조하였다.

혐기 EG 배지의 조성

40.0 g(1 ℓ 당)

육류 추출물 2.6 g

프로테오스 펩톤 10.0 g

효모 추출물 5.0 g

인산일수소나트륨 4.0 g

락토오스 1.5 g

용성 전분 0.5 g

L-시스틴 0.2 g

L-시스테인염산염 0.5 g

소포제(실리콘) 0.2 g

폴리소르베이트 80 0.5 g

한천 15.0 g

pH 7.7

얻어진 배양물 중 균체를 냉 PBS(-)로 2회 세정한 후, 소량의 PBS(-)에 현탁하고, 등량의 8 ％-포르말린-PBS에 현탁하여 균체를 고정시켰다. 이 고정시킨 균체로부터 IgA 생산 유도능의 측정 실험을 행하는 당일에 냉 PBS(-)로 세정함으로써 포르말린을 제거한 후, 균액을 PBS에 현탁하여 660 nm에서의 탁도가 1.6이 되도록 균액 농도를 조정하였다. 이와 같이 해서 얻어진 균액을 포르말린 처리 종료 비피더스 균액이라고 부르기로 하였다.

2. 비피더스균의 파이어판 세포로부터의 IgA 생산 유도능의 측정

8주령의 BALB/C 마우스(암컷)를 탄산 가스 기류하에 50 초간 노출시킴으로써 죽이고, 무균적으로 추출된 소장으로부터 파이어판을 채취하였다. 이 파이어판을 소량의 2 ％ 소태아 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지(Gibco) 중에 취출하고, 스즈키 등의 방법(슬라이드법; 비피도박테리아 마이크로플로라, 9:87-98, 1990)을 일부 개변하여 파이어판 세포를 제조하였다. 즉, 채취한 파이어판을 소량의 2 ％ 소태아 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지(Gibco사)를 넣은 샬레 상에 취출하고, 해부용 메스로 잘게 자르고, 플라스틱 실린지의 손잡이(데루모사)를 이용하여 서서히 풀었다. 이와 같이 해서 얻어진 세포 현탁액을 150 게이지의 멸균 스테인레스강 체를 통과시키고, 추가로 2 ％ 소태아 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지로 2회 세정하였다. 세포를 적당량의 2 ％ 소태아 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지에 재현탁하고, T 세포 및 B 세포를 포함하는 림프 세포군(파이어판 세포)을 얻었다.

얻어진 림프 세포군은 RPMI-1640 배지를 2회 교환하여 세정한 후, 트리판 블루를 이용하여 98 ％ 이상이 생세포인 것을 확인하면서, 96 웰 마이크로 플레이트(Falcon 3072)에 1 웰당 5×10⁵개로 파종하였다. 또한 이 96 웰 마이크로 플레이트는 각 웰에 미리 항 CD3 항체(CEDARLANE, No.CL7202AP, 사용 농도: 2.5 ㎍/㎖) 를 100 ㎕씩 넣어 37 ℃에서 2 시간 동안 보온하고, 그 후 200 ㎕ PBS에서 1회, 이어서 200 ㎕ FCS(-) RPMI 배지로 1회 세정함으로써, 미리 항 CD3 항체로 코팅해둔 것을 이용하였다.

또한, 림프 세포군을 파종한 96 웰 마이크로 플레이트에 상기 "1. 비피더스균의 제조"에 따라서 제조한 5균주 유래의 포르말린 처리 종료 비피더스균액(탁도 =1.0) 5 ㎕를 각각 3개의 웰에 첨가하고, 탄산 가스 배양기 내에서 37 ℃에서 5일간 배양하였다. 배양 후의 균액으로부터 1400 rpm, 10 분간의 원심 분리에 의해 림프 세포군을 제거한 배양 상청액을 IgA량 측정용 시료로 하고, 측정까지 -80 ℃로 보존하였다. 이어서 그 배양 상청액 시료 중 IgA량을 Mouse IgA ELISA Quantitation Kit(Bethyl laboratories사)를 이용하여 설명서에 기재된 방법에 따라서 측정하였다.

한편, 대조 실험으로서 포르말린 처리 종료 비피더스균액을 첨가하지 않는 것 이외에는 상기와 동일하게 하여 항 CD3 항체의 공존하에서 림프 세포군을 5일간 배양하고, 그 배양 상청액 중 IgA량을 마찬가지로 측정하였다.

