WO2014077365A1 - 特定のラクトバチルス・ガセリ株又はその処理物を含有するストレス性腸障害の軽減剤 - Google Patents

特定のラクトバチルス・ガセリ株又はその処理物を含有するストレス性腸障害の軽減剤 Download PDF

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    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a reducing agent (or inhibitor) of hypersecretion of water in the intestinal tract of a subject, which contains a live cell or bactericidal cell of a specific Lactobacillus gasseri strain or a processed product thereof as an active ingredient, or a stress property.
  • the present invention relates to an agent for reducing (or suppressing) intestinal disorders, particularly stressful diarrhea symptoms.
  • the present invention also relates to a novel low-temperature resistant Lactobacillus gasseri strain and a method for producing the same.
  • the present invention further relates to a stress intestinal disorder alleviating agent (or inhibitor) comprising the low-temperature resistant Lactobacillus gasseri strain or a processed product thereof as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a food additive or animal feed additive, or a food or a pharmaceutical composition containing the above-described alleviating agent (or inhibitor).
  • JP 2009-102292 A includes Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei as an active ingredient, a cytokine production regulating action, A stress suppressor based on an infection-protecting action, fattening action or diarrhea-suppressing action is described.
  • stress suppression refers to alleviating symptoms such as loss of appetite, indigestion, insomnia, poor physical condition, and infection by suppressing nonspecific reactions in the body caused by stressors, which are external stimuli that cause stress. It is stated that you can.
  • JP 2009-100692 (Patent Document 2) and JP 2008-212140 (Patent Document 3) contain a lactobacillus microorganism having a stress-reducing action, and a lactic acid bacteria preparation for mammals It is described that, by administering a specific lactic acid bacterium to a mammal, it exhibits an excellent stress-reducing effect and can prevent and treat digestive diseases such as diarrhea caused by stress. .
  • Patent Document 4 describes a pharmaceutical preparation necessary for the prevention and / or treatment of gastrointestinal disorders in humans and animals, which is Lactobacillus casei rhamnosus having the deposit number NCIMB 40564 ( A pharmaceutical preparation is described, characterized in that it comprises a viable microbial strain of Lactobacillus casei ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ rhamnosus) LB21 in at least one pharmaceutically acceptable carrier medium in which the microorganism maintains its viability .
  • JP 2011-200211 A (Patent Document 5) describes an anti-ulcer agent containing Lactobacillus gasseri MCC1183 strain, which is used for the prevention or prevention of gastric ulcer or duodenal ulcer caused by Helicobacter pylori. It is described as being used for treatment.
  • JP-T 2009-511471 discloses at least one probiotic bacterium selected from lactic acid bacteria for the production of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of autoimmune diseases.
  • the use of (Probiotic bacteria) strains is described, and the autoimmunity may be multiple sclerosis (MS), allergy, psoriasis, rheumatoid arthritis, Crohn's disease, ulcerative colitis, I Lactobacillus plantarum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus plantarum, selected from the group consisting of organ-specific autoimmunity such as type 2 diabetes, inflammatory bowel disease, and systemic lupus erythematosus Rhamobasus (Lactobacillus rhamnosus), Lactobacillus fermentum (Lactobacillus fermentum), Lactobacillus paracasei, It is described as selected from the group consisting of finely Lactobac
  • Patent Document 7 discloses an inflammatory bowel disease and / or irritable bowel comprising Lactobacillus gasseri SBT2055 (referred to as LG2055) (FERM P-15535) or its fermentation product as an active ingredient. Syndrome prophylaxis and treatment agents are described. In general, psychological stress control is performed for the treatment of irritable bowel syndrome, and stages ranging from intestinal and laxatives to antipsychotics are applied according to symptoms. It is described that a typical drug treatment is given.
  • Non-patent Document 1 Daisuke Sawada et al., 13th Society of Intestinal Bacteriology (2009), Tokyo, Japan (Non-patent Document 1) improved the stress relieving action of Lactobacillus gasseri CP2305 strain by living cells, such as stress abdominal pain It is described.
  • Patent Document 8 JP-A 2003-95963 (Patent Document 8) describes a preventive and therapeutic agent for inflammatory bowel disease or irritable bowel syndrome caused by Lactobacillus gasseri cells or fermentation products thereof.
  • JP 2009-102292 JP 2009-100692 JP 2008-212140 A Japanese Patent No. 4350170 JP 2011-200211 Special table 2009-511471 Japanese Patent No.4853986 JP 2003-95963 A
  • Lactobacillus gasseri strain a kind of lactic acid bacteria
  • gastrointestinal disorders such as inflammatory bowel disease and irritable bowel syndrome.
  • gastrointestinal disorders also have a description for estimating the relationship with stress.
  • Lactobacillus gasseri strains significantly prevented, improved or treated gastrointestinal disorders, especially the effects of suppressing excessive water secretion and stress-related diarrhea, while suppressing excessive stress and maintaining normal intestinal motility normally.
  • a lactic acid bacterium having an action of reducing stress-induced intestinal disorders (cold-resistant).
  • Lactobacillus gasseri strains significantly improve stress diarrhea symptoms while maintaining excessive intestinal motility under conditions exposed to stress that secretes stress hormones in the brain. There is no description about this. In particular, there is no description regarding suppression (reduction or alleviation) of stress diarrhea due to stress load on healthy individuals who are distinguished from IBS patients.
  • An object of the present invention is to prevent the production of a survivor or killed product of Lactobacillus gasseri or a processed product thereof from excessive secretion of water, or stress disorders associated with excessive secretion of water, such as stress diarrhea or stress abdominal pain. And to use for treatment.
  • the present invention includes the following features.
  • Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405), or Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) or derivative strain derived from CP2305s strain (NITE BP-1405), treated cells thereof Or a mixture thereof as an active ingredient, an agent for alleviating hypersecretion of water in the intestinal tract, stress diarrhea, stress bowel disorder, irritable bowel syndrome, or inflammatory bowel disease.
  • the derivative strain derived from the CP2305 strain, the CP2305s strain, or the Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) or the CP2305s strain (NITE BP-1405) is a living cell or a fungicide, The alleviating agent according to 1) or (2).
  • the alleviating agent according to any one of (1) to (7) which is an agent for improving drought stress diarrhea.
  • a method for producing animal feed comprising the step of producing an animal feed by blending the mitigating agent according to any one of (1) to (8) with an animal feed ingredient.
  • Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331), Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405), or Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) or a derivative derived from CP2305s strain
  • Viable or bactericidal cells of Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE405BP-1405), or derived from Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) or CP2305s strain, and their cells A food or drink containing a processed product or a mixture thereof.
  • Viable or bactericidal cells of Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405), or derived from Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) or CP2305s strain, and their cells
  • Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405), or derived from Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) or CP2305s strain, and their cells
  • Prevention or reduction of intestinal hydration, stress diarrhea, stress bowel disorder, irritable bowel syndrome, or inflammatory bowel disease characterized by containing a processed product or a mixture thereof as an active ingredient Or a pharmaceutical composition for inhibition or treatment.
  • Hypersecretion in the intestinal tract, stress diarrhea, stress comprising the alleviating agent according to any one of (1) to (8) and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • Lactic acid bacteria having an action to reduce stress intestinal disorders equivalent to or higher than that of Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM ⁇ BP-11331) or Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405) and different from CP2305 strain.
  • the stress-induced intestinal disorder reducing action is equivalent to Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) or Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405) in the diarrhea score described in Example 3 described later
  • the lactic acid bacterium according to (20) which has the above-described action for suppressing stress diarrhea.
  • the above lactic acid bacteria are Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITENBP-1405), Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) derivative or Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405) derivative strain
  • the lactic acid bacterium according to any one of (20) to (26).
  • Lactic acid bacteria For use in the prevention or alleviation of hypersecretion in the enema, stress diarrhea, stress bowel disorder, irritable bowel syndrome, diarrhea-type irritable bowel syndrome, or inflammatory bowel disease. ) Lactic acid bacteria according to any one of (27).
  • Lactic acid bacteria consisting of Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE-BP-1405), or Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM-BP-11331) or a derivative derived from CP2305s strain.
  • Lactic acid bacteria having a low temperature tolerance with a survival rate of 60% or more when kept on ice for 5 hours.
  • the ⁇ diarrhea score described in Example 3 described later '' in (21) above is specifically a diarrhea score evaluated by the method described in Example 3 of the present specification.
  • the i value is the measured stool weight (g)
  • the ii value is a score determined from the stool score criteria shown in FIG. 5 (ie, score 1, normal stool; score 2, slightly diarrhea stool; Score 3, diarrheal stool that began to collapse; score 4, diarrheal stool without shape).
  • Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERMFERBP-11331), Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405), or a strain derived from Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) or CP2305s strain of the present invention
  • Derived strains, treated products thereof, or a mixture thereof inhibits suppression of stress-induced pelvic (parasympathetic) nerve activity to maintain normal intestinal motility, and reduces stress diarrhea in subjects. It is effective for prevention, reduction or treatment of stress bowel disorder because of effective suppression.
  • This figure shows the viability rate of the low-temperature resistant strains (CP2305s, AD) obtained by cold shocking the Lactobacillus gasseri CP2305 strain.
  • This figure shows the influence of live cells, fungicides, and derived CP2305s fungicides of Lactobacillus gasseri CP2305 strain on the CRF-induced diarrhea model.
  • Placebo is a negative control that does not contain the CP2305 strain.
  • * Indicates that the risk factor p is less than 0.05.
  • This figure shows changes in colon chloride channel-related gene expression after CRF induction. It shows that the chloride channel-related gene that increases after CRF administration in the placebo group is suppressed in the CP2305 strain administration group.
  • Agt is angiotensinogen (serpin peptidase inhibitor, clade A, member 8)
  • Adcy5 is adenylate cyclase 5
  • Adora1 is Adenosine receptor A1
  • Ngf is nerve growth factor (beta polypeptide)
  • Igf2 is insulin-factor g2 Represents insulin-like growth factor 1.
  • This figure shows the effect of CP2305 strain administration on the pelvic (parasympathetic) nerve.
  • This figure shows a stool score criterion for calculating a diarrhea score in an experiment relating to the present invention.
  • the stool score was evaluated on a scale of 1 to 4 according to the “water condition” and “shape” of the stool (the color of the stool is not subject to the stool score criteria, but to show the effect of the present invention) It is attached as reference information.)
  • This figure shows the effect of administration of various lactic acid bacteria on the CRF-induced diarrhea model.
  • Lactic acid bacteria are Lactobacillus gasseri strain CP2305 viable cells, known deposited strain A (L. gasseri) and commercially available live cell preparation B (including L. acidophilus). Placebo is a negative control that does not contain the CP2305 strain.
  • This figure shows the effect of administration of sterilized fermented milk of various lactic acid bacteria on nerve stimulation-induced ion transport in the large intestine.
  • the vertical axis indicates the value when the percentage of ion secretion is 100% of the placebo (negative control) ion secretion.
  • A known deposited strain A (L. gasseri)
  • B L. acidophilus
  • C B. pseudocatenulatum
  • D L. delbrueckii
  • E S. thermophilus
  • F L. kefirgranum.
  • # Indicates that the risk factor p is less than 0.05.
  • This figure shows the effects of administration of each CP2305 strain, known deposited strain A (L. gasseri) and L.
  • the vertical axis indicates the value when the percentage of ion secretion is 100% of the placebo (negative control) ion secretion. * Indicates that the risk factor p is less than 0.05.
  • This figure shows the effects of administration of viable cells and sterilized cells of CP2305 strain, viable fermented milk and sterilized fermented milk of CP2305 strain on ion transport in rat large intestine (distal colon).
  • the vertical axis indicates the value when the percentage of ion secretion is 100% of the placebo (negative control) ion secretion.
  • # Indicates that the risk factor p is less than 0.05.
  • the present invention comprises, as an active ingredient, a living cell or sterilized body of Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) (hereinafter also simply referred to as “CP2305 strain”), a treated product thereof, or a mixture thereof.
  • CP2305 strain Lactobacillus gasseri CP2305 strain
  • An inhibitor of hypersecretion of water in the intestinal tract of a subject is provided.
