KR20200015575A - 세균 균주를 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 공생 세균 균주 및 유기 산을 포함하는 조성물, 그리고 질환의 치료에서 이들의 용도를 제공한다.

Description

세균 균주를 포함하는 조성물
기술 분야
본 발명은 포유류 소화관으로부터 단리된 세균 균주를 포함하는 조성물 및 질환의 치료에서 이런 조성물의 이용의 분야이다.
발명의 배경
인간 장은 자궁내에서 무균인 것으로 생각되지만, 이것은 출생 직후 매우 다양한 모계 미생물 및 환경 미생물에 노출된다. 그 후에, 미생물 집락형성과 천이의 동적 기간이 발생하는데, 이것은 인자, 예를 들면, 전달 방식, 환경, 식이 및 숙주 유전자형에 의해 영향을 받고, 이들 모두 특히, 어린 시절 동안 소화관 미생물 균총의 조성에 영향을 준다. 차후에, 미생물 균총은 안정되고 성인과 유사해진다 [1]. 인간 소화관 미생물 균총은 2가지 주요 세균 부문, 박테로이데테스 (Bacteroidetes) 및 피르미쿠테스 (Firmicutes)에 본질적으로 속하는 500-1000개 이상의 상이한 계통형을 내포한다 [2]. 인간 소화관의 세균 집락형성으로부터 발생하는 성공적인 공생 관계는 매우 다양한 물질대사 기능, 구조 기능, 보호 기능 및 다른 유익한 기능을 산출하였다. 집락형성된 소화관의 증강된 대사 활동은 만약 그렇지 않으면 비소화성인 식이 성분이 분해되어, 숙주에 대한 중요한 영양소 공급원을 제공하는 부산물이 방출되도록 담보한다. 유사하게, 소화관 미생물 균총의 면역학적 중요성은 충분히 인식되고, 그리고 공생균의 도입 이후에 기능적으로 재구성되는 손상된 면역계를 갖는 무균 동물에서 예증된다 [3-5].
미생물 균총 조성에서 극적인 변화가 위장관 장애, 예를 들면, 염증성 장 질환 (IBD)에서 문서화되었다. 가령, 클로스트리듐 (Clostridium) 클러스터 XIVa 세균의 수준은 IBD 환자에서 감소되는 반면, 대장균 (E. coli)의 숫자는 증가되는데, 이것은 소화관 내에서 공생체 및 유해균의 균형에서 변동을 암시한다 [6-9].
일정한 세균 균주가 동물 소화관에 대해 가질 수 있는 잠재적인 긍정적인 효과에 비추어, 다양한 질환의 치료에서 이용을 위한 다양한 균주가 제안되었다 (참조: 가령, [10-13]). 또한, 대부분의 락토바실루스 (Lactobacillus) 및 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 균주를 포함하는 일정한 균주가 장에 직접적으로 연계되지 않는 다양한 염증 질환 및 자가면역 질환을 치료하는데 이용을 위해 제안되었다 (리뷰를 위해 [14] 및 [15]를 참조한다). 하지만, 상이한 질환 및 상이한 세균 균주 사이에 관계, 그리고 소화관에서 및 전신 수준에서 및 질환의 임의의 특정 유형에서 특정 세균 균주의 정확한 효과는 특히, 신경변성 장애의 경우에 불량하게 특징화된다.
최근에, 인간 뇌 질환에서 병리생리학적 역할을 수행할 수 있는 소화관 마이크로바이옴에서 변경에 관하여 당해 분야에서 관심이 증가되었다 [16]. 임상전 및 임상적 증거는 뇌 발달 및 미생물 균총 사이에 연계를 강하게 암시한다 [17]. 임상전 문헌의 성장하는 중심부는 복수 신경내분비 및 내분비 신호전달 시스템을 수반하는, 뇌 및 소화관 마이크로바이옴 사이에 양지향성 신호전달을 증명하였다. 실제로, 마이크로바이옴에서 클로스트리듐 (Clostridium) 종의 증가된 수준이 뇌 장애에 연계되었고 [18], 그리고 박테로이데테스 (Bacteroidetes) 및 피르미쿠테스 (Firmicutes) 계통의 불균형이 또한, 뇌 발달 장애에 관련되었다 [19]. 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 락토바실루스 (Lactobacillus), 수테렐라 (Sutterella), 프레보텔라 (Prevotella) 및 루미노코쿠스 (Ruminococcus) 속 및 알칼리제네스과 (Alcaligenaceae) 과의 것들을 포함하는 소화관 공생체의 변경된 수준이 면역-매개된 중추신경계 (CNS) 장애에 관련된다는 제안은 환자 및 건강한 개체 사이에 미생물 균총에서 변경의 결여를 암시하는 연구에 의해 의문이 제기된다 [19]. 프로바이오틱스의 투여는 신경학적 장애의 치료에서 유익할 수 있는 것으로 또한 제안되었다. 하지만, 이들 연구는 프로바이오틱 조성물 그 자체가 신경변성의 치료에 대하여 치료적 유익성을 달성할 수 있다는 결론을 내리는데 실패하였고, 그리고 임의의 특정 세균에 대한 어떤 유용한 효과도 보여주지 못하였다 [20, 21]. 이것은 현재, 마이크로바이옴 및 인간 뇌 질환 사이에 연계의 실질적인 효과가 불량하게 특징화된다는 것을 지시한다. 따라서, 신경변성 장애에 대한 마이크로바이옴을 변경하는 치료적 영향을 확인하기 위한 더욱 직접적인 분석적 연구가 필요하다.
신경변성 장애를 치료하는 새로운 방법이 당해 분야에서 요구된다. 장내 세균을 이용하는 새로운 요법이 개발될 수 있도록, 장내 세균의 잠재적 효과가 특징화되는 것이 또한 요구된다.
발명의 요약
본 발명자들은 신경변성 장애를 치료하고 예방하기 위한 새로운 요법을 개발하였다. 특히, 본 발명자들은 일정한 유기 산을 생산하는 공생균이 신경보호 활성을 갖고 신경변성 질환을 치료하는데 효과적일 수 있다는 것을 확인하였다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 또한, 공생균을 포함하는 조성물에 유기 산을 첨가하거나, 또는 공생균과 조합으로 유기 산을 이용하는 것이 특히, 신경변성 장애의 치료에서 증강된 치료 효과를 제공할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 화학식 Rx-COOH를 갖는 한 가지 또는 그 이상의 유기 산을 생산하는 공생 세균 균주 (여기서 Rx는 4 내지 11개 범위의 탄소를 포함하는 알킬 기를 포함하거나, 또는 여기서 Rx는 치환체 히드록실 기를 갖는 페닐 기를 포함하고, 여기서 임의선택적으로 히드록실 기는 위치 4에 있다)가 신경변성 질환을 치료하는데 효과적일 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명자들은 공생 세균 균주 및 유기 산의 조합이 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는데 효과적일 수 있다는 것을 발견하였다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "본 발명의 조합", "본 발명의 치료적 조합" 및 "치료적 조합"은 교체가능하게 이용될 수 있고, 그리고 하기의 치료적 조합을 지칭한다: (a) 공생 세균 균주를 포함하는 조성물; 및 (b) 유기 산을 포함하는 조성물. 용어 "조합"은 치료적 조합의 맥락에서, 상기 조합의 성분 (a) 및 (b)가 반드시 동일한 조성물 내에 있고 및/또는 동시에 투여된다는 것을 지칭하지는 않는 것으로 이해된다.
실시예에서 설명된 바와 같이, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)를 포함하는 조성물의 투여는 반응성 산소 종으로부터 보호하고 염증을 예방할 수 있고, 따라서 신경보호제로서 행동할 수 있다. 본 발명자들은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)가 헥산산, 발레르산 및 4-히드록시페닐아세트산을 비롯한 일정한 유기 산을 생산한다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)로 치료가 LPS 및 돌연변이체 α-시누클레인에 의한 친염증성 분자, 예를 들면, NFκB 및 IL-6의 활성화를 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)가 친염증성 사이토킨 IL-8의 활성화를 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였는데, 이것은 뉴런 수초화를 증진하는데 도움을 줄 수 있다. 본 발명자들은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 및 레티노산의 조합으로 치료가 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF)의 분비를 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였는데, 이것은 신경발생 및 신경돌기생성을 증진하고 및/또는 세포 사멸을 예방하는데 도움을 줄 수 있다. 본 발명자들은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)로 치료가 시험관내에서 산화 스트레스를 약화시키고, 히스톤 탈아세틸화 활성 및 지질 과산화를 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였는데, 이것은 세포 사멸 및 아폽토시스를 감소시키는데 도움을 줄 수 있다. 특히, 본 발명자들은 발레르산을 생산할 수 있는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)로 치료가 히스톤 탈아세틸화를 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였는데, 이것은 세포 사멸 및 아폽토시스를 감소시키는데 도움을 줄 수 있다. 본 발명자들은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)가 염증 및 산화 스트레스를 약화시킬 수 있는 인돌을 생산할 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)로 치료가 키뉴레닌 수준을 증가시킬 수 있다는 것을 증명하였다. 게다가, 본 발명자들은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)가 헥산산을 생산할 수 있다는 것을 발견하였는데, 이것은 예로서, 신경돌기 생장을 증진함으로써 신경보호성 또는 신경복원성일 수 있다. 본 발명자들은 헥산산을 생산할 수 있는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)가 MAP2 (미소관 -연관된 단백질 2)의 발현을 증가시킨다는 것을 발견하였는데, 이것은 신경돌기생성에서 미소관 형성을 위해 필수적인 것으로 생각된다. 이런 이유로, 본 발명자들은 헥산산을 생산할 수 있는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)가 신경돌기 생장을 증진하는데 이용될 수 있다는 것을 발견하였다. 유기 산, 예를 들면, 헥산산, 발레르산 및 4-히드록시페닐아세트산을 생산하는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 및 다른 세균은 이런 이유로, 신경변성 장애를 치료하는데 유용할 수 있다.
따라서, 첫 번째 양상에서, 본 발명은 신경변성 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 공생 세균 균주를 포함하는 조성물을 설명하는데, 여기서 상기 균주는 각각 하기 화학식을 갖는 한 가지 또는 그 이상의 유기 산을 생산하고: Rx-COOH, 여기서 Rx는 최소한 4개의 탄소를 포함하는 알킬 기를 포함하거나, 또는 여기서 Rx는 치환체 히드록실 기를 갖는 페닐 기를 포함하고, 여기서 임의선택적으로 히드록실 기는 위치 4에 있다.
두 번째 양상에서, 본 발명은 공생 세균 균주 및 화학식 Rn-COOH를 갖는 한 가지 또는 그 이상의 유기 산 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 유기 산 발프로산, 발레르산, 헥산산, 레티노산 및 4-히드록시페닐아세트산 중에서 한 가지 또는 그 이상, 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함한다. 실시예는 이런 조합이 치료적 유익성을 갖는다는 것을 증명한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 개체에서 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 공생 세균 균주를 포함하는 조성물을 설명하는데, 여기서 상기 조성물은 한 가지 또는 그 이상의 유기 산 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르와 조합으로 투여된다. 실시예는 이런 조합이 특히 효과적일 수 있다는 것을 증명한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 개체에서 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 한 가지 또는 그 이상의 유기 산 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함하는 조성물을 설명하는데, 여기서 상기 조성물은 공생 세균 균주와 조합으로 투여된다. 실시예는 이런 조합이 특히 효과적일 수 있다는 것을 증명한다.
본 발명의 양쪽 양상의 바람직한 구체예는 하기에서 및 본 출원의 전역에서 논의된다.
일부 구체예에서, 공생 세균 균주는 짧은 사슬 지방산을 생산한다. 바람직하게는, 짧은 사슬 지방산은 부티르산이다. 부티르산염은 신경보호 효과를 갖는 혈액 뇌 장벽의 불투과성을 감소시키는데 기여할 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 것이다.
일부 구체예에서, 조성물은 신경변성 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 것이다.
특정한 구체예에서, 이들 조성물은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 것이다: 진행성 핵상 마비, 진행성 핵상 마비, 스틸-리처드슨-올스제브스키 증후군, 정상압 수두증, 혈관 또는 동맥경화성 파킨슨증 및 약물 유발된 파킨슨증을 비롯한 파킨슨병; 벤손 증후군을 비롯한 알츠하이머병; 다발성 경화증; 헌팅턴병; 근위축성 측삭 경화증; 루게릭병; 운동 뉴런 질환; 프리온 질환; 척수소뇌 실조증; 척수 근위축증; 루이체 치매, 혈관성 치매 및 전두측두엽 치매를 비롯한 치매; 원발성 진행형 실어증; 경미한 인지 장애; HIV-관련된 인지 장애, 진행성 염증성 신경병증 및 피질기저 퇴행.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 파킨슨병, 예를 들면, 환경적, 가족성, 또는 일반적인 염증성 상태와 연관된 파킨슨병을 치료하거나 또는 예방하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 본 발명자들은 본 발명의 조성물로 치료가 환경적 및 가족성 파킨슨병의 시험관내 모형에서 LPS 및 돌연변이체 α-시누클레인에 의한, 친염증성 분자, 예를 들면, NFκB 및 IL-6의 활성화를 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 조기 발생 신경변성 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경변성 장애의 발생 또는 진행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법에서 이용을 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 파킨슨병의 치료에서 이용을 위한 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주, 그리고 헥산산, 발레르산, 발프로산, 레티노산 또는 4-히드록시페닐아세트산으로 구성되는 목록에서 선택되는 유기 산을 포함하는 조합을 제공한다. 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 및 헥산산을 이용하는 조합은 신경변성 질환, 특히 파킨슨병을 치료하는 방법에서 이용하는데 특히 효과적일 수 있다. 본 발명의 바람직한 조성물은 공생균 및 레티노산을 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 조성물은 공생균 및 헥산산을 포함한다. 본 발명의 더욱 바람직한 조성물은 공생균 및 발레르산을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 공생 세균 균주는 박테로이데스 (Bacteroides), 엔테로코쿠스 (Enterococcus), 에스케리키아 (Escherichia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 락토바실루스 (Lactobacillus), 메가스파에라 (Megasphaera), 클로스트리듐 (Clostridium), 프로테우스 (Proteus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 살모넬라 (Salmonella), 파에칼리박테리움 (Faecalibacterium), 펩토스트렙토코쿠스 (Peptostreptococcus) 또는 펩토코쿠스 (Peptococcus), 또는 이들의 조합으로 구성되는 목록에서 선택되는 속으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 공생 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속으로부터 유래된다. 일부 바람직한 구체예에서, 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 균주이다. 밀접하게 관련된 균주, 예를 들면, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)의 세균 균주의 16S rRNA 서열과 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는 세균 균주 또한 이용될 수 있다. 바람직하게는, 세균 균주는 서열 번호: 2와 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호: 2에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 균주는 각각 하기 화학식을 갖는 한 가지 또는 그 이상의 유기 산을 생산하고: Rx-COOH, 여기서 Rx는 최소한 4개의 탄소를 포함하는 알킬 기를 포함하거나, 또는 여기서 Rx는 치환체 히드록실 기를 갖는 페닐 기를 포함하고, 여기서 임의선택적으로 히드록실 기는 위치 4에 있고, 여기서 상기 유기 산은 신경변성 장애의 치료 또는 예방에 효과적이다. 일부 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 균주는 헥산산, 발레르산, 발프로산, 레티노산 또는 4-히드록시페닐아세트산으로 구성되는 목록에서 선택되는 유기 산을 생산한다. 바람직하게는, 본 발명의 균주는 IL-8의 활성화를 증가시키고 IL-6의 활성화를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 조성물의 공생 세균 균주는 본 발명의 유기 산을 생산하도록 가공된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여용이다. 본 발명의 균주 및 적용가능한 경우에 본 발명의 유기 산의 경구 투여는 신경변성 장애에 효과적일 수 있다. 또한, 경구 투여는 환자 및 의사에게 편의하고, 그리고 장에 전달 및/또는 장의 부분적인 또는 전체 집락형성을 허용한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 한 가지 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 동결건조된 공생 세균 균주를 포함한다. 동결건조는 세균의 전달을 허용하는 안정된 조성물을 제조하기 위한 효과적이고 편의한 기술이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 전술된 바와 같은 조성물 중에서 어느 것을 포함하는 식품 산물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 전술된 바와 같은 조성물을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 신경변성 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 각각 하기 화학식을 갖는 한 가지 또는 그 이상의 유기 산을 생산하는 공생 세균 균주를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하고: Rx-COOH, 여기서 Rx는 최소한 4개의 탄소를 포함하는 알킬 기를 포함하거나, 또는 여기서 Rx는 치환체 히드록실 기를 갖는 페닐 기를 포함하고, 여기서 임의선택적으로 히드록실 기는 위치 4에 있다.
