WO2018003898A1 - 軟骨再生促進用組成物 - Google Patents

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WO2018003898A1
WO2018003898A1 PCT/JP2017/023850 JP2017023850W WO2018003898A1 WO 2018003898 A1 WO2018003898 A1 WO 2018003898A1 JP 2017023850 W JP2017023850 W JP 2017023850W WO 2018003898 A1 WO2018003898 A1 WO 2018003898A1
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lactic acid
composition
acid bacteria
food
lactobacillus
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PCT/JP2017/023850
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French (fr)
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一仁 六反
憲生 西田
由紀 桑野
茂 藤原
智詞 菅原
ゆめこ 青木
澤田　大輔
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アサヒグループホールディングス株式会社
国立大学法人徳島大学
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/145—Gasseri

Definitions

  • the present invention relates to means and methods for promoting cartilage regeneration. Specifically, the present invention relates to a composition for promoting cartilage regeneration and a composition for promoting type 2 collagen synthesis, which contain lactic acid bacteria and / or processed products thereof as active ingredients.
  • locomotive syndrome has increased due to biased nutritional balance, decreased exercise, decreased muscle strength associated with aging, and inflammation of joints.
  • These major diseases include osteoarthritis and rheumatoid arthritis. These are caused by inflammation of articular cartilage and immune abnormality of joint synovium, and treatment is performed by controlling inflammation and joint destruction.
  • side effects such as adrenal insufficiency and gastrointestinal inflammation have been serious problems with conventional steroid preparations and non-steroidal anti-inflammatory analgesics that are anti-inflammatory agents.
  • Patent Document 1 describes promotion of collagen production by administration of lactic acid bacteria (Lactobacillus plantarum).
  • Patent Document 1 shows in vitro promotion of type 1 collagen production by adding lactic acid bacteria to human cultured cells.
  • Patent Document 2 describes arthritis suppression based on autoimmune suppression or inflammation suppression using crushed lactic acid bacteria including Lactobacillus gasseri CP2305 strain, and pain improvement thereby.
  • Patent Document 3 describes that Lactobacillus gasseri CP2305 strain has a vagus nerve activation effect.
  • An object of the present invention is to provide effective means and methods for promoting cartilage regeneration, particularly in patients suffering from joint pain. It is also an object of the present invention to provide means and methods for promoting type 2 collagen synthesis, particularly in patients suffering from joint pain.
  • lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus particularly Lactobacillus gasseri
  • promotes cartilage regeneration and improves joint pain in the subject .
  • administration of lactic acid bacteria promotes higher type 2 collagen synthesis than degradation of type 2 collagen, and reduces inflammation, pain and stiffness of joint pain.
  • the present invention includes, but is not limited to: [1] A composition for promoting cartilage regeneration, containing lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus and / or a processed product thereof as an active ingredient. [2] A composition for accelerating synthesis of type 2 collagen comprising lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus and / or a processed product thereof as an active ingredient. [3] The composition according to [1] or [2], wherein the promotion of cartilage regeneration or the promotion of type 2 collagen synthesis is indicated by a decrease in the collagen degradation / synthesis ratio (C2C / CPII). [4] The composition according to any one of [1] to [3], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus gasseri.
  • the lactic acid bacterium is Lactobacillus gasseri CP2305 strain (Accession No. FERM BP-11331) or a mutant thereof, or Lactobacillus gaseri CP2305s strain (Accession No. NITE BP-1405) or a variant thereof, [1] ⁇ The composition according to any one of [4].
  • [6-1] The composition according to any one of [1] to [6], wherein the administration subject is a human patient suffering from joint pain or a human subject 40 years or older.
  • the food or drink includes a fermented milk drink, yogurt, powdered milk, baby food, miso soup, retort food, and a tablet.
  • a method for promoting cartilage regeneration in a subject comprising a step of administering a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus and / or a processed product thereof to the subject.
  • a method for promoting type 2 collagen synthesis in a subject comprising a step of administering a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus and / or a processed product thereof to the subject.
  • a method for promoting cartilage regeneration in a subject comprising administering a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus and / or a processed product thereof to the subject and promoting cartilage regeneration in the subject.
  • a method for promoting type 2 collagen synthesis in a subject comprising administering a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus and / or a processed product thereof to the subject and promoting type 2 collagen synthesis in the subject.
  • a composition for promoting cartilage regeneration and a composition for promoting type 2 collagen synthesis are provided.
  • the composition of the present invention is effective for improving joint pain, particularly in middle-aged and elderly subjects and subjects suffering from joint pain.
  • the lactic acid bacteria which are active ingredients are safe and inexpensive, and can be easily ingested as food and drink or nutritional supplements.
  • the present invention is the finding that administration of lactic acid bacteria can promote cartilage regeneration or promote type 2 collagen synthesis, can reduce inflammation, pain and stiffness of joint pain, and can improve joint pain. Based on. Specifically, as a result of administering lactic acid bacteria (Lactobacillus gasseri CP2305 strain) to middle-aged people (40-90s), compared to placebo, it promotes the synthesis of type 2 collagen and improves joint pain It is based on the fact that lactic acid bacteria confirmed the effect of promoting cartilage regeneration and the effect of improving joint pain.
  • lactic acid bacteria confirmed the effect of promoting cartilage regeneration and the effect of improving joint pain.
  • the present invention relates to a composition for promoting cartilage regeneration and a composition for promoting collagen type 2 containing lactic acid bacteria and / or processed products thereof as active ingredients.
  • the present invention also relates to a method for promoting cartilage regeneration in a subject, and a method for promoting type 2 collagen synthesis in a subject, comprising the step of administering a lactic acid bacterium and / or a processed product thereof to the subject.
  • the lactic acid bacteria used in the present invention are bacteria that produce lactic acid from saccharides by fermentation, and particularly include bacteria belonging to the genus Lactobacillus.
  • a lactic acid bacterium strain known in the art can be used as long as the lactic acid bacterium or a processed product thereof exhibits a target function or activity specifically described below. In consideration of administration / ingestion to animals, it is preferable that the strain has been confirmed to be safe in animals.
  • More specific species of lactic acid bacteria include bacteria belonging to the genus Lactobacillus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus zeae, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus Reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatas, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrukki Subspecies Bulgaricus, and Lactobacillus johnsonii and so on.
  • the intended function or activity in the context of the present invention means the action of promoting cartilage regeneration in a subject.
  • the target function or activity means an action of promoting type 2 collagen synthesis.
  • Promotion of cartilage regeneration includes promotion of type 2 collagen synthesis, suppression of type 2 collagen degradation, and both.
  • type 2 collagen synthesis and type 2 collagen degradation can be measured by methods known in the art.
  • the target function or activity means an action for improving joint pain.
  • Improvement of joint pain means reduction of inflammation of joint pain, reduction of pain and stiffness of joint pain, elimination of the cause of joint pain (due to cartilage regeneration), treatment not only eliminates joint pain completely It includes a reduction compared to before.
  • Reduction of inflammation can be determined by, for example, a decrease in blood monocytes and ⁇ globulin, which are indicators of inflammation.
  • the pain and stiffness of joint pain can be evaluated by, for example, the knee osteoarthritis patient function evaluation scale (JKOM: Japanese Knee Osteoarthritis Measure).
  • JKOM Japanese Knee Osteoarthritis Measure
  • Whether or not a lactic acid bacterium or a treated product thereof has a target function or activity is determined by administering a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus or a treated product thereof to an experimental animal or a test volunteer, and then cartilage before and after administration. It can be evaluated by confirming the regeneration state, type 2 collagen synthesis, type 2 collagen degradation, improvement of joint pain, and the like.
  • any lactic acid bacterium can be used as long as the microbial cell or the processed product is evaluated to have the target function or activity by the method described above.
  • Preferred lactic acid bacteria having such a function or activity include the Lactobacillus gasseri CP2305 strain and the Lactobacillus gasseri CP2305s strain.
