JP2005536197A - プロバイオティクス菌株、その選択方法、その組成物、およびその使用 - Google Patents
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Abstract
a.母乳および/または羊水中で生存できる非病原性菌株の選択、および
b.健常人が経口摂取した後に、粘膜を除く他の内臓に定着することなく母乳および/または羊水中に移行され得る非病原性菌株の選択
からなる、新規プロバイオティクス菌株を選択するための新規方法に関する。本発明はまた、新規ラクトバチルス菌株:CECT5711(ラクトバチルス・コリニフォルミス)、CECT5713(ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス)、CECT5714:(ラクトバチルス・ガセリ、以前はL.アシドフィラス)、CETC5715:(ラクトバチルス・ガセリ)、およびCECT5716:(ラクトバチルス・ファーメンタム)を提供し、また消化器疾患、感染症、神経変性疾患、およびアレルギーなどの免疫関連疾患または炎症性疾患の予防または処置のためのそれらの使用にも関する。
Description
・CECT5711:(ラクトバチルス・コリニフォルミス(Lactobacillus coryniformis))、
・CECT5713:(ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius))、
・CECT5714:(ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)、以前はL.アシドフィラス(L. acidophilus))、
・CECT5715:(ラクトバチルス・ガセリ)、および
・CECT5716:(ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum))
を提供する。
a.母乳および/または羊水中で生存できる非病原性菌株の選択、および
b.健常人が経口摂取した後に、粘膜を除く他の内臓に定着することなく母乳および/または羊水中に移行され得る非病原性菌株の選択。
・CECT5711:(ラクトバチルス・コリニフォルミス)前記の細菌はヤギのチーズから得られ、提案された方法により選択され、図3のRAPDプロフィールにより特徴付けられ、その特性は表I、IIおよびVIIIに記載されている。
・CECT5713:(ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス)前記の細菌は母乳育ちのヒトの乳幼児の糞便から得られ、提案された方法により選択され、図3のRAPDプロフィールにより特徴付けられ、その特性は表I、IIおよびVIIIに記載されている。
・CECT5714:(ラクトバチルス・ガセリ、以前はL.アシドフィラス)前記の細菌はヒト母乳から得られ、またヒト羊水からも検出され、提案された方法により選択され、図3のRAPDプロフィールにより特徴付けられ、その特性は表I、IIおよびVIIIに記載されている。
・CECT5715:(ラクトバチルス・ガセリ)前記の細菌はヒト母乳から得られ、またヒト羊水からも検出され、提案された方法により選択され、図3のRAPDプロフィールにより特徴付けられ、その特性は表I、IIおよびVIIIに記載されている。
・CECT5716:(ラクトバチルス・ファーメンタム)前記の細菌はヒト母乳から得られ、提案された方法により選択され、図3のRAPDプロフィールにより特徴付けられ、その特性は表I、IIおよびVIIIに記載されている。
さらなる態様において本発明は、本発明の細菌株培養物の上清から得られる組成物、または本発明の任意の組成物から得られる組成物を提供する。好ましい実施形態においては、この組成物は本発明の任意の細菌株の培養物の抽出、または本発明の組成物から得られる。
本発明者らは、母乳および/または羊水中で生存する能力を持つ新規細菌株であって、その能力により経口摂取後に母乳および/または羊水へ移行され得るこれらの菌株の新規選択方法を開発した。本発明に記載のこの新規方法の原理は、その方法により得られた選択された菌株の特別な特性を保証する。なぜなら、得られた細菌株がプロバイオティクス菌株に起因する大部分の特徴、すなわち消化プロセスに対する優れた抵抗性、腸に定着する能力のみならず、またより自然なヒト由来のものであり、安全で、ヒトの腸以外のいくつかの適所に定着し、調整できる能力という特徴を絶対的に有しているからである。さらに、これらの新規菌株はヤギのチーズ、ヒト母乳や羊水のような糞便以外の様々な供給源から得られる。