  • the present invention also includes a Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405) (hereinafter also simply referred to as “CP2305s strain”), or a Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) or a derivative derived from CP2305s strain.
  • a strain eg, a low temperature resistant derivative is provided.
  • the Lactobacillus gasseri strain is exposed to a temperature of 10 ° C. or lower, the surviving low-temperature resistant strain is selected and bred, this operation is repeated once or more as necessary, and the surviving low-temperature resistant strain is recovered.
  • a low-temperature resistant strain can be produced.
  • a cold-resistant strain having a viable cell rate of about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, 85% or more, 90% or more after cold shock can be obtained. .
  • Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITENBP-1405) could be obtained (FIG. 1).
  • the Lactobacillus gasseri CP2305s strain was obtained by the applicant from the Japan Institute for Product Evaluation and Technology Patent Microorganisms Depositary Center (Kazusakami, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818, Japan), an international depositary organization based on the provisions of the Budapest Treaty. Foot 2-5-8) has been deposited internationally as NITE BP-1405 on August 14, 2012.
  • the present invention is further derived from Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331), Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405), Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) or CP2305s strain Strains (for example, low-temperature resistant derivatives), treated products thereof, or mixtures thereof as active ingredients, hypersecretion in the intestinal tract, stress diarrhea, stress intestinal disorders, irritability Provided is a relieving agent for irritable bowel syndrome, diarrhea-type irritable bowel syndrome or inflammatory bowel disease.
  • the CP2305 strain, the CP2305s strain, or a derivative strain (for example, a low temperature resistant derivative strain) from the CP2305 strain or the CP2305s strain may be either a living cell or a sterilized cell.
  • the “subject” in this specification refers to animals belonging to mammals and birds, preferably primates such as humans, domestic animals such as cows, horses, sheep, goats, pigs, chickens, and turkeys, and competition animals such as horses. , Pets such as dogs and cats.
  • the other strains derived from the CP2305 strain or the CP2305s strain also have an effect of reducing stress intestinal disorder that is equal to or higher than that of the parent strain, and an action of suppressing excessive secretion of water in the intestine. It can be obtained as a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus gasseri species different from the above strain.
  • Such derivative strains include irradiating the parent strain with ultraviolet light, culturing the parent strain in the presence of a mutagenic substance, culturing at a temperature other than the optimum temperature, culturing in the presence of an organic solvent, etc.
  • mutagenic substances include 3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido [4,3-b] indole (Trp-P-1), 2-amino-6-methylimida-5H-pyrido [1 , 2-a-3 ', 2'-d] -imidazole (Glu-P-1), 2-amino-3,4-dimethylimidazo [4,5-f] quinoline (MeIQ), 4-nitroquinoline- N-oxide (4NQO), N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) and the like can be mentioned.
  • the target derivative has, for example, (1) Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331) or Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405) equivalent to or better than the stress intestinal disorder
  • the stress intestinal disorder reducing action has a diarrhea score that is equivalent to or higher than that of the above strain, and (2) the survival rate when kept on ice for 5 hours or more is 60% or more, (3) Selection can be made using as an indicator that it has an action of inhibiting the suppression of pelvic (parasympathetic) nerve activity due to stress, and (4) an action of inhibiting water secretion by inhibiting the colonic chloride channel.
  • the present invention also relates to a lactic acid bacterium having such characteristics (1) and any of the characteristics (2) to (4).
  • Lactobacillus gasseri SBT 2055 strain (FERM P-15535) having a preventive / therapeutic effect on inflammatory bowel disease or irritable bowel syndrome is known (JP 2003-95963 A). Issue gazette).
  • This bacterium is a lactic acid bacterium isolated and cultured from the Japanese intestine. In a test using live bacteria using the DDS-induced ulcerative colitis model, it was reported that blood stool and melena were suppressed compared to the control group. ing.
  • Lactobacillus gasseri OLL2716 strain (FERM BP-6999) that improves the gut microbiota and reduces the occurrence of diarrhea (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-305128).
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2004-305128 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-305128
  • the incidence of diarrhea rate of occurrence of diarrhea within 2 weeks after introduction into the test ranch
  • these known Lactobacillus gasseri strains are clearly different from the CP2305 strain and the CP2305s strain that is a low-temperature resistant derivative thereof.
  • CP2305s strain which is a low temperature resistant strain of CP2305 strain, or a viable cell and a sterilized cell of CP2305 strain or a derivative strain from CP2305s strain (for example, a low temperature resistant derivative strain), Surprisingly, it has the effect of suppressing excessive secretion of water from the intestinal tract, and has the effect of significantly suppressing stress diarrhea (see FIGS. 1 and 2).
  • This action is achieved by sterilizing fermented milk of the parent strain Lactobacillus gasseri CP2305 with known deposited Lactobacillus gasseri strains, L. acidophilus, B. pseudocatenulatum, L. ophil delbrueckii, S.
  • Lactobacillus gasseri CP2305 strain of the present invention Lactobacillus gasseri CP2305s strain, or a derivative strain such as a low temperature resistant derivative strain from CP2305 strain or CP2305s strain, using a medium usually used for culture of lactic acid bacteria, suitable It can be prepared by culturing under conditions. As long as the medium used for culture contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like and can culture lactic acid bacteria efficiently, either a natural medium or a synthetic medium may be used. If so, a known medium suitable for the strain to be used can be appropriately selected.
  • the carbon source lactose, glucose, sucrose, fructose, galactose, molasses, etc.
  • organic nitrogen-containing materials such as casein hydrolyzate, whey protein hydrolyzate, and soy protein hydrolyzate can be used.
  • inorganic salts phosphates, sodium, potassium, magnesium and the like can be used.
  • the medium suitable for culturing lactic acid bacteria include MRS liquid medium, GAM medium, BL medium, Briggs LiverBroth, animal milk, skim milk, and milky whey.
  • a sterilized MRS medium can be used.
  • the culture of the CP2305s strain of the present invention, or a derivative strain such as a low temperature resistant derivative from the CP2305 strain or the CP2305s strain is 20 ° C. to 50 ° C., preferably 25 ° C. to 42 ° C., more preferably about 37 ° C.
  • the temperature condition can be adjusted by a thermostatic bath, a mantle heater, a jacket, or the like.
  • the anaerobic condition means a hypoxic environment where bacteria can grow, for example, by using an anaerobic chamber, an anaerobic box, a sealed container or bag containing an oxygen scavenger, or the like.
  • Anaerobic conditions can be achieved by simply sealing the culture vessel.
  • the culture may be any culture mode such as stationary culture, shaking culture, tank culture and the like.
  • the culture time can be 3 hours to 100 hours or more, preferably about 10 hours to 50 hours.
  • the pH of the medium at the start of culture is preferably maintained at 3.5 to 8.0.
  • viable cell bodies separated from the culture solution by a separation technique such as filtration or centrifugation, or a viable cell-containing culture solution can be obtained.
  • a sterilized body can be obtained by subjecting these live cells or a culture solution thereof to a known sterilization treatment using an autoclave or the like.
  • a microbial cell processed material can be produced from a living microbial cell or a living microbial cell culture solution, and can be subjected to a sterilization treatment as necessary.
  • the treated microbial cell product is obtained by subjecting the microbial cell to physical, chemical, biological treatment such as drying treatment, destruction or crushing treatment, and fermentation treatment. Therefore, examples of the processed microbial cell product used in the present invention include dried microbial cells, disrupted microbial cells, crushed microbial cells, fermented processed products (for example, fermented milk), and the like.
  • the dried microbial cells can be obtained by subjecting the microbial cells isolated from the culture solution to a sterilizing treatment if necessary, and subjecting the microbial cells to a drying treatment.
  • a drying treatment examples include drum drying, spray drying, vacuum drying, freeze drying, and the like.
  • Destructed cells or broken cells can be obtained by treating cells by crushing, grinding, enzyme treatment, chemical treatment, dissolution, or the like.
  • the disrupted or disrupted cells consist essentially of all the solid and soluble components of the disrupted or disrupted cells, and can be obtained, for example, by subjecting the disrupted or disrupted product to lyophilization as it is.
  • Destruction or crushing can be performed by a known method such as physical crushing, enzyme dissolution treatment, chemical treatment, and the like. Physical crushing may be carried out either wet or dry, with stirring using a homogenizer, ball mill, bead mill, dyno mill, planetary mill, etc., using a jet mill, French press, cell crusher, etc. Can do.
  • the enzyme dissolution treatment can be performed by destroying the cell structure of the fungus using an enzyme such as lysozyme.
  • the chemical treatment can be carried out by destroying the cell structure of the fungus using a surfactant such as glycerin fatty acid ester and soybean phospholipid. Preferably, physical crushing.
  • a specific method for preparing a crushed material is, for example, a known dynomill cell crusher (DYNO-MILL crusher (Shinmaru Enterprises (Japan, Osaka, Japan), etc.)) , Using glass beads, crushing tank temperature 10-30 ° C at peripheral speed 10.0-20.0m / s (eg about 14.0m / s), processing flow rate 0.1-10L / 10min (eg about 1L / 10min) This includes crushing the cells by treating 1 to 7 times (for example, 3 to 5 times) (for example, about 15 ° C.).
  • the suspension of the bacteria is discharged in a known wet jet mill cell crusher (JN20 Nanojet Pal (Joko (Japan, Kanagawa, Kawasaki), etc.)) with a discharge pressure of 50 to 1000 MPa (for example, 270 MPa) and a processing flow rate.
  • the cells can be crushed by treating 1 to 30 times (for example, 10 times) at 50 to 1000 (for example, 300 ml / min).
  • a known dry planetary mill cell crusher the cell powder is mixed with various balls (for example, zirconia 10 mm balls, zirconia 5 mm balls, alumina 1 mm balls) at a rotational speed of 50 to 10,000 rpm (for example, 240 rpm, 190 rpm).
  • Fermented milk can be obtained by inoculating a raw milk, skim milk powder or soy milk with a strain and performing fermentation under lactic acid bacteria fermentation conditions.
  • the obtained fermentation product may be subjected to treatments such as filtration, dilution, and concentration as necessary.
  • the above microbial cells and processed microbial cells can be used as they are or can be sterilized by sterilization.
  • the sterilization treatment includes, for example, known treatments such as sterilization by high energy ray irradiation, heat sterilization, pressure sterilization, and autoclave sterilization.
  • a preferred sterilization method is autoclave sterilization. This method comprises sterilizing a living bacterium or a bacterium-containing culture liquid in an autoclave (high-pressure steam sterilizer), for example, at a temperature of, for example, 110 ° C. to 140 ° C. under pressurized steam for about 10 minutes to 1 hour. Including.
  • the CP2305 strain, CP2305s strain of the present invention, or a derivative strain such as a low-temperature resistant derivative from the CP2305 strain or the CP2305s strain, or a treated product thereof is described below. It is useful as an alleviating agent for excessive secretion, stress bowel disorder, stress diarrhea, irritable bowel syndrome, diarrhea-type irritable syndrome, or inflammatory bowel disease.
  • stress diarrhea is a symptom accompanied by excessive secretion of water in the intestinal tract due to stress that causes stress hormones in the brain to be secreted. May not accompany.
  • stressed abdominal pain means abdominal pain that occurs in the intestinal tract caused by stress, that is, exposed to stress that causes secretion of stress hormones in the brain.
  • stressed diarrhea and “stressed abdominal pain” are distinguished from patients with irritable bowel syndrome (IBS) in that they are stressful symptoms caused by stress on healthy individuals .
  • IBS irritable bowel syndrome
  • stress diarrhea and “stress abdominal pain” are collectively referred to as “stressed bowel disorder”.
  • “diarrhea symptoms of stress-induced intestinal disorder” means symptoms of stress diarrhea.
  • intestinal hyperhydric secretion means excessive hypersecretion in the intestinal tract regardless of whether it is caused by stress or not.
  • irritable bowel syndrome refers to irritable bowel syndrome.