  • the Lactobacillus gasseri CP2305 strain was obtained by the applicant from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Ibaraki Prefecture, Japan), an independent administrative agency that is an international depositary authority based on the provisions of the Budapest Treaty for the deposit of patent microorganisms.
  • mutant strains of the specific strains described above can also be used as long as they have the intended function or activity.
  • the Lactobacillus gasseri CP2305s strain is a mutant obtained from the Lactobacillus gasseri CP2305 strain, and the mutants of the CP2305 strain and the CP2305s strain are also likely to have the desired function or activity in the same manner.
  • Such mutant strains can also be used in the present invention.
  • mutant strain means any strain obtained from the parent strain. Specifically, it is obtained by a method of artificially increasing the frequency of mutation from a parent strain by natural mutation or induced mutation by a chemical or physical mutagen, or by a specific mutagenesis technique (for example, gene recombination). Means a stock. A microbial individual produced by such a method is repeatedly selected and separated, and a useful microbial individual is bred to obtain a mutant having the desired function or activity.
  • mutant strains derived from Lactobacillus gasseri CP2305 strain or CP2305s strain can be easily distinguished from other lactic acid strains by molecular weight distribution of amplified fragments of lactic acid bacteria genomic DNA by polymerase chain reaction (PCR) method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a DNA sample is prepared, and gene amplification is performed by PCR using primers having a characteristic sequence (for example, 16S rDNA base sequence). It is possible to determine whether or not it is a mutant strain derived from the CP2305 strain or the CP2305s strain.
  • the method for confirming whether or not it is a mutant is not limited to this method, and it can be confirmed whether or not it is a mutant by a technique known in the art such as mycological properties. .
  • Lactic acid bacteria can be prepared by culturing under appropriate conditions using a medium usually used for culturing lactic acid bacteria.
  • a medium usually used for culturing lactic acid bacteria contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like and can culture lactic acid bacteria efficiently, either a natural medium or a synthetic medium may be used. If so, a known medium suitable for the strain to be used can be appropriately selected. Lactose, glucose, sucrose, fructose, galactose, molasses etc. can be used as carbon source, and organic nitrogen containing casein hydrolyzate, whey protein hydrolyzate, soy protein hydrolyzate etc. as nitrogen source Things can be used.
  • inorganic salts phosphates, sodium, potassium, magnesium and the like can be used.
  • a medium suitable for culturing lactic acid bacteria include MRS liquid medium, GAM medium, BL medium, Briggs Liver Broth, animal milk, skim milk, and milky whey.
  • a sterilized MRS medium can be used.
  • lactic acid bacteria are cultured at 20 to 50 ° C., preferably 25 to 42 ° C., more preferably about 37 ° C. under anaerobic conditions.
  • the temperature condition can be adjusted by a thermostatic bath, a mantle heater, a jacket, or the like.
  • the anaerobic condition means a low oxygen environment in which lactic acid bacteria can grow.
  • an anaerobic chamber, an anaerobic box, a sealed container or bag containing an oxygen scavenger, or the like is used.
  • Anaerobic conditions can be achieved by sealing the culture vessel.
  • the culture format is stationary culture, shake culture, tank culture, or the like.
  • the culture time can be 3 to 96 hours.
  • the pH of the medium at the start of the culture is preferably maintained at 4.0 to 8.0.
  • lactic acid bacteria A specific preparation example of lactic acid bacteria will be briefly described.
  • the lactic acid bacterium is inoculated in a medium for lactic acid bacteria (for example, MRS liquid medium), preferably a medium for food grade lactic acid bacteria, and is overnight at about 37 ° C. ( Incubate for about 18 hours.
  • a medium for lactic acid bacteria for example, MRS liquid medium
  • MRS liquid medium preferably a medium for food grade lactic acid bacteria
  • the obtained lactic acid bacteria culture may be used as it is, or may be subjected to solid-liquid separation and / or sterilization by filtration and / or filtration if necessary.
  • the lactic acid bacteria used in the present invention may be live cells or dead cells, may be wet cells, or may be dry cells. Preferably, dead lactic acid bacteria are used.
  • a processed product of lactic acid bacteria obtained by processing microbial cells of lactic acid bacteria may be used, or a processed product of lactic acid bacteria may be further processed.
  • An example of such processing is described below.
  • It can be prepared as a suspension or dilution by suspending or diluting lactic acid bacteria and / or treated products in an appropriate solvent.
  • solvent examples include water, physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), and the like.
  • a fermented product can be prepared by fermenting raw milk, skim milk powder or soy milk using lactic acid bacteria cells and / or processed products.
  • lactic acid bacteria or other treated lactic acid bacteria are inoculated into raw milk, skim milk powder or soy milk, and fermented under lactic acid bacteria fermentation conditions known in the art (substantially the same as the lactic acid bacteria culture conditions described above).
  • the obtained fermentation product may be used as it is, or may be subjected to other treatments such as filtration, sterilization, dilution and concentration.
  • Lactic acid bacteria and / or treated products can be prepared as a sterilized product by sterilization.
  • known sterilization processes such as filtration sterilization, radioactive sterilization, heating sterilization, and pressure sterilization can be performed.
  • the lactic acid bacteria and / or the treated product are treated at a high temperature (for example, 80 to 150 ° C.) for a certain period of time, for example, about 10 minutes to 1 hour (for example, about 10 to 20 minutes). .
  • a high temperature for example, 80 to 150 ° C.
  • a certain period of time for example, about 10 minutes to 1 hour (for example, about 10 to 20 minutes).
  • a crushed product and a cell-free extract can be prepared.
  • crushing can be performed by physical crushing (stirring, filter filtration, etc.), enzyme dissolution treatment, chemical treatment, or autolysis treatment.
  • Extracts can be obtained by extracting lactic acid bacterial cells and / or processed products using an appropriate aqueous or organic solvent.
  • the extraction method is not particularly limited as long as it is an extraction method using an aqueous solvent or an organic solvent as an extraction solvent, but the lactic acid bacterium or a processed product obtained by performing other treatments on the lactic acid bacterium is treated with an aqueous or organic solvent (for example, water, methanol). And a known method such as a method of immersing, stirring or refluxing in ethanol).
  • the lactic acid bacteria cells and / or the treated product can be dried to obtain a powdery product (powder) or a granular product.
  • a powdery product for example, spray drying, drum drying, vacuum drying, freeze-drying etc. are mentioned, These can be employ
  • components or fractions having the desired function or activity may be purified from lactic acid bacteria and / or processed products using a known separation / purification method.
  • separation / purification methods include methods utilizing solubility such as salt precipitation and organic solvent precipitation, methods utilizing differences in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration and gel filtration, and ion exchange chromatography. Examples include methods that use the difference in charge, methods that use specific binding such as affinity chromatography, and methods that use hydrophobicity such as hydrophobic chromatography and reverse phase chromatography. Or two or more types can be used in combination.
  • the lactic acid bacteria and / or processed product obtained above are used alone or in combination with other components as a composition of the present invention or in a food, drink, feed, nutritional supplement or pharmaceutical composition.
  • the effect of promoting cartilage regeneration and / or the effect of promoting type 2 collagen synthesis and the effect of improving joint pain are expected.
  • composition of the present invention contains the above-mentioned lactic acid bacteria and / or treated product as an active ingredient, but may contain one kind of lactic acid bacteria and / or treated product, or a plurality of different lactic acid bacteria.
  • a body and / or a processed product, and a plurality of processed lactic acid bacteria processed differently may be included in combination.
  • composition of the present invention includes additives, other known drugs, and nutritional supplements described below, unless the target function or action is inhibited. You may add an agent etc. individually or in combination of two or more.