種々の供給源から単離したコロニーの、ヒト母乳およびヒト羊水中で生存する能力を試験した。本発明のプロバイオティクス菌株の生存率を分析するために、108cfuの各々の細菌を、1mlのヒト母乳またはヒト羊水中で、37℃、嫌気性条件下で60分間培養した。生存率はMRS寒天プレートで連続希釈培養して計算し、対照条件で得られたコロニー数と比較した(MRSブロスpH6.2)。 プレートは37℃、嫌気性条件下で16〜18時間培養した。この実験は3回繰り返した。ヒト体液のうちの少なくとも1種において、対照条件と比較して75%より高い生存率である場合に、その菌株は抵抗性であるとみなした(図 1)。
本発明に記載の選択プロセスの第二の基準は、細菌が経口摂取後に母乳および/または羊水へと移行できなければならないことである。この能力を試験するために、以下に記載するように推定される菌株を遺伝学的に標識し、動物モデルとしての妊娠マウスに経口投与した。細菌の移行は、羊水と、母乳を与えられたマウスの腸から得られたコロニーをPCRスクリーニングして分析した。
3つの異なるPCR断片(それぞれF159:159bp、F189:189pb、およびF228:228bp)を得るために3種のプライマーの組を用いた。この3つの断片は、カリフラワーモザイクウイルス(Cauliflower Mosaic Virus:CaMV)の35SrRNAプロモーター、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)由来の5−エノールピルビルシキメート−3−ホスフェートシンターゼ(EPSPS)遺伝子の間の接合部に含めた。プライマーは、Roundup Ready soya(EMBL受託番号:AX033493)中に存在する人工配列から設計した。PCR断片のクローニングを容易にするために、BamHI部位を総てのプライマーの5'末に加えた。得られたPCR産物は、QIAquick PCR精製キット(Qiagen)を用いて精製し、BamHIで消化し、クロラムフェニコール(Cm)耐性を付与したプラスミドであるpTG262に連結した。続いてこれらのプラスミドを個々に、通常のプロトコールに従って、エレクトロポレーションにより、選択された菌株中へ導入した。形質転換株の同定はPCRにより確認した(図2A)。
4匹の妊娠Balb/cマウスに、200μlのミルク中の108cfuの遺伝学的に標識した菌株を、分娩2週間前から2日毎に経口接種した。分娩直前に、2匹のマウスから羊水を無菌的に採取し、MRS寒天プレート上で培養した。その他の2匹の妊娠マウスは妊娠期間を終了させた。遺伝学的に標識した細菌の母乳への移行は、初回授乳の直前および直後の新生児の腸から単離した細菌を比較することにより分析した。総てのプレートを、37℃、嫌気性条件下で24時間インキュベートした。得られた各々のサンプルについて、MRSプレート上で増殖し、かつCm−MRSプレート上で二次培養された中から、52個のコロニーを無作為に選択した。最後に、Cm−耐性コロニーから遺伝学的に標識したコロニーを検出するために、Cm−耐性コロニーのDNAをテンプレートとして用いてPCR分析を行った(図2B)。少なくとも1つのサンプルにおいて、少なくとも2つのPCR−陽性コロニーが検出できた場合に移行が起こったものとした。
本発明に記載の選択方法によって得られた細菌株は、ヤギのチーズならびにヒト母乳および羊水などの、糞便以外の種々の供給源から得られた。この単離プロセスは前記のように行う:
2mlのヒト母乳サンプルを、35才の女性から無菌的に採取した(出産後15日)。このサンプルから細菌株を単離するために、ペプトン水中の連続希釈液0.1mlをMRS(pH6.2)、MRS(pH5.5)、APT、RCM、LM17、GM17およびElliker寒天プレート上で、37℃、好気性および嫌気性条件下で24〜48時間培養した。合計約740個のコロニーから、評価された異なる形態の少なくとも2個のコロニーを含む74個のコロニー(10%)を選択し、さらにMRS寒天中で、37℃、嫌気性条件下で培養し、提案された方法に従って試験した。このサンプルから得られたコロニーのうちの2個が定義された基準を満たした。