  • diarrhea-type irritable bowel syndrome is caused by a hypersensitive reaction when passing through the intestinal contents due to hypersensitivity of the large intestine, causing excessive contraction movements that promote drainage, frequent diarrhea symptoms, and chronic abdominal pain.
  • Suffering from continuous anxiety due to stress increase the incidence of mental illness.
  • the diagnostic criteria are defined in Rome III and are patients with low QOL regardless of the presence or absence of stress environment.
  • inflammatory bowel disease is a general term for chronic diseases that cause inflammation of unknown cause mainly in the digestive tract, and mainly consists of two diseases, ulcerative colitis and Crohn's disease. Aggravated by stress, with diarrhea.
  • the mitigating agent (or inhibitor) of the present invention is a CP2305 strain, a CP2305s strain, or a derivative strain such as a low-temperature resistant derivative strain from CP2305 strain or CP2305s strain, a treated product thereof, or an active ingredient comprising a mixture thereof, although not limited to the following, it contains, for example, about 0.1 wt% to 100 wt%, preferably about 10 wt% to about 90 wt% per mitigating agent.
  • the above-mentioned alleviating agent can contain an excipient, a diluent or a carrier, and other additives as required, in addition to the above active ingredient.
  • the form may be either a solid form or a liquid form.
  • a solid form consists of arbitrary shapes, such as a powder, a granule, a tablet, a pellet, for example.
  • the liquid form is, for example, a shape such as a suspension, an emulsion, a fermented liquid (for example, fermented milk).
  • Excipients, diluents or carriers are substances that can usually be used in foods, animal feeds or pharmaceuticals as described below.
  • Other additives are not necessarily required, but when added, examples include preservatives, pH adjusters, emulsifiers, antioxidants, and colorants as described below.
  • the present invention further relates to a derivative strain such as the above-mentioned Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331), Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405), or a cold-tolerant derivative from CP2305 strain or CP2305s strain,
  • a food additive or animal feed additive containing the above-mentioned alleviating agent (or inhibitor) is provided.
  • the above alleviating agent or inhibitor
  • These food additives or animal feed additives may be in solid or liquid form.
  • the solid form consists of any shape such as powder, granule, tablet, pellet, gel, capsule and the like.
  • the liquid form is, for example, a shape such as a suspension, an emulsion, a fermented liquid (for example, fermented milk).
  • Excipients, diluents or carriers are substances that can normally be used in food or animal feed, and other additives include, for example, preservatives, pH adjusters, emulsifiers, colorants, nutritional supplements (natural or Artificial) sweeteners, seasonings, flavors and the like.
  • the food additive or animal feed additive contains the above-mentioned mitigating agent, but is not limited to the following, but contains, for example, about 1 wt% to about 50 wt%, preferably about 5 wt% to about 20 wt% per additive. can do.
  • a food additive or animal feed additive is added to food or animal feed to reduce excess intestinal hydration, stress diarrhea, stress bowel disorder, irritable bowel syndrome or inflammatory bowel disease Can be used to reduce excess intestinal hydration, stress diarrhea, stress bowel disorder, irritable bowel syndrome or inflammatory bowel disease Can be used to reduce excess intestinal hydration, stress diarrhea, stress bowel disorder, irritable bowel syndrome or inflammatory bowel disease Can be used to reduce excess intestinal hydration, stress diarrhea, stress bowel disorder, irritable bowel syndrome or inflammatory bowel disease Can be used to
  • the present invention further includes an animal feed containing the above-mentioned alleviating agent (or inhibitor), or the above-described alleviating agent (or inhibitor) combined with an animal feed component, and the subject is subject to excessive water secretion and stress in the intestinal tract of the subject.
  • a method for producing an animal feed comprising producing an animal feed having an effect of reducing diarrhea, stress bowel disorder, irritable bowel syndrome or inflammatory bowel disease is provided.
  • an animal feed can be produced by blending an effective amount of the mitigation agent of the present invention with a feed component for producing an animal feed and formulating it into an arbitrary dosage form if necessary.
  • the present invention further includes a derivative strain such as the aforementioned Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERMFERBP-11331), Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405), or a low temperature resistant derivative from CP2305 strain or CP2305s strain, Or a sterilized product thereof, a processed product thereof, or a mixture thereof, a food or drink containing the above-mentioned alleviating agent, a functional food or drink, or a food carrier or excipient containing the above-mentioned reducing agent.
  • a derivative strain such as the aforementioned Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERMFERBP-11331), Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405), or a low temperature resistant derivative from CP2305 strain or CP2305s strain, Or a sterilized product thereof, a processed product thereof, or a mixture thereof, a food or
  • the amount of the above-mentioned alleviating agent is determined depending on the form of the feed and foods and drinks and the desired effect (that is, suppressing excessive secretion of water in the intestinal tract of the subject, It can be determined appropriately by those skilled in the art in view of (suppressing diarrhea and the like).
  • the total amount of sterilized or viable cells and / or treated cells of CP2305 strain, CP2305s strain, or a derivative strain such as a low temperature resistant derivative from CP2305 strain or CP2305s strain in animal feed or functional food and drink is 10 5 to 10 14 cfu / g, preferably 10 6 to about 10 13 cfu / g, more preferably 10 7 to 10 12 cfu / g.
  • the amount of the bacterium is, for example, 0.001 to 10% by weight, preferably 0.01 to 5% by weight.
  • the effective amount can be appropriately set by those skilled in the art based on the relationship between the added amount and the effect of reducing diarrhea symptoms.
  • the animal feed dosage form has an arbitrary shape such as a powder, a granule, a tablet and a pellet in the case of a solid form, and has a shape such as a suspension and fermented milk in the case of a liquid form.
  • the functional food dosage form may be of any shape such as powder, granule, tablet, pellet, gel, capsule, etc. in the solid form, and in the liquid form, such as suspension, emulsion, fermentation, etc.
  • the shape is milk.
  • tablets, pellets and capsules can be coated in a single layer or multiple layers with an enteric substance so as to be enteric.
  • Enteric substances are those that do not dissolve at pH in the acidic range such as gastric juice but dissolve at pH in the neutral range, such as hypromellose phthalate, shellac, zein, lactoferrin, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose. Examples thereof include acetate succinate, carboxymethyl ethyl cellulose, and cellulose acetate phthalate.
  • Excipients, diluents or carriers are not limited to the following: water, milk fermentation liquid, carbonated water, ethanol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium alginate, water-soluble dextran, water-soluble dextrin, Examples include sodium carboxymethyl starch, carboxymethyl cellulose, starch, pectin, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petroleum jelly, paraffin, stearyl alcohol, mannitol, sorbitol, and lactose.
  • Additives are not limited to the following, but are coloring agents (plant pigments, synthetic pigments, etc.), flavoring agents (natural flavoring agents, etc.), sweeteners (stevia, aster palm, etc.), preservatives (sodium acetate, Sorbic acid, etc.), emulsifiers (sodium chondroitin sulfate, propylene glycol fatty acid ester, etc.), antioxidants (disodium EDTA, vitamin C, etc.), pH adjusters (citric acid, etc.), chemical seasonings (sodium inosinate, sodium glutamate) Etc.), thickeners (xanthan gum, etc.), swelling agents (calcium carbonate, etc.), antifoaming agents (calcium phosphate), binders (sodium polyphosphate, etc.), nutrient enhancers (calcium fortifier, vitamin A, etc.
  • the present invention further includes Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331), Lactobacillus gasseri CP2305s strain (NITE BP-1405), or a derivative strain such as CP2305 strain or CP2305 strain or CP2305s strain or a low temperature resistant derivative
  • a medicinal product for preventing, reducing or suppressing or treating stress intestinal disorders characterized by containing, as an active ingredient, viable cells or bactericides, or processed products of these, or a mixture thereof A composition is provided.
  • the present invention provides a subject with stress bowel disorders, particularly hypersecretion of water and stress, comprising the above-mentioned alleviating agent (or inhibitor) and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • a pharmaceutical composition for preventing, reducing or suppressing or treating diarrhea comprising the above-mentioned alleviating agent (or inhibitor) and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • the active ingredient of the present invention has an effect of suppressing stress bowel disorder, particularly excessive water secretion and stress diarrhea.
  • CP2305 strain, CP2305s strain, or CP2305 strain, or a derivative strain such as a low-temperature resistant derivative from CP2305 strain or CP2305s strain (viable cells or sterilized cells), or a treated product thereof, as described above induces stress.
  • has the effect of inhibiting pelvic (parasympathetic) nerve suppression that is, it has the function of maintaining intestinal motility normally by anti-stress, and the action of inhibiting colonic chloride channels, thereby suppressing excessive secretion of water in the intestinal tract
  • Stress leads to stress-sensitive bowel disorders and exacerbates the symptoms of the disorder.
  • CP2305 strain of the present invention CP2305s strain, or a derivative strain such as a low-temperature resistant derivative strain from CP2305 strain or CP2305s strain, In particular, it is effective for preventing, reducing or suppressing stress bowel disorder, or treating it, in order to suppress frequent diarrhea symptoms of stress bowel disorder. This effect was confirmed to be higher than any commercially available Lactobacillus gasseri strain preparation.
  • the pharmaceutical composition can be formulated into any dosage form as long as it exhibits the above effects.
  • examples thereof include tablets, capsules, granules, powders, powders, syrups, dry syrups, solutions, suspensions, emulsions, fermentation emulsions, and the like, and oral preparations, suppositories, etc. are particularly preferred.
  • compositions As the active ingredient of the present invention, pharmaceutically acceptable commonly used excipients, carriers, diluents, disintegrants, binders, wetting agents, stabilizers, buffers, lubricants, preservatives, surfactants Additives such as sweeteners, flavoring agents, fragrances, acidulants, and coloring agents can be blended according to the dosage form, and can be produced according to conventional methods. Examples of these substances are those mentioned above.
  • the total amount of the above-described CP2305 strain, CP2305s strain, or a derivative strain such as a low-temperature resistant derivative strain from CP2305 strain or CP2305s strain, and / or a cell-treated product in the pharmaceutical composition is not limited to the following.
  • the amount of viable bacteria is 10 5 to 10 12 cfu / g, preferably 10 6 to about 10 12 cfu / g, more preferably 10 7 to 10 12 cfu / g, or
  • the amount of the bacteria is, for example, 0.001 to 10% by weight, preferably 0.01 to 5% by weight.
  • the effective amount can be appropriately set by those skilled in the art based on the relationship between the added amount and the effect of reducing diarrhea symptoms.
  • the preferred administration method is oral administration or suppository administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is effective in preventing, reducing or treating hypersecretion of water in the intestinal tract, stressful bowel disorder, irritable bowel syndrome or inflammatory bowel disease, worsening of diarrhea symptoms during stress. is there.
  • Example 1 ⁇ Breeding low temperature resistant strain> Inoculated with broth 10ml entering the test tube polypropylene-made capacity 15ml inner diameter 15 mm (food ⁇ land) Lactobacillus gasseri CP2305 strain (Number 10 3 to 10 4 bacteria), 37 ° C., 19 hours Culture was performed.
  • a 15-ml test tube made of polypropylene having an inner diameter of 15 mm was inserted into a sufficient amount of ice above the liquid level in the test tube (on ice) and rapidly cooled and held for 5 hours. This culture and cooling were repeated 80 times to breed a strain having high low temperature tolerance.
  • on ice means that 10 ml of the culture solution is put into a 15 ml test tube made of polypropylene with an inner diameter of 15 mm, and the test tube is inserted into a sufficient amount of ice above the liquid level in the test tube. The state of cooling.
  • composition of the “food medium” used in the present specification is as follows (Table 1).
  • ⁇ Evaluation of low temperature resistant strain The evaluation of the viability of the low temperature resistant strain in the evaluation of the low temperature resistant strain of the present invention was evaluated by the viable cell ratio before and after low temperature exposure (also referred to as “viability” in the present specification) as in the following formula. . Specifically, to inoculate evaluated strain broth 10ml entering the test tube polypropylene-made capacity 15ml of (bacterial number 10 3 to 10 4) the inner diameter of 15 mm (food ⁇ land), 37 ° C., Culture was performed for 19 hours.