  • composition of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include tablets, capsules, granules, powders, powders, syrups, dry syrups, liquids, suspensions, inhalants and other oral preparations, suppositories, and the like. It is good also as dosage forms, such as an enteral formulation, a drip, an injection. Of these, oral preparations are preferred. Liquid preparations such as liquids and suspensions may be dissolved or suspended in water or other appropriate medium immediately before taking. In the case of tablets and granules, the preparations may be prepared by well-known methods. The surface may be coated. Furthermore, the composition of the present invention may be a controlled release formulation such as sustained release formulation, delayed release formulation or immediate release formulation using techniques known in the art.
  • Such a dosage form composition comprises the above-mentioned components, commonly used excipients, disintegrants, binders, wetting agents, stabilizers, buffers, lubricants, preservatives, surfactants, sweeteners.
  • Additives such as flavoring agents, fragrances, acidulants, and coloring agents can be blended according to the dosage form, and can be produced according to conventional methods.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or additive can be blended.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water soluble dextran, water soluble dextrin , Sodium carboxymethyl starch, pectin, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, pharmaceutical additives
  • an artificial cell structure such as a liposome can be used.
  • the content of lactic acid bacteria and / or treated products as active ingredients varies depending on the dosage form, but the amount of lactic acid bacteria is usually Is in the range of 0.0001 to 99% by mass, preferably 0.001 to 80% by mass, more preferably 0.001 to 75% by mass, and the dosage per day can be controlled so that the desired intake of the active ingredient can be ingested. It is desirable to make it.
  • the number of lactic acid bacteria or treated products contained in the composition of the present invention is about 10 7 / g to about 10 12 / g (in the case of treated products, the number of lactic acid bacteria before treatment).
  • various additives and other various substances used in the production of pharmaceuticals, foods and drinks, and feeds may coexist in the composition of the present invention.
  • Such substances and additives include various fats and oils (for example, vegetable oils such as soybean oil, corn oil, safflower oil, olive oil, animal fats such as beef tallow and sardine oil), herbal medicines (eg royal jelly, carrots, etc.), Amino acids (eg, glutamine, cysteine, leucine, arginine, etc.), polyhydric alcohols (eg, ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, glycerin, sugar alcohols such as sorbitol, erythritol, xylitol, maltitol, mannitol, etc.), natural polymers (For example, gum arabic, agar, water-soluble corn fiber, gelatin, xanthan gum, casein, gluten or gluten hydrolyzate, lecithin, starch, dextrin, etc
  • the amount of these additives is appropriately determined according to the type of additive and the amount of intake to be desired, but the content of lactic acid bacteria and / or processed products as active ingredients varies depending on the dosage form.
  • the amount of lactic acid bacteria before the treatment is usually preferably 0.0001 to 99% by mass, preferably 0.001 to 80% by mass, more preferably 0.001 to 75% by mass. .
  • Subjects to be administered or ingested the composition of the present invention are vertebrates, specifically mammals such as humans, primates (monkeys, chimpanzees, etc.), livestock animals (bovines, horses, pigs, sheep, chickens, etc.). , Pet animals (dogs, cats, etc.), laboratory animals (mouse, rats, etc.), and reptiles and birds (chicks, etc.).
  • mammals such as humans, primates (monkeys, chimpanzees, etc.), livestock animals (bovines, horses, pigs, sheep, chickens, etc.).
  • Pet animals dogs (dogs, cats, etc.), laboratory animals (mouse, rats, etc.), and reptiles and birds (chicks, etc.).
  • Particularly preferred are subjects for which arthralgia is desired to be improved, such as human patients suffering from arthritis, middle-aged people (human subjects over 40 years old) having cartilage wear due to aging.
  • Administration or intake of the composition of the present invention varies depending on the age and weight of the subject, administration / intake route, administration / intake frequency, administration purpose (acceleration of cartilage regeneration, promotion of type 2 collagen synthesis, improvement of joint pain, etc.), Various modifications can be made at the discretion of a person skilled in the art so as to achieve the intended action.
  • the lactic acid bacteria and / or processed product contained in the composition is usually about 10 6 to about 10 12 per kg body weight as the amount of lactic acid bacteria, preferably It is desirable to administer about 10 7 to about 10 11 .
  • the content ratio of the lactic acid bacteria and / or the processed product is not particularly limited, and may be appropriately adjusted according to the ease of production, the preferable daily dose, and the like. Since the composition of the present invention is highly safe, the intake can be further increased.
  • the daily intake may be taken once, but may be taken in several divided doses.
  • the frequency of administration or ingestion is not particularly limited, and various conditions such as administration / intake route, age and weight of the subject, and desired effects (acceleration of cartilage regeneration, promotion of type 2 collagen synthesis, improvement of arthritis, etc.) It is possible to select appropriately according to the situation.
  • the administration / intake route of the composition of the present invention is not particularly limited, and includes oral administration or ingestion, parenteral administration (eg, rectal, subcutaneous, intramuscular, intravenous administration) and the like.
  • the composition of the present invention is particularly preferably administered or ingested orally.
  • the composition of the present invention improves cartilage regeneration, promotes type 2 collagen synthesis, and can effectively cope with joint pain in particular. Specifically, compared to controls not administered the composition of the present invention (lactic acid bacteria and / or processed product thereof), promotes type 2 collagen synthesis in the subject, suppresses inflammation, and improves joint pain To do. Therefore, the composition of the present invention has an effect of improving joint pain in subjects, particularly human patients suffering from arthritis, and middle-aged people (human subjects over 40 years old) who have cartilage wear due to aging.
  • composition of the present invention may be used in combination with other medicines, treatment or prevention methods.
  • Such other medicaments may form one preparation with the composition of the present invention, or may be administered in separate preparations at the same time or at intervals.
  • the composition of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for promoting cartilage regeneration, promoting type 2 collagen synthesis, improving joint pain, and the like.
  • the composition of the present invention is highly safe and easy to take for a long time. Therefore, the composition of this invention can be used also for food-drinks, a nutritional supplement, and feed.
  • the composition of the present invention has the functions or activities as described above, and contains lactic acid bacteria having a dietary experience, and has high safety. Furthermore, since it does not inhibit the flavor of the food and drink itself even if added to various foods and drinks, it can be added to various foods and drinks and continuously consumed, and the intended function or action is expected to be exhibited.
  • the food and drink of the present invention contains the above-described composition of the present invention.
  • drinks are also included in the food and drink.
  • the food and drink containing the composition of the present invention includes functional foods and drinks (nutritional supplements, foods for specified health use, etc.) that promote health through functions and activities such as promotion of cartilage regeneration, promotion of type 2 collagen synthesis, and improvement of joint pain.
  • functional foods and drinks nutritional supplements, foods for specified health use, etc.
  • functions and activities such as promotion of cartilage regeneration, promotion of type 2 collagen synthesis, and improvement of joint pain.
  • all foods and beverages that can be formulated with the composition of the present invention are included.
  • the “functional food / beverage” of the present invention means a food / beverage having a certain functionality with respect to a living body, for example, a health functional food / beverage including a specific health food and a nutritional functional food, a functional indication food, a special food So-called health foods and drinks such as foods, nutritional supplements, health supplements and foods, supplements (for example, various dosage forms such as tablets, coated tablets, dragees, capsules and liquids) and beauty foods and drinks (for example, diet foods and drinks) Includes all.
  • the functional food / beverage products of the present invention also include health food / beverage products to which health claims based on the food standards of Codex (FAO / WHO Joint Food Standards Committee) are applied.