ヒト羊水からの細菌株の単離は、2人のボランティアの分娩時に臨床スタッフにより無菌的に採取された2mlのヒト羊水を希釈することにより行った。ペプトン水中の連続希釈液0.1mlをMRS(pH6.2)、MRS(pH5.5)、APT、RCM、LM17、GM17およびElliker寒天プレート上で、37℃、好気性および嫌気性条件下で24〜48時間培養した。合計400個のコロニーから、評価された異なる形態の少なくとも2個のコロニーを含む40個のコロニー(10%)を選択し、さらにMRS寒天中で、37℃、嫌気性条件下で培養し、提案された方法に従って試験した。
食品からの細菌株の単離は、20gの食品の中心部を無菌的に採取し、ペプトン水中でホモジナイズすることにより行った。0.1mlの連続希釈液をMRS寒天(Oxoid)プレートおよびRCM寒天(Oxoid)プレート中に播種し、32℃、好気性および嫌気性条件下で48時間培養した。合計500個を超えるコロニーから、各条件の5個のコロニーを選択し、さらにMRS寒天中で、37℃、嫌気性条件下で培養した。これらのコロニーは、提案された方法に従って試験した。コロニーのうち1つだけが定義された基準を満たした。この選択されたチーズ由来のコロニー、ラクトバチルス・コリニフォルミスCECT5711は、本来は好気性条件下で培養されたMRS寒天プレートから単離されたものであった。
ヒト糞便からの細菌株の単離は、3人の無関係な乳幼児(15〜45日齢)から2gの糞便を無菌的に採取し、ペプトン水中でホモジナイズすることにより行った。連続希釈液0.1mlをMRS(pH6.2)、MRS(pH5.5)、APT、RCM、LM17、GM17およびElliker寒天プレート上で、37℃、好気性および嫌気性条件下で24〜48時間培養した。合計約670個のコロニーから、評価された異なる形態の少なくとも2個のコロニーを含む67個のコロニー(10%)を選択し、さらにMRS寒天中で、37℃、嫌気性条件下で培養し、提案された方法に従って試験した。コロニーのうち1つだけが定義された基準を満たした。
MRS培地上で(寒天またはブロス)37℃、嫌気性条件下で増殖した各々の選択された細菌株の表現型を表Iに記載した:
本発明の種々のプロバイオティクス菌株の表現型の特徴を、既知の市販されているプロバイオティクス菌株(Valio社のラクトバチルス・ラムノサスLGG(Lactobacillus rhamnosus LGG)、Nestle社のラクトバチルス・ジョンソニLa1(Lactobacillus johnsonii La1)およびDanone社のラクトバチルスカゼイ・イミュニタス(Lactobacilluscasei immunitas))と比較した。
本発明の種々のプロバイオティクス菌株の発酵能力を、API 50CH法(BioMerieux)を用いて、いくつかの市販のプロバイオティクス菌株(Valio社のラクトバチルス・ラムノサスLGG、Nestle社のラクトバチルス・ジョンソニLa1およびDanone社のラクトバチルスカゼイ・イミュニタス)で観察されるものと比較した。陽性の発酵性基質は、灰色で示してある。
・ラクトバチルス・コリニフォルミス:CECT5711
・ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス:CECT5713
・ラクトバチルス アシドフィラス:CECT5714
・ラクトバチルス・ガセリ:CECT5715
・ラクトバチルス・ファーメンタム:CECT5716
実施例2で行われたSDS−PAGE1Dタンパク質プロファイリング、および16SrDNA配列決定といった分析法は、細菌種を明確にするために好適な方法であるが、同じ細菌種の異なる菌株間を区別するほど特異的ではない。このため、2つの異なる乳酸菌特異的プライマー(ArgDeiおよびOPL5)を用いて菌株のRAPD-PCR分析を行った。無作為増幅多型性DNA(RAPD)−PCR分析に関しては、DNeasy組織キット(Qiagen)を用いて、また、供給業者により推奨されたグラム陽性細菌からのゲノムDNA単離のためのプロトコールに従って、10mlのMRS一晩培養物からゲノムDNAを単離した。