  • test tube After culturing for 19 hours, insert a test tube of 15 ml in diameter and made of polypropylene with a capacity of 15 ml into a sufficient amount of ice above the liquid level in the test tube and quickly cool it (on ice). After maintaining for 5 hours on ice, compare the number of viable bacteria before rapid cooling (before low temperature exposure) and the number of viable bacteria after holding for 5 hours on ice (after low temperature exposure) to evaluate the viable cell rate using the following formula.
  • the viable cell rate is at least 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more (see below) Strains exhibiting the formula are preferred.
  • Viable bacteria rate (%) number of viable bacteria after low temperature exposure / number of viable bacteria before low temperature exposure x 100 The method for counting the number of viable bacteria was evaluated by measuring the viable count by counting the number of colonies after smearing the culture solution on an MRS agar medium or BCP-added plate count agar medium and culturing at 37 ° C. under slight aerobic condition. .
  • Example 2 ⁇ Method for producing low temperature resistant strain>
  • the target strain is cultured in a culture solution (e.g., a supplemented medium) at an appropriate culture temperature (e.g., about 37 ° C) and a moderate culture time (e.g., about 19 hours).
  • a culture solution e.g., a supplemented medium
  • the culture solution is kept at a temperature of 10 ° C. or lower, preferably 7 ° C. or lower, more preferably 5 ° C. or lower, more preferably 3 ° C.
  • the strain that is resistant to low temperature which is the target temperature, is produced by exposure and, if necessary, repeating these cultivation and low temperature exposure.
  • test cell combination diet is free for 3 weeks as follows: Ingested.
  • Bacteria consumption in this study was estimated to be approximately 2.0 ⁇ 10 10 cells / day.
  • CRF Corticotropin Releasing Factor
  • the definition of diarrhea score is as follows.
  • the stool collected at each time is quantified as the stool score of each time according to the stool score criteria shown in FIG. 5 from the water status and shape of the stool (the stool score (ii value) of each time)
  • (d) Obtain the stool weight (i value) x stool score (ii value) each time.
  • Lactobacillus gasseri CP2305s strain significantly suppressed stress diarrhea compared with placebo (CRF-1 only) (FIG. 2).
  • the diarrhea inhibitory effect is equivalent to that of CP2305 strain (live cells and bactericides).
  • Example 3 From the results of Example 3 above, it was proved that lactic acid bacteria having diarrhea scores of Example 3 of 11 or less were obtained.
  • the diarrhea score is preferably 10 or less, more preferably 9 or less.
  • lactic acid bacteria having a diarrhea score with a reduction rate of diarrhea score with respect to placebo of 90% or less can be obtained.
  • Example 5 The result of the deposited bacterial strain A (L. gassei) as a comparison target is the result of administration of the same number of bacteria as the CP2305 strain. Moreover, the result of the commercially available live bacterial preparation B (L. acidphilus) is the result of administration so that the weight of the daily intake for humans is equivalent to the weight per unit body weight in terms of the body weight of the rat (FIG. 6). From these results, it has been proved that CP2305 strain has the effect of suppressing stress-related diarrhea from the commercially available bacterial agents that have been reported to have anti-diarrhea activity, and the CP2305s strain has the same effect as the CP2305 strain. This proved the superiority of the CP2305s strain.
  • Example 6 Furthermore, dissection was performed 4 hours after administration of CRF, and colon tissues were extracted with total RNA using ISOGEN (Nippon Gene) and RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA), and then gene expression was determined using Rat whole genome ver. 3 (G4847B, Agilent , USA). As a result, it was confirmed that the chloride channel-related gene increased after CRF administration in the placebo group was suppressed in the CP2305 strain administration group (FIG. 3). Therefore, the CP2305 strain is thought to suppress chloride channels and control water movement, and the CP2305s strain, which has the same diarrhea inhibitory effect, also suppresses chloride channels and controls water movement. Conceivable.
  • Example 7 SD male rats (4 weeks old, manufactured by Kiwa Animal Co., Ltd.) are bred for 12 weeks under a light / dark cycle (lights on for 12 hours from 8 o'clock) for 1 week, and then CP2305 mixed diet or uncontained control powder diet for 3 weeks Ad libitum. On the day of the experiment, rats were fasted for 3 hours, then anesthetized with urethane, a cannula for intravenous administration was inserted into the jugular vein, and then the pelvic (parasympathetic) nerve that innervates the lower colon was lifted with a silver electrode, and its electrical activity was measured.
  • Example 8 SD rat (weight: 380-400g, manufactured by Japan SLC) was anesthetized, decapitated and exsanguinated, distal to the distal colon according to anatomical criteria, and the rotatory and longitudinal muscle layers were examined under a microscope. After exfoliation, a mucosa-submucosa plexus specimen containing the submucosal plexus was prepared. The specimen was mounted in a Ussing chamber (CHM2, WPI, FL, USA) having a measurement area of 0.64 cm 2 , and a potential difference generated between the mucosa side and the serosa side of the specimen and a short-circuit current (I SC ) were measured.
  • CHM2, WPI, FL, USA Ussing chamber having a measurement area of 0.64 cm 2
  • a 10 mV command pulse was applied to the tissue for 3 seconds per minute, and the membrane conductance (Gt) was calculated from the amount of change in the short-circuit current.
  • electrical stimulation 25 V, duration of 0.5 ms, 5 Hz, 120 s
  • a test lactic acid bacterium or a diluted solution of fermented milk 500 ⁇ g / ml is administered to the mucous membrane side, changes in I SC and Gt are measured, and a test for Cl ⁇ / HCO 3 ⁇ secretion generated by neural stimulation induction The effect of the substance was evaluated.
  • the sterilized fermented milk of CP2305 strain suppressed ion secretion more strongly than known deposited strain A (L. gasseri) and other 5 strains (BF), It was suggested that it regulates secretion and contributes to diarrhea suppression (Fig. 7).
  • Example 9 Furthermore, in order to evaluate the effect of bacterial cells alone on nerve stimulation-induced ion transport in the rat large intestine (distal colon), sterilized lactic acid bacteria were prepared and administered. Compared with strain A (L. gasseri) and L. acidophilus germicide, it was suggested that ion secretion was significantly suppressed and strongly contributed to diarrhea suppression (FIG. 8).
  • Lactobacillus gasseri CP2305 strain (FERM BP-11331), Lactobacillus gaselli CP2305s strain (NITE BP-1405) of the present invention, or a strain derived from CP2305 strain or CP2305s strain (for example, a low temperature resistant derivative strain)
  • the treatment, or a mixture thereof inhibits the suppression of stress-induced pelvic (parasympathetic) nerve activity to maintain normal intestinal motility. It can be suppressed, reduced or improved.

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Abstract