  • foods and drinks include liquid foods such as tube enteral nutrients, healthy foods and drinks in the form of preparations such as tablet confections, tablets, chewable tablets, tablets, powders, powders, capsules, granules and drinks, and Nutritional supplement food and drink; tea beverages such as green tea, oolong tea and black tea, soft drinks, jelly drinks, sports drinks, milk drinks, carbonated drinks, vegetable drinks, fruit juice drinks, fermented vegetable drinks, fermented fruit drinks, fermented milk drinks (yogurt, etc.) ), Lactic acid bacteria beverages, milk beverages (coffee milk, fruit milk, etc.), powdered beverages (milk powder, etc.), cocoa beverages, milk and beverages such as purified water; spreads such as butter, jam, sprinkles and margarine; mayonnaise, shortening, Custard cream, dressing, bread, cooked rice, noodles, pasta, miso soup, tofu, yogurt, baby food, soup or Sauces, confectionery products (for example, biscuits and cookies such, chocolate, candy, cake, ice cream,
  • the food and drink according to the present invention include other food materials, various nutrients, various vitamins, minerals, dietary fiber, and various additives (for example, taste ingredients, sweet tastes) used in the production of the food and drink.
  • various additives for example, taste ingredients, sweet tastes
  • sour agents such as organic acids, stabilizers, flavors
  • the blending amount of lactic acid bacteria which are active ingredients and / or processed products thereof can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the form of the food / beverage products and the required taste or texture.
  • the total amount of lactic acid bacteria and / or processed product in the composition to be added is 0.0001 to 99% by mass, preferably 0.001 to 80% by mass, more preferably 0.001 to 75% by mass as the amount of lactic acid bacteria.
  • the blending amount is as follows. Since the composition of the present invention is highly safe, the blending amount in food and drink can be further increased. It is preferable that the daily intake can be controlled so that the desired intake can be eaten and consumed. Thus, by eating and drinking the food and drink of the present invention in a form that can control the desired intake of the composition of the present invention, the method of promoting cartilage regeneration, promoting type 2 collagen synthesis, and improving joint pain using the food and drink Is provided.
  • the composition of the present invention may be contained in a food or drink by any appropriate method available to those skilled in the art. For example, after preparing the composition of this invention in the liquid form, the gel form, the solid form, the powder form, or the granular form, it can be mix
  • the composition of the present invention may be applied, coated, penetrated or sprayed on food and drink.
  • the composition of this invention may be disperse
  • the composition of the present invention may be wrapped with an edible film or an edible coating agent.
  • composition of this invention after adding a suitable excipient
  • the food / beverage products containing the composition of the present invention may be further processed, and such processed products are also included in the scope of the present invention.
  • the food and drink of the present invention have a useful effect and are highly safe and have no side effects.
  • the composition of the present invention has a good flavor, and even when added to various foods and drinks, it does not inhibit the taste of the food or drink. Useful effects are expected.
  • composition of the present invention can be blended not only in foods and drinks for humans, but also in animal feeds for livestock (cattle, pigs, chickens, etc.), racehorses, pets (dogs, cats, etc.). Since the feed is almost the same as the food and drink except that the subject is other than a human, the above description regarding the food and drink can be applied to the feed as well.
  • C2C / CPII type 2 collagen degradation / synthesis ratio
  • JKOM knee osteoarthritis patient function evaluation scale
  • Example 1 ⁇ Preparation of test beverage> Lactobacillus gasseri CP2305 strain and Lactobacillus helveticus were used to ferment skim milk powder and yeast extract at 32-37 ° C for 12-22 hours, and then the resulting fermented milk was liquid sugar, sweetener, acidulant , Formulated and sterilized with stabilizers and fragrances.
  • the placebo was prepared and sterilized in the same manner as described above using milk fermented under the same conditions using Lactobacillus helveticus without using CP2305 strain. 200 ml of a sterilizing solution was filled in a paper container to obtain a test beverage and a placebo beverage.