본 발명은 또한, 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 공생 세균 균주 및 유기 산 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르의 조합을 투여하는 것을 포함한다.
상기 발명을 개발하는 동안, 본 발명자들은 요법에 특히 유용한 세균 균주를 확인하고 특징화하였다. 본 발명의 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주는 본원에서 설명된 질환, 예를 들면, 신경변성 질환을 치료하는데 효과적인 것으로 밝혀진다. 이런 이유로, 다른 양상에서, 본 발명은 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한, 이런 세포를 포함하는 조성물, 또는 이런 세포의 생물학적으로 순수한 배양액을 제공한다. 본 발명은 또한, 특히 본원에서 설명된 질환에 대한 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다.
본 발명의 어느 한쪽 양상의 일정한 구체예에서, 조성물은 뇌 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물의 신경보호 활성 및 히스톤 탈아세틸화효소 활성 (HDAC)의 수준을 감소시키는 능력은 이들을 뇌 손상을 치료하는데 유용하게 만들 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌졸중을 치료하는데, 예를 들면, 뇌졸중으로부터 발생하는 뇌 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1: 신경모세포종 세포의 세포 생존력
도 2: IL-6 분비의 하향조절
도 3: IL-8의 분비
도 4: α-시누클레인 IL-6 및 IL-8 분비의 저해
도 5: α-시누클레인 유도된 NFκB 프로모터 활성화의 저해
도 6: LPS 유도된 NFκB 프로모터 활성화의 저해
도 7: 신경돌기 생장의 증진: 광학 검경 및 MAP2 유전자 발현 (도 7a), 팔로이딘 면역형광 현미경검사 (도 7b)
도 8: 항산화 용량에서 변화
도 9: 전체 항산화 용량 (지질 산화)에서 변화
도 10: (a) U373 세포 및 (b) SHSY-5Y 세포에서 ROS 수준에서 변화
도 11: 신경보호 - 세포 생존력. 도 11은 도 1과 동일한 데이터를 보여준다.
도 12: 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC) 활성에서 변화
도 13 전체 세포 및 세포 용해물 히스톤 탈아세틸화효소 활성에서 균주-유도된 변화 (도 13a), 히스톤 탈아세틸화효소 활성에서 산-유도된 변화 (도 13b), 균주에 의한 대사산물 생산 (도 13c)
도 14 HDAC1 저해 (도 14a), HDAC2 저해 (도 14b), HDAC3 저해 (도 14c)
도 15 클래스 I HDACs의 저해 (도 15a); HDAC1의 저해 (도 15b); HDAC2의 저해 (도 15c); HDAC3의 저해 (도 15d)
도 16: 인돌 생산의 수준
도 17: 키뉴레닌 생산의 수준
도 18: BDNF 생산의 수준
도 19: 뇌에서 대사산물 생산 - 신경전달물질의 수준
도 20: 상층액에서 대사산물 생산 - 유기 산의 수준
도 21: 선조체에서 평균 도파민 (DA) 수준 (도 21a), DOPAC 수준 (도 21b) 및 HVA 수준 (도 21c). 데이터는 평균 + SEM으로서 전시된다.
도 22: 장관 장벽 기능에 대한 효과.
도 23: 뇌에서 신경전달물질의 생산
도 24: 해마 수용체 발현에서 변화 - A) 옥시토신 수용체, B) 바소프레신 수용체, C) 글루코코르티코이드 수용체 및 D) 광물코르티코이드 수용체
도 25: A) 코르티코트로핀-방출 호르몬 (CRH), B) BDNF 발현 및 C) TLR4의 해마 발현에서 변화
도 26: A) 해마 부신겉질자극호르몬 방출 호르몬 수용체 1 (CRFR1) 발현 및 B) 부신겉질자극호르몬 방출 호르몬 수용체 2 (CRFR2) 발현에서 변화
도 27: A) 종양 괴사 인자, B) 인터류킨 1b 및 C) IL-6의 해마 발현에서 변화
도 28: A) 해마 인테그린 알파 M (CD11b) 발현에서 변화 및 B) 해마 세로토닌 1A 수용체 (5-HT1A 수용체) 발현에서 변화
도 29: A) 해마 글루타민산염 이온성 수용체 NMDA 유형 아단위 2A (Grin2A) 및 B) 글루타민산염 이온성 수용체 NMDA 유형 아단위 2B (Grin2B) 발현에서 변화
도 30: A) 감마 아미노부티르산 A 수용체 2 (GABA A2), B) 감마 아미노부티르산 B 수용체 1 (GABA BR1) 및 C) 도파민 수용체 1 (DRD1)의 해마 발현에서 변화
도 31: 편도 수용체 발현에서 변화 - A) 옥시토신 수용체, B) 바소프레신 수용체, C) 글루코코르티코이드 수용체 및 D) 광물코르티코이드 수용체
도 32: A) 뇌 유래된 신경영양 인자 (BDNF), B) 톨 유사 수용체 4 (TLR-4), C) 부신겉질자극호르몬 방출 호르몬 수용체 1 (CRFR1) 및 D) 부신겉질자극호르몬 방출 호르몬 수용체 2 (CRFR2)의 편도 발현에서 변화
도 33: A) 인테그린 알파 M (CD11b), B) 인터류킨-6 (IL-6), C) 글루타민산염 이온성 수용체 NMDA 유형 아단위 2A (Grin2A) 및 D) 글루타민산염 이온성 수용체 NMDA 유형 아단위 2B (Grin2B)의 편도 발현에서 변화
도 34: A) GABA-A 수용체 알파 2 아단위 (GABRA2), B) GABA-A 유형 B 수용체 1 아단위 (GABBR1) 및 C) 도파민 수용체 1 (DRD1)의 편도 발현에서 변화
도 35: A) 옥시토신 수용체, B) 뇌 유래된 신경영양 인자 (BDNF), C) 광물코르티코이드 수용체 및 D) 글루코코르티코이드 수용체의 전전두엽 피질 발현에서 변화
도 36: A) 톨 유사 수용체 4 (TLR-4), B) 부신겉질자극호르몬 방출 호르몬 수용체 1 (CRFR1), C) 부신겉질자극호르몬 방출 호르몬 수용체 2 (CRFR2) 및 D) 인테그린 알파 M (CD11b)의 전전두엽 피질 발현에서 변화
도 37: A) 인터류킨-6 (IL-6), B) 글루타민산염 이온성 수용체 NMDA 유형 아단위 2A (Grin2A), C) 글루타민산염 이온성 수용체 NMDA 유형 아단위 2B (Grin2B) 및 D) GABA-A 수용체 알파 2 아단위 (GABRA2)의 전전두엽 피질 발현에서 변화
도 38: A) GABA-A 수용체 유형 B 수용체 아단위 1 (GABBR1) 및 B) 도파민 수용체 1 (DRD1)의 전전두엽 피질 발현에서 변화
도 39: A) 트립토판 수산화효소-1 (Tph1) 및 B) 인돌아민2,3-디옥시게나아제-1 (IDO1)의 결장 발현에서 변화
도 40: A) 트립토판 수산화효소-1 (Tph1) 및 B) 인돌아민2,3-디옥시게나아제-1 (IDO1)의 회장 발현에서 변화
도 41: A) 키뉴레닌, B) 트립토판 및 C) 물질대사의 키뉴레닌/ 트립토판 지수의 순환하는 트립토판 대사산물 수준에서 변화
도 42: MRx0029가 급이된 생쥐로부터 생쥐 비장세포로부터 인터페론-γ 생산에 대한 효과
도 43: 비장세포로부터 인터류킨-1β 생산에 대한 효과
도 44: 비장세포로부터 인터류킨-6 생산에 대한 효과
도 45: 비장세포로부터 종양 괴사 인자 생산에 대한 효과
도 46: 비장세포로부터 인터류킨-10 생산에 대한 효과
도 47: 비장세포로부터 화학유인물질 CXCL1 생산에 대한 효과
도 48: 맹장 짧은 사슬 지방산 수준에서 변화
도 49: 액틴, 빌린, 오클루딘 TJP1, TJP2, MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PINK1, PARK7 및 NSE의 유전자 발현 수준에서 MRx0029 및 MRX005-유도된 변화.
도 50: MRx0005 및 MRx0029에 의해 유도된 SHSY5Y 세포 분화. (A-C) 팔로이딘 및 MAP2로 면역표지화된 세포의 대표적인 이미지. (D-F) DAPI 이미지와 병합된 A-C의 이미지. (G-I) β3 튜불린 면역표지화된 세포. (J-L) DAPI 이미지와 병합됨. 배율 x630. SHSY5Y 세포에 대한 MRx0005 및 MRx0029 처리의 효과의 웨스턴 블롯 분석. 웨스턴 블롯 막은 MAP2 (M) 및 b3 튜불린 (N)에 대한 항체로 탐침되었다. 액틴은 부하 대조로서 이용되었다. 아래쪽 패널: 6가지 별개의 실험 중에서 한 가지로부터 대표적인 블롯; 위쪽 패널: 상대적 농도계측 강도.
발명의 개시
세균 균주
본 발명의 조성물은 질환을 치료하거나 예방하는데 유용한 공생 세균 균주를 포함한다. 첫 번째 양상에서, 본 발명의 공생 세균 균주는 각각 하기 화학식을 갖는 한 가지 또는 그 이상의 유기 산을 생산하고: Rx-COOH, 여기서 Rx는 최소한 4개의 탄소를 포함하는 알킬 기를 포함하거나, 또는 여기서 Rx는 치환체 히드록실 기를 갖는 페닐 기를 포함하고, 여기서 임의선택적으로 히드록실 기는 위치 4에 있다. 두 번째 양상에서, 본 발명은 공생 세균 균주 및 화학식 R-COOH를 갖는 한 가지 또는 그 이상의 유기 산 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함하는 조성물을 제공한다. 두 번째 양상의 공생 세균 균주는 본 발명에 따른 유기 산을 생산하거나 또는 생산하지 않을 수 있다.
본 발명자들은 일정한 공생 세균 균주가 염증성 사이토킨, 예를 들면, IL-6의 활성화를 감소시키고, 그리고 염증성 사이토킨 IL-8의 활성화를 증가시킨다는 것을 발견하였다. IL-8은 미엘린초 형성에 연루되었다. IL-6에 의해 유도된 만성 염증은 세포 사멸을 궁극적으로 야기할 수 있다. 이런 이유로, 본 발명의 공생 세균 균주는 신경변성 장애의 치료 또는 예방에서 특히 유용하다. 일부 구체예에서, 공생 세균 종은 IL-6의 증강된 활성화에 의해 특징화되는 질환의 치료에 유용하다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 탈수초화에 의해 특징화되는 신경변성 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다. 많은 신경변성 질환이 탈수초화에 의해 특징화된다. 탈수초화는 뉴런 내에서 활동 전위의 전파를 방해하고, 신경계 내에서 효과적인 통신을 손상시킨다. IL-8은 미엘린초 형성 및 수복에 긍정적으로 기여하는 것으로 밝혀졌다 [22]. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 특히, 탈수초화에 의해 특징화되는 신경변성 장애, 예를 들면, 다발성 경화증의 치료 또는 예방에서 유익하다.
본 발명자들은 본 발명의 공생균이 질환의 모형에서 신경변성 질환의 증상을 경감한다는 것을 발견하였다. 가령, 본 발명자들은 특정 공생균 균주가 시험관내에서 신경돌기 생장을 증진하고, 그리고 이런 이유로, 신경변성 질환의 치료 또는 예방을 위한 뉴런 수복을 증진하는데 이용될 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 공생 세균 균주는 신경변성 질환의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 것이다.
본 발명의 첫 번째 양상의 공생 세균 균주는 본 발명의 유기 산 중에서 한 가지 또는 그 이상을 생산하고 본 발명의 유기 산 중에서 한 가지 또는 그 이상과 조합으로 투여될 수 있다.
신경변성 질환의 치료 또는 예방에 유익한 두 번째 양상의 공생 세균 균주는 본원에서 설명된 신경복원 또는 신경보호 성질을 갖는 유기 산과 조합으로 투여될 수 있다.
본 발명의 첫 번째와 두 번째 양상의 공생 세균 균주는 공생 세균 균주가 본 발명에 따른 유기 산 중에서 한 가지 또는 그 이상을 생산하는 지 아닌 지에 상관없이, IL-6/IL-8 축의 전역에서 유익한 효과를 전시하는 것들을 포함한다.
본 발명자들은 또한, 본 발명의 공생 세균 균주가 BDNF의 활성화를 증가시킨다는 것을 발견하였다. BDNF는 뉴런 분화 및 생존을 증강하는 것으로 밝혀진 신경영양 성장 인자이다. 이러한 효과는 공생 세균 균주가 본 발명의 유기 산과 조합으로 투여될 때 가장 두드러지게 관찰된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 신경변성 질환의 치료 또는 예방에서 신경세포 생존을 증강하는 방법에서 이용될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "활성화"를 "증가시키는" 또는 "감소시키는" 것은 바람직하게는, 위장관에 투여 이후에 생리학적 기능을 수행하는데 이용가능한 생리활성 생체분자의 농도를 증강하거나 또는 감소시키는 것을 지칭한다. 다시 말하면, "증가시키는" 또는 "감소시키는"은 생리학적 반응이 온당하게 변화되도록 생체분자의 수준을 조정하는 것을 지칭한다. 이것은 예로서, 생체분자의 발현 또는 분비를 조정함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 공생 세균 균주를 포함한다. 공생 세균 균주는 포유동물, 예를 들면, 인간의 위장관으로부터 유래된 공생체이다. 공생 세균 균주가 유래될 수 있는 속의 실례는 박테로이데스 (Bacteroides), 엔테로코쿠스 (Enterococcus), 에스케리키아 (Escherichia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 락토바실루스 (Lactobacillus), 메가스파에라 (Megasphaera), 클로스트리듐 (Clostridium), 프로테우스 (Proteus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 살모넬라 (Salmonella), 파에칼리박테리움 (Faecalibacterium), 펩토스트렙토코쿠스 (Peptostreptococcus) 또는 펩토코쿠스 (Peptococcus)를 포함한다. 일부 구체예에서, 공생 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 공생 세균 균주이다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용을 위한 메가스파에라 (Megasphaera) 종은 메가스파에라 엘스데니이 (Megasphaera elsdenii), 메가스파에라 세레비지애 (Megasphaera cerevisiae), 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis), 메가스파에라 인디카 (Megasphaera indica), 메가스파에라 파우시보란스 (Megasphaera paucivorans), 메가스파에라 수에시엔시스 (Megasphaera sueciensis) 및 메가스파에라 마이크로누시포르미스 (Megasphaera micronuciformis)를 포함한다. 본 발명에서 이용을 위한 메가스파에라 (Megasphaera) 종의 추가 실례는 메가스파에라 헥사노이카 (Megasphaera hexanoica)이다. 메가스파에라 (Megasphaera)는 인간을 비롯하여, 반추 및 비반추 포유동물의 절대 혐기성, 유산염-발효, 위장관 미생물이다. 바람직하게는, 세균 균주는 조성물이 투여되도록 의도되는 종으로부터 유래된다.