이상에 따라서 측정된 배양 상청액 중 IgA 농도를 하기 표 1에 나타낸다.

표 1에 기초하여 도 1에는 결과를 그래프로 나타내었다.

도 1의 그래프 좌측에 도시된 바와 같이, 항 CD3 항체의 공존하에서 상기 림프구 세포군(파이어판 세포)을 5일간 배양한 바, 배양 상청액 중에 IgA가 분비되었다. 이는 항 CD3 항체의 공존하에서 배양한 파이어판 세포에서 IgA 생산 세포(형질 세포)가 분화하는 것을 확인하는 것이다.

표 1 및 도 1의 그래프 우측에 나타낸 바와 같이, 본 분석계를 이용함으로써, 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주 및 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주의 IgA 생산 유도능은 IgA 생산 유도능을 갖는 것이 과거에 보고되어 있는 비피도박테리엄 롱검 OLB 6001주(수탁 번호 FERM P-13610) 및 비피도박테리엄 브레베주(수탁 번호 FERM BP-2824)에 비해 2 내지 5배 큰 것이 나타났다.

[실시예 2] 비피더스균의 분비 성분 생산 유도능의 측정 I

1. 비피더스균 파쇄물의 조제

비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주, 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주, 비피도박테리엄 비피덤 MEP 170212(이전의 명칭: 비피도박테리엄 비피덤 #1(메이지)주; 본 균주는 메이지 뉴교 가부시끼가이샤(일본)가 보유하고 있음) 및 비피도박테리엄 비피덤 MEP 170222(이전의 명칭: 비피도박테리엄 비피덤 #2(메이지)주; 본 균주는 메이지 데어리스 코포레이션(일본)이 보유하고 있음)의 각각을 실시예 1과 동일하게 하여 글루코스를 락토오스로 변경하여 제조한 혐기 EG 배지에서 하룻밤 배양하였다. 이어서, 얻어진 배양물 중 균체를 냉 PBS(-)로 2회 세정한 후, PBS(-) 중에 10 mg/㎖로 현탁하였다. 이 현탁물을 75 ℃에서 60 분간에 걸쳐 가열 처리한 후, 초음파 파쇄기(BRANSON SONIFIER 250, 실행 사이클(Duty cycle): 60 ％, 출력 제어(Output control): 2 마이크로 팁 한계)에 의해서 균체 파쇄물을 얻었다.

2. 비피더스균 파쇄물에 의한 HT -29 세포로부터의 분비 성분 생산 유도능의 측정

인간 장관 상피 세포 유래인 HT-29 세포를 12 웰 플레이트에 3 내지 6×10⁵ 개/웰 정도가 되도록 파종하고, 10 ％ 소태아 혈청을 포함하는 McCoy의 5A 배지(인비트로젠사 제조) 1.0 ㎖를 첨가하였다. 다음날 상기 "1. 비피더스균 파쇄물의 제조"에 따라서 제조한 4균주의 비피더스균(비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주, 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주, 비피도박테리엄 비피덤 MEP 170212 및 비피도박테리엄 비피덤 MEP 170222) 유래의 균체 파쇄물을 상기에서 제조한 12 웰 플레이트의 각각 3개의 웰의 배지에 균체 파쇄물 농도 50 내지 500 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고, 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 대조 실험에는 균체 파쇄물 대신에 PBS(-)[Ca 및 Mg 이온을 제거한 둘베코 인산 완충 염수]를 이용하였다. 얻어진 배양물로부터 배양 상청액을 채취하고, 배양 상청액 중 분비 성분 농도를 ELISA법으로 측정하였다. 이 때문에, 우선 ELISA 플레이트의 웰을 인간 분비 성분에 대한 폴리클로날 항체(DAKO사, PBS(-)로 1000배 희석하여 사용)를 이용하여 4 ℃에서 밤새 코팅한 후, 0.01 ％ tween 20가 PBS(-)로 세정하고, 이어서 1 ％ 소혈청 알부민 (BSA)-PBS(-)를 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 배양하여 블록킹하였다. 이어서 이 플레이트의 각 웰에 상기에서 얻어진 각 배양 상청액의 50 ㎕를 샘플로서 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 각 웰을 0.1 ％ tween 20가 PBS(-)로 세정한 후, 호세라디시(heseradish) 퍼옥시다제 표지한 항 인간 분비 성분 항체(DAKO사, 1 ％ BSA-PBS(-)로 1000배 희석)를 첨가하고, 실온에서 30 분간 배양하였다. 이어서 각 웰을 0.01 ％ tween 20가 PBS(-)로 세정한 후, 오르토페닐렌디아민/과산화수소 수용액 100 ㎕를 각 웰에 넣고 30 분간 반응시켰다. 반응 후, 2NH₂SO₄ 20 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 측정 파장 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 대조의 분비 성분 생산량을 1로 했을 때의 상대값으로 나타내었다. 각 군 사이의 유의차 검정은 스튜던트 t-검정에 의해 위험률 5 ％ 이하로 유의차의 유무를 판정하였다.