  • Example 2 ⁇ Human drinking test> Divided into 2 groups for 34 middle-aged and elderly people (40-90s), test beverages containing 10 or 10 Lactobacillus gasseri CP2305 strains, or placebo beverages not containing CP2305 strains 1 dose per day for 12 weeks.
  • FIG. 1 plots the change with respect to the initial number of monocytes, and the regression line was obtained by the least square method.
  • FIG. 2 shows changes in gamma globulin with respect to drinking time (weeks).
  • FIG. 3 plots the change of the degradation / synthesis ratio (C2C / CPII) index of type 2 collagen with respect to the initial value, and the regression line was obtained by the least square method.
  • the score value using the knee osteoarthritis patient function evaluation scale (JKOM) was also confirmed to decrease in the CP2305 strain drinking group (FIG. 4).
  • FIG. 4 plots changes with respect to the initial value of JKOM, and obtains a regression line by the method of least squares. From these results, it was shown that there was an improvement effect on the joint pain of the subject, especially the middle-aged elderly.
  • Example 3 ⁇ Human drinking test> (Promoting collagen synthesis) A test was conducted on 18 elderly people (70 to 90 years old) in the same manner as in Example 2, and changes in the collagen synthesis index CPII before and after drinking were confirmed.

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Abstract

本発明は、軟骨再生を促進するための手段及び方法に関する。具体的には、本発明は、乳酸菌及び／又はその処理物を有効成分として含有する軟骨再生促進用組成物及び2型コラーゲン合成促進用組成物に関する。

Description

軟骨再生促進用組成物
　本発明は、軟骨再生を促進するための手段及び方法に関する。具体的には、本発明は、乳酸菌及び／又はその処理物を有効成分として含有する軟骨再生促進用組成物及び2型コラーゲン合成促進用組成物に関する。
　近年、栄養バランスの偏り、運動量の低下、加齢に伴う筋力の低下や関節の炎症等により、ロコモティブ・シンドロームが増加している。ロコモティブ・シンドロームの重篤化から要介護になるリスクは高く、運動器症候群の予防や早期発見・治療が重要視されている。これらの主要な疾患として変形性関節症及び関節リウマチが挙げられる。これらは関節軟骨の炎症や関節滑膜の免疫異常に起因しており、炎症や関節破壊の制御により治療が行われる。しかしながら、従来の抗炎症剤であるステロイド製剤や非ステロイド性消炎鎮痛剤は、副腎機能不全や消化管炎症等の副作用が大きな問題となっている。
　乳酸菌を使用して主に皮膚に局在する1型コラーゲンの産生を促進すること、抗炎症作用を有する乳酸菌が存在すること、炎症によってコラーゲン分解が促進されることは先行技術として知られている。しかし、主に軟骨に局在する2型コラーゲンの合成促進や、1型又は2型コラーゲンの合成・分解比の改善については報告がない。
　具体的には、特許文献１には、乳酸菌（ラクトバチルス・プランタラム）投与によるコラーゲンの産生促進が記載されている。特許文献１は、ヒト培養細胞に乳酸菌を加えて1型コラーゲン産生促進がin vitroで示されている。
　特許文献２にはラクトバチルス・ガセリCP2305株を含む乳酸菌の破砕物による自己免疫抑制又は炎症抑制を機序とした関節炎抑制と、それによる痛み改善が記載されている。
　特許文献３にはラクトバチルス・ガセリCP2305株が迷走神経活性化効果を有することが記載されている。
特開2015-96476号公報 特開2012-158568号公報 特開2012-17282号公報
　本発明の目的は、特に関節痛を患う患者において、軟骨再生を促進するための有効な手段及び方法を提供することである。また本発明の目的は、特に関節痛を患う患者において、2型コラーゲン合成を促進するための手段及び方法を提供することである。
　本発明者は上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ラクトバチルス属に属する乳酸菌、特にラクトバチルス・ガセリを投与することにより、対象において軟骨再生を促進し、関節痛を改善することを見出した。具体的には、乳酸菌の投与が、2型コラーゲンの分解よりも高い2型コラーゲン合成を促進し、関節痛の炎症、痛み及びこわばりを軽減するという知見を得た。
　本発明は、限定されるものではないが、以下を包含する：
[1] ラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又はその処理物を有効成分として含有する軟骨再生促進用組成物。
[2] ラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又はその処理物を有効成分として含有する2型コラーゲン合成促進用組成物。
[3] 軟骨再生促進又は2型コラーゲン合成促進が、コラーゲン分解/合成比（C2C/CPII）の低下により示される、[1]又は[2]に記載の組成物。
[4] 乳酸菌がラクトバチルス・ガセリである、[1]～[3]のいずれかに記載の組成物。
[5] 乳酸菌が、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（受託番号FERM BP-11331）若しくはその変異株、又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（受託番号NITE BP-1405）若しくはその変異株である、[1]～[4]のいずれかに記載の組成物。
[5-1] 乳酸菌が死菌体である、[1]～[5]のいずれかに記載の組成物。
[6] 関節痛改善に使用するための、[1]～[5]のいずれかに記載の組成物。
[6-1] 投与対象が関節痛を患うヒト患者又は40歳以上のヒト対象である、[1]～[6]のいずれかに記載の組成物。
[7] 組成物が、飲食品、飼料、栄養補助剤及び医薬からなる群より選択される、[1]～[6]のいずれかに記載の組成物。
[8] 飲食品が、発酵乳飲料、ヨーグルト、粉ミルク、ベビーフード、味噌汁、レトルト食品及びタブレットを含む、[7]に記載の組成物。
[9] ラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又はその処理物を対象に投与するステップを含む、対象において軟骨再生を促進する方法。
[9-1] 上記乳酸菌及び／又はその処理物を投与していない対照と比較して、上記対象における軟骨再生を促進させる、[9]に記載の方法。
[10] ラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又はその処理物を対象に投与するステップを含む、対象において2型コラーゲン合成を促進する方法。
[10-1] 上記乳酸菌及び／又はその処理物を投与していない対照と比較して、上記対象における2型コラーゲン合成を促進させる、[10]に記載の方法。
[11] ラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又はその処理物を対象に投与し、対象において軟骨再生を促進するステップを含む、対象の軟骨再生を促進する方法。
[12] ラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又はその処理物を対象に投与し、対象において2型コラーゲン合成を促進するステップを含む、対象の2型コラーゲン合成を促進する方法。
[13] 軟骨再生の促進に使用するためのラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又はその処理物。
[14] 2型コラーゲン合成の促進に使用するためのラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又はその処理物。
　本発明により、軟骨再生促進用組成物及び2型コラーゲン合成促進用組成物が提供される。本発明の組成物は、特に中高齢者や関節痛を患う対象において関節痛を改善するために有効である。また、有効成分である乳酸菌は安全かつ安価であり、飲食品や栄養補助剤として容易に摂取することができる。
乳酸菌による単球の改善効果を示すグラフである。 乳酸菌によるγグロブリンの改善効果を示すグラフである。 乳酸菌による2型コラーゲンの分解/合成比（C2C/CPII）の改善効果を示すグラフである。 乳酸菌による変形性膝関節症患者機能評価尺度（JKOM）の改善効果を示すグラフである。 乳酸菌によるコラーゲン合成指標（CPII）の改善効果を示すグラフである。