메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis)의 표준 균주는 NP3 (=CSUR P245=DSM 26228)이다 [23]. 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주 NP3의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 GenBank 수탁 번호는 JX424772.1 (본원에서 서열 번호: 1로서 개시됨)이다.
실시예에서 검사된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 세균은 본원에서 균주 MRx0029로서 지칭된다. MRX0029 및 MRx0029는 본원에서 교체가능하게 이용된다. 검사된 MRx0029 균주에 대한 16S rRNA 서열은 서열 번호: 2에서 제공된다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용을 위한 세균은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 균주, 특히 균주 MRx0029이다.
균주 MRx0029는 2017년 7월 13일자에 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Cornhill Road, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)에 의해 "메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRx0029"로서 국제 기탁 기관 NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)에 기탁되었고, 그리고 수탁 번호 NCIMB 42787이 배정되었다.
실시예에서 검사된 균주에 밀접하게 관련된 공생 세균 균주 또한, 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는데 효과적일 것으로 예상된다. 일정한 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)의 세균 균주의 16S rRNA 서열과 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호: 2와 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 서열 번호: 2에 의해 대표되는 16S rRNA 서열을 갖는다.
균주 MRx0029의 생물형인 공생 세균 균주 또한, 신경변성 장애를 치료하거나 예방하는데 효과적일 것으로 예상된다. 생물형은 동일한 또는 매우 유사한 생리학적 및 생화학적 특징을 갖는 밀접하게 관련된 균주이다.
균주 MRx0029의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 균주 MRx0029에 대한 다른 뉴클레오티드 서열을 염기서열결정함으로써 확인될 수 있다. 가령, 실제적으로 전체 유전체가 염기서열결정될 수 있고, 그리고 본 발명에서 이용을 위한 생물형 균주는 이의 전체 유전체의 최소한 80%에 걸쳐 (가령, 이의 전체 유전체의 최소한 85%, 90%, 95% 또는 99%, 또는 전역에 걸쳐) 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있다. 생물형 균주를 확인하는데 이용을 위한 다른 적합한 서열은 hsp60 또는 반복 서열, 예를 들면, BOX, ERIC, (GTG)5, 또는 REP [24]을 포함할 수 있다. 생물형 균주는 균주 MRx0029의 상응하는 서열에 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 유용한 공생 세균 균주는 본 발명의 유기 산을 생산하는 것이다. 이런 생물형은 세균 균주의 대사산물의 생산을 프로파일링함으로써 확인될 수 있다. 대사산물 프로파일링이 본 발명의 신경자극 유기 산을 생산하는 후보 세균 균주를 확인하는데 이용될 수 있다. 대사산물 프로파일링은 질량 분광분석법에 의해 수행될 수 있다. 유기 산을 생산하고 본원에서 설명된 용도에 적합한 후보 균주는 이후, 실시예에서 명시된 바와 같은 방법 및 검정을 수행함으로써 확인될 수 있다.
대안으로, 본 발명의 유기 산을 생산할 수 있는 적합한 생물형은 이들 유기 산을 생산하는 대사 경로를 내포하는 것들이다. 이런 균주는 예로서, 세균 균주가 원하는 유기 산의 생합성에 필요한 효소를 인코딩하는 지를 결정함으로써, 유전체학 분석에 의해 확인될 수 있다. 가령, 헥산산 생산은 복수 효소의 존재를 필요로 하는 다단계 촉매 과정이다. 헥산산의 생산에서 결정적인 단계는 C6 아실-CoA 중간체, 예를 들면, 3-케토헥사노일-CoA를 형성하기 위한 아세틸-CoA 및 부티르산-CoA의 응축이다. C4 및 C2-CoA 전구체의 생산을 위해 필요한 효소는 당업자에게 널리 알려져 있다. C2 및 C4 전구체의 응축을 위한 적합한 효소의 실례는 베타-케토티올라아제이다. C4 CoA의 형성을 위한 효소 경로는 C6 기질과의 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이런 이유로, 일단 C6 중간체가 형성되면, C4 부티르산-CoA의 생산을 촉매작용하는 효소 또한 헥산산의 산출에 적합하다. 따라서, 적합한 생물형은 C4-CoA 및 C2-CoA 생산- 효소, 그리고 베타-케토티올라아제 활성을 갖는 효소를 인코딩하는 것들이다. 적합한 균주는 헥산산의 생산에 관련된 널리 알려진 효소의 조회 서열을 이용함으로써 상동성 서열 검색 데이터베이스, 예를 들면, BLASTP 또는 UNIPROT KB를 이용하여 확인될 수 있다.
아래에는 보충 참고문헌과 함께, 본 발명에 따라서 이용되는 유기 산을 생산하는 것으로 알려져 있는 세균이 열거된다. 이들 목록 및 인용된 문헌을 이용하여, 신경변성 장애를 치료하는데 유용한 추가 균주 및 종이 확인될 수 있다.
하기의 종 및 균주는 헥산산을 생산하는 것으로 알려져 있고, 그리고 따라서, 본 발명의 조성물에서 유용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 하기에서 선택되는 종의 세균 균주를 포함한다: 메가스파에라 헥사노이카 (Megasphaera hexanoica) [25], 특히 균주 메가스파에라 헥사노이카 (Megasphaera hexanoica) KFCC11466P (KR101745084B1); 메가스파에라 (Megasphaera) 종 MH [26]; 메가스파에라 엘스데니이 (Megasphaera elsdenii) [27] 및 [28], 특히 균주 메가스파에라 엘스데니이 (Megasphaera elsdenii) NCIMB 702410 [29]; 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri) [30]; 클로스트리듐 (Clostridium) 종 BS-1 [31], CPB6 (루미노코카세 박테리움 (Ruminococcaceae bacterium), 클로스트리듐 클러스터 (Clostridium cluster) IV) [32]; 락토바실루스 샌프란시센시스 (Lactobacillus sanfranciscensis) CB1 [33]; 페디오코쿠스 아키딜락티키 (Pediococcus acidilactici) [34]; 리시니바실루스 (Lysinibacillus) 종 Y20 [35] 또는 유박테리움 피루바티보란스 (Eubacterium pyruvativorans) (I-6) [36].
바실루스 세레우스 (Bacillus cereus)는 레티노산을 생산하는 것으로 알려져 있고, 그리고 따라서, 본 발명의 조성물에서 유용할 수 있다 [37]. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 바실루스 세레우스 (Bacillus cereus) 종의 균주를 포함한다.
하기의 속, 종 및 균주는 (4)-히드록시페닐아세트산을 생산하는 것으로 알려져 있고, 그리고 따라서, 본 발명의 조성물에서 유용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 클로스트리디아 (Clostridia) 속의 세균 균주 [38] 및 [39], 바람직하게는 클로스트리듐 디피실 (C. difficile) 종의 세균 균주 [40] 및 [41], 특히 균주 클로스트리듐 디피실 (C. difficile) CDC A567 [42], 클로스트리듐 디피실 (C. difficile) DSM 101085 [43], 클로스트리듐 디피실 (C. difficile) DSM 102978 [43], 클로스트리듐 디피실 (C. difficile) DSM 102860 [43], 그리고 클로스트리듐 디피실 (C. difficile) DSM 28666 [43]; 클로스트리듐 푸트레파시엔스 (C. putrefaciens) [44]); 클로스트리듐 스틱클란디이 (C. stricklandii) [44] 및 Great Plains Lab, Organic Acid Test, Nutritional and Metabolic Profile, Clostridia Bacterial Markers); 클로스트리듐 리투세부렌세 (C. lituseburense) [44] 및 Great Plains Lab, Organic Acid Test, Nutritional and Metabolic Profile, Clostridia Bacterial Markers; 클로스트리듐 서브터미날레 (C. subterminale) [45], [46] 및 [44]; 클로스트리듐 프로피오니쿰 (C. propionicum) [44] [46]; 클로스트리듐 클로스트리디포르메 (C. clostridiiforme) [46]; 클로스트리듐 코클레아리움 (C. cochlearium) [46]; 클로스트리듐 글리코리쿰 (C. glycolicum) [46]; 클로스트리듐 하스티포르메 (C. hastiforme) [46]; 클로스트리듐 일레굴라리스 (C. irregularis) [46]; 클로스트리듐 퍼프린젠스 (C. perfringens) [47]; 또는 클로스트리듐 보툴리눔 (C. botulinum) 유형 G [48] 및 [49]를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 하기에서 선택되는 종의 세균 균주를 포함한다: 박테로이데스 프라길리스 (Bacteroides fragilis) [50] 및 [51]); 박테로이데스 테타이오타오미크론 (Bacteroides thetaiotaomicron) [51]; 박테로이데스 에게르티이 (Bacteroides eggerthii) [51]; 박테로이데스 오바투스 (Bacteroides ovatus) [51]; 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) [51]; 유박테리움 할리이 (Eubacterium hallii) [51]; 클로스트리듐 바르틀레티 (Clostridium bartlettii) [51]; 포르피로모나스 깅기발리스 (Porphyromonas gingivalis) [52]; 플라보박테리움 (Flavobacterium) 종 [53]; 데술피토박테리움 데할로게난스 (Desulfitobacterium dehalogenans) [54] 및 [55]; 데술피토박테리움 하프니엔스 (Desulfitobacterium hafniense) DCB-2 [54]; 또는 스트렙토미세스 센토니 (Streptomyces sentonii) [56].
본 발명의 첫 번째 양상에 따른, 신경보호 성질을 갖지만 유기 산을 생산하지 않는 공생균은 본 발명의 두 번째 양상에서, 유기 산과 조합으로 조성물에서 유용할 수 있다. 본 발명의 두 번째 양상의 조성물에서 이용될 수 있는 세균은 속 로세부리아 (Roseburia) (가령, 로세부리아 호미니스 (Roseburia hominis)), 박테로이데스 (Bacteroides), 파라박테로이데스 (Parabacteroides) (가령, 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis)), 블라우티아 (Blautia) (가령, 블라우티아 하이드로게노트로피카 (Blautia hydrogenotrophica), 블라우티아 스테르코리스 (Blautia stercoris), 블라우티아 웩슬러레 (Blautia wexlerae)), 루미노코쿠스 (Ruminococcus) (가령, 루미노코쿠스 알부스 (Ruminococcus albus) [57]), 클로스트리듐 (Clostridium) (가령, 클로스트리듐 부티리쿰 (Clostridium butyricum) [58]), 락토코쿠스 (Lactococcus) (가령, 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis), 락토코쿠스 람노수스 (Lactococcus rhamnosus)), 비피도박테리움 (Bifidobacterium) (가령, 비피도박테리움 브레베 (Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱굼 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis), 비피도박테리움 락티스 (Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 인판티스 (Bifidobacterium infantis)), 락토바실루스 (Lactobacillus) (가령, 락토바실루스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 델브루엑키 (Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실루스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus)) 또는 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) (가령, 스트렙토코쿠스 써모필루스 (Streptococcus thermophilus)) ([59], [60])에 속하는 것들을 포함한다.
대안으로, 균주 MRX0029의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 균주 MRX0029 및 제한 단편 분석 및/또는 PCR 분석을 이용함으로써, 예를 들면, 형광 증폭된 단편 길이 다형성 (FAFLP) 및 반복성 DNA 요소 (rep)-PCR 지문확인, 또는 단백질 프로파일링, 또는 부분적인 16S 또는 23S rDNA 염기서열결정을 이용함으로써 확인될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이런 기술은 다른 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주를 확인하는데 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 균주 MRX0029의 생물형이고 본 발명에서 이용에 적합한 균주는 증폭된 리보솜 DNA 제한 분석 (ARDRA)에 의해 분석될 때, 예를 들면, Sau3AI 제한 효소를 이용할 때 균주 MRX0029와 동일한 패턴을 제공하는 균주이다 (예시적인 방법 및 보도를 위해, 가령 [61]을 참조한다). 대안으로, 생물형 균주는 균주 MRX0029와 동일한 탄수화물 발효 패턴을 갖는 균주로서 확인된다.
본 발명의 조성물과 방법에서 유용한 다른 공생 세균 균주, 예를 들면, MRX0029의 생물형은 실시예에서 설명된 검정을 비롯하여, 임의의 적합한 방법 또는 전략을 이용하여 확인될 수 있다. 가령, 본 발명에서 이용을 위한 균주는 신경모세포종 세포와 함께 배양하고, 그리고 이후, 사이토킨 수준 및 신경보호 또는 신경증식의 수준을 사정함으로써 확인될 수 있다. 특히, MRX0029와 유사한 성장 패턴, 물질대사 유형 및/또는 표면 항원을 갖는 세균 균주가 본 발명에서 유용할 수 있다. 유용한 균주는 MRX0029에 필적하는 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 생물형 균주는 실시예에서 도시된 효과에 필적하는 신경변성 질환 모형에 대한 효과 및 필적하는 사이토킨 수준에 대한 효과를 이끌어 낼 것인데, 이들 효과는 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 균주는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029 균주이다. 이것은 실시예에서 검사되고 질환을 치료하는데 효과적인 것으로 밝혀진 예시적인 균주이다. 이런 이유로, 본 발명은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRX0029의 세포, 예를 들면, 단리된 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRX0029의 세포, 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRX0029의 생물학적으로 순수한 배양액을 제공한다. 본 발명은 또한, 특히 본원에서 설명된 질환에 대한 요법에서 이용을 위한 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRX0029의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다.
본 발명의 특히 바람직한 균주는 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주이다. 이것은 실시예에서 검사되고 질환을 치료하는데 효과적인 것으로 밝혀진 예시적인 MRx0029 균주이다. 이런 이유로, 본 발명은 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 예를 들면, 단리된 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 생물학적으로 순수한 배양액을 제공한다. 본 발명은 또한, 특히 본원에서 설명된 질환에 대한 요법에서 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 제공한다.
본 발명의 균주의 유도체는 본래 균주로부터 딸 균주 (자손) 또는 배양된 (하위클로닝된) 균주일 수 있다. 본 발명의 균주의 유도체는 생물학적 활성을 제거하지 않으면서, 예로서 유전적 수준에서 변형될 수 있다. 특히, 본 발명의 유도 균주는 치료적으로 활성이다. 유도 균주는 MRX0029 균주에 필적하는 치료적 활성을 가질 것이다. 특히, 유도 균주는 실시예에서 도시된 효과에 필적하는 신경변성 질환 모형에 대한 효과 및 필적하는 사이토킨 수준에 대한 효과를 이끌어 낼 것인데, 이들은 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다. MRX0029 균주의 유도체는 일반적으로 MRX0029 균주의 생물형일 것이다.