次いで総てのDNAを、Techne DNA ThermalCycler中で行うPCR増幅に用いた。PCR増幅は、プライマーOPL5(5’−ACGCAGGCAC−3’)、またはArgDei(5’−ACCYTRGAAGGYGGYGATGTB−3’)のいずれかを用いて行った。5lのPCR混合物を、1.2%(wt/vol)アガロース(Sigma)ゲル上で、エチジウムブロマイド染色により分析した。100−bp ladder(Invitrogen)を、分子量基準として用いた。ゲルに100Vで約1時間通電し、DNAは、Diversity データベースソフトウエアパッケージ(Bio-Rad)を用いて、ゲル記録システム(Gel Doc 2000, Bio-Rad)で可視化および分析を行った。その結果を図3に示す。
ラクトバチルス・コリニフォルミス
・DSM20005:ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルケンス(torquens)
・DSM20007:ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種コリニフォルミス
・CECT982:ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種コリニフォルミス
・CECT 4129:ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルケンス
ラクトバチルス・ファーメンタム
・LMG8900:ラクトバチルス・ファーメンタム=ATCC11976
・LMG17551:ラクトバチルス・ファーメンタム=ATCC23271
・CECT285:ラクトバチルス・ファーメンタム=ATCC9338
・CECT4007:ラクトバチルス・ファーメンタム=ATCC14931
ラクトバチルス・ガセリ
・LMG11413:ラクトバチルス・ガセリ
・LMG13047:ラクトバチルス・ガセリ=ATCC19992
・LMG13134:ラクトバチルス・ガセリ=ATCC9857
・LMG18176:ラクトバチルス・ガセリ
・LMG18194:ラクトバチルス・ガセリ
・CECT4479:ラクトバチルス・ガセリ
ラクトバチルス・サリバリウス
・DSM20492:ラクトバチルス・サリバリウス
・CECT4062:ラクトバチルス・サリバリウス
・CECT4063:ラクトバチルス・サリバリウス
本発明者らはまた、本発明に含められるプロバイオティクス選択プロセスの適切性を、所望のプロバイオティクス特性を有する細菌株を選択する能力に関して分析した。これを評価するために、プロバイオティクス菌株として働くそれらの能力を高め得る多くの異なる特性に関して、選択された菌株を分析した。さらに、本発明者らは本発明に含められるプロバイオティクス菌株と、他の選択基準によって得られた各々の試験の結果に(示されたように)任意に数値を割り当てた。得られた結果は、本実施例末の表VIIIに要約し、以下の下位の実施例に記載し、いくつかの市販の菌株と比較した。
−Caco−2および HT−29細胞の培養
付着および阻害アッセイのために、細胞系Caco−2(ATCCHTB−37)およびHT−29(ATCCHTB−38)を、小腸細胞モデルとして用いた。双方の細胞系は、分極、小腸酵素の発現、および特定の構造ポリペプチドとムチンの産生などの、小腸細胞に特徴的な特性を示した。
・プロバイオティクス菌株:
本発明のプロバイオティクス菌株は、MRSブロス(pH6.2)中にグリセロールストックから0.1%(v/v)を播種した後に、37℃、嫌気性条件下で16〜18時間培養した。この条件下では、MRS寒天上の培養で観察された培養物の濃度は1〜2×109cfu/mlであった。
大腸菌(Escherichia coli)0157:H7(非病原性)(CECT4972)、大腸菌0157:H7(腸内−病原性)(CECT4783)、大腸菌0157:H7(腸内−病原性)(CECT4782)、サルモネラ・コレラスイス・チフィ(Salmonella cholerasuis typhi)(CECT409)およびサルモネラ・コレラスイス・チフィムリウム(S. cholerasuis typhimurium)(CECT443)は、総てCECT−Coleccin Espanola de Cultivos Tipo−から入手した。総てのグラム陰性菌株は、TSBブロス(AES Laboratoire)中にグリセロールストックから0.1%(v/v)を播種した後に、37℃、嫌気性条件下で16〜18時間培養した。この条件下では、TSA寒天(AES Laboratoire)上の培養で観察された培養物の濃度は1〜2×109cfu/mlであった。