　本発明は、乳酸菌の投与によって、軟骨再生を促進し、又は2型コラーゲン合成を促進し、また関節痛の炎症、痛み及びこわばりを軽減することができ、関節痛を改善することができるという知見に基づいている。具体的には、中高齢者（40～90歳代）を対象として、乳酸菌（ラクトバチルス・ガセリCP2305株）を投与した結果、プラセボと比較して2型コラーゲンの合成促進効果及び関節痛改善効果が認められ、乳酸菌の軟骨再生促進効果及び関節痛改善効果を確認したことに基づいている。
　したがって、本発明は、乳酸菌及び／又はその処理物を有効成分として含有する軟骨再生促進用組成物及び2型コラーゲン合成促進用組成物に関する。また本発明は、乳酸菌及び／又はその処理物を対象に投与するステップを含む、対象において軟骨再生を促進する方法、並びに対象において2型コラーゲン合成を促進する方法に関する。
　本発明において使用する乳酸菌とは、発酵によって糖類から乳酸を産生する細菌であり、特にラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する細菌が含まれる。本発明においては、乳酸菌の菌体又はその処理物が以下に具体的に記載する目的の機能又は活性を示すものであれば、当技術分野で公知の乳酸菌株を使用することができる。なお、動物への投与・摂取を考慮して、動物において安全性が確認されている菌株であることが好ましい。
　乳酸菌のより具体的な種としては、ラクトバチルス属に属する細菌として、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ガリナーラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・デルブルッキ　サブスピーシーズ　ブルガリカス、及びラクトバチルス・ジョンソニーなどがある。
　一実施形態において、本発明に関して目的の機能又は活性とは、対象において軟骨再生を促進する作用を意味する。また別の実施形態において、目的の機能又は活性とは、2型コラーゲン合成を促進する作用を意味する。軟骨再生の促進には、2型コラーゲン合成の促進、2型コラーゲン分解の抑制、及びその両者が含まれる。また2型コラーゲン合成及び2型コラーゲン分解は、当技術分野で公知の方法により測定することができる。
　本発明の特定の実施形態において、目的の機能又は活性とは、関節痛の改善作用を意味する。関節痛の改善とは、関節痛の炎症の軽減、関節痛の痛みやこわばりの軽減、（軟骨再生による）関節痛の原因の除去を意味し、関節痛が完全になくなることだけではなく、処理前と比べて軽減していることを包含する。炎症の軽減は、例えば炎症の指標である血液の単球やγグロブリンの低下により判定することができる。関節痛の痛み及びこわばりは、例えば変形性膝関節症患者機能評価尺度（JKOM：Japanese Knee Osteoarthritis Measure）により評価することができる。関節痛の原因の除去は、上述したような軟骨再生の促進、2型コラーゲン合成の促進、2型コラーゲン分解の抑制を測定することによって判定することができる。
　乳酸菌の菌体又はその処理物が目的の機能又は活性を有するか否かは、ラクトバチルス属に属する乳酸菌の菌体又はその処理物を、実験動物又は被験ボランティアなどに投与し、投与前後の軟骨再生状態、2型コラーゲン合成、2型コラーゲン分解、関節痛の改善などを確認することによって評価することができる。
　本発明においては、上述したような方法により菌体又は処理物が目的の機能又は活性を有すると評価された乳酸菌であれば、任意の乳酸菌を用いることができる。そのような機能又は活性を有する好ましい乳酸菌としては、ラクトバチルス・ガセリCP2305株及びラクトバチルス・ガセリCP2305s株が挙げられる。なお、ラクトバチルス・ガセリCP2305株は、本出願人により、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約の規定に基づく国際寄託当局である独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6）に、2007年9月11日付で受託番号FERM BP-11331として国際寄託されている。なお、この株は、現在、国際寄託当局である独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に移されて保管されている。またラクトバチルス・ガセリCP2305s株は、本出願人により、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約の規定に基づく国際寄託当局である独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に、2012年8月14日付で受託番号NITE BP-1405として国際寄託されている。
　本発明においては、上述した具体的な菌株の変異株も、目的の機能又は活性を有する限り使用することができる。例えば、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株はラクトバチルス・ガセリCP2305株から得られた変異株であり、CP2305株及びCP2305s株の変異株は同様に目的の機能又は活性を有している蓋然性が高く、そのような変異株も本発明において使用することができる。
　本発明において、「変異株」とは、親株から得られた任意の株を意味する。具体的には、親株から自然突然変異や化学的若しくは物理的変異原による誘発変異によって人工的に突然変異の頻度を高める方法、又は特異的な突然変異誘発技術（例えば、遺伝子組換え）により得られる株を意味する。こうした方法により生じた微生物個体を、選別、分離を繰り返し、有用な微生物個体を育種することにより、目的の機能又は活性を有する変異株を得ることができる。
　例えば、ラクトバチルス・ガセリCP2305株又はCP2305s株に由来する変異株は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法による乳酸菌のゲノムDNAの増幅断片の分子量分布により、他の乳酸菌株と容易に識別することができる。簡単に説明すると、目的とする乳酸菌について、DNA試料を調製し、特徴的な配列（例えば16S rDNA塩基配列）を有するプライマーを用いたPCR法により遺伝子増幅を行い、得られた断片の電気泳動パターンを分析することにより、CP2305株又はCP2305s株に由来する変異株であるか否かを判定することができる。ただし、変異株であるか否かを確認する方法はこの方法に限定されるものではなく、菌学的性質などの当技術分野で公知の手法により変異株であるかどうかを確認することができる。
　乳酸菌は、乳酸菌の培養に通常用いられる培地を使用して、適当な条件下で培養することにより調製することができる。培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、乳酸菌の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよく、当業者であれば使用する菌株に適切な公知の培地を適宜選ぶことができる。炭素源としてはラクトース、グルコース、スクロース、フラクトース、ガラクトース、廃糖蜜などを使用することができ、窒素源としてはカゼインの加水分解物、ホエータンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物を使用することができる。また無機塩類としては、リン酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどを用いることができる。乳酸菌の培養に適した培地としては、例えばMRS液体培地、GAM培地、BL培地、Briggs Liver Broth、獣乳、脱脂乳、乳性ホエーなどが挙げられる。好ましくは、滅菌されたMRS培地を使用することができる。
　また乳酸菌の培養は、20℃から50℃、好ましくは25℃から42℃、より好ましくは約37℃において、嫌気条件下で行う。温度条件は、恒温槽、マントルヒーター、ジャケットなどにより調整することができる。また、嫌気条件下とは、乳酸菌が増殖可能な程度の低酸素環境下のことであり、例えば嫌気チャンバー、嫌気ボックス又は脱酸素剤を入れた密閉容器若しくは袋などを使用することにより、あるいは単に培養容器を密閉することにより、嫌気条件とすることができる。培養の形式は、静置培養、振とう培養、タンク培養などである。また、培養時間は3時間から96時間とすることができる。培養開始時の培地のpHは4.0～8.0に維持することが好ましい。
　乳酸菌の具体的な調製例を簡単に説明する。例えば乳酸菌としてラクトバチルス・ガセリCP2305株又はCP2305s株を用いる場合には、乳酸菌用培地（例えばMRS液体培地）、好ましくは食品グレードの乳酸菌用培地に乳酸菌を植菌し、約37℃で一晩（約18時間）かけて培養を行う。
　培養後、得られる乳酸菌培養物をそのまま使用してもよいし、さらに必要に応じて遠心分離などによる粗精製及び／又は濾過等による固液分離や滅菌操作を行ってもよい。なお、本発明において使用する乳酸菌は、生菌体であっても又は死菌体であってもよいし、湿潤菌体であっても又は乾燥菌体であってもよい。好ましくは、乳酸菌の死菌体を使用する。
　また、目的の機能又は活性を有する限り、乳酸菌の菌体に処理を行って得られる乳酸菌の処理物を用いてもよいし、また乳酸菌の処理物にさらなる処理を行ってもよい。そのような処理の例を以下に記載する。
　乳酸菌の菌体及び／又は処理物を適当な溶媒に懸濁又は希釈することによって、懸濁物又は希釈物として調製することができる。使用することができる溶媒としては、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などが挙げられる。
　乳酸菌の菌体及び／又は処理物を用いて生乳、脱脂粉乳又は豆乳を発酵することにより、発酵産物を調製することができる。例えば、乳酸菌又は他の処理を行った乳酸菌を、生乳、脱脂粉乳又は豆乳などに接種し、当技術分野で公知の乳酸菌発酵条件（上述した乳酸菌培養の条件とほぼ同じである）にて発酵を行う。得られる発酵産物は、そのまま使用してもよいし、又は濾過、滅菌、希釈、濃縮などの他の処理を行ってもよい。
　乳酸菌の菌体及び／又は処理物を滅菌処理によって、滅菌処理物として調製することができる。乳酸菌の菌体及び／又は処理物を滅菌処理するには、例えば、濾過滅菌、放射性殺菌、加熱式殺菌、加圧式殺菌などの公知の滅菌処理を行うことができる。