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029 균주의 세포에 대한 언급은 균주 MRX0029와 동일한 안전성 및 치료 효력 특징을 갖는 임의의 세포를 포괄하고, 그리고 이런 세포는 본 발명에 의해 포괄된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 생존가능하고, 그리고 장을 부분적으로 또는 완전히 집락화할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 이용될 수 있는 추가 공생균은 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) 종이다. 실시예는 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) 및 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 둘 모두 신경보호 활성을 갖긴 하지만, 상이한 대사산물을 생산하고 상이한 작용 기전 및 특정한 신경보호 활성을 가질 수 있다는 것을 증명한다. 이런 이유로, 이들 종은 특히, 조합으로 이용될 때 효과적일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) 종의 균주 및 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 균주를 포함한다. 조성물은 본원에서 규정된 바와 같이, 유기 산을 또한 포함할 수 있다.
수탁 번호 NCIMB 42382 하에 기탁된 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) 세균은 실시예에서 검사되었고, 그리고 본원에서 균주 MRx0005로서 또한 지칭된다. MRX0005, MRX005, MRx005 및 MRx0005는 본원에서 교체가능하게 이용된다. 검사된 MRx0005 균주에 대한 16S rRNA 서열은 서열 번호: 17에서 제공된다. 균주 MRx0005는 2015년 3월 12일자에 GT Biologics Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)에 의해 "파라박테로이데스 (Parabacteroides) 종 755"로서 국제 기탁 기관 NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)에 기탁되었고, 그리고 수탁 번호 NCIMB 42382가 배정되었다. GT Biologics Ltd.는 차후에, 사명을 4D Pharma Research Limited로 변경하였다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 바람직하게는 요법에서 이용을 위한, 바람직하게는 신경변성 질환, 예를 들면, 파킨슨병을 치료하는데 이용을 위한, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 NCIMB에서 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형, 그리고 수탁 번호 NCIMB 42382 하에 NCIMB에서 기탁된 균주, 또는 이의 유도체 또는 생물형을 포함하는 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 세균 균주를 포함하지 않는다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하지 않는다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 기탁된 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주를 포함하지 않는다.
유기 산
실시예에서 증명된 바와 같이, 본원에서 설명된 한 가지 또는 그 이상의 유기 산은 신경보호 및/또는 신경복원 성질을 갖는다. 가령, 본 발명의 유기 산은 신경돌기 생장을 증진할 수 있다. 신경돌기 생장은 신경돌기생성의 과정인데, 이것은 뉴런의 세포체로부터 축삭돌기 또는 수상돌기의 형성을 지칭한다. 축삭돌기 및 수상돌기는 활동 전위를 받아들이고 전파하는데 책임이 있다. 따라서, 신경돌기 생장을 증가시키는 것은 신경계 내에서 신경 네트워크 내에 효과적인 통신을 복원하거나 또는 보존할 수 있다. 이런 이유로, 일부 구체예에서, 본 발명에서 이용에 적합한 유기 산은 신경돌기 생장을 증진할 수 있는 것들이다. 이런 유기 산은 질환을 예방하는 방법에서 이용을 위한 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 유기 산은 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 것이다.
한 가지 또는 그 이상의 유기 산은 하기 화학식을 포함한다: R-COOH.
일부 구체예에서, R은 알킬 기를 포함한다. 본원에서 지칭된 바와 같이, 알킬 기는 선형, 분지된 또는 환상 포화된 탄화수소 사슬, 또는 그것으로부터 유래된 임의의 치환체이다. 일부 구체예에서, R은 알케닐 기를 포함한다. 본원에서 지칭된 바와 같이, 알케닐 기는 최소한 하나의 탄소-대-탄소 이중 결합을 포함하는 선형, 분지된 또는 환상 불포화 탄화수소, 또는 그것으로부터 유래된 임의의 치환체이다. 일부 구체예에서, R은 알키닐 기를 포함한다. 본원에서 지칭된 바와 같이, 알키닐 기는 최소한 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 선형, 분지된 또는 환상 불포화 탄화수소, 또는 그것으로부터 유래된 임의의 치환체이다. 일부 구체예에서, R은 아릴 기를 포함한다. 본원에서 지칭된 바와 같이, 아릴 기는 선형, 분지된 또는 환상 방향족 탄화수소, 또는 그것으로부터 유래된 임의의 치환체이다.
본원에서 지칭된 바와 같이, 치환체는 부모 탄화수소 사슬의 하나 또는 그 이상의 수소를 대체하는 원자 또는 원자의 군이다. 일부 구체예에서, R은 하나 또는 그 이상의 치환체를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 치환체는 히드록실, 카르보닐, 알데히드, 할로포르밀, 탄산염 에스테르, 카르복실산염, 카르복실, 에스테르, 메톡시, 히드로페록시, 페록시, 에테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 아세탈, 케탈, 오르토에스테르, 메틸렌디옥시, 카르복스아미드, 아민, 이민, 질산염, 니트릴, 아질산염, 피리딜, 술피드릴, 황화물, 디설피드, 술피닐, 술포닐, 술피노, 술포, 카르보노티오일, 카테콜, 또는 이들의 조합으로 구성되는 목록에서 선택된다.
일부 구체예에서, R은 최소한 4개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구체예에서, R은 최소한 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구체예에서, R은 4 내지 19개 범위의 탄소 원자를 포함한다.
일부 구체예에서, R은 4 내지 11개 범위의 탄소를 포함한다. 일부 구체예에서, R은 5개의 탄소 원자로 구성되는 알킬 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 한 가지 또는 그 이상의 유기 산은 헥산산을 포함한다. 본 발명자들은 헥산산 및 헥산산을 생산하는 본원에서 설명된 세균 균주가 신경돌기 생장을 증강한다는 것을 발견하였다. 따라서, 이들 유기 산은 신경돌기 생장을 증진하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 유기 산은 신경변성 질환의 치료 또는 예방에서 신경돌기 생장을 증진하는데 이용될 수 있다. 헥산산을 생산하는 본 발명의 예시적인 세균 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속으로부터 것들을 포함한다.
일부 구체예에서, R은 4개의 탄소 원자로 구성되는 알킬 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 한 가지 또는 그 이상의 유기 산은 발레르산을 포함한다. 발레르산 및 펜탄산은 본원에서 교체가능하게 이용된다. 본 발명자들은 발레르산 및 발레르산을 생산하는 본원에서 설명된 공생 세균 균주가 히스톤 탈아세틸화를 감소시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 특히 본 발명자들은 발레르산이 히스톤 탈아세틸화효소 저해제이라는 것을 발견하였다. 히스톤 탈아세틸화효소 (HDACs)는 염색질 아세틸화를 조정함으로써 유전자 발현을 조절한다. HDACs의 상이한 동종형의 과다발현이 여러 유형의 암 세포에서뿐만 아니라 신경학적 및 염증성 병리에서 발견되었다. 인간에서는 총 13가지 HDACs가 있는데, 이들은 4가지 주요 부류 - 클래스 I (HDACs 1, 2, 3 및 8), 클래스 IIa (HDACs 4,5,7 및 9) 및 클래스 IIb (HDACs 6 및 10), 클래스 III (sirt1-sirt7) 및 클래스 IV (HDAC 11)로 분류된다. 본 발명자들은 발레르산이 클래스 1 HDAC 저해제이라는 것을 발견하였다.
일부 구체예에서, R은 분지된 알킬 기를 포함한다. 일부 구체예에서, R은 최소한 5개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구체예에서, R은 5 내지 9개 범위의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구체예에서, R은 부티르산 기를 포함한다. 일부 구체예에서, R은 부틸 기 및 프로필 기로 구성된다. 일부 구체예에서, 한 가지 또는 그 이상의 유기 산은 발프로산을 포함한다. 본 발명자들은 발프로산이 신경돌기 생장을 증가시키고, 그리고 따라서, 신경회복의 방법에서 이용될 수 있다는 것을 보여주었다. 발프로산은 비록 세균 요법과 조합으로는 아니지만, PD의 쥐 모형에서 신경회복을 보조하는 것으로 또한 밝혀졌다 [62]. 발프로산은 MAP2 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
일부 구체예에서, R은 아릴 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 아릴 기는 페닐 기이다. 일부 구체예에서, 페닐 기는 히드록실 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 히드록실 기는 고리 위치 2, 3, 4, 5 또는 6에 있다. 일부 구체예에서, 히드록실 기는 고리 위치 4에 있다. 일부 구체예에서, R은 4-히드록시페닐아세틸 기로 구성된다. 일부 구체예에서, 한 가지 또는 그 이상의 유기 산은 4-히드록시페닐아세트산을 포함한다. 본 발명자들은 이러한 유기 산 또는 이러한 유기 산을 생산하는 본원에서 설명된 세균 균주가 신경돌기 생장을 증진하는데 이용될 수 있다는 것을 보여주었다. 4-히드록시페닐아세트산은 또한, 항산화제이다. 일부 구체예에서, 4-히드록시페닐아세트산을 포함하는 한 가지 또는 그 이상의 유기 산은 산화 스트레스를 감소시켜 신경변성 장애의 치료 또는 예방에서 이용될 수 있다. 4-히드록시페닐아세트산은 도파민 및 노르에피네프린의 중간체이다. 도파민 및 노르에피네프린 (노르아드레날린으로서 또한 알려져 있음)은 교감신경계에서 작용하는 신경전달물질이다. 도파민 및 노르에피네프린의 수준은 신경변성 질환, 예를 들면, 파킨슨병으로 고통받는 개체에서 감소된다. 본 발명자들은 4-히드록시페닐아세트산을 생산하는 본원에서 설명된 공생 세균 균주가 뇌에서 노르아드레날린, 세로토닌 또는 5-히드록시트립타민 (5-HT)의 수준을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 이런 이유로, 4- 히드록시페닐아세트산은 더욱 낮은 수준의 노르에피네프린, 도파민, 세로토닌 또는 5- 히드록시트립타민에 의해 특징화되는 신경변성 질환의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 4- 히드록시페닐아세트산은 신경변성 질환의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있다.
일부 구체예에서, R은 알케닐 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 알케닐 기는 최소한 부분적으로 환상이다. 본원에서 지칭된 바와 같이, "부분적으로 환상" 기는 선형 사슬 부분 및 환상 사슬 부분을 포함하는 탄화수소 사슬이다. 일부 구체예에서, 부분적으로 환상 알케닐 기는 19개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구체예에서, R은 1 내지 8개 범위의 메틸 치환체 기를 포함한다. 일부 구체예에서, R은 1 내지 8개 범위의 탄소-대-탄소 이중 결합을 포함한다. 일부 구체예에서, 유기 산은 레티노산 또는 이의 유도체이다. 본 발명자들은 이들 유기 산이 본 발명의 세균 균주와 조합으로 투여될 때 BDNF의 활성화를 증가시킨다는 것을 발견하였다. 따라서, 일부 구체예에서, 이들 유기 산은 BDNF의 활성화를 증가시키는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 유기 산은 신경변성 질환의 치료 또는 예방에서 BDNF의 활성화를 증가시키는데 이용될 수 있다.
본 발명에서 이용을 위한 유기 산은 실시예에서 설명된 배양 및 투여 프로토콜을 이용함으로써 확인될 수 있다. 가령, 본 발명에서 이용을 위한 유기 산은 신경모세포종 세포와 함께 배양하고, 그리고 이후, 사이토킨 수준 및 신경보호 또는 신경증식 및 신경돌기생성의 수준을 사정함으로써 확인될 수 있다. 유용한 유기 산은 실시예에서 보여 지는 바와 같이, 최소한 발프로산, 헥산산 또는 레티노산에 필적하게 신경돌기 생장 활성을 증강할 수 있다. 특히, 유용한 유기 산은 유기 산이 본 발명의 공생 세균 균주와 조합으로 투여될 때, 실시예에서 도시된 효과에 필적하는 신경변성 질환 모형에 대한 효과 및 필적하는 사이토킨 및 성장 인자 수준에 대한 효과를 이끌어 낼 수 있다. 가령, 적합한 유기 산은 본 발명의 세균 균주와 조합으로 투여될 때 레티노산과 필적하게 BDNF의 활성화를 증가시킬 것이다. 첫 번째 양상에서, 유기 산은 본 발명의 공생 세균 균주에 의해 생산된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 적합한 유기 산은 본 발명의 공생 세균 균주와 함께 작용하여 치료적 반응을 증강하는 것들이다. 가령, 실시예는 MRX0029와 함께 발프로산의 투여가 BDNF의 분비를 증가시킨다는 것을 보여준다. BDNF는 기존의 뉴런의 생존을 뒷받침하는데 도움을 주고 새로운 뉴런 및 시냅스의 성장과 발육에 도움을 줄 수 있다. 이런 이유로, 본 발명의 일정한 유기 산은 신경보존, 또는 다시 말하면, 뉴런 사멸을 예방하는 방법에서 이용을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 짧은 사슬 지방산 (SCFAs)을 더욱 포함할 수 있다. SCFAs는 0 내지 4개의 탄소 원자로 구성되는 선형 또는 분지된 탄화수소 알킬 기에 결합된 카르복실산 기를 포함하는 유기 산이다. SCFAs는 혈액 뇌 장벽의 투과성을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 특히, SCFAs는 결함성 BBB 투과성을 시정하고, 따라서 투과성을 생리학적으로 온당한 수준까지 복원하는 것으로 밝혀졌다. 일부 구체예에서, SCFA는 포름산, 에탄산, 프로판산, 부티르산, 2-메틸프로판산 이소발레르산, 또는 이들의 염 또는 에스테르로 구성되는 목록에서 선택된다. 일부 구체예에서, SCFA는 치료적 조합의 일부이다. 일부 구체예에서, SCFA는 본 발명의 공생 세균 균주에 의해 생산된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 SCFA는 부티르산 또는 이의 염이다. 일부 구체예에서, 공생 세균 균주는 부티르산 또는 이의 염을 생산한다. 일부 구체예에서, 부티르산 또는 이의 염을 생산하는 공생 세균 균주는 본원에서 균주 MRX0029로서 지칭되는 메가스파에라 마스일리엔시스 (M. massiliensis) 균주이다. SCFA를 생산하는 세균 균주의 적합한 생물형은 이전 섹션에서 설명된 임의의 다른 방법, 예를 들면, 대사산물 프로파일링, 유전체 분석, 또는 증폭된 리보솜 DNA 제한 분석을 이용하여 확인될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 숙신산 또는 이의 염을 더욱 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 공생 세균 균주는 숙신산 또는 이의 염을 생산한다. 일부 구체예에서, 숙신산을 생산하는 공생 세균 균주는 본원에서 균주 MRX0005로서 지칭되는 균주이다. 숙신산은 산화 인산화에 관련된 Krebs 주기 대사산물이다. 산화 인산화의 기능장애가 알츠하이머병, 파킨슨병 및 척수소뇌 실조증 유형 1을 비롯한 신경변성 장애에서 보고되었다 [63,64]). 이런 이유로, 숙신산의 이용가능성을 증가시키는 것은 산화 인산화에서 결함을 반전시키고 미토콘드리아 활성을 증가시켜 신경변성 질환, 예를 들면, PD에 종속되는 뉴런의 건강을 향상시킬 수 있다 [65].