小腸細胞系Caco−2およびHT−29を、抗生物質を含まない2mlの培養液を入れた35mmのプラスチック製ディッシュ中で、集密まで培養した。集密後10〜14日目に1mlの培養液を1mlのDMEM中108個の細菌懸濁液と交換した。この培養物を37℃で1時間インキュベートした。その後、細胞をPBSを用いて2回洗浄し、氷冷した70%メタノールで30分間固定した。プレートを風乾し、グラム染色した。付着した細菌は、光学顕微鏡Axiovert200(Zeiss)を用いて、1000倍、油浸で可視化した。20の無作為化領域を計数し、その結果は細胞付着細菌数の平均/領域±標準偏差として表した。プロバイオティクス菌株の能力は、付着した細菌数が250を超える場合は高く、100〜250の間では中間、100より少ない場合はわずかであるとした(図5)。
本発明のプロバイオティクス菌株の、これらの細菌が消化過程で遭遇することになる酸性および高胆汁塩含量に対する抵抗性を分析するために、細菌をpH3.0のMRSブロス培養液中で、または0.15%胆汁塩(Sigma)を添加したMRSブロス(pH6.2)中で90分間培養した。生存率は連続希釈液のMRS寒天培養により計算し、また対照条件下(MRSブロスpH6.2)で得られたコロニー数と比較した。プレートは、37℃、嫌気性条件下で16〜18時間培養した。この実験を3回繰り返した。対照条件と比較して生存率が80%を超える場合は抵抗性が高く、80〜60%では中間、60%より小さい場合は低いとした(図6)。
世代時間とは、細菌培養物の細菌濃度が2倍になるのに要する時間を意味し、プロバイオティクス細菌の重要な特性である。これは、産業的観点(同じ時間でより多量のバイオマスの産生)、およびプロバイオティクスの観点(腸での高い定着率)から重要である。両方の面を考慮に入れるために、本発明者らは富栄養培地(産業的観点)、および貧栄養培地(プロバイオティクスの観点)中での、本発明のプロバイオティクス菌株の世代時間を分析した。
複合糖質(可溶性および不溶性繊維)を代謝するための細菌株の能力は、これらのプロバイオティクス菌株が結腸中で炭素源としてそれらを使用でき、従って定着効率を高めることを保証する。この理由のために、本発明者らはいくつかの消化できない繊維を唯一の糖質源として使用する、本発明のプロバイオティクス菌株の能力を試験した。
抗生物質の使用は、共生腸内細菌の減少をもたらし、しばしば下痢および他の腸疾患に関連する。さらに、この腸細菌数の減少は日和見性病原性細菌およびウイルスによる宿主感染を引き起こすという結果となり得る。感染症を阻止するための抗生物質の使用は、この疾患を治さないばかりか悪化させる。小腸の炎症のようなその他の場合においてはプロバイオティクスが有益な役割を発揮し得るが、この可能性のある効果はしばしば抗生物質による同時治療により制限される。これらの理由から、一般的な抗生物質に対して耐性を有する可能性のあるプロバイオティクス菌株の選択は、当技術分野の向上につながるであろう。
プロバイオティクス細菌による代謝性酸、すなわち乳酸、酢酸、プロピオン酸 、および酪酸の産生、ならびにその結果としての糞便中のpHの低下は、日和見病原性微生物の増殖および感染能力の低下によるこれらの細菌の有益な効果と広範囲にわたり関連している。さらに、これらの酸のうちのいくつか、特に酪酸は、素早く吸収され、小腸細胞にエネルギー源として利用される。この意味合いで、母乳育ちの乳児の糞便中のpHが低いことは、調乳育ちの乳幼児と比べて腸疾患のリスクが低下していることと関連があるとされてきた。
プロバイオティクスの主たる有益な効果は、腸における有用および有害腸内細菌のバランスのコントロールであることが示唆されてきた。有用細菌数が減少すれば、日和見性細菌が過剰増殖し、宿主の健康を害し、感染症をも引き起こし得る。大部分の細菌微生物は、共に生息している他の微生物の増殖能力を低下させる獲得特性またはメカニズムを有し、このために、それらの選択的増殖が可能となる。実施例4fで述べたように、乳酸菌による酸の産生を介するpHの低下は、かかるメカニズムの1つである。さらに、いくつかの乳酸菌もまた、他の細菌、酵母または真菌の増殖を選択的に阻害する生物活性ペプチド成分および他の代謝産物を産生する。これは、ペディオシン(pediocin)のような、バクテリオシンの場合である。