상기 측정에서 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주의 균체 파쇄물을 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖로 양을 변화시켜 배지에 첨가한 경우의 분비 성분의 측정 결과를 하기 표 2 및 도 2에 나타낸다.

이 결과, 균체 파쇄물을 50 ㎍/㎖로 첨가한 경우에도, 이미 대조와 비교하여 약 1.4배의 분비 성분 생산량의 증가를 보였다. 그리고 균체 파쇄물의 용량을 증가시켜도 분비 성분 생산량의 증가는 동일한 정도였다(도 2).

또한 이 결과는 본 발명의 비피더스균이 75 ℃에서 60 분간 가열 처리를 행하여 불활성화한 균체의 파쇄물이어도 분비 성분 생산의 촉진 효과가 있는 것으로 나타내었다.

또한 상기 측정에서 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주의 균체 파쇄물을 500 ㎍/㎖로 배지에 첨가한 경우의 분비 성분의 측정 결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타낸다.

이와 같이 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주의 균체 파쇄물을 500 ㎍/㎖로 첨가한 경우, 대조에 비해 약 2.5배의 분비 성분 생산량의 증가가 보였다.

또한, 상기 측정에서 비피도박테리엄 비피덤 MEP 170212 및 비피도박테리엄 비피덤 MEP 170222의 균체 파쇄물을 250 ㎍/㎖ 및 500 ㎍/㎖로 배지에 첨가한 경우의 분비 성분의 측정 결과를 하기 표 4 및 도 4에 나타낸다.

도 4에 도시된 바와 같이, 비피도박테리엄 비피덤 MEP 170212 및 비피도박테리엄 비피덤 MEP 170222에서는 250 ㎍/㎖이라는 비교적 고농도에서도 분비 성분 생산량의 증가는 인정되지 않았다. 이는 비피도박테리엄 비피덤에 속하는 비피더스균이 반드시 분비 성분 생산을 증강하는 능력을 갖는 것은 아니라는 것을 나타내고 있다.

[실시예 3] 비피더스균 파쇄물로 처리한 소장 및 대장 기관 배양 조직에서의 분비 성분 유전자 발현량의 측정

출산된 후 24 시간 이내의 BALB/c 마우스로부터 회장 및 근위대장을 적출하고, 기관 배양한 것을 검토에 이용하였다. 즉, 회장 및 근위대장을 둥글게 잘라서 폭 약 2 내지 4 mm의 조직편을 제조하였다. 조직편을 유리 여과지 상에서 시트상으로 세로 방향으로 절단하고, 세로판측의 면을 유리 여과지에 밀착시켰다. 제조한 조직 시트를 48 웰 플레이트에 넣고, 100 U/㎖ 페니실린(반유 세이야꾸), 0.1 mg/㎖ 스트렙토마이신(메이지 세이까), 0.05 mg/㎖ 겐타마이신(LIFE TECHNOLOGIES), 및 10 ％ 소태아 혈청 함유 RPMI 배지(닛스이 세이야꾸) 0.5 ㎖를 첨가하였다.

계속해서, 상기 실시예 2의 "1. 비피더스균 파쇄물의 제조"에 따라서 제조한 B. 비피덤 OLB 6378주 유래의 균체 파쇄물을 상기에서 제조한 48 웰 플레이트의 각각 3개의 웰의 배지에 균체 파쇄물 농도 500 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고, 37 ℃에서 18 시간 동안 배양하였다(n=3). 대조 실험에는 균체 파쇄물 대신에 PBS(-)를 이용하였다(n=3).