치료적 용도
실시예에서 증명된 바와 같이, 본 발명의 세균 조성물은 신경변성 장애를 치료하는데 효과적이다. 특히, 본 발명의 조성물로 치료는 신경증식 또는 신경돌기생성을 증가시키거나, 또는 뉴런, 예를 들면, 도파민 뉴런을 파괴하는 작용제에 대항하여 신경보호제로서 작용한다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 뉴런 사멸의 결과로서 발생하는 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 NFκB 프로모터의 활성화를 감소시킬 수 있는데, 이것은 사이토킨 생산, 예를 들면, IL-1β, IL-1α, IL-18, TNFα 및 IL-6을 활성화시킨다. 돌연변이체 α-시누클레인으로 세포를 처리하는 것은 가족성 파킨슨병에 대한 모형이다. 위치 53에서 아데닌으로부터 트레오닌으로의 점 돌연변이는 α-시누클레인 오접힘을 야기한다. 부정확하게 접힘된 α-시누클레인은 차후에, 불용성 원섬유 내로 응집하고, 이들은 루이체를 형성한다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 신경염증, 단백질 오접힘 및/또는 환경적 노출의 결과로서 발생하는 신경변성 장애를 치료하거나 예방하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 가족성 파킨슨병의 치료에 이용될 수 있다. NFκB 프로모터의 활성화는 TLR4 리간드를 통해 매개된다. TLR4는 파킨슨병을 모의하는 생쥐 모형 MPTP에서 세포 사멸을 매개하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 조성물은 NFκB 프로모터를 활성화시키는 TLR4의 능력을 저해하는데 이용될 수 있다. 특히 PD와 관련하여, TLR2 및 TLR4 둘 모두 PD 환자의 뇌에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다 [66]. 게다가 α-syn은 TLR2에 대한 리간드로서 설명되었고 [67], 그리고 우리는 HEK-TLR4 세포를 이용하여, α-syn이 또한 TLR4에 대한 리간드이라는 것을 증명하였다 [68].
본 발명의 조성물은 지질다당류 (LPS)에 의해 유도될 수 있는 친염증성 사이토킨, 예를 들면, IL-6의 분비를 감소시킨다. LPS로 세포의 처리는 환경 인자에 의해 유발된 파킨슨병을 모의한다. 본 발명의 조성물은 IL-6 분비를 줄이는데 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 환경적 파킨슨병의 치료에 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 IL-8의 분비를 증가시킬 수 있다. IL-8은 뉴런 수초화에서 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8 분비를 증가시키는데 이용될 수 있다.
본 발명의 치료 조성물은 BDNF의 활성화를 증가시킬 수 있다. BDNF는 중추신경계의 일정한 뉴런에서 작용하여, 기존의 뉴런의 생존을 뒷받침하고 새로운 뉴런과 시냅스의 성장과 발육에 도움을 준다. BDNF는 해마, 피질 및 기저 전뇌에서 활성이고, 그리고 장기 기억에 중요하다. 본 발명의 조성물은 이런 이유로, BDNF의 분비를 증가시키는데 이용될 수 있다. 이들 조성물은 이런 이유로, 장기 기억의 손상과 연관된 신경변성 질환의 치료에서 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 장기 기억을 향상시키는데, 특히 신경변성 질환에 의해 손상되는 장기 기억을 향상시키는데 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뉴런 세포에서 미토콘드리아 대사 활동을 증가시킨다.
본 발명의 조성물에 의해 치료되는 신경변성 질환의 실례는 하기를 포함한다: 진행성 핵상 마비, 진행성 핵상 마비, 스틸-리처드슨-올스제브스키 증후군, 정상압 수두증, 혈관 또는 동맥경화성 파킨슨증 및 약물 유발된 파킨슨증을 비롯한 파킨슨병; 벤손 증후군을 비롯한 알츠하이머병; 다발성 경화증; 헌팅턴병; 근위축성 측삭 경화증; 루게릭병; 운동 뉴런 질환; 프리온 질환; 척수소뇌 실조증; 척수 근위축증; 루이체 치매, 혈관성 치매 및 전두측두엽 치매를 비롯한 치매; 원발성 진행형 실어증; 경미한 인지 장애; HIV-관련된 인지 장애, 진행성 염증성 신경병증 및 피질기저 퇴행.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 특히, 신경변성 장애의 치료에서 뉴런 사멸을 감소시키는데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 특히, 신경변성 장애의 치료에서 뉴런을 보호하는데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 흑색질에서 도파민 세포의 상실을 감소시키거나 또는 예방하는데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 흑색질 치밀부에서 도파민 뉴런의 변성을 감소시키거나 또는 예방하는데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 흑색질 치밀부에서 도파민 뉴런의 변성 및 선조체에서 이들의 돌출 신경 섬유의 결과적인 상실을 감소시키거나 또는 예방하는데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 흑질선조체 도파민 뉴런의 상실을 감소시키거나 또는 예방하는데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 도파민 수준을 증가시키는데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 DOPAC (3,4-디히드록시페닐아세트산) 수준을 증가시키는데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 도파민 및 DOPAC 수준을 증가시키는데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 도파민 및/또는 DOPAC 수준은 선조체에서 증가된다. 도파민 및 DOPAC 수준은 당해 분야에서 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 예로서 혈장 또는 CSF에서 방사선효소 방법 (가령, [69]에서 설명된 바와 같이), 또는 예로서 혈장 또는 CSF에서 아마도 전기화학적 검출과 함께 역상 HPLC 방법 (가령, [70]에서 설명된 바와 같이)을 이용하여 계측될 수 있다.
실시예에서 증명된 바와 같이, 본 발명의 조성물의 신경보호 성질은 이들 조성물이 특히, 신경변성 장애의 발생 또는 진행을 예방하거나 또는 지연시키는데 효과적일 수 있다는 것을 의미한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경변성 장애의 발생 또는 진행을 지연시키는데 이용을 위한 것이다.
미생물 균총-소화관-뇌 축의 조정
소화관 및 뇌 (미생물 균총-소화관-뇌 축) 사이에 통신은 양지향성 신경호르몬 통신 시스템을 통해 일어난다. 최근 증거는 소화관에 있는 미생물 균총이 미생물 균총-소화관-뇌 축을 통해 뇌 발달을 조정하고 행동 표현형을 산출할 수 있다는 것을 보여준다. 실제로, 다수의 리뷰는 중추신경계 기능성을 유지하는데 있어서 미생물 균총-소화관-뇌 축의 역할을 암시하고, 그리고 미생물 균총-소화관-뇌 축의 기능장애를 중추신경계 장애와 질환의 발달에 연루시킨다 [16],[19],[71].
뇌 및 소화관 (다시 말하면, 미생물 균총-소화관-뇌 축) 사이에 양지향성 통신은 중추신경계, 시상하부-뇌하수체-부신 (HPA) 축을 포함하는 신경내분비 및 신경면역성 시스템, 장 신경계 (ENS) 및 미주 신경을 포함하는 자율신경계 (ANS)의 교감신경성 및 부교감신경성 팔, 그리고 소화관 미생물 균총을 포함한다.
실시예에서 증명된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 미생물 균총-소화관-뇌 축을 조정하고 신경변성 장애와 연관된 세포 사멸을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 신경변성 장애, 특히 미생물 균총-소화관-뇌 축의 기능장애와 연관된 장애와 질환을 치료하거나 예방하는데 유용할 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는데 유용할 수 있다: 진행성 핵상 마비, 진행성 핵상 마비, 스틸-리처드슨-올스제브스키 증후군, 정상압 수두증, 혈관 또는 동맥경화성 파킨슨증 및 약물 유발된 파킨슨증을 비롯한 파킨슨병; 벤손 증후군을 비롯한 알츠하이머병; 다발성 경화증; 헌팅턴병; 근위축성 측삭 경화증; 루게릭병; 운동 뉴런 질환; 프리온 질환; 척수소뇌 실조증; 척수 근위축증; 루이체 치매, 혈관성 치매 및 전두측두엽 치매를 비롯한 치매; 원발성 진행형 실어증; 경미한 인지 장애; HIV-관련된 인지 장애, 진행성 염증성 신경병증 및 피질기저 퇴행.
본 발명의 조성물은 특히, 만성 질환을 치료하거나 예방하고, 다른 요법 (가령, 레보도파, 도파민 효현제, MAO-B 저해제, COMT 저해제, 글루타민산염 길항제 및/또는 항콜린작용제로 치료)에 반응하지 않았던 환자에서 질환을 치료하거나 예방하고 및/또는 조직 손상 및 미생물 균총-소화관-뇌 축의 기능장애와 연관된 증상을 치료하거나 예방하는데 유용할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CNS를 조정한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 자율신경계 (ANS)를 조정한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 장 신경계 (ENS)를 조정한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 시상하부, 뇌하수체, 부신 (HPA) 축을 조정한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경내분비 경로를 조정한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경면역성 경로를 조정한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CNS, ANS, ENS, HPA 축 및/또는 신경내분비 및 신경면역성 경로를 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체의 공생 대사산물 및/또는 위장관 투과성의 수준을 조정한다.
미생물 균총-소화관-뇌 축의 신호전달은 신경계에 의해 조정된다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경계에서 신호전달을 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 중추신경계의 신호전달을 조정한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 감각 뉴런에서 신호전달을 조정한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 운동 뉴런에서 신호전달을 조정한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 ANS에서 신호전달을 조정한다. 일부 구체예에서, ANS는 부교감신경계이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 미주 신경의 신호전달을 조정한다. 다른 구체예에서, ANS는 교감신경계이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 장 신경계에서 신호전달을 조정한다. 일정한 구체예에서, ANS 및 ENS 뉴런의 신호전달은 위장관의 내강 내용물에 직접적으로 반응한다. 다른 구체예에서, ANS 및 ENS 뉴런의 신호전달은 내강 세균에 의해 생산된 신경화학물질에 간접적으로 반응한다. 다른 구체예에서, ANS 및 ENS 뉴런의 신호전달은 내강 세균 또는 장내분비 세포에 의해 생산된 신경화학물질에 반응한다. 일정한 바람직한 구체예에서, ENS의 뉴런은 CNS의 기능에 영향을 주는 미주신경성 구심체를 활성화시킨다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 장크롬친화성 세포의 활성을 조절한다.
신경변성 질환
파킨슨병
파킨슨병은 신경 세포 (도파민-생산 세포)의 이질성 개체군의 변성에 의해 신경병리학적으로 특징화되는 통상적인 신경변성 질환이다. 파킨슨병의 임상 진단은 운동완만증 및 하기 코어 증상 중에서 최소한 한 가지를 필요로 한다: 안정시 떨림; 근육 경축 및 자세 반사 장애. 상기 질환의 진행 동안 존재하거나 또는 발달할 수 있는 다른 징후와 증상은 생리자율신경 장애 (타액과다증, 지루, 변비, 배뇨 장애, 성기능, 기립 저혈압, 다한증), 수면 장애, 그리고 후각 또는 온도감에서 장애이다. 파킨슨병은 미생물 균총-소화관-뇌 축의 기능장애로 인해 발달하거나 또는 존속할 수 있는 신경변성 질환이다. 이런 이유로, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 파킨슨병을 치료하거나 예방하는데 이용을 위한 것이다.
더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 파킨슨병을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 파킨슨병의 모형에서 운동 및 인지 기능을 향상시킬 수 있다. 이들 조성물로 치료는 중추신경계, 생리자율신경계 및 장 신경계에서 신호전달을 조정할 수 있고; HPA 축 경로의 활성을 조정할 수 있고; 신경내분비 및/또는 신경면역성 경로를 조정할 수 있고; 그리고 개체의 공생 대사산물, 염증성 마커 및/또는 위장관 투과성의 수준을 조정할 수 있는데, 이들 모두 파킨슨병의 신경병리에 관여한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 파킨슨병을 치료하거나 또는 예방하는 방법에서 이용을 위한, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)를 이용하는 조성물은 파킨슨병을 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 조성물은 유기 산을 더욱 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 파킨슨병의 증상 중에서 한 가지 또는 그 이상을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 파킨슨병의 한 가지 또는 그 이상의 코어 증상을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 운동완만증을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 안정시 떨림; 근육 경축 및/또는 자세 반사 장애를 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 생리자율신경 장애 (타액과다증, 지루, 변비, 배뇨 장애, 성기능, 기립 저혈압, 다한증), 수면 장애, 그리고 후각 또는 온도감에서 장애에서 선택되는 파킨슨병 진행과 연관된 한 가지 또는 그 이상의 증상을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 파킨슨병과 동시이환성 우울증 증상을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 언어 기억 및/또는 실행 기능을 향상시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 주의력, 작업 기억, 언어 유창성 및/또는 불안을 향상시킨다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 파킨슨병과 동시이환성 인지 기능장애를 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 파킨슨병 진행을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 말기 운동 합병증을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 말기 운동 변동을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뉴런 상실을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 파킨슨병 치매 (PDD)의 증상을 향상시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 실행 기능, 주의력 및/또는 작업 기억의 장애를 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 도파민작용성 신경전달을 향상시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 손상된 도파민작용성 신경전달을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 증후성 또는 진단적 척도에 따라서 파킨슨병의 증상을 향상시킨다. 일정한 구체예에서, 파킨슨병에서 운동 기능의 증후성 향상을 사정하기 위한 검사는 통합된 파킨슨병 순위평가 척도이다. 특히, UPDRS II는 일상 생활의 활동을 고려하고, 그리고 UPDRS III는 운동 검사를 고려한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 증후성 또는 진단적 검사 및/또는 척도에 따라서 PDD와 연관된 증상을 향상시킨다. 일정한 구체예에서, 상기 검사 또는 척도는 Hopkins 언어 학습 검사 - 개정판 (HVLT-R); Delis-Kaplan 실행 기능 시스템 (D-KEFS) 색채 단어 간섭 검사; Hamilton 우울증 순위평가 척도 (HAM-D 17; 우울증); Hamilton 불안 순위평가 척도 (HAM-A; 불안) 및 통합된 파킨슨병 순위평가 척도 (UPDRS; PD 증상 심각도)에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 정신의학적 및 신경학적 장애를 사정하기 위한 전반적 임상 인상 - 전반적 향상 (CGI-I) 척도를 향상시킨다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 파킨슨병을 앓는 개체의 전반적인 사회적 및 직업적 장애에 대한 긍정적인 효과를 전시한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 신경학적 장애, 예를 들면, 파킨슨병을 치료하거나 예방하는데 이용을 위한 것인데, 여기서 상기 이용은 흑색질에서 도파민 세포의 상실을 감소시키거나 또는 예방하는 것을 수반한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 신경학적 장애, 예를 들면, 파킨슨병을 치료하거나 예방하는데 이용을 위한 것인데, 여기서 상기 이용은 흑색질 치밀부에서 도파민 뉴런의 변성을 감소시키거나 또는 예방하는 것을 수반한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 신경학적 장애, 예를 들면, 파킨슨병을 치료하거나 예방하는데 이용을 위한 것인데, 여기서 상기 이용은 흑색질 치밀부에서 도파민 뉴런의 변성 및 선조체에서 이들의 돌출 신경 섬유의 결과적인 상실을 감소시키거나 또는 예방하는 것을 수반한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 신경학적 장애, 예를 들면, 파킨슨병을 치료하거나 예방하는데 이용을 위한 것인데, 여기서 상기 이용은 흑질선조체 도파민 뉴런의 상실을 감소시키거나 또는 예방하는 것을 수반한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 신경학적 장애, 예를 들면, 파킨슨병을 치료하거나 예방하는데 이용을 위한 것인데, 여기서 상기 이용은 도파민 수준을 증가시키는 것을 수반한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 신경학적 장애, 예를 들면, 파킨슨병을 치료하거나 예방하는데 이용을 위한 것인데, 여기서 상기 이용은 DOPAC 수준을 증가시키는 것을 수반한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 신경학적 장애, 예를 들면, 파킨슨병을 치료하거나 예방하는데 이용을 위한 것인데, 여기서 상기 이용은 도파민 및 DOPAC 수준을 증가시키는 것을 수반한다. 일정한 구체예에서, 도파민 및/또는 DOPAC 수준은 선조체에서 증가된다.