小腸細胞系Caco−2を、抗生物質を含まない2mlの完全培地を入れた35mmのプラスチック製ディッシュ中で、集密まで培養した。集密後10〜14日目に1mlの培地を1mlのDMEM中108個のプロバイオティクス細菌懸濁液と置換した。この培養物を、37℃で1時間インキュベートした。その後、DMEM中108個の病原性細菌(大腸菌またはサルモネラ・チフィムリウム)懸濁液1mlを培養物に加え、37℃で1時間以上インキュベートした。その後、PBSを用いて細胞を2回洗浄し、氷冷した70%メタノールで30分間固定した。プレートを風乾し、グラム染色した。付着した細菌は、光学顕微鏡Axiovert200(Zeiss)を用いて、1000倍、油浸で可視化した。10の無作為化領域の、グラム陰性細菌数を計数し、その結果はプロバイオティクス菌株なしの対照培養物と比較して細胞に付着した病原性細菌の割合の平均として表した。病原性細菌の小腸細胞への付着を阻害するプロバイオティクス菌株の能力は、対照と比較して、両方の菌株のグラム陰性付着細菌の割合が25%より低い場合は高く、25%〜75%の間では中間、75%を超える場合はわずかであるとした(図12)。
本発明の種々の菌株のプロバイオティクスとして作用する種々の効力を、いくつかの市販のプロバイオティクス菌株(Valio社のラクトバチルス・ラムノサスLGG、Nestle社のラクトバチルス・ジョンソニLa1およびDanone社のラクトバチルスカゼイ・イミュニタス)と比較し、任意に数量化した。
定義によれば、プロバイオティクスは宿主の腸粘膜に定着しなければならない。さらに、プロバイオティクスにより有益な作用が及ぼされるには、定着することが要求されると記載されてきた。小腸細胞系への付着能力、または消化条件に対する抵抗性のようなin vitro研究は、プロバイオティクス菌株を選択するための優れたアプローチであるが、これらの試験はin vivoで選択された菌株が腸粘膜に定着する効果を保証するものではない。この理由から、本発明者らは本発明のプロバイオティクス菌株の定着能力のin vivo分析を、マウスを実験動物モデルとして用いて行った。
グラム陰性細菌の腸上皮を横断する移行は、特に胃腸の感染症、疾患または外科手術後の被検体で起こり得る。処置せずに放置すれば、内毒素血症を引き起こし得る。本実施例において、L.ファーメンタムCECT5716投与の、腸病原菌であるサルモネラ・チフィムリウムの移行に及ぼす効果を検討した。
感染症リスクの低下に加えて、プロバイオティクス処置に関連する多くの臨床学的効果は、選択されたプロバイオティクス菌株の免疫調節能力によるものである。通常、免疫応答の制御はTNF−αなどの炎症促進サイトカイン(Th1)と、IL-4または IL-13などの液性サイトカイン(Th2)、ならびにIL-10およびTGF−βなどの調節性サイトカイン(Th3)の間のバランスの変化により媒介されている。この理由から、本発明のいくつかのプロバイオティクス菌株の、いくつかのこれらの重要なサイトカイン発現の調節における効果もまた試験した。
本発明のプロバイオティクス菌株の免疫グロブリン産生に対する効果を、オスBalb/cマウス(6〜8週齢)の脾臓から得られたリンパ球培養物を用いて分析した。2×106個のリンパ球を1mlDMEMを入れた24ウェルのプラスチック製プレート中で培養し、25μg/mlのLPS存在下または不在下で、不活性化プロバイオティクス培養物(108cfu/ml)で6日間にわたって刺激した。リンパ球によるIgGの産生を、BethylのマウスIgGELISAを用いて評価した。
プロバイオティクスを用いる標準的な発酵液乳組成物は、以下に示す処方により調製した:
ミルク1.5%脂肪;3.2%タンパク質 997g/kg
スキムミルク粉末 3g/kg
プロバイオティクス菌株(1012cfu/g) 0.1g/kg
プロバイオティクスを含むヨーグルト製品を、以下に示す処方により調製した:
ミルク3.1%脂肪;3.2%タンパク質 987g/kg