배양 완료 후, RNA 정제 키트(QIAGEN, RNeasy mini kit)를 이용하여 배양 조직으로부터 총 RNA를 추출하고, 이것을 주형으로서 올리고 dT 프라이머(인비트로젠)에 의해 cDNA를 제조하였다. 또한 그 cDNA를 주형으로 하고, pIgR 유전자(분비 성분 유전자)에 특이적인 PCR 프라이머(5'-AGGCAATGACAACATGGGG-3'(서열 1), 및 5'-ATGTCAGCTTCCTCCTTGG-3'(서열 2))을 이용하는 실시간 PCR을 라이트 사이클러(Light Cycler, Roche사)를 이용하여 행하고, cDNA 중 pIgR 유전자 발현량을 측정하였다. 각 시료에 대해서 측정한 pIgR 유전자 발현량은 관리 유전자(housekeeping gene) 중 하나인 GAPDH 유전자 (PCR 프라이머, 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'(서열 3), 및 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(서열 4)을 이용하여 동일한 방법으로 검출)의 발현량을 이용하여 이하의 수학식 1에 따라서 보정하였다.

pIgR 유전자의 상대 발현량=pIgR 유전자 발현량/GAPDH 유전자 발현량

이상과 같이 하여 산출된 pIgR 유전자 상대 발현량에 기초하여, 다수개의 실험 샘플로부터 pIgR 유전자의 상대 발현량의 평균값을 산출한 결과를 하기 표 5 및 도 5에 나타낸다.

도 5 중, 백색의 바가 대조 실험에서의 pIgR 유전자의 상대 발현량, 흑색의 바가 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주의 균체 파쇄물을 첨가한 경우의 pIgR 유전자의 상대 발현량을 나타낸다. 각 바에 표준 편차도 나타낸다.

표 5 및 도 5에 도시된 바와 같이, 실시예 2에 따라서 제조한 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주의 균체 파쇄물을 균체 파쇄물 농도 500 ㎍/㎖로 첨가한 경우, 대조에 비해 회장(소장의 하부)에서 2.9배, 근위대장(대장의 시작의 부분)에서 2.4배의 pIgR 유전자(분비 성분 유전자)의 유전자 발현량의 증가를 보였다. 대장에서의 증가는 만-휘트니(Mann-Whitney)의 U 검정에 의해 유의(P<0.05)한 차가 확인되었다. 이에 따라, 비피도박테리엄 비피덤의 균체 파쇄물이 소장 및 대장에서 분비 성분 유전자의 발현을 증강하는 것이 나타났다.

[실시예 4] 비피더스균 파쇄물로 처리한 소장 및 대장 기관 배양 조직에서의 분비 성분 유전자 발현량, 및 IRF-1 유전자 발현량의 DNA 마이크로 어레이에 의한 측정

태생 18일째의 BALB/c 마우스로부터 회장 및 근위대장을 적출하고, 기관 배양한 것을 검토에 이용하였다. 상기 실시예 3과 마찬가지로 회장 및 근위대장을 둥글게 잘라서 폭 약 2 내지 4 mm의 조직편을 제조하였다. 조직편을 유리 여과지 상에서 시트상으로 세로 방향으로 잘라내고, 세로판측의 면을 유리 여과지에 밀착시켰다. 제조한 조직 시트를 48 웰 플레이트에 넣고, 100 U/㎖ 페니실린(반유 세이야꾸), 0.1 mg/㎖ 스트렙토마이신(메이지 세이까), 0.05 mg/㎖ 겐타마이신(LIFE TECHNOLOGIES), 및 10 ％ 소태아 혈청 함유 DMEM 배지(Gibco) 0.5 ㎖를 첨가하였다.

계속해서, 상기 실시예 2의 "1. 비피더스균 파쇄물의 제조"에 따라서 제조한 B. 비피덤 OLB 6378주 유래의 균체 파쇄물을 상기에서 제조한 48 웰 플레이트의 각각 3개의 웰의 배지에 균체 파쇄물 농도 500 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고, 37 ℃에서 18 시간 동안 배양하였다. 대조 실험에는 균체 파쇄물 대신에 PBS(-)를 이용하였다(n=3).