알츠하이머병 및 치매
DSM-5에서, 용어 치매는 용어 주요 신경인지 장애 및 경미한 신경인지 장애로 대체되었다. 신경인지 장애는 정신 질환의 이질성 부류이다. 가장 흔한 신경인지 장애는 알츠하이머병, 그 다음에 혈관성 치매 또는 이들 2가지의 혼합된 형태이다. 다른 형태의 신경변성 장애 (가령, 루이체 질환, 전두측두엽 치매, 파킨슨성 치매, 크로이츠펠트 야콥병, 헌팅턴병 및 베르니케 코르사코프 증후군)는 치매를 동반한다.
알츠하이머병 및 치매는 또한, 뉴런 상실에 의해 특징화되고, 따라서 본 발명의 조성물에 대해 실시예에서 도시된 신경보호 및 신경증식 효과는 이들이 이들 질환을 치료하거나 예방하는데 유용할 수 있다는 것을 지시한다.
DSM-5 하에 치매에 대한 증후성 기준은 하기에서 선택되는 한 가지 또는 그 이상의 인지 도메인에서 성과의 이전 수준으로부터 유의미한 인지 감퇴의 증거이다: 학습 및 기억; 언어; 실행 기능; 복합 주의력; 지각-운동 및 사회적 인지. 인지 결손은 일상적인 활동에서 독립을 간섭할 것임에 틀림없다. 이에 더하여, 인지 결손은 섬망의 맥락에서 배타적으로 발생하지 않고, 그리고 다른 정신 장애 (가령, MDD 또는 정신분열병)에 의해 더 잘 설명되지 않는다.
일차 증상에 더하여, 신경변성 장애를 앓는 개체는 동요, 공격성, 우울증, 불안, 무감동, 정신병 및 수면 각성 주기 장애를 비롯한 행동 및 정신의학적 증상을 전시한다.
신경변성 장애는 미생물 균총-소화관-뇌 축의 기능장애로 인해 발달하거나 또는 존속할 수 있다. 이런 이유로, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 신경변성 장애를 치료하거나 예방하는데 이용을 위한 것이다. 바람직한 구체예에서, 신경변성 장애는 알츠하이머병이다. 다른 구체예에서, 신경변성 장애는 혈관성 치매; 알츠하이머병 및 혈관성 치매의 혼합된 형태; 루이체 질환; 전두측두엽 치매; 파킨슨성 치매; 크로이츠펠트 야콥병; 헌팅턴병; 및 베르니케 코르사코프 증후군에서 선택된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 신경변성 장애의 증상 중에서 한 가지 또는 그 이상을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 인지 감퇴의 발생을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하기에서 선택되는 한 가지 또는 그 이상의 인지 도메인에서 신경변성 장애를 앓는 개체의 성과의 수준을 향상시킨다: 학습 및 기억; 언어; 실행 기능; 복합 주의력; 지각-운동 및 사회적 인지. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 동요, 공격성, 우울증, 불안, 무감동, 정신병 및 수면 각성 주기 장애에서 선택되는, 신경변성 장애와 연관된 한 가지 또는 그 이상의 행동 및 정신의학적 증상의 발생을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 임상전 시기에서 의심되는 병원성 기전에서 개입에 의해 증후성 질환을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 증상 진행의 늦춤 또는 정지로, 질환 조절을 향상시킨다. 일부 구체예에서, 증상 진행의 늦춤 또는 정지는 근원적인 신경병리학적 과정을 지연시키는데 있어서 증거와 상관한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 증강된 인지 및 기능 향상을 포함하는 신경변성 장애의 증상을 향상시킨다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 치매의 행동 및 정신의학적 증상 (BPSD)을 향상시킨다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경변성 장애를 앓는 개체의 일상적인 활동을 수행하는 능력을 향상시킨다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 알츠하이머병을 앓는 개체에서 인지 및 기능 둘 모두를 향상시킨다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 알츠하이머병을 앓는 개체에서 인지 종결점을 향상시킨다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 알츠하이머병을 앓는 개체에서 기능 종결점을 향상시킨다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 알츠하이머병을 앓는 개체에서 인지 및 기능 종결점을 향상시킨다. 다른 더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 알츠하이머병을 앓는 개체에서 전반적인 임상적 반응 (총괄적 종결점)을 향상시킨다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 증후성 또는 진단적 검사에 따라서 신경변성 장애의 증상을 향상시킨다. 일정한 구체예에서, 알츠하이머병 (및 다른 신경변성 장애)의 증후성 향상을 사정하기 위한 검사는 객관적 인지 검사, 일상 생활 활동 검사, 변화의 전반적 사정 검사, 건강 관련된 삶의 질 검사, 그리고 신경변성 장애의 행동 및 정신의학적 증상을 사정하는 검사에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 증후성 향상의 사정을 위한 객관적 인지 검사는 알츠하이머병 사정 척도 인지 하위척도 (ADAS-cog) 및 고전적인 ADAS 척도를 이용한다. 일정한 구체예에서, 인지의 증후성 향상은 알츠하이머병에서 이용을 위한 신경생리학적 검사 배터리 (NTB)를 이용하여 사정된다.
일부 구체예에서, 변화의 전반적 사정 검사는 정신의학적 및 신경학적 장애를 사정하기 위한 전반적 임상 인상 - 전반적 향상 (CGI-I) 척도를 이용한다. 일부 구체예에서, 총괄적 척도는 변화 플러스의 인터뷰 기반 임상 인상 (CIBIC-plus)이다. 일부 구체예에서, 총괄적 척도는 변화의 알츠하이머병 협력적 연구 단위 전반적 임상 인상 (ADCS-CGIC)이다.
일정한 구체예에서, 건강 관련된 삶의 질 척도는 알츠하이머병-관련된 QOL (ADRQL) 및 QOL-알츠하이머병 (QOL-AD)이다.
일정한 구체예에서, 신경변성 장애의 행동 및 정신의학적 증상을 사정하는 검사는 알츠하이머병 순위평가 척도에서 행동 병리 (BEHAVE-AD); 치매에 대한 행동 순위평가 척도 (BRSD); 신경정신행동검사 (NPI); 및 Cohen-Mansfield 동요 인벤토리 (CMAI)에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 특히, 신경변성 장애를 치료하기 위한 다른 요법과 조합으로 이용될 때 신경변성 장애를 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감하는데 효과적이다. 일정한 구체예에서, 이런 요법은 도네페질 (Aricept®), 갈란타민 (Razadyne®) 및 리바스티그민 (Exelon®), 그리고 메만틴을 비롯한 아세틸콜린에스테라아제 저해제를 포함한다.
다발성 경화증
다발성 경화증 (MS)은 뇌 및 척수에서 뉴런을 둘러싸는 미엘린초가 손상되는 탈수초성 질환이다. MS의 정확한 근원적인 원인은 알려져 있지 않지만, 개체 사이에서 달라지는 것으로 생각된다. MS의 일정한 형태는 유전성이다. 환경 인자가 또한, MS에 기여하는 것으로 생각된다. 일부 개체에서는 유전 인자 및 환경 인자 둘 모두의 조합이 MS의 발생을 촉발할 수 있다.
MS와 연관된 매우 다양한 증상이 있다. 개체는 생리자율신경, 시각, 운동 또는 감각 제어의 손상과 연관된 거의 모든 신경학적 증상을 전시할 수 있다. 정확한 증상은 뉴런 손상/탈수초화의 부위에 따라서 변할 것이다.
IL-8은 미엘린초의 형성에 연루되었다. 본 발명의 조성물은 이런 이유로, MS를 앓는 개체에서 뉴런의 재수초화에서 이용을 위한 것일 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한, 탈수초화로부터 뉴런을 보호하는데 이용될 수 있다. 다시 말하면, 본 발명의 조성물은 뉴런 미엘린초의 상실을 복원하거나 또는 예방함으로써 다발성 경화증을 치료하거나 또는 예방하는 방법에서 이용을 위한 것일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 MS의 한 가지 또는 그 이상의 증상을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 피로를 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 개체에서 안정시 떨림, 근육 약화, 근육 연축, 근육 경직, 감각이상 및/또는 운동실조를 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 생리자율신경 장애: 변비, 배뇨 장애, 성기능, 연하곤란, 구음장애, 실신, 어지러움 및/또는 현기증; 수면 장애; 및 후각 또는 온도감에서 장애로 구성되는 목록에서 선택되는, MS 진행과 연관된 한 가지 또는 그 이상의 증상을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 MS와 연관된 한 가지 또는 그 이상의 눈 증상을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다. 일부 구체예에서, 눈 증상은 개체에서 시력 상실, 눈 통증, 색맹, 복시 및/또는 불수의적 눈 움직임으로 구성되는 목록에서 선택된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 현기증, 어지러움, 신경병성 통증, 근골격 통증, 인지 기능장애, 장 실금, 연하곤란, 구음장애, 또는 이들의 임의의 조합을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 MS와 동시이환성 우울증 증상 또는 불안을 예방하거나, 감소시키거나 또는 경감한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 증상의 향상은 MS를 진단하기 위한 2017 McDonald 기준을 이용하여 결정된다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물로 치료는 MS 발생 또는 MS 심각도에서 감소를 야기한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 재발 발생 또는 재발 심각도를 감소시키는데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물로 치료는 운동 기능에서 감퇴를 예방하거나, 또는 MS와 연관된 향상된 운동 기능을 유발한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 운동 기능에서 감퇴를 예방하는데 이용을 위한, 또는 MS의 치료에서 운동 기능을 향상시키는데 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물로 치료는 MS에서 마비의 발달을 예방한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 MS의 치료에서 마비를 예방하는데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서 본 발명의 조성물은 다발성 경화증의 위험에 처해 있는 것으로 확인되었거나, 또는 초기 단계 다발성 경화증 또는 "재발 이완성" 다발성 경화증으로 진단된 환자에서 다발성 경화증을 예방하는데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 MS의 발달을 예방하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 MS의 진행을 예방하는데 유용할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 MS에 대한 유전적 소인, 예를 들면, 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 II 표현형, 인간 백혈구 항원 (HLA)-DR2 또는 HLA-DR4를 갖는 것으로 확인된 환자에서 이용을 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 다발성 경화증을 관리하거나 또는 경감하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 다발성 경화증과 연관된 증상을 감소시키는데 특히 유용할 수 있다. 다발성 경화증의 치료 또는 예방은 예로서, 증상의 심각도의 경감, 또는 환자에게 문제가 되는 악화의 빈도 또는 유발요인의 범위에서 감소를 지칭할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 상기 질환의 진행을 늦추거나 또는 중단시킨다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 재발 이완성 MS를 치료하는데 이용을 위한 것이다. 대안적 구체예에서, 본 발명의 조성물은 진행성 MS, 예를 들면, 속발성 진행형 MS (SPMS) (이것은 RRMS의 진단 이후에 시간의 추이에서 발달한다), 원발성 진행형 MS (PPMS) (이것은 점진적이고 연속적인 신경학적 악화를 전시한다) 및 진행성 재발형 MS (PRMS) (이것은 PPMS와 유사하지만 중첩성 재발을 갖는다)를 치료하는데 이용을 위한 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 MS의 증상 중에서 한 가지 또는 그 이상을 치료하는데 이용을 위한 것이다: 피로, 시력 문제, 무감각, 자통, 근육 연축, 근육 경직, 근육 약화, 이동성 문제, 통증, 사고, 학습 및 계획에 문제, 우울증 및 불안, 성적 문제, 방광 문제, 장 문제, 언어 및 삼키기 어려움.
신경화학 인자, 신경펩티드 및 신경전달물질, 그리고 미생물 균총-소화관-뇌 축
상기 개설된 바와 같이, 미생물 균총-소화관-뇌 축은 다수의 상이한 생리학적 시스템에 의해 조정된다. 미생물 균총-소화관-뇌 축은 다수의 신호전달 분자에 의해 조정된다. 이들 신호전달 분자의 수준에서 변경은 신경변성 질환을 유발한다. 본 발명자들에 의해 수행된 실험은 메가스파에라 (Megasphaera) 공생 세균 균주, 그리고 특히, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)의 투여가 인돌 및 키뉴레닌의 수준을 조정할 수 있다는 것을 지시한다. 이들 대사산물의 조절장애는 신경변성 질환, 예를 들면, 파킨슨병을 야기할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌 모노아민 및 이들의 대사산물의 수준을 조정한다. 바람직한 구체예에서 대사산물은 키뉴레닌이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 트립토판 물질대사의 주요 루트인 키뉴레닌을 조정하는데, 이것은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD+) 생산에 대한 루트로서 역할을 한다. 키뉴레닌은 신경활성 화합물, 예를 들면, 키뉴렌산 (KYNA) 및 3-히드록시-l-키뉴레닌 (3-OH-l-KYN)으로, 그리고 추가 단계에서 퀴놀린산 (QUIN)으로 물질대사될 수 있다. 키뉴레닌 경로의 조절장애는 면역계의 활성화 및 잠재적으로 신경독성 화합물의 축적을 야기할 수 있다. 키뉴레닌 물질대사에서 변경은 파킨슨병의 발달에 관련될 수 있다. 키뉴레닌 수준은 PD (파킨슨병)를 앓는 환자의 전두 피질, 조가비핵 및 흑색질 치밀부에서 감소되는 것으로 증명되었다 [72]. 이런 이유로, 일정한 구체예에서 본 발명의 조성물은 파킨슨병의 치료에서 키뉴레닌의 수준을 증가시키는데 이용을 위한 것이다.
본 발명의 일정한 구체예에서 본 발명의 조성물은 키뉴레닌의 수준을 증가시킬 수 있다. 증가된 수준의 키뉴레닌은 시험관내에서 인간 도파민작용성 신경모세포종 세포주에서 MPP+-유도된 뉴런 세포 사멸을 약화시키는 것으로 밝혀졌다 [73]. 일정한 구체예에서 키뉴레닌 및 키뉴렌산은 GI 아릴 탄화수소 수용체 (Ahr) 및 GPR35 수용체를 활성화시킬 수 있다. Ahr 수용체의 활성화는 IL-22 생산을 유도하는데, 이것은 국부 염증을 저해할 수 있다. GPR35의 활성화는 이노시톨 삼인산염의 생산 및 Ca2+ 동원을 유도한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 인돌의 수준을 조정한다. 바람직한 구체예에서 대사산물은 키뉴레닌이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 트립토판 물질대사의 주요 루트인 키뉴레닌을 조정한다.
미생물 균총-소화관-뇌 축의 신호전달은 신경화학 인자, 신경펩티드 및 신경전달물질의 수준에 의해 조정된다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경화학 인자, 신경펩티드 및 신경전달물질의 수준을 조정한다. 따라서, 일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CNS 생화학을 직접적으로 변경한다.
미생물 균총-소화관-뇌 축의 신호전달은 γ-아미노부티르산 (GABA)의 수준에 의해 조정된다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 GABA의 수준을 조정한다. GABA는 뉴런 흥분성을 감소시키는 저해성 신경전달물질이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 GABA의 수준을 증가시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 GABA의 수준을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 GABA성 신경전달을 변경한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 중추신경계의 상이한 영역에서 GABA 전사의 수준을 조정한다. 일정한 구체예에서, 공생 유래된 GABA는 혈액 뇌 장벽을 교차하고, 그리고 신경전달에 직접적으로 영향을 준다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 해마, 편도 및/또는 청반에서 GABA의 감소를 야기한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 피질 영역에서 GABA의 증가를 야기한다.