スキムミルク粉末 13g/kg
開始物質 0.1g/kg
プロバイオティクス菌株(1012cfu/g) 0.1g/kg
プロバイオティクスを用いる乳児用調乳を、以下に示す処方で調製した:
脱塩乳清 512g/kg
パームオレイン 135g/kg
ラクトース 92g/kg
スキムミルク 95g/kg
菜種油 52g/kg
ココナツ油 49g/kg
ヒマワリ油 28g/kg
水 31g/kg
予混ビタミン 2g/kg
予混ミネラル 4g/kg
プロバイオティクス菌株(1012cfu/g) 0.1g/kg
Claims (38)
- a.母乳および/または羊水中で生存できる非病原性菌株の選択、および
b.健常人が経口摂取した後に、粘膜を除く他の内臓に定着することなく母乳および/または羊水中に移行され得る非病原性菌株の選択
の工程を含む、プロバイオティクス微生物菌株を選択するための方法。 - 母乳および羊水がヒト由来のものである、請求項1に記載の方法。
- 該プロバイオティクス試験菌株がラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、およびビフィドバクテリウム属から選択される任意の乳酸菌である、請求項2に記載の方法。
- 試験されたプロバイオティクス菌株が、母乳、母乳育ちの乳幼児の糞便または羊水からあらかじめ得られたものである、請求項3に記載の方法。
- 試験された菌株がヒトのサンプルから得られたものである、請求項4に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法により選択された細菌株。
- CECTに受託番号5711で受託された細菌株(ラクトバチルス・コリニフォルミス)またはその変異株。
- CECTに受託番号5713で受託された細菌株(ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス)またはその変異株。
- CECTに受託番号5714で受託された細菌株(ラクトバチルス・ガセリ、以前はL.アシドフィラス)またはその変異株。
- CECTに受託番号5715で受託された細菌株(ラクトバチルス・ガセリ)またはその変異株。
- CECTに受託番号5716で受託された細菌株(ラクトバチルス・ファーメンタム)またはその変異株。
- 請求項6〜11のいずれか一項に記載の、菌株の生物学的に純粋な培養物。
- 非病原性プロバイオティクス細菌、特にラクトバチルス属、ラクトコッカス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、およびビフィドバクテリウム属から選択されるプロバイオティクス細菌を得るための供給源としての、哺乳類の母乳および哺乳類の羊水の使用。
- 哺乳類の母乳および哺乳類の羊水がヒトに由来するものである、請求項13に記載の哺乳類の母乳および哺乳類の羊水の使用。
- 請求項6〜11のいずれか一項に定義された微生物菌株を得るための供給源としての、請求項14に記載の哺乳類の母乳および哺乳類の羊水の使用。
- 請求項6〜11で定義された少なくとも1種の細菌株を含んでなる組成物であって、該組成物が好ましくは2〜6菌株、より好ましくは2〜4菌株、最も好ましくは2〜3菌株を含んでなり、かつ各々の菌株が該組成物中に0.1%〜99.9%、好ましくは1%〜99%、より好ましくは10%〜90%の割合で存在する、組成物。
- 請求項6〜11で定義された少なくとも1種の細菌株ともう1種の菌株または菌株の混合物を含んでなる組成物であって、該混合物が好ましくは2〜6菌株、より好ましくは2〜4菌株、最も好ましくは2〜3菌株を含んでなり、かつ各々の菌株が該組成物中に0.1%〜99.9%、好ましくは1%〜99%、より好ましくは10%〜90%の割合で存在する、組成物。
- 請求項6〜11のいずれか一項で請求された菌株、または請求項16〜17のいずれか一項で定義された組成物を、凍結乾燥された形態で含んでなる組成物。
- 請求項6〜11のいずれか一項で請求された菌株、または請求項16〜17のいずれか一項で定義された組成物を、凍結された形態で含んでなる組成物。
- 請求項6〜11のいずれか一項で請求された菌株、または請求項16〜17のいずれか一項で定義された組成物を、不活性化型または死菌の形態で含んでなる組成物。