この出願は、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又は、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株（例えば低温耐性派生株）及びその製造法、該派生株、その菌体処理物又はそれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とする、ストレス性腸障害の軽減剤、この軽減剤を含む、食品添加剤、動物添加剤、動物飼料及び医薬組成物を提供する。

Description

特定のラクトバチルス・ガセリ株又はその処理物を含有するストレス性腸障害の軽減剤
　本発明は、ある特定のラクトバチルス・ガセリ株の生菌体若しくは殺菌体又はその処理物を有効成分として含む、被験体の腸管での水分過剰分泌の軽減剤（若しくは抑制剤）、或いはストレス性腸障害、とりわけストレス性下痢症状、の軽減剤（若しくは抑制剤）に関する。
　本発明はまた、新規の低温耐性ラクトバチルス・ガセリ株及びその製造法に関する。
　本発明はさらに、上記の低温耐性ラクトバチルス・ガセリ株又はその処理物を有効成分として含む、ストレス性腸障害の軽減剤（若しくは抑制剤）に関する。
　本発明はまた、上記軽減剤（若しくは抑制剤）を含有する、食品添加剤若しくは動物飼料添加剤、或いは、食品又は医薬組成物に関する。
　ラクトバチルス（Lactobacillus）属の乳酸菌にストレス抑制作用や胃腸疾患に有効である可能性を示す先行技術文献が、以下に例示するようにいくつか散見される。
　例えば、特開2009-102292号公報（特許文献１）には、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピシーズ・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)である乳酸菌FERM P-19169を有効成分とし、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制剤が記載されている。この文献では、ストレス抑制とは、ストレスを引き起こす外部刺激であるストレッサーにより生じた生体の非特異的反応を抑制することによって、食欲減退、消化不良、不眠、体調不良、感染症などの症状を緩和することができると記載されている。
　特開2009-100692号公報（特許文献2）及び特開2008-212140号公報（特許文献3）には、ストレス軽減作用を有するラクトバチルス属微生物を含有することを特徴とする哺乳動物用乳酸菌製剤が記載されており、特定の乳酸菌を、哺乳動物に投与することにより、優れたストレス軽減効果を発揮し、ストレスに起因する下痢症などの消化器疾患を予防及び治療し得ると記載されている。
　日本特許第4350170号公報（特許文献4）には、ヒト及び動物における胃腸障害の予防及び/又は処置に必要な薬学的調製物であって、寄託番号NCIMB 40564を有するラクトバチルス・カゼイ・ラムノーサス(Lactobacilluscasei rhamnosus)LB21の生存可能な微生物株を、微生物がその生存性を維持している少なくとも１つの薬学的に受容可能なキャリア媒体に含むことを特徴とする、薬学的調製物が記載されている。
　特開2011-200211号公報（特許文献5）には、ラクトバチルス・ガセリMCC1183株を含有する抗潰瘍剤が記載されており、この薬剤は、ヘリコバクター・ピロリに起因する胃潰瘍又は十二指腸潰瘍の予防又は治療に用いられると記載されている。
　特表2009-511471号公報（特許文献6）には、自己免疫疾患の治療及び/又は予防のための薬学的組成物の製造のための、乳酸菌から選択された少なくとも1種のプロバイオティクス細菌 (Probiotic bacteria) 株の使用が記載されており、該自己免疫が、多発性硬化症(MS)、アレルギー、乾癬、関節リウマチ（rhematoid arthritis）、クローン病（Crohn’s disease）、潰瘍性大腸炎、I型糖尿病、炎症性腸疾患、及び全身性エリテマトーデスなどの臓器特異的自己免疫（organ specific autoimmunity）からなる群から選ばれる、また、乳酸菌株が、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、及びラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）からなる群より選ばれると記載されている。
　日本特許4853986号公報（特許文献7）には、ラクトバチルス・ガセリSBT2055(LG2055という)(FERM P-15535)の菌体又はその発酵産物を有効成分とする炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防及び治療剤が記載されており、また、一般に過敏性腸症候群の治療について、心理的ストレスのコントロールを行うとともに、整腸薬、緩下薬から抗精神病薬まで、症状に応じた段階的な薬物治療が施されていると記載されている。
　澤田大輔ら、第13回腸内細菌学会(平成21年)、東京、日本（非特許文献1）には、ラクトバチルス・ガセリCP2305株の生菌体によるストレス緩和作用、例えばストレス性腹痛を改善することが記載されている。
　Daisuke Sawada et al., The 10th Syｍposium on Lactic Acid Bacteria （2011年）、オランダ国、Federation of European Microbiological Societies (FEMS)とNetherlands Society for Microbiology (NVvM)（非特許文献２）には、過敏性腸症候群（IBS）患者にCP2305株生菌体を投与したことが記載されているが下痢症状緩和に関する記載はない。
　特開2003-95963号公報（特許文献8）には、ラクトバチルス・ガセリの菌体又はその発酵産物による炎症性腸疾患又は過敏性腸症候群の予防及び治療剤が記載されている。
特開2009-102292号公報 特開2009-100692号公報 特開2008-212140号公報 日本特許第4350170号公報 特開2011-200211号公報 特表2009-511471号公報 日本特許4853986号公報 特開2003-95963号公報
澤田大輔ら、第13回腸内細菌学会(平成21年)、東京、日本 Daisuke Sawada et al., The 10th Syｍposium on Lactic Acid Bacteria （2011年）、オランダ国、Federation of European Microbiological Societies (FEMS)と Netherlands Society for Microbiology (NVvM)
　乳酸菌の一種であるラクトバチルス・ガセリ株が、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群などの胃腸障害の予防又は治療に有効であるという記載はある。また、そのような胃腸障害には、ストレスとの関係を推定する記載もある。しかし、従来、ラクトバチルス・ガセリ株が、胃腸障害、とりわけ、ストレスを抑制して過剰な腸運動を正常に保持しながら、水分過剰分泌抑制作用やストレス性下痢症状を有意に予防、改善又は治療する、ストレス性腸障害の軽減作用を有する（低温耐性）乳酸菌についての記載がない。そして、従来、ラクトバチルス・ガセリ株が、脳内ストレスホルモンが分泌されるようなストレスに曝露された状況下で、過剰な腸運動を正常に保持しながら、ストレス性下痢症状を有意に改善することについての記載もない。特に、IBS患者と区別される健常人に対するストレス負荷によるストレス性下痢の抑制（軽減もしくは緩和）に関する記載はない。本発明の目的は、ラクトバチルス・ガセリの生菌体若しくは殺菌体又はその処理物を、水分過剰分泌、或いは、水分過剰分泌が関係するストレス性障害、例えばストレス性下痢又はストレス性腹痛、の予防及び治療のために使用することである。
　さらに、製造上問題となる低温に耐性があるストレス性腸障害等の効果を有する乳酸菌は知られていない。
　本発明は、以下の特徴を包含する。
　(1) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株（NITE BP-1405）から派生した派生株、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、又は炎症性腸疾患の軽減剤。
　(2) ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、その菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、又はストレス性下痢の軽減剤。
　(3) ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）の殺菌体、その菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、又はストレス性腸障害の軽減剤。
　(4) 前記CP2305株、前記CP2305s株、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株（NITE BP-1405）から派生した派生株が、生菌体又は殺菌体である、(1)又は(2)に記載の軽減剤。
　(5) 前記菌体処理物が、乾燥菌体、破壊菌体、破砕菌体又は発酵乳である、(1)～(4)のいずれかに記載の軽減剤。
　(6) ストレスによる骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有する、(1)～(5)のいずれかに記載の軽減剤。
　(7) 大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、(1)～(6)のいずれかに記載の軽減剤。
　(8) ストレス性下痢の改善剤である、(1)～(7)のいずれかに記載の軽減剤。
　(9) (1)～(8)のいずれかに記載の軽減剤を動物飼料成分と配合して動物飼料を製造する工程を含む、動物飼料の製造方法。
　(10) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株（NITE BP-1405）から派生した派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する動物飼料。
　(11) (1)～(10)のいずれかに記載の軽減剤を含有する食品添加剤又は動物飼料添加剤。
　(12) ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する食品添加物。
　(13) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する飲食品。
　(14) 機能性飲食品である、(13)に記載の飲食品。
　(15) (1)～(8)のいずれかに記載の軽減剤を食品用の担体、賦形剤又は希釈剤と混合し、場合により食品添加剤をさらに混合して、機能性飲食品を製造することを含む、機能性飲食品の製造方法。
　(16) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、又は炎症性腸疾患の予防、軽減若しくは抑制、又は治療するための医薬組成物。
　(17) ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、その菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、又はストレス性下痢の予防、軽減若しくは抑制、又は治療するための医薬組成物。
　(18) ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）の殺菌体、その菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害の予防、軽減若しくは抑制、又は治療するための医薬組成物。
　(19) (1)～(8)のいずれかに記載の軽減剤と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤又は希釈剤とを含む、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、又は炎症性腸疾患を予防、軽減若しくは抑制、又は治療するための医薬組成物。
　(20) ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）と同等以上のストレス性腸障害の軽減作用を有し、かつCP2305株と異なる乳酸菌。
　(21) 前記ストレス性腸障害の軽減作用が、後述の実施例3記載の下痢スコアでラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）と同等以上のストレス性下痢抑制作用を有する、(20)に記載の乳酸菌。
　(22) 後述の実施例3記載の方法によって下痢スコアを評価した場合においてプラセボと比較して有意（ｐ＜0.05vsプラセボ）にストレス性下痢を抑制しかつCP2305株（FERM BP-11331）と異なる乳酸菌。
　(23) 氷上で5時間保持したときの生存率が、60％以上である低温耐性を有する、(20)～(22)のいずれかに記載の乳酸菌。
　(24) ストレスによる骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有する、(20)～(23)のいずれかに記載の乳酸菌。
　(25) 大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、(19)～(24)のいずれかに記載の乳酸菌。
　(26) 上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌であることを特徴とする、(20)～(25)のいずれかに記載の乳酸菌。
　(27) 上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）の派生株又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）の派生株である(20)～(26)のいずれかに記載の乳酸菌。
　(28) 腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群、又は炎症性腸疾患の予防又は軽減に用いるためのものである、(20)～(27)のいずれか記載の乳酸菌。
　(29) 乳酸菌を10℃以下の温度に曝露し、生存した低温耐性株を選抜し、育種すること、必要に応じてこの操作を繰り返すこと、及び生存した低温耐性株を回収することを含む、乳酸菌低温耐性株の製造方法。
　(30) 乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）である、(29)に記載の方法。
　(31) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株からなる乳酸菌。
　(32) 氷上で5時間保持したときの生存率が、60％以上である低温耐性を有する、乳酸菌。
　(33) 上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌であることを特徴とする、(32)に記載の乳酸菌。
　(34) (20)～(27)及び(31)～(33)のいずれかに記載の乳酸菌を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群、又は炎症性腸疾患の予防又は軽減剤。
　ここで、上記(21)の「後述の実施例3記載の下痢スコア」は、具体的には、本明細書実施例3記載の方法により評価された下痢スコアであるが、簡単に説明すると、糞便重量（i値）×糞便スコア（ii値）の10回分の総和を指す。i値は、測定された糞便の重量（g）であり、ii値は、図5に示された糞便スコア基準から決定されたスコア（すなわち、スコア1、普通便；スコア2、やや下痢便；スコア3、形が崩れだした下痢便；スコア4、形のない下痢便）である。
　さらにまた、上記(22)の「後述の実施例3記載の方法」は、簡単に説明すると、ラット（4週齢、雄）に、CRF-1（商標）餌25gに対し、菌数2.0×1010個が含まれる試験菌体の凍結乾燥粉末を配合した試験菌体配合餌を3週間自由摂取させたのち、コルチコトロピン放出因子（CRF; Corticotropin Releasing Factor）溶液を該ラットに125μg/kg腹腔内投与してストレス性下痢を誘発させ、CRF投与後の100分間の糞便状況を下痢スコア（上記）を用いて評価し（各群19匹）、その結果に基づいて試験菌体のストレス性下痢抑制を評価することを含む方法である。