면역 반응
미생물 균총-소화관-뇌 축의 신호전달은 면역 반응 및 염증성 인자와 마커에서 변경에 의해 조정된다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역 반응을 조정할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 순환하는 신경면역성 신호전달 분자의 전신 수준을 조정한다. 일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 친염증성 사이토킨 생산 및 염증을 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 염증성 상태를 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6 생산과 분비를 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 NFκB 프로모터의 활성화를 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 강력한 친염증성 내독소 지질다당류 (LPS)에 의한 IL-6 생산의 활성화를 조정할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 LPS 및 α-시누클레인 돌연변이체 단백질, 예를 들면, A53T에 의한 NFκB 프로모터의 활성화를 조정할 수 있다. 증가된 순환 수준의 사이토킨은 파킨슨병, 치매 및 알츠하이머병을 비롯한 다양한 신경변성 장애와 밀접하게 연관된다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경변성 장애의 치료에서 IL-6 수준 및/또는 NFκB 수준을 감소시키는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8의 분비를 증가시킨다. IL-8은 미엘린초 형성을 유도하고 효과적인 뉴런 신호전달을 복원하거나 또는 보존하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경변성 질환의 치료에서 미엘린초 형성을 유도하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뉴런 신호전달을 복원하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뉴런 신호전달을 보존하는데 이용을 위한 것이다.
미생물 균총-소화관-뇌 축의 신호전달은 공생 대사산물의 수준에 의해 조정된다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 미생물 균총 대사산물의 전신 수준을 조정한다. 일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 짧은 사슬 지방산 (SCFAs)의 수준을 조정한다. 일정한 구체예에서 SCFAs의 수준은 증가되거나 또는 감소된다. 일부 구체예에서, SCFAs의 수준은 증가된다. 일부 구체예에서, SCFA는 부티르산 (BA) (또는 부티르산염)이다. 일부 구체예에서, SCFA는 프로피온산 (PPA)이다. 일부 구체예에서, SCFA는 아세트산이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 혈액 뇌 장벽을 교차하는 SCFAs의 능력을 조정한다.
히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화는 유전자 발현의 중요한 후성적 조절인자이다. 히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화에서 불균형은 아폽토시스를 유발할 수 있다. 이런 히스톤 아세틸전달효소의 조절장애는 연령-연관된 신경변성 질환, 예를 들면, 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 및 인지 감퇴와 연관된 발병에 연루되었다 [74]. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 히스톤 탈아세틸화효소 활성을 조정할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 히스톤 탈아세틸화효소 활성을 감소시킬 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 히스톤 아세틸라아제 활성을 감소시킬 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 클래스 1 히스톤 탈아세틸화효소 활성을 감소시킬 수 있다.
파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병 및 근위축성 측삭 경화증을 비롯한 신경변성 질환을 앓는 환자는 높은 수준의 지질 과산화를 전시한다. 지질은 반응성 산소 종에 의한 산화에 취약하고, 그리고 뇌는 다중불포화된 지방산이 풍부하다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 지질 과산화를 조정할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 지질 과산화를 감소시킬 수 있다. 반응성 산소 종에 의해 유발된 산화 손상을 감소시키는 것은 초기 단계 신경변성 질환을 표적으로 하는데 이용될 수 있다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 초기 단계 신경변성을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 또한 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경변성 장애의 발달을 예방하는데 이용을 위한 것이다. 이런 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경변성 장애가 발달할 위험에 처해있는 것으로 확인된 환자에서 이용을 위한 것일 수 있다.
미생물 균총-소화관-뇌 축의 신호전달은 위장관 투과성의 수준에 의해 조정된다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 상피의 완전성을 변경한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위장관의 투과성을 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위장관의 장벽 기능 및 완전성을 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 운동성을 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 내강으로부터 혈류 내로 공생 대사산물 및 염증성 신호전달 분자의 전위를 조정한다.
미생물 균총-소화관-뇌 축의 신호전달은 위장관 내에서 마이크로바이옴 조성에 의해 조정된다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위장관의 마이크로바이옴 조성을 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 마이크로바이옴 장내세균불균형 및 독성 대사산물 (가령, LPS)에서 연관된 증가를 예방한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 내에서 클로스트리듐 (Clostridium)의 수준을 조정한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 내에서 클로스트리듐 (Clostridium)의 수준을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni)의 수준을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 유해한 혐기성 세균의 증식 및 이들 세균에 의해 생산된 신경독의 생산을 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 락토바실루스 (Lactobacillus) 및/또는 비피도박테리움 (Bifidobacterium)의 마이크로바이옴 수준을 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 수테렐라 (Sutterella), 프레보텔라 (Prevotella), 루미노코쿠스 (Rumincoccus) 속 및/또는 알칼리제네스과 (Alcaligenaceae) 과의 마이크로바이옴 수준을 조정한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 락토바실루스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 및/또는 사카로미세스 보울라르디이 (Saccharomyces boulardii)의 수준을 증가시킨다.
뇌 손상
실시예는 본 발명의 조성물이 신경보호성이고 HDAC 저해 활성을 갖는다는 것을 증명한다. HDAC2는 뇌졸중으로부터 기능적 회복을 위한 결정적인 표적이고 [75], 그리고 HDAC 저해는 백색질 손상을 예방할 수 있고 [76], 따라서 본 발명의 조성물은 뇌 손상의 치료에 유용할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 뇌 손상은 외상성 뇌 손상이다. 일부 구체예에서, 뇌 손상은 후천성 뇌 손상이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 외상으로부터 발생하는 뇌 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 종양으로부터 발생하는 뇌 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌졸중으로부터 발생하는 뇌 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌 출혈로부터 발생하는 뇌 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌염으로부터 발생하는 뇌 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 대뇌 저산소증으로부터 발생하는 뇌 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 대뇌 무산소증으로부터 발생하는 뇌 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌졸중을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 실시예에서 도시된 효과는 특히, 뇌졸중의 치료에 유관하다. 뇌졸중은 뇌의 최소한 일부에 혈류가 단절될 때 발생한다. 뇌 조직에 산소 및 영양소를 제공하고 뇌 조직으로부터 폐기물을 제거하기 위한 혈액의 적절한 공급이 없으면, 뇌 세포는 빠르게 죽기 시작한다. 뇌졸중의 증상은 부적당한 혈류에 의해 영향을 받는 뇌의 영역에 좌우된다. 증상은 근육의 마비, 무감각 또는 허약, 균형의 상실, 현기증, 갑작스러운 심각한 두통, 언어 능력 장애, 기억의 상실, 추론 능력의 상실, 갑작스러운 착란, 시력 손상, 혼수 또는 심지어 사망을 포함한다. 뇌졸중은 뇌 발작 또는 뇌혈관 사고 (CVA)로서 또한 지칭된다. 뇌졸중의 증상은 만약 적절한 혈류가 짧은 기간 내에 복원되면 단기적일 수 있다. 하지만, 만약 부적당한 혈류가 유의미한 기간 동안 계속되면, 증상은 영구적일 수 있다.
일부 구체예에서, 뇌졸중은 대뇌 허혈이다. 대뇌 허혈은 뇌의 조직에 혈류가 대사 요구량에 부합하기에는 불충분할 때 발생한다. 일부 구체예에서, 대뇌 허혈은 국소 대뇌 허혈이다, 다시 말하면, 뇌의 특정한 영역에 국한된다. 일부 구체예에서 대뇌 허혈은 전역 대뇌 허혈이다, 다시 말하면, 뇌 조직의 넓은 부위를 포괄한다. 국소 대뇌 허혈은 통상적으로, 대뇌 혈관이 부분적으로 또는 완전하게 차단되어, 뇌의 특정한 영역으로 혈액의 유동이 감소할 때 발생한다. 일부 구체예에서 국소 대뇌 허혈은 허혈성 뇌졸중이다. 일부 구체예에서, 허혈성 뇌졸중은 혈전성이다, 다시 말하면, 대뇌 혈관에서 발달하고 혈류를 제한하거나 또는 차단하는 혈전 또는 혈전에 의해 유발된다. 일부 구체예에서 허혈성 뇌졸중은 혈전성 뇌졸중이다. 일부 구체예에서, 허혈성 뇌졸중은 색전성이다, 다시 말하면, 혈류를 통해 이동하고 발생 지점으로부터 멀리 떨어진 부위에서 혈류를 제한하거나 또는 차단하는 색전, 또는 부착되지 않은 덩어리에 의해 유발된다. 일부 구체예에서 허혈성 뇌졸중은 색전성 뇌졸중이다. 전역 대뇌 허혈은 통상적으로, 뇌에 혈류가 전체적으로 차단되거나 또는 감소될 때 발생한다. 일부 구체예에서 전역 대뇌 허혈은 관류저하에 의해 유발된다, 다시 말하면, 쇼크에 기인한다. 일부 구체예에서 전역 대뇌 허혈은 심장 정지의 결과이다.
일부 구체예에서 뇌 손상으로 진단된 개체는 대뇌 허혈을 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 국소 대뇌 허혈을 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 허혈성 뇌졸중을 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 혈전성 뇌졸중을 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 색전성 뇌졸중을 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 전역 대뇌 허혈을 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 관류저하를 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 심장 정지를 겪었다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 대뇌 허혈을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 국소 대뇌 허혈을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 허혈성 뇌졸중을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 혈전성 뇌졸중을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 색전성 뇌졸중을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 전역 대뇌 허혈을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 관류저하를 치료하는데 이용을 위한 것이다.
일부 구체예에서, 뇌졸중은 출혈성 뇌졸중이다. 출혈성 뇌졸중은 뇌의 세포와 조직에 팽창, 압박 및 손상을 유발하는, 뇌 내로 또는 주변에 출혈에 의해 유발된다. 출혈성 뇌졸중은 통상적으로, 파열되고 주변 뇌 내로 출혈하는 약화된 혈관의 결과이다. 일부 구체예에서, 출혈성 뇌졸중은 뇌내 출혈이다, 다시 말하면, 뇌 조직 그 자체 내에서 출혈에 의해 유발된다. 일부 구체예에서 뇌내 출혈은 뇌실질내 출혈에 의해 유발된다. 일부 구체예에서 뇌내 출혈은 뇌실내 출혈에 의해 유발된다. 일부 구체예에서 출혈성 뇌졸중은 거미막하 출혈이다, 다시 말하면, 뇌 조직의 외부이지만 여전히 두개골 내에서 발생하는 출혈이다. 일부 구체예에서, 출혈성 뇌졸중은 대뇌 아밀로이드 혈관병증의 결과이다. 일부 구체예에서, 출혈성 뇌졸중은 뇌 동맥류의 결과이다. 일부 구체예에서, 출혈성 뇌졸중은 대뇌 동정맥 기형 (AVM)의 결과이다.
일부 구체예에서 뇌 손상으로 진단된 개체는 출혈성 뇌졸중을 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 뇌내 출혈을 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 뇌실질내 출혈을 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 뇌실내 출혈을 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 거미막하 출혈을 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 대뇌 아밀로이드 혈관병증을 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 뇌 동맥류를 겪었다. 일부 구체예에서, 뇌 손상으로 진단된 개체는 대뇌 AVM을 겪었다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 출혈성 뇌졸중을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌내 출혈을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌실질내 출혈을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌실내 출혈을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 거미막하 출혈을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 대뇌 아밀로이드 혈관병증을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌 동맥류를 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 대뇌 AVM을 치료하는데 이용을 위한 것이다.
단절의 기간 후 뇌에 적절한 혈류의 수복은 비록 뇌졸중과 연관된 증상을 경감하는데 효과적이긴 하지만, 뇌 조직에 추가 손상을 역설적으로 유발할 수 있다. 단절의 기간 동안, 영향을 받은 조직은 산소 및 영양소의 결여를 겪고, 그리고 혈류의 갑작스러운 수복은 산화 스트레스의 유도를 통해 염증 및 산화 손상을 유발할 수 있다. 이것은 재관류 손상으로서 알려져 있고, 그리고 뇌졸중 이후에서뿐만 아니라 허혈 또는 산소의 결여의 기간 후 혈액 공급이 조직으로 복귀하는 심장마비 또는 다른 조직 손상 이후에 충분히 문서화된다. 일부 구체예에서 뇌 손상으로 진단된 개체는 뇌졸중의 결과로서 재관류 손상을 겪었다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌졸중의 결과로서 재관류 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다.
미니-뇌졸중으로서 종종 지칭되는 일과성 허혈 발작 (TIA)은 더욱 심각한 뇌졸중에 대한 인정된 경고 신호이다. 한 번 또는 그 이상의 TIAs를 겪었던 개체는 이런 이유로, 뇌졸중의 더욱 큰 위험에 처해 있다. 일부 구체예에서 뇌 손상으로 진단된 개체는 TIA를 겪었다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TIA를 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 TIA를 겪었던 개체에서 뇌 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다.
높은 혈압, 높은 혈중 콜레스테롤, 뇌졸중의 가족력, 심장병, 당뇨병, 뇌 동맥류, 동정맥 기형, 겸상 적혈구병, 혈관염, 출혈 장애, 비스테로이드성 항염증성 약물 (NSAIDs)의 이용, 담배 흡연, 대량의 알코올 흡음, 불법 약물 이용, 비만, 신체 활동의 결여 및 해로운 식이 모두 뇌졸중에 대한 위험 인자인 것으로 고려된다. 특히, 혈압을 낮추는 것은 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중 둘 모두를 예방하는 것으로 확정적으로 밝혀졌다 [77, 78]. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 뇌졸중에 대한 최소한 하나의 위험 요인을 갖는 개체에서 뇌 손상을 치료하는데 이용을 위한 것이다. 일부 구체예에서 개체는 뇌졸중에 대한 2개의 위험 인자를 갖는다. 일부 구체예에서 개체는 뇌졸중에 대한 3개의 위험 인자를 갖는다. 일부 구체예에서 개체는 뇌졸중에 대한 4개의 위험 인자를 갖는다. 일부 구체예에서 개체는 뇌졸중에 대한 4개보다 많은 위험 인자를 갖는다. 일부 구체예에서 개체는 높은 혈압을 갖는다. 일부 구체예에서 개체는 높은 혈중 콜레스테롤을 갖는다. 일부 구체예에서 개체는 뇌졸중의 가족력을 갖는다. 일부 구체예에서 개체는 심장병을 앓는다. 일부 구체예에서 개체는 당뇨병을 앓는다. 일부 구체예에서 개체는 뇌 동맥류를 앓는다. 일부 구체예에서 개체는 동정맥 기형을 앓는다. 일부 구체예에서 개체는 혈관염을 앓는다. 일부 구체예에서 개체는 겸상 적혈구병을 앓는다. 일부 구체예에서 개체는 출혈 장애를 앓는다. 일부 구체예에서 개체는 비스테로이드성 항염증성 약물 (NSAIDs)의 이용의 전력을 갖는다. 일부 구체예에서 개체는 담배를 피운다. 일부 구체예에서 개체는 대량의 알코올을 흡음한다. 일부 구체예에서 개체는 불법 약물을 이용한다. 일부 구체예에서 개체는 비만하다. 일부 구체예에서 개체는 과체중이다. 일부 구체예에서 개체는 신체 활동의 결여를 갖는다. 일부 구체예에서 개체는 해로운 식이를 갖는다.