- 請求項6〜11のいずれか一項に記載の細菌株の培養物上清から得られる組成物、または請求項16〜17のいずれか一項に記載の組成物から得られる組成物。
- 請求項6〜11に記載の任意の細菌株の培養物の抽出により得られる組成物、または請求項16〜17に記載の組成物の抽出により得られる組成物。
- 請求項6〜11で指定された任意の菌株の代謝活動により得られる生成物、請求項12に記載の培養物から得られる生成物、または請求項16〜17に記載の組成物から得られる生成物であって、好ましくはそれが酵素である、生成物。
- 支持材および請求項6〜11のいずれか一項に記載の少なくとも1種の菌株、請求項12および16〜24に記載の培養物、組成物または生成物を含んでなる食品。
- 該支持材がミルク、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、発酵乳製品、発酵肉製品、発酵穀物製品、粉乳、穀粉、乳児用調乳、臨床用栄養処方、アイスクリーム、ジュース、小麦粉、パン、ケーキ、砂糖、キャンディまたはチューインガムから選択される食品組成物である、請求項24に記載の製品。
- 請求項6〜11に記載の微生物菌株が支持材中に約105〜約1012cfu/g支持材、好ましくは約106〜約1011cfu/g支持材、より好ましくは約106〜約1010cfu/g支持材の量で含有される、請求項24に記載の製品。
- 請求項6〜11のいずれか一項に記載の少なくとも1種の菌株、請求項12および16〜26に記載の培養物、組成物または製品、ならびに医薬上許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物。
- 該微生物菌株が支持材中に105〜1014cfu/g支持材、好ましくは106〜約1013cfu/g支持材、より好ましくは107〜1012cfu/g支持材の量で含有される、請求項27に記載の医薬組成物。
- 治療または予防的処置のための、請求項6〜11のいずれか一項で請求された細菌株、請求項12および16〜26に記載の培養物、組成物または製品。
- 局所、経口、眼球内、鼻腔内、経腸、泌尿生殖器内、膣内または直腸内投与のための、請求項29に記載の組成物。
- 胎児の治療または予防的処置のために妊娠女性に投与する目的で設計された、請求項29に記載の組成物。
- 母乳で育つ乳幼児の治療または予防的処置のために授乳中の女性に投与する目的で設計された、請求項29に記載の組成物。
- ヒトおよび動物の疾患の治療または予防的処置のための製品の製造における、請求項6〜11のいずれか一項に記載の菌株、請求項12および16〜27に記載の培養物、組成物もしくは製品の使用。
- 慢性もしくは急性感染症、または望ましくない微生物の定着の処置および/または予防のための使用であって、その感染症または定着が寄生虫
、細菌、酵母、真菌またはウイルスによって、それらを必要とする被検体または動物の粘膜表面で引き起こされ、該粘膜表面が、限定されるものではないが、経口、鼻咽頭、呼吸器、胃、小腸、泌尿生殖器および腺からなる群から選択される、請求項33に記載の使用。 - 生理的ストレスに曝された個人の、一時的に低下した免疫レベルの処置および/または予防のための、請求項33に記載の使用。
- 消化管免疫バリアの改善が必要な被検体または動物のための;食物に対するダウンレギュレート性の過敏感反応および乳糖不耐症のような代謝性不耐症;便秘および他の消化器疾患;IBD、潰瘍性大腸炎、関節炎、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、乾癬またはサルコイドーシスなどの炎症性または自己免疫疾患;ならびに腫瘍増殖、転移および癌の処置および/または予防を必要とする被検体または動物のための、請求項33に記載の使用。
- アレルギー性疾患および喘息の処置および/または予防を必要とする被検体または動物のための、請求項33に記載の使用。
- 限定されるものではないが、パーキンソン病、卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病および痴呆からなる群より選択される、神経変性疾患の処置および/または予防を必要とする被検体または動物のための、請求項33に記載の方法。
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