배양 완료 후, RNA 정제 키트(QIAGEN, RNeasy mini kit)를 이용하여 배양 조직으로부터 총 RNA를 추출하고, 3개의 웰의 총 RNA를 하나로 통합하여 이하의 측정에 사용하였다. 총 RNA를 주형으로서 유전자칩 1-주기 표적 표지화 및 제어 시약 키트(GeneChip One-Cycle Target Labeling and Control Reagents Kit(Affymetrix사))를 이용하여 단편화 cRNA를 합성하였다. 즉, 상기 키트에 포함되는 유전자칩 발현 3'-증폭 시약 1-주기 cDNA 합성 키트(GeneChip Expression 3'-Amplification Reagent One-Cycle cDNA Synthesis Kit(Affymetrix사)), 및 유전자칩 진핵성 폴리-A RNA 제어 키트(GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit(Affymetrix사))를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이어서, 유전자칩 클린업 모듈(GeneChip Cleanup Module(Affymetrik사))을 이용하여 cDNA를 정제하고, 유전자칩 발현 3'-증폭 시약 IVT 표지 키트(GeneChip Expression 3'-Amplification Reagent IVT labeling Kit(Affymetrix사))를 이용하여 시험관 내 전사 반응을 행하였다. 유전자칩 클린업 모듈(Affymetrix사)을 이용하여 cRNA를 정제한 후, cRNA를 단편화 완충액(Fragmentation buffer; Affimetrix사)에 의해서 단편화 처리하여 단편화 cRNA를 얻었다. 단편화 cRNA를 이용하여 DNA 어레이 시스템(Affymetrix사)에 의한 분석을 하였다. 여기서 이용한 DNA 어레이의 프로브로는 약 36000종의 마우스 유전자를 포함하는 마우스게놈 MG_U74Av2세트(Affymetrix사)를 사용하였다. 실험 사이의 변동은 유전자 발현 대 내부 대조군의 비를 이용하여 보정하였다. 각 유전자의 발현량에 대한 B. 비피덤 OLB 6378주에서의 처리의 효과를 대조 실험(PBS(-) 처리)에서의 각 유전자의 발현량에 대한 비로서 나타내었다.

그 결과, 소장 및 대장 기관 배양 조직에서의 분비 성분 유전자(pIgR 유전자)의 발현량 증가, 및 세포 내 신호 전달 인자인 IRF-1 유전자의 발현량 증가가 확인되었다(표 6).

표 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에 따라서 제조한 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주의 균체 파쇄물을 균체 파쇄물 농도 500 ㎍/㎖로 첨가한 경우, 대조에 비해 회장(소장의 하부)에서 2.0배, 근위대장(대장의 시작의 부분)에서 6.1배의 분비 성분 유전자(pIgR 유전자) 발현량의 증가가 보이고, 실시예 3의 결과와 거의 일치하였다. 또한, 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주의 균체 파쇄물에 의해 대조에 비해 회장에서 1.5배, 근위대장(대장의 시작의 부분)에서 4.0배의 IRF-1 유전자 발현량의 증가를 보였다.

IRF-1은 분비 성분 유전자의 전사 조절 인자 중 1개인 것으로 나타나 있다(Blanch et al. J Immunol 1999, 162:1232-1235). 따라서, B. 비피덤 OLB 6378주를 이용한 처리에 의한 분비 성분 유전자 발현의 유도는 세포 내 신호 전달 경로를 통해 증강되는 것으로 나타났다.

[실시예 5] 비피더스균의 분비 성분 생산 유도능의 측정 II

기본적으로는 실시예 2의 방법에 따라서 비피더스균 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주와 비피도박테리엄 비피덤 JCM 1255^T주의 분비 성분 생산 유도능을 측정하고 비교하였다. 또한 비피도박테리엄 비피덤 JCM 1255^T주는 비교용의 주로서 독립 행정 법인 이화학 연구소 바이오 리소스 센터 미생물 재료 개발실(JCM)(일본 사이타마껭 와코시 히로사와 2-1)로부터 입수하였다.

비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주와 비피도박테리엄 비피덤 JCM 1255^T주는 실시예 2의 절차에 따라서 하룻밤 배양한 후, 냉 PBS(-)로 2회 세정한 후 PBS(-) 중에 현탁하고, 이를 실시예 2의 절차에 따라서 제조한 HT-29 세포를 뿌린 배지(10 ％ 소태아 혈청을 포함하는 McCoy의 5A 배지(인비트로젠사 제조))에 균체 농도 500 ㎍/㎖가 되는 양으로 첨가하여 37 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다(n=2). 얻어진 배양물로부터 48 시간째 및 72 시간째에 배양 상청액을 채취하고, 실시예 2에 기재된 절차에 따라서 각각의 배양 상청액 중 분비 성분 농도를 ELlSA법으로 측정하였다.