　本発明のラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）から派生した株もしくはCP2305s株から派生した株、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物は、ストレス誘発性骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害して腸運動を正常に保持すること、並びに、被験体のストレス性下痢を効果的に抑制するため、ストレス性腸障害の予防、軽減又は治療に有効である。特に、本発明のラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した株（例えば低温耐性株）、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物は、ストレス誘発性骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害して腸運動を正常に保持すること、被験体の腸管での水分過剰分泌を顕著に抑制すること、並びに、被験体のストレス性下痢を効果的に抑制することなどのため、ストレス性腸障害の予防、軽減又は治療に有効である。
この図は、ラクトバチルス・ガセリCP2305株にコールドショックを施して得られた低温耐性株（CP2305s、A～D）の生菌率を示す。 この図は、CRF誘発下痢モデルに対するラクトバチルス・ガセリCP2305株の生菌体、殺菌体、及び派生株CP2305s殺菌体の影響を示す。プラセボは、CP2305株非含有の陰性対照である。また、＊は、危険率pが0.05未満であることを示す。 この図は、CRF誘発後の結腸クロライド・チャネル関連遺伝子発現変動を示す。プラセボ群でCRF投与後に増加するクロライド・チャネル関連遺伝子を、CP2305株投与群では抑制することを示している。図中、Agtはangiotensinogen (serpin peptidase inhibitor, clade A, member 8)、Adcy5はadenylate cyclase 5、Adora1はAdenosine receptor A1、Ngfはnerve growth factor (beta polypeptide)、Igf2はinsulin-like growth factor 2、Igf1はinsulin-like growth factor 1 を表す。 この図は、骨盤(副交感)神経に対するCP2305株投与の影響を示す。 この図は、本発明に関する実験における下痢スコアを算出するための、糞便スコア基準を示したものである。糞便の「水分状況」・「形状」によって糞便スコアを１～4の4段階で評価を行った（表中の糞便の色は糞便スコア基準の対象としないが、本発明の効果を示すための参考情報として付する。）。 この図は、CRF誘発下痢モデルに対する各種乳酸菌投与の影響を示す。乳酸菌は、ラクトバチルス・ガセリCP2305株の生菌体、公知寄託菌株A（L. gasseri）および市販生菌製剤B（L. acidophilus 含む）である。プラセボは、CP2305株非含有の陰性対照である。また、＊は、危険率pが0.05未満であることを示す。 この図は、各種乳酸菌の殺菌発酵乳の投与が大腸の神経刺激誘発のイオン輸送に及ぼす影響を示す。縦軸は、イオン分泌のパーセンテージを、プラセボ（陰性対照）のイオン分泌を100％とした時の値を示す。図中、A：公知寄託菌株A(L. gasseri)、B：L. acidophilus、C：B. pseudocatenulatum、D：L. delbrueckii、E：S. thermophilus、F：L. kefirgranumを示す。＃は、危険率pが0.05未満であることを示す。 この図は、CP2305株、公知寄託菌株A(L. gasseri)及びL. acidophilusの各殺菌体の投与がラット大腸（遠位結腸）の神経刺激誘発のイオン輸送に及ぼす影響を示す。縦軸は、イオン分泌のパーセンテージを、プラセボ（陰性対照）のイオン分泌を100％とした時の値を示す。＊は、危険率pが0.05未満であることを示す。 この図は、ラット大腸（遠位結腸）のイオン輸送に対するCP2305株の生菌体と殺菌体、CP2305株の生菌発酵乳と殺菌発酵乳の投与の影響を示す。縦軸は、イオン分泌のパーセンテージを、プラセボ（陰性対照）のイオン分泌を100％とした時の値を示す。＃は、危険率pが0.05未満であることを示す。
　本発明をさらに具体的に説明する。
＜腸管での水分過剰分泌の抑制剤＞
　本発明は、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）（以下、単に「CP2305株」とも称する。）の生菌体若しくは殺菌体、その菌体処理物、或いはその混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、被験体の腸管での水分過剰分泌の抑制剤を提供する。
＜低温耐性ラクトバチルス・ガセリ株＞
　本発明はまた、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）（以下、単に「CP2305s株」とも称する。）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株（例えば低温耐性派生株）、を提供する。
　ラクトバチルス・ガセリ株を、10℃以下の温度に暴露し、生存した低温耐性株を選抜し、育種すること、必要に応じてこの操作を１回以上繰り返すこと、生存した低温耐性株を回収することを含む方法を用いることによって、低温耐性株を製造することができる。この操作によって、コールドショック後に、生菌率が約60％以上、好ましくは、約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、85％以上、90％以上、の低温耐性株を得ることができる。
　このようなコールドショック法により、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）を含めて数種の低温耐性株を得ることができた（図１）。このラクトバチルス・ガセリCP2305s株は、本出願人により、ブダペスト条約の規定に基づく国際寄託機関である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、2012年8月14日付でNITE BP-1405として国際寄託されている。
　なお、親株であるラクトバチルス・ガセリCP2305株は、本出願人により、ブダペスト条約の規定に基づく国際寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、2007年9月11日付でFERM BP-11331として国際寄託されている。この株は、現在、国際寄託機関である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に移されて保管されている。
＜ストレス性腸障害等の軽減剤＞
　本発明はさらに、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）若しくはCP2305s株から派生した派生株（例えば低温耐性派生株）、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の軽減剤を提供する。
　CP2305株、CP2305s株、又はCP2305株若しくはCP2305s株からの派生株（例えば低温耐性派生株）は、生菌体又は殺菌体のいずれでもよい。
　本明細書中の「被験体」は、哺乳類及び鳥類に属する動物、好ましくはヒトなどの霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウなどの家畜動物、ウマなどの競技用動物、イヌ、ネコなどの愛玩動物などである。
　CP2305株やCP2305s株と同様に、CP2305株もしくはCP2305s株からの他の派生株もまた、親株と同等以上のストレス性腸障害の軽減作用、及び腸管での水分過剰分泌の抑制作用を有する、かつ、前記株と異なるラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌として得ることができる。そのような派生株は、親株に紫外線を照射すること、変異原性物質の存在下で親株を培養すること、至適温度以外の温度で培養すること、有機溶剤存在下で培養することなどの、親株にとって非一般的な条件下に親株を置くことによって作製可能である。変異原性物質として、例えば、3-アミノ-1,4-ジメチル-5H-ピリド[4,3-b]インドール（Trp-P-1）、2-アミノ-6-メチルイミダ-5H-ピリド[1,2-a-3’,2’-d]-イミダゾール（Glu-P-1）、2-アミノ-3,4-ジメチルイミダゾ[4,5-f]キノリン（MeIQ）、4-ニトロキノリン-Ｎ-オキシド（4NQO）、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（MNNG）などが挙げられる。目的の派生株は、例えば、(1)ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）と同等以上のストレス性腸障害の軽減作用を有する、例えばストレス性腸障害の軽減作用が下痢スコアで前記株と同等以上のストレス性下痢抑制作用を有する、(2)氷上で5時間以上保持したときの生存率が60％以上である、(3)ストレスによる骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有する、(4)大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、ことを指標にして、選抜することができる。本発明は、このような(1)の特性、及び、(2)～(4)のいずれかの特性を有する乳酸菌にも関する。
　関連する公知ラクトバチルス・ガセリ株に関して、炎症性腸疾患又は過敏性腸症候群の予防・治療効果があるラクトバチルス・ガセリSBT 2055株(FERM P-15535)が知られている（特開2003-95963号公報）。この菌は、日本人の腸から分離・培養された乳酸菌であり、DDS誘発潰瘍性大腸炎モデルを使用した生菌での試験では、対照群に比べて血便や下血が抑制されたと報告されている。また、腸内菌叢を改善して下痢の発症を低減するラクトバチルス・ガセリOLL2716株(FERM BP-6999)が知られている（特開2004-305128号公報）。その実施例では、仔牛の飼育の間に下痢の発生率（試験牧場に導入後2週間以内に下痢を発生した率）が低下したと記載されている。しかし、これらの公知ラクトバチルス・ガセリ株は、以下に記載するように、CP2305株や、その低温耐性派生株であるCP2305s株と明らかに異なる株である。
　本発明の、CP2305株の低温耐性株であるCP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの派生株（例えば低温耐性派生株）、の生菌体及び殺菌体、並びに該株の菌体処理物は、意外にも腸管からの水分過剰分泌を抑制する作用を有し、ストレス性下痢を著しく抑制する効果を有している（図1及び図2参照）。この作用は、親株であるラクトバチルス・ガセリCP2305株の殺菌発酵乳を、公知の寄託ラクトバチルス・ガセリ株、L. acidophilus、B. pseudocatenulatum、L. delbrueckii、S. thermophilus及びL. kefirgranumの殺菌発酵乳と比較した場合であっても、格別有意である（図７）。腸管からの水分過剰分泌の抑制は、CRF投与ラットの結腸組織での遺伝子発現の網羅的解析により、CP2305株が、大腸クロライドチャネルを抑制し、水分の移動を制御していることによることが立証された（図3参照）。このCP2305株はまた、今回、ストレス誘発性骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有することが、下部大腸を神経支配する骨盤（副交換）神経の電気活動を測定することによって証明された。CP2305株の投与によって、被験体のストレス時の腸管機能が正常に回復し維持される。このため、CP2305株は、ストレス性腸障害の下痢症状を有意に軽減するという格別の効果を有する。上記のCP2305s株及びその低温耐性株などの派生株もまた、ストレス性腸障害、とりわけストレス性下痢、を軽減する作用効果を有する。
　本発明のラクトバチルス・ガセリCP2305株、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株は、乳酸菌の培養に通常用いられる培地を使用して、適当な条件下で培養することにより調製することができる。培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、乳酸菌の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよく、当業者であれば使用する菌株に適切な公知の培地を適宜選ぶことができる。炭素源としてはラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、ガラクトース、廃糖蜜などを使用することができる。また、窒素源としてはカゼインの加水分解物、乳漿タンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物を使用することができる。無機塩類としては、リン酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどを用いることができる。乳酸菌の培養に適した培地としては、例えばMRS液体培地、GAM培地、BL培地、Briggs LiverBroth、獣乳、脱脂乳、乳性ホエーなどが挙げられる。好ましくは、滅菌されたMRS培地を使用することができる。
　また、本発明のCP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株の培養は、20℃～50℃、好ましくは25℃～42℃、より好ましくは約37℃において、嫌気的培養条件下で行う。温度条件は、恒温槽、マントルヒーター、ジャケットなどにより調整することができる。ここで、嫌気条件下とは、菌が増殖可能な程度の低酸素環境下のことであり、例えば嫌気チャンバー、嫌気ボックス又は脱酸素剤を入れた密閉容器若しくは袋などを使用することにより、あるいは単に培養容器を密閉することにより、嫌気条件とすることができる。培養は、静置培養、振とう培養、タンク培養などのいずれの培養様式でもよい。また、培養時間は3時間～100時間又はそれ以上、好ましくは約10時間～50時間とすることができる。培養開始時の培地のpHは3.5～8.0に維持することが好ましい。
　培養後、培養液から濾過、遠心分離等の分離技術により分離した生菌体、或いは生菌体含有培養液を得ることができる。また、これらの生菌体又はその培養液を、オートクレーブ等による公知の殺菌処理にかけることによって、殺菌体を得ることができる。また、生菌体又は生菌体培養液から菌体処理物を作製し、必要に応じて殺菌処理にかけることができる。
　菌体処理物は、菌体を、乾燥処理、破壊又は破砕処理、発酵処理などの物理的、化学的、生物学的処理等にかけることによって得られるものである。したがって、本発明で使用する菌体処理物の例は、乾燥菌体、破壊菌体、破砕菌体、発酵処理物（例えば、発酵乳）などである。
　乾燥菌体は、上記培養液から分離した菌体を、必要であれば殺菌処理にかけられた菌体を、乾燥処理にかけることによって得ることができる。乾燥処理としては、例えばドラム乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などを挙げることができる。
　破壊菌体又は破砕菌体は、菌体を、破砕、磨砕、酵素処理、薬品処理、溶解などによって処理することによって得ることができる。破壊菌体又は破砕菌体は、破壊又は破砕された菌体の固体成分及び可溶性成分のすべてから本質的になり、例えば破壊物又は破砕物をそのまま凍結乾燥にかけることによって得ることができる。破壊又は破砕は、公知の手法、例えば物理的破砕、酵素溶解処理、薬品処理、等によって行うことができる。物理的破砕は、湿式又は乾式のいずれで行ってもよく、ホモゲナイザー、ボールミル、ビーズミル、ダイノミル、遊星ミル等を使用した撹拌により、ジェットミル、フレンチプレス、細胞破砕機、等を使用して行うことができる。酵素溶解処理は、例えばリゾチームなどの酵素を用いて、菌の細胞構造を破壊することによって行うことができる。薬品処理は、グリセリン脂肪酸エステル、ダイズリン脂質などの界面活性剤を使用して、菌の細胞構造を破壊することによって行うことができる。好ましくは、物理的破砕である。