　また、乳酸菌の菌体及び／又は処理物を加熱処理することにより、加熱処理物として調製することができる。加熱処理物を調製するには、乳酸菌の菌体及び／又は処理物を、一定時間、例えば約10分～1時間（例えば約10～20分）にわたり、高温処理（例えば80～150℃）する。
　乳酸菌の菌体及び／又は処理物を破砕、細砕又は磨砕することによって、破砕物、無細胞抽出物を調製することができる。例えばそのような破砕は、物理的破砕（撹拌、フィルター濾過など）、酵素溶解処理、薬品処理、あるいは自己溶解処理などによって行うことができる。
　乳酸菌の菌体及び／又は処理物を、適当な水性溶媒又は有機溶媒を用いて抽出することによって、抽出物を得ることができる。抽出方法としては、水性溶媒又は有機溶媒を抽出溶媒として用いる抽出方法であれば特に制限されないが、上記の乳酸菌又は乳酸菌に他の処理を行った処理物を、水性又は有機溶媒（例えば水、メタノール、エタノールなど）中に浸漬、攪拌又は還流する方法など公知の方法を挙げることができる。
　また、乳酸菌の菌体及び／又は処理物を乾燥して粉状物（粉末）又は粒状物とすることができる。具体的な乾燥方法としては、特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、ドラム乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などが挙げられ、これらを単独で又は組み合わせて採用できる。その際、必要に応じて通常用いられる賦形剤を添加してもよい。
　さらに、乳酸菌の菌体及び／又は処理物から、公知の分離・精製法を用いて、目的の機能又は活性を有する成分又は画分を精製してもよい。そのような分離・精製法としては、塩沈殿及び有機溶媒沈殿などの溶解性を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、アフィニティクロマトグラフィーのような特異的結合を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどの疎水性を利用する方法などが挙げられ、これらの方法の1種を、又は2種以上を組み合わせて使用することができる。
　上述した処理は、単一の処理を行ってもよいし、あるいは複数を適宜組み合わせて行ってもよい。本発明においては、このような処理物も本発明の組成物に用いることができる。
　上記で得られた乳酸菌の菌体及び／又は処理物は、単独で又は他の成分と共に、本発明の組成物として又は飲食品、飼料、栄養補助剤若しくは医薬組成物に配合して継続的に摂取すると、軟骨再生促進効果及び／又は2型コラーゲン合成促進効果と、それによる関節痛改善の効果が期待される。
　本発明の組成物は、有効成分として上述した乳酸菌の菌体及び／又は処理物を含むものであるが、1種の乳酸菌の菌体及び／又は処理物を含んでもよいし、複数の異なる乳酸菌の菌体及び／又は処理物、さらには異なる処理を行った複数の乳酸菌処理物を組み合わせて含んでもよい。
　また本発明の組成物には、有効成分である乳酸菌の菌体及び／又は処理物に加えて、目的とする機能又は作用を阻害しない限り、後述する添加剤、他の公知の薬剤、栄養補助剤などを単独又は複数組み合わせて添加してもよい。
　本発明の組成物の形態は特に制限されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤、吸入剤などの経口剤、坐剤などの経腸製剤、点滴剤、注射剤などの剤型としてもよい。これらのうちでは、経口剤とするのが好ましい。なお、液剤、懸濁剤などの液体製剤は、服用直前に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよく、また錠剤、顆粒剤の場合には周知の方法でその表面をコーティングしてもよい。さらに、本発明の組成物は、当技術分野で公知の技術を使用して、徐放性製剤、遅延放出製剤又は即時放出製剤などの放出が制御された製剤としてもよい。
　このような剤型の組成物は、上述した成分に、通常用いられる賦形剤、崩壊剤、結合剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、滑沢剤、保存剤、界面活性剤、甘味料、矯味剤、芳香剤、酸味料、着色剤などの添加剤を剤型に応じて配合し、常法に従って製造することができる。例えば、本発明の組成物を医薬組成物とする場合には、薬学的に許容される担体又は添加剤を配合することができる。そのような薬学的に許容される担体及び添加物の例として、水、薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などの他、リポゾームなどの人工細胞構造物などが挙げられる。
　本発明の組成物が、上記添加剤や他の薬剤などを含む場合、有効成分である乳酸菌の菌体及び／又は処理物の含有量は、その剤型により異なるが、乳酸菌の量として、通常は、0.0001～99質量％、好ましくは0.001～80質量％、より好ましくは0.001～75質量％の範囲であり、有効成分の望ましい摂取量を摂取できるように、1日当たりの投与量が管理できる形にするのが望ましい。また、本発明の組成物に含まれる乳酸菌又は処理物は、約107個／g～約1012個／gである（処理物の場合には処理前の乳酸菌数）。
　本発明の組成物に添加又は配合することができる他の薬剤としては、限定されるものではないが、コンドロイチン、ビタミンB1、グルコサミン、ヒアルロン酸などが挙げられる。
　さらに、本発明の組成物には、医薬、飲食品、飼料の製造に用いられる種々の添加剤やその他種々の物質を共存させてもよい。このような物質や添加剤としては、各種油脂（例えば、大豆油、コーン油、サフラワー油、オリーブ油などの植物油、牛脂、イワシ油などの動物油脂）、生薬（例えばロイヤルゼリー、人参など）、アミノ酸（例えばグルタミン、システイン、ロイシン、アルギニンなど）、多価アルコール（例えばエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、糖アルコール、例としてソルビトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、マンニトールなど）、天然高分子（例えばアラビアガム、寒天、水溶性コーンファイバー、ゼラチン、キサンタンガム、カゼイン、グルテン又はグルテン加水分解物、レシチン、澱粉、デキストリンなど）、ビタミン（例えばビタミンC、ビタミンB群など）、ミネラル（例えばカルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄など）、食物繊維（例えばマンナン、ペクチン、ヘミセルロースなど）、界面活性剤（例えばグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルなど）、精製水、賦形剤（例えばブドウ糖、コーンスターチ、乳糖、デキストリンなど）、安定剤、pH調製剤、酸化防止剤、甘味料、呈味成分、酸味料、着色料及び香料などが挙げられる。
　これら添加剤の配合量は、添加剤の種類と所望すべき摂取量に応じて適宜決められるが、有効成分である乳酸菌の菌体及び／又は処理物の含有量は、その剤型により異なるが、処理物の場合には処理前の乳酸菌の量として、通常は、0.0001～99質量％、好ましくは0.001～80質量％、より好ましくは0.001～75質量％の範囲となるよう配合することが望ましい。
　本発明の組成物を投与又は摂取する対象は、脊椎動物、具体的には、哺乳動物、例えばヒト、霊長類（サル、チンパンジーなど）、家畜動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ニワトリなど）、ペット用動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラットなど）、さらには爬虫類及び鳥類（ニワトリなど）である。特に、関節痛の改善が望まれる対象、例えば関節炎を患うヒト患者、老化による軟骨摩耗を有する中高齢者（40歳以上のヒト対象）が好ましい。
　本発明の組成物の投与又は摂取量は、対象の年齢及び体重、投与・摂取経路、投与・摂取回数、投与目的（軟骨再生促進、2型コラーゲン合成促進、関節痛改善等）などにより異なり、目的とする作用を達成できるように当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。例えば、経口的に投与又は摂取する場合には、組成物に含まれる乳酸菌の菌体及び／又は処理物を、乳酸菌の量として、体重1kgあたり、通常約106個～約1012個、好ましくは約107個～約1011個投与することが望ましい。乳酸菌の菌体及び／又は処理物の含有割合は特に限定されず、製造の容易性や好ましい一日投与量等に合わせて適宜調節すればよい。本発明の組成物は安全性の高いものであるため、摂取量をさらに増やすこともできる。1日当たりの摂取量は、1回で摂取してもよいが、数回に分けて摂取してもよい。また、その投与又は摂取の頻度も、特に限定されず、投与・摂取経路、対象の年齢及び体重、目的とする効果（軟骨再生促進、2型コラーゲン合成促進、関節炎の改善等）の種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。
　本発明の組成物の投与・摂取経路は特に限定されず、経口投与若しくは摂取、又は非経口投与（例えば直腸内、皮下、筋肉内、静脈内投与）などが挙げられる。本発明の組成物は、特に経口的に投与又は摂取することが好ましい。
　本発明の組成物は、軟骨再生を改善し、2型コラーゲン合成を促進し、特に関節痛に対して効果的に対処することができる。具体的には、本発明の組成物（乳酸菌及び／又はその処理物）を投与していない対照と比較して、対象における2型コラーゲン合成を促進し、炎症を抑制し、また関節痛を改善する。そのため、本発明の組成物は、対象、特に関節炎を患うヒト患者、老化による軟骨摩耗を有する中高齢者（40歳以上のヒト対象）において、関節痛を改善する効果がある。
　本発明の組成物は、他の医薬、治療又は予防法等と併用してもよい。このような他の医薬は、本発明の組成物と共に一製剤を成していてもよいし、また、別々の製剤であって同時に又は間隔を空けて投与してもよい。
　上述したように、本発明の組成物は、医薬組成物として、軟骨再生の促進、2型コラーゲン合成の促進、関節痛の改善などに使用することができる。
　また、本発明の組成物は、安全性が高く長期間の継続的摂取が容易である。そのため、本発明の組成物は、飲食品、栄養補助剤及び飼料にも使用できる。本発明の組成物は、上述したような機能又は活性を有するうえ、食経験のある乳酸菌を含むものであり、安全性が高い。さらに、様々な飲食品に添加しても飲食品自体の風味を阻害しないため、種々の飲食品に添加して継続的に摂取することができ、目的の機能又は作用の発揮が期待される。