또한 대조 실험에서는, 균체의 PBS(-) 중 현탁물 대신에 PBS(-)를 상기 배지에 첨가하였다(하기 표 7 중, PBS(-)). 추가적인 대조 실험으로는 상기 배지에 균체의 PBS(-) 중 현탁물을 첨가하지 않고, 대체 물질도 아무것도 첨가하지 않고 배양하였다(하기 표 7 중, 배지단독).

이 결과를 하기 표 7 및 도 6에 나타낸다. 표 7에 나타내는 분비 성분 농도는 n=2의 평균값이다.

표 7 및 도 6에 나타낸 바와 같이, HT-29 세포는 무자극으로도 분비 성분을 생산하였다. 또한, 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주는 비피도박테리엄 비피덤 JCM 1255^T주와 비교하여도 현저히 많은 양의 분비 성분을 생산 유도할 수 있었다.

본 발명의 면역 부활용 조성물은 분비 성분의 생산을 촉진하고, IgA 생산을 고도로 촉진함으로써, 특히 점막 면역계의 기능을 높일 수 있다. 따라서 본 발명의 면역 부활용 조성물은 이러한 면역 기능 증강 작용을 음식품이나 의약 조성물에 부여하는 데에서 유용하다. 또한 본 발명의 면역 부활용 조성물을 포함하는 음식품 및 의약 조성물은 면역 기능이 낮은 환자, 예를 들면 유아나 고령자, 환자 등에 이용하는 데에 적합하다. 또한 본 발명의 면역 부활용 조성물은 본 발명의 비피더스균의 사균체를 사용하여 제조할 수 있기 때문에, 육아용 조제 분유 등 생물학적 규격을 갖는 제품에도 첨가하여 사용할 수 있고, 제품 형태 등에 관계없이 여러 가지 제품에 이용 가능하다.

<서열 목록 프리텍스트>

서열 1 내지 4의 배열은 프라이머이다.

SEQUENCE LISTING <110> Meiji Dairies Corporation <120> Compositions for immunostimulation <130> PH-2696-PCT <140> PCT/JP2006/301661 <141> 2006-02-01 <150> JP 2005-026631 <151> 2005-02-02 <150> JP 2005-256835 <151> 2005-09-05 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inventor: Moro, Itaru; Iwase, Takashi; Ochiai, Kuniyasu Inventor: Yajima, Masako; Terahara, Masaki; Nakamura, Yoshitaka Inventor: Totsuka Mamoru; Yamada, Kiyoshi <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 1 aggcaatgac aacatgggg 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 2 atgtcagctt cctccttgg 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 tgaacgggaa gctcactgg 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 tccaccaccc tgttgctgta 20 1/2

Claims

장관 상피 세포에서의 분비 성분 생산량을 적어도 1.2배로 증가시키는 분비 성분 생산 유도능을 갖는 비피도박테리엄 비피덤(Bifidobacterium bifidum)에 속하는 비피더스균 및/또는 상기 비피더스균의 처리물을 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 부활용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 비피더스균이 항 CD3 항체 존재하에서의 파이어판(Peyer's patch) 세포 5×10⁵개당 IgA 생산량을 적어도 10 ㎍/㎖로 증가시키는 IgA 생산 유도능을 더 갖는 것을 특징으로 하는 면역 부활용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비피더스균이 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주(수탁 번호 NITE BP-30) 또는 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주(수탁 번호 NITE BP-31)인 면역 부활용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비피더스균의 처리물이 비피더스균의 현탁물, 배양물, 배양 상청액, 발효물, 가열 처리물, 파쇄물, 농축물, 페이스트화물, 건조물 및 희석물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상인 면역 부활용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 면역 부활용 조성물을 포함하는 음식품.
제5항에 있어서, 영아용 식품, 유아용 식품, 수유부용 식품, 고령자용 식품, 환자용 식품, 건강 보조 식품, 보충제, 발효유 및 유산균 음료로 이루어지는 군으로부터 선택되는 음식품.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 면역 부활용 조성물을 포함하는 의약 조성물.
면역 부활용 음식품 또는 의약 조성물을 제조하기 위한 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주(수탁 번호 NITE BP-30) 또는 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주(수탁 번호 NITE BP-31)의 사용.
(a) 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6377주(수탁 번호 NITE BP-30) 또는

(b) 비피도박테리엄 비피덤 OLB 6378주(수탁 번호 NITE BP-31)

의 비피더스균.