　破砕物を調製するための具体的な方法は、例えば、菌の懸濁液を、公知のダイノミル細胞破砕機（DYNO-MILL破砕装置（シンマルエンタープライゼス（日本国、大阪、堺））など）において、ガラスビーズを使用して、周速10.0～20.0m/s（例えば約14.0m/s）、処理流速0.1～10L/10min（例えば約1L/10min）にて、破砕槽温度10～30℃（例えば約15℃）で1～7回（例えば3～5回）処理することによって、菌体を破砕することを含む。また例えば、菌の懸濁液を、公知の湿式ジェットミル細胞破砕機（JN20 ナノジェットパル（常光（日本国、神奈川、川崎））など）において、吐出圧力50～1000Mpa（例えば270MPa）、処理流速50～1000（例えば300ml/min）にて、1～30回（例えば10回）処理することによって、菌体を破砕することができる。また、公知の乾式遊星ミル細胞破砕機において、菌体粉末を各種ボール（例えばジルコニア製10mmボール、ジルコニア製5mmボール、アルミナ製1mmボール）共存下で、回転数50～10,000rpm（例えば240rpm、190rpm）で30分～20時間（例えば5時間）処理することによって、菌体を破砕することも可能である。菌体粉末を公知の乾式ジェットミル細胞破砕機（ナノジェットマイザーなど）において、供給速度0.01～10000g/min（例えば0.5g/min）、吐出圧力1～1000kg/cm2（例えば6kg/cm2）の圧力にて、複数回処理することによって、菌体を破砕してもよい。
　発酵乳は、生乳、脱脂粉乳又は豆乳などに菌株を接種し、乳酸菌発酵条件にて発酵を行うことによって得ることができる。得られる発酵産物は、必要に応じて、濾過、希釈、濃縮などの処理にかけてもよい。
　上記の菌体及び菌体処理物は、そのまま使用するか、或いは、殺菌処理にかけて殺菌体としうる。殺菌処理は、例えば高エネルギー線照射による殺菌、加熱殺菌、加圧殺菌、オートクレーブ殺菌などの公知の処理を含む。好ましい殺菌法は、オートクレーブ殺菌である。この方法は、オートクレーブ（高圧蒸気滅菌器）内で、生菌又は生菌含有培養液を、例えば約10分～１時間にわたり、加圧水蒸気下で例えば110℃～140℃の温度で殺菌することを含む。
　上記の特性のために、本発明のCP2305株、CP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、或いはその菌体処理物は、下記に記載する、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、ストレス性下痢、過敏性腸症候群、下痢型過敏性症候群、又は、炎症性腸疾患の軽減剤として有用である。
　明細書中「ストレス性下痢」とは、脳内ストレスホルモンが分泌されるようなストレスに曝露された状況下、すなわちストレスに起因する腸管での水分過剰分泌を伴う症状であり、腹痛を伴う場合と伴わない場合がある。
　明細書中「ストレス性腹痛」とは、脳内ストレスホルモンが分泌されるようなストレスに曝露された状況下、すなわちストレスに起因する腸管において生じる腹痛を意味する。
　したがって、特に、健常人に対するストレスに起因するストレス性の症状である点において、明細書中、「ストレス性下痢」と「ストレス性腹痛」は、過敏性腸症候群（IBS）の患者と区別される。
　明細書中、「ストレス性下痢」と「ストレス性腹痛」をあわせて、「ストレス性腸障害」と呼ぶ。
　したがって、明細書中、「ストレス性腸障害の下痢症状」とは、ストレス性下痢の症状を意味する。
　明細書中「腸管の水分過剰分泌」とは、ストレス起因か否かに関係なく、腸管での水分過剰分泌を意味する。
　明細書中「過敏性腸症候群」とは、過敏性腸症候群は、腸の粘膜に炎症やポリープ・腫瘍など（器質的病変という）がなく、ただ腸の働きが強くなりすぎることによって腹痛や便通異常（特に、下痢、便秘・下痢を繰り返す交替型）などといった症状が現れる病気である。特に、下痢型過敏性腸症候群は、大腸の知覚過敏により腸内容物通過時に過敏な反応が起こり、排出を促す収縮運動が過剰に誘発され、下痢症状が頻発し慢性的な腹痛を伴うことから、ストレスによる継続的不安に悩まされ精神疾患の併発率が高まる。診断基準は、RomeIIIに規定されており、ストレス環境の有無に関係なくQOLの低い患者である。
　明細書中、「炎症性腸疾患」とは、主として消化管に原因不明の炎症を起こす慢性疾患の総称で、主に潰瘍性大腸炎、クローン病の2疾患からなる。ストレスによって悪化し、下痢症状を伴う。
　本発明の軽減剤（若しくは抑制剤）は、CP2305株、CP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、その菌体処理物、或いはその混合物からなる有効成分を、以下のものに限定されないが、該軽減剤あたり、例えば約0.1重量％～100重量％、好ましくは約10重量％～約90重量％含有する。
　上記軽減剤（若しくは抑制剤）は、上記有効成分の他に、賦形剤、希釈剤又は担体、必要に応じてその他の添加物を含むことができる。その形態は、固体形態又は液体形態のいずれでもよい。固体形態は、例えば粉末、顆粒、タブレット、ペレットなどの任意の形状からなる。また、液体形態は、例えば懸濁液、乳濁液、発酵液（例えば発酵乳）などの形状である。
　賦形剤、希釈剤又は担体は、以下に述べるような食品、動物飼料又は医薬品で通常使用されうる物質である。他の添加物は、必ずしも必要ないが、添加する場合、以下に記載されるような、例えば保存料、pH調整剤、乳化剤、酸化防止剤、着色料などを挙げることができる。
＜食品又は動物飼料＞
　本発明はさらに、上記のラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、或いは、上記軽減剤（若しくは抑制剤）を含有する食品添加剤又は動物飼料添加剤を提供する。
　上記軽減剤（若しくは抑制剤）が、有効成分の他に、賦形剤、希釈剤又は担体、及びその他の添加物を含む場合、食品添加剤又は動物飼料添加剤として使用することができる。これらの食品添加剤又は動物飼料添加剤は、固体形態又は液体形態のいずれでもよい。固体形態は、例えば粉末、顆粒、タブレット、ペレット、ゲル、カプセルなどの任意の形状からなる。また、液体形態は、例えば懸濁液、乳濁液、発酵液（例えば発酵乳）などの形状である。賦形剤、希釈剤又は担体は、食品又は動物飼料で通常使用されうる物質であり、また他の添加物は、例えば保存料、pH調整剤、乳化剤、着色料、栄養補助剤、（天然若しくは人工）甘味料、調味料、香料などを挙げることができる。
　食品添加剤又は動物飼料添加剤は、上記軽減剤を、以下のものに限定されないが、添加剤あたり、例えば約1重量％～約50重量％、好ましくは約5重量％～約20重量％含有することができる。
　食品添加剤又は動物飼料添加剤は、食品又は動物飼料に添加して、被験体の腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の軽減するために使用することができる。
　本発明はさらに、上記の軽減剤（若しくは抑制剤）を含む動物飼料、或いは、上記の軽減剤（若しくは抑制剤）を動物飼料成分と配合して、被験体の腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の軽減する効果を有する動物飼料を製造することを含む、動物飼料の製造方法を提供する。
　すなわち、動物飼料を製造するための飼料成分に、本発明の軽減剤を有効量配合し、必要であれば任意の剤型に製剤化することによって動物飼料を製造することができる。
　本発明はさらに、上記のラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、或いは、上記の軽減剤を含む飲食品、機能性飲食品、或いは、上記の軽減剤を食品用担体、賦形剤又は希釈剤と混合し、場合により食品添加物をさらに混合して、被験体の腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患を軽減する効果を有する機能性飲食品を製造することを含む、機能性飲食品の製造方法を提供する。
　動物飼料又は機能性飲食品において、上記軽減剤の配合量は、飼料や飲食品の形態や求められる効果（すなわち、被験体の腸管での水分過剰分泌を抑制し、ストレス性腸障害、ストレス性下痢等を抑制する）を考慮して、当業者が適宜定めることができる。動物飼料又は機能性飲食品中のCP2305株、CP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、の殺菌体もしくは生菌体及び/又は菌体処理物の総量が、以下のものに限定されないが、該菌の生菌量として、105～1014cfu/g、好ましくは106～約1013cfu/g、より好ましくは107～1012cfu/gに相当する量であるか、或いは、該菌の量として、例えば0.001重量％～10重量％、好ましくは0.01～5重量％となるような量である。その有効量は、添加量と下痢症状の軽減効果との関係に基づいて、当業者が適宜設定することが可能である。
　動物飼料の剤型は、固体形態の場合、例えば粉末、顆粒、タブレット、ペレットなどの任意の形状からなり、また、液体形態の場合、例えば懸濁液、発酵乳などの形状である。
　機能性食品の剤型は、固体形態の場合、例えば粉末、顆粒、タブレット、ペレット、ゲル、カプセルなどの任意の形状からなり、また、液体形態の場合、例えば懸濁液、乳濁液、発酵乳などの形状である。
　上記の剤型中、タブレット、ペレット及びカプセルは、必要であれば、腸溶性となるように腸溶性物質で単層又は多層にコーティングすることができる。腸溶性物質は、胃液等の酸性域のpHで溶けず、中性域のpHで溶解するものであり、例えばヒプロメロースフタル酸エステル、セラック、ゼイン、ラクトフェリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースなどを挙げることができる。
　賦形剤、希釈剤又は担体は、以下のものに限定されないが、水、乳発酵液、炭酸水、エタノール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、カルボキシメチルセルロース、スターチ、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどを挙げることができる。
　動物飼料又は機能性飲食品の製造においては、飼料又は飲食品に慣用的に使用されるような各種添加物を使用しうる。添加物としては、以下のものに限定するものではないが、着色料（植物色素、合成色素等）、香料（天然香料等）、甘味料（ステビア、アステルパーム等）、保存料（酢酸ナトリウム、ソルビン酸等）、乳化剤（コンドロイチン硫酸ナトリウム、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）、酸化防止剤（EDTA二ナトリウム、ビタミンC等）、pH調整剤（クエン酸等）、化学調味料（イノシン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム等）、増粘剤（キサンタンガム等）、膨張剤（炭酸カルシウム等）、消泡剤（リン酸カルシウム）、結着剤（ポリリン酸ナトリウム等）、栄養強化剤（カルシウム強化剤、ビタミンA等）、等が挙げられる。その他、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、食物繊維、酸味料、安定剤、フレーバー、天然物エキスなどを配合しうる。配合量は、添加物としての効果が発揮される量であり、適宜選択可能である。
＜医薬組成物＞
　本発明はさらに、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はCP2305株又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、ストレス性腸障害を予防、軽減若しくは抑制、又は治療するための医薬組成物を提供する。
　或いは、本発明は、上記の軽減剤（若しくは抑制剤）と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤又は希釈剤とを含む、被験体のストレス性腸障害、とりわけ水分過剰分泌やストレス性下痢、を予防、軽減若しくは抑制、又は治療するための医薬組成物を提供する。
　いずれの医薬組成物においても、本発明の有効成分は、ストレス性腸障害、とりわけ水分過剰分泌やストレス性下痢を抑制する効果を有する。
　CP2305株、CP2305s株、又はCP2305株又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株（以上、生菌体若しくは殺菌体）、又はその菌体処理物は、上記のとおり、ストレス誘発性骨盤（副交感）神経抑制を阻害する作用、すなわち抗ストレスにより腸管運動を正常に維持する働きを有すること、及び、大腸クロライドチャネルを抑制し、それによって腸管での水分過剰分泌を抑制する作用を有し、ストレス性下痢を抑制、軽減又は改善する。ストレスは、ストレスに過敏な腸障害をもたらし、該障害の症状を悪化させる。本発明のCP2305株、CP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、（以上、生菌体若しくは殺菌体）、或いはその菌体処理物は、ストレス性腸障害、とりわけストレス性腸障害の頻発の下痢症状を抑制するため、ストレス性腸障害の予防、軽減若しくは抑制、又は治療のために有効である。この効果は、市販されるいずれのラクトバチルス・ガセリ株製剤と比較しても高いことが確認された。
　医薬組成物は、上記効果を発揮するかぎりいずれの剤型に製剤化しうる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤、乳濁剤、発酵乳剤などであり、経口製剤、坐剤など、特に経口製剤が好ましい。
　本発明の有効成分に、薬学的に許容される通常用いられる賦形剤、担体、希釈剤、崩壊剤、結合剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、滑沢剤、保存剤、界面活性剤、甘味料、矯味剤、芳香剤、酸味料、着色剤などの添加物を剤型に応じて配合し、常法に従って製造することができる。これらの物質の例は、上記の物質である。
　医薬組成物中の上記のCP2305株、CP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、及び/又は菌体処理物の総量が、以下のものに限定されないが、該菌の生菌量として、105～1012cfu/g、好ましくは106～約1012cfu/g、より好ましくは107～1012cfu/gに相当する量であるか、或いは、該菌の量として、例えば0.001重量％～10重量％、好ましくは0.01～5重量％となるような量である。その有効量は、添加量と下痢症状の軽減効果との関係に基づいて、当業者が適宜設定することが可能である。
　好ましい投与法は、経口投与又は坐剤投与である。
　本発明の医薬組成物は、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の予防、ストレス時の下痢症状の悪化、の予防、軽減又は治療に有効である。
　以下に実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に制限されないものとする。
［実施例１］
＜低温耐性株の育種＞
　内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管に入った10mlの培養液（食添培地）にラクトバチルス・ガセリCP2305株（菌数103個～10４個）を接種し、37℃、19時間培養を行った。
　19時間の培養後、この内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管を、試験管内の液面以上となる十分な量の氷の中に挿入し(氷上)急速冷却し5時間保持した。この培養、および冷却を80回繰返し、低温耐性の高い株を育種した。
　本明細書において「氷上」とは、内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管に10mlの培養液を入れて、試験管内の液面以上となる十分な量の氷の中に試験管を挿入して冷却している状態をいう。
　なお、本明細書で使用する「食添培地」の組成は下記のとおりである（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜低温耐性株の評価＞
　本発明の低温耐性株の評価における上記低温耐性株の生存性の評価を、下記の式のように、低温曝露前後の生菌率（本明細書において「生存率」ともいう。）で評価した。具体的には、評価対象株（菌数103個～10４個）を内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管に入った10mlの培養液（食添培地）に接種し、37℃、19時間培養を行った。19時間の培養後、この内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管を、試験管内の液面以上となる十分な量の氷の中に試験管を挿入して(氷上)にて急速冷却し、氷上で5時間保持した後、急速冷却前(低温暴露前)の生菌数と氷上で5時間保持後(低温曝露後)の生菌数を比較し下記式で生菌率を評価する。