　本発明の飲食品は、上述した本発明の組成物を含有する。本発明において、飲食品には飲料も包含される。本発明の組成物を含有する飲食品には、軟骨再生促進、2型コラーゲン合成促進、関節痛改善などの機能・活性により健康増進を図る機能性飲食品（栄養補助剤、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等）などの他、本発明の組成物を配合できる、全ての飲食品が含まれる。
　本発明の組成物を含有する飲食品として、機能性飲食品はとりわけ好ましい。本発明の「機能性飲食品」は、生体に対して一定の機能性を有する飲食品を意味し、例えば、特定保健用食品及び栄養機能食品を含む保健機能飲食品、機能性表示食品、特別用途食品、栄養補助剤、健康補助飲食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤などの各種剤形のもの）及び美容飲食品（例えばダイエット飲食品）などのいわゆる健康飲食品全般を包含する。本発明の機能性飲食品はまた、コーデックス（FAO/WHO合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Health claim）が適用される健康飲食品を包含する。
　飲食品の具体例としては、経管経腸栄養剤などの流動食、錠菓、錠剤、チュアブル錠、錠剤、粉剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤及びドリンク剤などの製剤形態の健康飲食品及び栄養補助飲食品；緑茶、ウーロン茶及び紅茶などの茶飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、スポーツ飲料、乳飲料、炭酸飲料、野菜飲料、果汁飲料、醗酵野菜飲料、醗酵果汁飲料、発酵乳飲料（ヨーグルトなど）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳など）、粉末飲料（粉ミルクなど）、ココア飲料、牛乳並びに精製水などの飲料；バター、ジャム、ふりかけ及びマーガリンなどのスプレッド類；マヨネーズ、ショートニング、カスタードクリーム、ドレッシング類、パン類、米飯類、麺類、パスタ、味噌汁、豆腐、ヨーグルト、ベビーフード、スープ又はソース類、菓子（例えば、ビスケットやクッキー類、チョコレート、キャンディ、ケーキ、アイスクリーム、チューインガム、タブレット）などが挙げられる。
　本発明の飲食品は、上記の有効成分のほかに、その飲食品の製造に用いられる他の食品素材、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、食物繊維、種々の添加剤（例えば呈味成分、甘味料、有機酸などの酸味料、安定剤、フレーバー）などを配合して、常法に従って製造することができる。
　本発明の飲食品において、有効成分である乳酸菌及び／又はその処理物の配合量は、飲食品の形態や求められる食味又は食感を考慮して、当業者が適宜定めることができる。通常は、添加される組成物中の乳酸菌の菌体及び／又は処理物の総量が、乳酸菌の量として、0.0001～99質量％、好ましくは0.001～80質量％、より好ましくは0.001～75質量％となるような配合量が適当である。本発明の組成物は安全性の高いものであるため、飲食品におけるその配合量をさらに増やすこともできる。望ましい摂取量を飲食できるよう、1日当たりの摂取量が管理できる形にするのが好ましい。このように本発明の飲食品を、本発明の組成物の望ましい摂取量を管理できる形態で飲食することにより、該飲食品を用いた軟骨再生促進、2型コラーゲン合成促進、関節痛改善の方法が提供される。
　本発明の組成物は、当業者が利用可能である任意の適切な方法によって、飲食品に含有させればよい。例えば、本発明の組成物を、液体状、ゲル状、固体状、粉末状又は顆粒状に調製した後、それを飲食品に配合することができる。あるいは本発明の組成物を、飲食品の原料中に直接混合又は溶解してもよい。本発明の組成物は、飲食品に塗布、被覆、浸透又は吹き付けてもよい。本発明の組成物は、飲食品中に均一に分散させてもよいし、偏在させてもよい。本発明の組成物を入れたカプセルなどを調剤してもよい。本発明の組成物を、可食フィルムや食用コーティング剤などで包み込んでもよい。また本発明の組成物に適切な賦形剤等を加えた後、錠剤などの形状に成形してもよい。本発明の組成物を含有させた飲食品はさらに加工してもよく、そのような加工品も本発明の範囲に包含される。
　本発明の飲食品の製造においては、飲食品に慣用的に使用されるような各種添加物を使用してもよい。
　本発明の飲食品は、上述したとおり、有用な効果を奏する上に、安全性が高く副作用の心配がない。また、本発明の組成物は風味がよく、様々な飲食品に添加してもその飲食品の風味を阻害しないため、得られる飲食品は長期間の継続的摂取が容易であり、長期にわたってその有用な効果の発揮が期待される。
　さらに本発明の組成物は、ヒト用の飲食品のみならず、家畜（ウシ、ブタ、ニワトリなど）、競走馬、ペット（イヌ、ネコなど）の動物の飼料にも配合することができる。飼料は、対象がヒト以外であることを除き飲食品とほぼ等しいことから、上記の飲食品に関する記載は、飼料についても同様に当てはめることができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［試験例］
（１）乳酸菌の準備
　乳酸菌として、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（受託番号FERM BP-11331）及びラクトバチルス・ガセリCP2305s株（受託番号NITE BP-1405）を準備した。
（２）単球及びγグロブリンの測定
　対象から血液を採取し、フローサイトメトリー法にて単球数を測定した。血清を用いて免疫比濁法にてγグロブリン（免疫グロブリンIg-G、Ig-A、Ig-M）を測定した。
（３）2型コラーゲンの分解/合成比（C2C/CPII）の測定
　対象からの血清を用いて、C2C測定に関してはIBEX社の「Collagen Type II Cleavage Assay」を使用し、CPII測定に関してはUSCN社の「II型コラーゲンC末端プロペプチド（PIICP）酵素結合免疫吸着測定キット」を使用して、ELISAにて測定した。測定値の比をとりC2C/CPIIを算出した。
（４）変形性膝関節症患者機能評価尺度（JKOM）の測定
　対象が変形性膝関節症患者機能評価尺度（JKOM）質問紙に記入した結果を集計し測定した。
［実施例１］
＜試験飲料の調製＞
　ラクトバチルス・ガセリCP2305株及びラクトバチルス・ヘルベティカスを用いて、脱脂粉乳及び酵母エキスを、32～37℃にて12～22時間発酵した後、得られた発酵乳に液糖、甘味料、酸味料、安定剤、香料で調合・殺菌した。
　また、プラセボは、CP2305株を使用せずにラクトバチルス・ヘルベティカスを用いて同条件にて発酵した乳を用いて、上記と同様に調合・殺菌した。
　殺菌液を紙容器に200ml充填し、試験飲料及びプラセボ飲料とした。
［実施例２］
＜ヒト飲用試験＞
　中高齢者（40～90歳代）34名を対象として2群に分け、ラクトバチルス・ガセリCP2305株を含有した試験飲料（菌体量として1010個）、又はCP2305株を含まないプラセボ飲料を、1日1本で12週間にわたり投与した。
　その結果、CP2305株飲用群で、炎症の血液指標である単球、及びγグロブリンの減少が確認された（図１及び２）。2型コラーゲンの分解/合成比（C2C/CPII）の減少も確認され（図３）、これは2型コラーゲン合成が2型コラーゲン分解よりも促進されたことを示している。図１は、単球の初期数に対する変化をプロットし、回帰線を最小二乗法により求めた。図２は、飲用時間（週）に対するγグロブリンの変化を示している。図３は、2型コラーゲンの分解/合成比（C2C/CPII）指標の初期値に対する変化をプロットし、回帰線を最小二乗法により求めた。変形性膝関節症患者機能評価尺度（JKOM）を使用したスコア値もCP2305株飲用群で減少が確認された（図４）。図４は、JKOMの初期値に対する変化をプロットし、回帰線を最小二乗法により求めた。これらの結果から、対象、特に中高齢者の膝の関節痛に関して改善効果があることが示された。
［実施例３］
＜ヒト飲用試験＞（コラーゲン合成促進）
　高齢者（70歳～90歳）18名に対して実施例２と同様の方法で試験を実施し、コラーゲン合成指標CPIIの飲用前後の変化を確認した。
　その結果を図５に示す。CP2305株飲用群で、コラーゲン合成指標であるCPIIの減少抑制が確認された（図５）。よって、CP2305群は、プラセボ群と比較して、有意にコラーゲン合成を促進・維持する。
　受託番号FERM BP-11331（ラクトバチルス・ガセリCP2305株、2007年9月11日付寄託）
　受託番号NITE BP-1405（ラクトバチルス・ガセリCP2305S株、2012年8月14日付寄託） 

Claims (8)

  1. 　ラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又はその処理物を有効成分として含有する軟骨再生促進用組成物。
  2. 　ラクトバチルス属に属する乳酸菌及び／又はその処理物を有効成分として含有する2型コラーゲン合成促進用組成物。
  3. 　軟骨再生促進又は2型コラーゲン合成促進が、コラーゲン分解/合成比（C2C/CPII）の低下により示される、請求項1又は2に記載の組成物。
  4. 　乳酸菌がラクトバチルス・ガセリである、請求項1～3のいずれか1項に記載の組成物。
  5. 　乳酸菌が、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（受託番号FERM BP-11331）若しくはその変異株、又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（受託番号NITE BP-1405）若しくはその変異株である、請求項1～4のいずれか1項に記載の組成物。
  6. 　関節痛改善に使用するための、請求項1～5のいずれか1項に記載の組成物。
  7. 　組成物が、飲食品、栄養補助剤及び医薬からなる群より選択される、請求項1～6のいずれか1項に記載の組成物。
  8. 　飲食品が、発酵乳飲料、ヨーグルト、粉ミルク、ベビーフード、味噌汁、レトルト食品及びタブレットを含む、請求項7に記載の組成物。
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