　生菌率は、少なくとも60%以上、好ましくは65%以上、さらに好ましくは、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上の生菌率（下記の式参照）を示す株が好ましい。
　生菌率(%)=低温曝露後の生菌数/低温曝露前の生菌数×100
　上記生菌数のカウント方法は、培養液をMRS寒天培地またはBCP加プレートカウント寒天培地に塗抹し、37℃微好気で48時間培養を行い、コロニーをカウントし生菌数を測定し評価した。
　上記育種および評価により、60%以上の生菌率を示すCP2305s株などの数種の耐性株を取得した(図1)。
［実施例２］
＜低温耐性株の製造方法＞
　なお、低温耐性株の製造方法としては、例えば、CP2305株は10℃以下で生存率が低くなる傾向を示す。このため、低温耐性株の製造方法としては、対象株を、培養液(例:食添培地)にて適度な培養温度(例:37℃程度)で程度な培養時間(例:19時間程度)培養し、その後、培養液を10℃以下、好ましくは7℃以下、より好ましくは5℃以下、さらに好ましくは3℃以下、2℃以下、1℃以下の温度に適度な時間（例：5時間）曝露して、また、必要に応じ、これらの培養、低温曝露を繰り返すことによって、目的とする温度である低温に耐性がある株を製造する。
［実施例３］
　SD雄ラット（４週齢、日本チャールス・リバー社製）を12時間毎の明暗周期下（8時より12時間点灯）で１週間飼育後、試験菌体配合餌を以下のように3週間自由摂取させた。
a)餌は、オリエンタル酵母株式会社のCRF-1粉末餌を使用した。
b)上記餌（CRF－１）25ｇに対し、菌数2.0×1010個が含まれる試験菌体の凍結乾燥粉末を配合（餌CRF-1：25gに対し、凍結乾燥粉末0.25g）し、試験菌体配合餌とした。
c)試験菌体配合餌を３週間自由摂取させた。
d)この試験による菌体摂食量はおおよそ2.0×1010個/日と推定された。
e)各群19匹に摂取させた。
　3週間後、CRF（Corticotropin Releasing Factor、アナスペック社製、USA）溶液を125μg/kg腹腔内投与し、ストレス性下痢を誘発させ、CRF投与後の100分間の糞便状況を以下に記載する下痢スコアにて評価し、試験菌体のストレス性下痢抑制を評価した。
　下痢スコアの定義は、以下のとおりである。
(a)CRF投与後の100分間の糞便を10分間隔で10回採取する。
(b)各回で採取した糞便の重量をg単位で測定する(各回の糞便重量(i値))。例えば、ある回の糞便重量が0.4gであった場合は、i値=0.4とする。
(c)各回で採取した糞便について、糞便の水分状況及び形状から図5に示す糞便スコア基準により、各回の糞便スコアとして数値化する（各回の糞便スコア（ii値））
(d)各回の糞便重量（i値）×各回の糞便スコア（ii値）を求める。
(e)各回で求めた、糞便重量（i値）×糞便スコア（ii値）の10回分の総和を「下痢スコア」と定義する。
(f)これによって、CRF投与後100分間の糞便状況を、プラセボ（CRF-1のみ）も含めて評価した（Dunnetの多重比較により評価）。
　その結果、本発明のラクトバチルス・ガセリCP2305株の生菌体及び殺菌体は、プラセボ（CRF-1のみ）と比較して、有意にストレス性下痢を抑制した（図2）。
［実施例４］
　上記実験および定義された下痢スコアに基づいて、下記の効果を確認した。
　その結果、ラクトバチルス・ガセリCP2305ｓ株（殺菌体）は、プラセボ（CRF-1のみ）と比較して、有意にストレス性下痢を抑制した（図2）。下痢抑制効果は、CP2305株（生菌体及び殺菌体）と比べて同等の効果を有している。
　上記実施例3の結果から、乳酸菌において、実施例3における下痢スコアにおいて11以下の乳酸菌を得ることが証明された。下痢スコアは、好ましくは10以下、さらに好ましくは9以下である。
　さらに、実施例3の結果から、下痢スコアにおいてプラセボに対する下痢スコアの低減割合が90％以下の乳酸菌が得られることが証明された。下痢スコアの低減割合は好ましくは85％以下、より好ましくは、80％以下が好ましい（下痢スコア低減割合＝評価対象株下痢スコア/プラセボ下痢スコア×100）。
［実施例５］
　比較対象とした寄託菌株Ａ菌体（L. gassei）の結果は、CP2305株と同菌数投与した結果である。また、市販生菌製剤Ｂ（L. acidphilus）の結果は、ヒト1日分の摂取用量の重量をラットの体重換算で、単位体重あたり同量となるよう投与した結果である（図6）。本結果から従来下痢抑制作用があるとされている市販生菌剤などよりストレス性下痢を抑制する作用がCP2305株であることが証明され、CP2305ｓ株もCP2305株と同様のストレス性下痢の抑制効果があることからCP2305ｓ株の優位性が証明された。
［実施例６］
　さらにまた、CRF投与4時間後に解剖を実施し、結腸組織をISOGEN(ニッポンジーン)およびRNeasy Mini Kit(Qiagen,USA)にて総RNAを抽出後、遺伝子発現をRat whole genome ver. 3 (G4847B,Agilent,USA)で網羅的に解析を行った。その結果、プラセボ群でCRF投与後に増加するクロライド・チャネル関連遺伝子を、CP2305株投与群では抑制することを確認した（図3）。従って、CP2305株はクロライドチャネルを抑制し、水分の移動を制御していると考えられ、また、同様の下痢抑制効果を有するCP2305s株もクロライドチャネルを抑制し、水分の移動を制御していると考えられる。
［実施例７］
　SD系雄ラット（４週齢、株式会社紀和動物製）を12時間毎の明暗周期下（8時より12時間点灯）で１週間飼育後、CP2305株配合餌もしくは未配合対照粉餌を3週間自由摂食させた。実験当日はラットを3時間絶食させた後、ウレタン麻酔し、頚静脈に静脈投与用のカニューレを挿入し、その後、下部大腸を神経支配する骨盤（副交感）神経を銀電極で吊上げ、その電気活動を測定した。測定値が安定した時期にCRF溶液（1μg/kg）を頚静脈投与し骨盤神経の電気活動（PNA）の変化を電気生理学的に測定した。データは5分間毎の5秒あたりの発火頻度の平均値にて解析し、頚静脈投与直前の値（0分値）を100％として百分率で示した。その結果、ストレスホルモン(CRF）投与することで、ラット大腸を神経支配する骨盤（副交感）神経活動が抑制されることを確認した。更にはCP2305株の投与がストレス誘発の骨盤(副交感)神経抑制を阻害することを確認した（図4）。従って、CP2305株の投与により、ストレス時の腸管機能が正常に保たれるものと考えられ、また、同様の下痢抑制効果を有するCP2305s株も同様の効果があると考えられる。
[実施例８]
　SDラット（体重380～400g、日本SLC社製）を麻酔後、断頭、放血屠殺し、解剖学的基準により遠位結腸(distal colon)摘出し、実態顕微鏡下で輪走筋および縦走筋層を剥離し、粘膜下神経叢を含む粘膜－粘膜下神経叢標本を作製した。標本を測定面積0.64cm2のUssing chamber(CHM2, WPI, FL, USA)に装着し、標本の粘膜側－漿膜側間に生じる電位差及び短絡電流short-circuit current(ISC)を測定した。1分間に3秒間10mVのコマンドパルスを組織に与え、短絡電流の変化量から膜コンダクタンス（Gt）を算出した。basel ISC およびGtが安定したところで粘膜下神経に電気刺激(25V, duration of 0.5ms, 5Hz, 120s)を行い組織の状態を確認した。その後、試験乳酸菌の菌体または発酵乳の希釈溶液(500μg/ml)を粘膜側に投与し、ISCおよびGtの変化を測定し、神経刺激誘発により発生するCl－/HCO3 －分泌に対する試験物質の影響を評価した。
　各種乳酸菌の殺菌発酵乳の影響を評価した結果、CP2305株の殺菌発酵乳は、公知寄託菌株A（L. gasseri）及び他の5菌株（B～F）よりも強くイオン分泌を抑制し、水分分泌を制御し、下痢抑制に寄与していることが示唆された（図7）。
[実施例９]
　さらに、ラット大腸（遠位結腸）の神経刺激誘発のイオン輸送に及ぼす菌体のみの影響を評価するために、各種乳酸菌の殺菌体を調製し、投与した結果、CP2305株殺菌体は、公知寄託菌株A（L. gasseri）殺菌体及びL. acidophilus殺菌体と比較し、有意にイオン分泌を顕著に抑制し、下痢抑制に強く寄与していることが示唆された（図8）。
　さらにまた、ラット大腸（遠位結腸）の神経刺激誘発のイオン輸送に及ぼすCP2305株の生菌体、生菌発酵乳、殺菌体、殺菌発酵乳の投与による影響を調べた結果、そのすべての形態で、とりわけCP2305株殺菌体で、下痢抑制に強く寄与していることが示された（図9）。
　本発明のラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの派生株（例えば低温耐性派生株）、その菌体処理物、或いはその混合物は、ストレス誘発性骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害して腸運動を正常に保持するとともに、被験体のストレス性腸障害、とりわけ該障害のストレス性下痢症状、を抑制、軽減又は改善することができる。

Claims (34)

  1. 　ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株（NITE BP-1405）から派生した派生株、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、又は炎症性腸疾患の軽減剤。
  2. 　ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、その菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、又はストレス性下痢の軽減剤。
  3. 　ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）の殺菌体、その菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、又はストレス性腸障害の軽減剤。
  4. 　前記CP2305株、前記CP2305s株、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株（NITE BP-1405）から派生した派生株が、生菌体又は殺菌体である、請求項１又は２に記載の軽減剤。
  5. 　前記菌体処理物が、乾燥菌体、破壊菌体、破砕菌体又は発酵乳である、請求項１～４のいずれか１項に記載の軽減剤。
  6. 　ストレスによる骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有する、請求項１～５のいずれか1項に記載の軽減剤。
  7. 　大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、請求項１～６のいずれか1項に記載の軽減剤。
  8. 　ストレス性下痢の改善剤である、請求項１～７のいずれか1項に記載の軽減剤。
  9. 　請求項１～８のいずれか1項に記載の軽減剤を動物飼料成分と配合して動物飼料を製造する工程を含む、動物飼料の製造方法。
  10. 　ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株（NITE BP-1405）から派生した派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する動物飼料。
  11. 　請求項１～１０のいずれか1項に記載の軽減剤を含有する食品添加剤又は動物飼料添加剤。
  12. 　ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する食品添加物。
  13. 　ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する飲食品。
  14. 　機能性飲食品である、請求項１３に記載の飲食品。
  15. 　請求項１～８のいずれか1項に記載の軽減剤を食品用の担体、賦形剤又は希釈剤と混合し、場合により食品添加剤をさらに混合して、機能性飲食品を製造することを含む、機能性飲食品の製造方法。
  16. 　ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、又は炎症性腸疾患の予防、軽減若しくは抑制、又は治療するための医薬組成物。
  17. 　ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）、その菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、又はストレス性下痢の予防、軽減若しくは抑制、又は治療するための医薬組成物。
  18. 　ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）の殺菌体、その菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害の予防、軽減若しくは抑制、又は治療するための医薬組成物。
  19. 　請求項１～８のいずれか1項に記載の軽減剤と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤又は希釈剤とを含む、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、又は炎症性腸疾患を予防、軽減若しくは抑制、又は治療するための医薬組成物。
  20. 　ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）と同等以上のストレス性腸障害の軽減作用を有し、かつCP2305株と異なる乳酸菌。
  21. 　前記ストレス性腸障害の軽減作用が、明細書の実施例3記載の下痢スコアでラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）と同等以上のストレス性下痢抑制作用を有する、請求項２０に記載の乳酸菌。
  22. 　明細書の実施例3記載の方法によって下痢スコアを評価した場合においてプラセボと比較して有意（ｐ＜0.05vsプラセボ）にストレス性下痢を抑制しかつCP2305株（FERM BP-11331）と異なる乳酸菌。
  23. 　氷上で5時間保持したときの生存率が、60％以上である低温耐性を有する、請求項２０～２２のいずれか1項に記載の乳酸菌。
  24. 　ストレスによる骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有する、請求項２０～２３のいずれか1項に記載の乳酸菌。
  25. 　大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、請求項１９～２４のいずれか1項に記載の乳酸菌。
  26. 　上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌であることを特徴とする、請求項２０～２５のいずれか1項に記載の乳酸菌。
  27. 　上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）の派生株又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）の派生株である、請求項２０～２６のいずれか1項に記載の乳酸菌。
  28. 　腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群、又は炎症性腸疾患の予防又は軽減に用いるためのものである、請求項２０～２７のいずれか１項に記載の乳酸菌。
  29. 　乳酸菌を10℃以下の温度に曝露し、生存した低温耐性株を選抜し、育種すること、必要に応じてこの操作を繰り返すこと、及び生存した低温耐性株を回収することを含む、乳酸菌低温耐性株の製造方法。
  30. 　乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）である、請求項２９に記載の方法。
  31. 　ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株からなる乳酸菌。
  32. 　氷上で5時間保持したときの生存率が、60％以上である低温耐性を有する、乳酸菌。
  33. 　上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌であることを特徴とする、請求項３２記載の乳酸菌。
  34. 　請求項２０～２７及び３１～３３のいずれか１項に記載の乳酸菌を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性下痢、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群、又は炎症性腸疾患の予防又は軽減剤。
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