실시예는 본 발명의 조성물이 손상 사건이 발생하기 전에 투여될 때, 뇌 손상을 치료하고 회복을 보조하는데 유용할 수 있다는 것을 지시한다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 뇌 손상, 예를 들면, 뇌졸중의 위험에 처해 있는 개체에게 투여될 때 뇌 손상을 치료하는데 특히 유용할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 잠재적인 뇌 손상, 바람직하게는 뇌졸중에 의해 유발된 손상을 감소시키는데 이용을 위한 것이다. 이들 조성물은 이들이 잠재적인 뇌 손상이 일어나기 이전에 투여될 때, 특히 뇌 손상의 위험에 처해 있는 것으로 확인된 환자에게 투여될 때 유발된 손상을 감소시킬 수 있다.
실시예는 본 발명의 조성물이 손상 사건이 발생한 후 투여될 때, 뇌 손상을 치료하고 회복을 보조하는데 유용할 수 있다는 것을 지시한다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 뇌 손상, 예를 들면, 뇌졸중 이후에 개체에게 투여될 때 뇌 손상을 치료하는데 특히 유용할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 운동 근육 손상을 감소시킴으로써 뇌 손상을 치료한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 운동 기능을 향상시킴으로써 뇌 손상을 치료한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 근력을 향상시킴으로써 뇌 손상을 치료한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 기억을 향상시킴으로써 뇌 손상을 치료한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 사회적 인식을 향상시킴으로써 뇌 손상을 치료한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경학적 기능을 향상시킴으로써 뇌 손상을 치료한다.
뇌 손상의 치료는 예로서, 증상의 심각도의 경감을 지칭할 수 있다. 뇌 손상의 치료는 또한, 뇌졸중 이후에 신경학적 장애를 감소시키는 것을 지칭할 수 있다. 뇌졸중을 치료하는데 이용을 위한 본 발명의 조성물은 예로서, 뇌졸중의 위험에 처해 있는 것으로 확인된 환자에서 뇌졸중의 발생에 앞서 개체에게 제공될 수 있다. 뇌졸중을 치료하는데 이용을 위한 본 발명의 조성물은 뇌졸중이 일어난 후, 예를 들면, 회복 동안 제공될 수 있다. 뇌졸중을 치료하는데 이용을 위한 본 발명의 조성물은 회복의 급성기 (다시 말하면, 뇌졸중 후 1 주까지) 동안 제공될 수 있다. 뇌졸중을 치료하는데 이용을 위한 본 발명의 조성물은 회복의 아급성기 (다시 말하면, 뇌졸중 후 1 주부터 3 개월까지) 동안 제공될 수 있다. 뇌졸중을 치료하는데 이용을 위한 본 발명의 조성물은 회복의 만성기 (뇌졸중 후 3 개월부터) 동안 제공될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 이차성 활성제와 조합으로 이용을 위한 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 아스피린 또는 조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA)와 조합으로 이용을 위한 것이다. 다른 이차성 작용제는 다른 항혈소판제 (가령, 클로피도그렐), 항응고제 (가령, 헤파린, 와파린, 아픽사반, 다비가트란, 에독사반 또는 리바록사반), 혈압강하제 (가령, 이뇨제, ACE 저해제, 칼슘 통로 차단제, 베타-차단제 또는 알파-차단제) 또는 스타틴을 포함한다. 본 발명의 조성물은 이차성 활성제에 대한 환자의 반응을 향상시킬 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 조직에 대한 허혈의 효과를 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 허혈에 의해 유발된 조직에 대한 손상의 양을 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 허혈에 의해 손상된 조직은 대뇌 조직이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 괴사 또는 괴사성 세포의 숫자를 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 아폽토시스 또는 아폽토시스성 세포의 숫자를 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 괴사성 세포 및 아폽토시스성 세포의 숫자를 감소시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 괴사 및/또는 아폽토시스에 의한 세포 사멸을 예방한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 허혈에 의해 유발된 괴사 및/또는 아폽토시스에 의한 세포 사멸을 예방한다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 허혈에 의해 손상된 조직의 회복을 향상시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 괴사성 세포 및/또는 아폽토시스성 세포의 청소 속도를 향상시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 괴사성 세포 및/또는 아폽토시스성 세포의 청소의 효력을 향상시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 조직 내에서 세포의 대체 및/또는 재생을 향상시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 허혈에 의해 손상된 조직 내에서 세포의 대체 및/또는 재생을 향상시킨다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 조직의 전반적인 조직구조를 향상시킨다 (가령, 생검 시에).
투여 방식
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 본 발명의 공생 세균 균주로 장에 전달 및/또는 장의 부분적인 또는 전체 집락형성을 할 수 있게 하기 위해 위장관에 투여될 것이다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 경구 투여되지만, 이들은 직장, 비내, 또는 협측 또는 설하 루트를 통해 투여될 수도 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 본 발명의 균주 및 유기 산을 포함한다. 일부 구체예에서, 유기 산 및 공생 세균 균주의 별개의 조성물이 제공된다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 공생 세균 균주를 포함하는 조성물은 거품, 스프레이 또는 겔로서 투여될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 예로서, 테오브로마 오일 (코코아 버터), 합성 경지방 (가령, 수포시르, 위텝솔), 글리세로-젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 비누 글리세린 조성물의 형태에서 좌약, 예를 들면, 직장 좌약으로서 투여될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 튜브, 예를 들면, 비강영양관, 입위관, 위관, 공장조루술 튜브 (J 튜브), 경피적 내시경 위조루술 (PEG), 또는 포트, 예를 들면, 위, 공장 및 다른 적합한 접근 포트에 접근을 제공하는 흉벽 포트를 통해 위장관에 투여된다.
본 발명의 조성물은 1회 투여될 수 있거나, 또는 이들은 치료 섭생의 일부로서 순차적으로 투여될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 매일 투여될 것이다.
본 발명의 일정한 구체예에서, 본 발명에 따른 치료는 환자의 소화관 미생물 균총의 사정을 동반한다. 만약 본 발명의 균주의 전달 및/또는 이것으로 부분적인 또는 전체 집락형성이 효력이 관찰되는 정도로 달성되지 않으면 치료는 반복될 수 있고, 또는 만약 전달 및/또는 부분적인 또는 전체 집락형성이 성공적이고 효력이 관찰되면 치료는 중단될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 자궁내 소아에서 및/또는 소아가 출생한 후 염증성 또는 자가면역 질환이 발달하는 것을 예방하기 위해 임신 동물, 예를 들면, 포유동물, 예를 들면, 인간에게 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 신경변성 질환으로 진단되었거나, 또는 신경변성 질환의 위험에 처해 있는 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 이들 조성물은 또한, 건강한 환자에서 신경변성 질환의 발달을 예방하기 위한 예방적 조치로서 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비정상적인 소화관 미생물 균총을 갖는 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 가령, 환자는 메가스파에라 (Megasphaera), 그리고 특히, 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)에 의한 감소된 집락형성을 갖거나 또는 집락형성이 부재할 수 있다.
본 발명의 세균을 포함하는 조성물은 식품 산물, 예를 들면, 영양 보충제로서 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 유기 산의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함하는 조성물은 정맥내 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 유기 산은 동결건조되고 경구 투여된다.
일부 구체예에서, 공생 세균 균주를 포함하는 조성물 및 유기 산을 포함하는 조성물은 동시에, 별개로 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 각각의 상이한 조성물은 본원에서 설명된 투여 방식의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 비록 이들이 단위 포유동물, 예를 들면, 가금류, 돼지, 고양이, 개, 말 또는 토끼를 비롯한 동물을 치료하는데 이용될 수 있긴 하지만, 인간의 치료를 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 동물의 성장 및 성과를 증강하는데 유용할 수 있다. 만약 동물에게 투여되면, 경구 위관영양이 이용될 수 있다.
조성물
일반적으로, 본 발명의 조성물은 세균을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 유기 산 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 더욱 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 조성물은 동결건조된 형태에서 조제된다. 가령, 본 발명의 조성물은 본 발명의 세균 균주 및/또는 본 발명의 유기 산을 포함하는 과립 또는 젤라틴 캡슐, 예를 들면, 경성 젤라틴 캡슐을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 유기 산 및 본 발명의 세균은 별개의 조성물로서 조제된다. 일부 구체예에서, 각각의 별개의 조성물은 동결건조된 형태에서 조제된다. 본 발명의 조성물의 조제에 관한 일반적인 보도는 가령, Aulton's Pharmaceutics: The Design and Manufacture of Medicines에서 발견될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 동결건조된 세균을 포함한다. 세균의 동결건조는 충분히 확립된 절차이고, 그리고 유관한 보도가 가령, 참고문헌 [79], [], [81]에서 가용하다.
대안으로, 본 발명의 조성물은 살아있는, 활성 세균 배양액을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 비활성화되지 않았다, 예를 들면, 열-비활성화되지 않았다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 사멸되지 않았다, 예를 들면, 열-사멸되지 않았다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 약독화되지 않았다, 예를 들면, 열-약독화되지 않았다. 가령, 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 사멸, 비활성화 및/또는 약독화되지 않았다. 가령, 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 살아있다. 가령, 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 생존가능하다. 가령, 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 장을 부분적으로 또는 완전히 집락화할 수 있다. 가령, 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물에서 세균 균주는 생존가능하고 장을 부분적으로 또는 완전히 집락화할 수 있다.
일부 구체예에서, 조성물은 살아있는 세균 균주 및 사멸된 세균 균주의 혼합물을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 장에 세균 균주 및/또는 유기 산 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르의 전달을 가능하게 하기 위해 캡슐화된다. 캡슐화는 예로서, 화학적 또는 물리적 자극, 예를 들면, 압력, 효소 활성, 또는 pH에서 변화에 의해 촉발될 수 있는 물리적 붕괴로 파열하는 것을 통해, 표적 위치에서 전달 때까지 조성물을 분해로부터 보호한다. 임의의 적합한 캡슐화 방법이 이용될 수 있다. 예시적인 캡슐화 기술은 다공성 매트릭스 내에 포획, 고체 담체 표면상에 부착 또는 흡착, 면상반응에 의한 또는 교차연결 작용제로 자가-응집, 그리고 미소다공성 막 또는 마이크로캡슐 뒤에서 기계적 봉쇄를 포함한다. 본 발명의 조성물을 제조하는데 유용할 수 있는 캡슐화에 관한 보도는 가령, 참고문헌 [82] 및 [83]에서 가용하다.
조성물은 경구 투여될 수 있고, 그리고 정제, 캡슐 또는 분말의 형태일 수 있다. 메가스파에라 (Megasphaera)가 혐기균이기 때문에, 캡슐화된 산물이 선호된다. 다른 성분 (가령, 예로서 비타민 C)이 생체내에서 전달 및/또는 부분적인 또는 전체 집락형성과 생존을 향상시키기 위한 산소 스캐빈저 및 프리바이오틱 기질로서 포함될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 식품 또는 영양적 산물, 예를 들면, 우유 또는 유장 기초된 발효된 유제품으로서, 또는 제약학적 산물로서 경구 투여될 수 있다.
조성물은 프로바이오틱으로서 조제될 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 세균 균주의 치료 효과량 및/또는 본 발명의 유기 산 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르의 치료 효과량을 포함한다. 세균 균주 및/또는 본 발명의 유기 산의 치료 효과량은 환자에게 유익한 효과를 발휘하는데 충분하다. 세균 균주의 치료 효과량은 환자의 장에 전달 및/또는 이것의 부분적인 또는 전체 집락형성을 유발하는데 충분할 수 있다.
예로서, 성인에 대한 세균의 적합한 일일 용량은 약 1 x 103 내지 약 1 x 1011 집락 형성 단위 (CFU); 예를 들면, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU; 다른 실례에서 약 1 x 106 내지 약 1 x 1010 CFU일 수 있다.
일정한 구체예에서, 조성물은 조성물의 중량에 대하여 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 CFU/g; 예를 들면, 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010 CFU/g의 양으로 세균 균주를 내포한다. 용량은 예로서, 1 g, 3g, 5g 및 10g일 수 있다. 전형적으로, 프로바이오틱, 예를 들면, 본 발명의 조성물은 임의선택적으로, 최소한 하나의 적합한 프리바이오틱 화합물과 조합된다. 프리바이오틱 화합물은 통상적으로, 비소화성 탄수화물, 예를 들면, 올리고당류 또는 다당류, 또는 당 알코올인데, 이것은 상부 소화관에서 분해되거나 또는 흡수되지 않는다. 공지된 프리바이오틱스는 상업적인 산물, 예를 들면, 이눌린 및 트랜스갈락토-올리고당류를 포함한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 총 중량 조성물에 대하여 중량으로 약 1 내지 약 30% (가령, 중량으로 5 내지 20%)의 양으로 프리바이오틱 화합물을 포함한다. 탄수화물은 하기와 같이 구성된 군에서 선택될 수 있다: 프럭토- 올리고당류 (또는 FOS), 짧은 사슬 프럭토-올리고당류, 이눌린, 이소말트-올리고당류, 펙틴, 자일로올리고당류 (또는 XOS), 키토산-올리고당류 (또는 COS), 베타-글루칸, 경작가능 검 변형된 및 난소화성 전분, 폴리덱스트로스, D-타가토오스, 아카시아 섬유, 캐럽, 귀리, 그리고 감귤류 섬유. 한 양상에서, 프리바이오틱스는 짧은 사슬 프럭토-올리고당류 (단순함을 위해 본원에서 FOSs-c.c로서 아래에 도시됨); 상기 FOSs-c.c는 일반적으로 첨채당의 전환에 의해 획득되고, 그리고 3개의 글루코오스 분자가 결합되는 사카로오스 분자를 포함하는 가소화성 탄수화물이 아니다.
일부 구체예에서, 유기 산은 이의 동결건조된 염 또는 에스테르로서 제공된다. 동결건조된 유기 산 산물은 단일 약형에서 조제될 수 있다. 동결건조된 유기 산은 반복 약형에서 조제될 수 있다. 동결건조된 유기 산 산물은 단일 약형에서 동결건조된 세균과 함께 조제될 수 있다. 대안으로, 유기 산 산물은 반복 약형에서 동결건조된 세균과 함께 조제될 수 있다.
일부 구체예에서, 유기 산 산물은 "느린 방출" 또는 "빠른 방출" 조성물로서 조제될 수 있다. "느린 방출" 조성물은 유기 산 산물의 혈청 혈장 농도에서 더욱 낮은 초기 증가를 유발하지만, 유기 산의 상승된 혈장 수준이 더욱 길게 존속하는 더욱 지속된 효과를 갖는다. 대조적으로, "빠른 방출" 조성물은 유기 산 산물의 높은 초기 용량을 제공하여 더욱 높은 초기 혈장 농도를 유발하도록 조제되지만 더욱 짧은 지속 효과를 갖는다.
일부 구체예에서, 유기 산은 정맥내 투여된다. 가령, 유기 산은 나트륨 발프로에이트일 수 있고, 그리고 60 분 주입에서 20 mg/분 이내의 속도로 개체에게 투여될 수 있다. 유기 산 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르의 전형적인 일일 용량은 개체의 신체 특징, 투여 루트 및/또는 조성물의 효과의 원하는 지속 기간에 따라서 변할 것이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경변성 장애를 치료하거나 예방하기 위한 다른 치료 화합물과 조합으로 이용된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경보호 또는 신경증식을 조정하는 영양 보충제와 함께 투여된다. 바람직한 구체예에서, 영양 보충제는 영양 비타민을 포함하거나 또는 이것으로 구성된다. 일정한 구체예에서, 비타민은 비타민 B6, 마그네슘, 디메틸글리신 (비타민 B16) 및 비타민 C이다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 다른 프로바이오틱과 조합으로 투여된다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 신경변성 질환에 대한 두 번째 작용제의 효과를 증강하는데 이용을 위한 것이다. 본 발명의 조성물의 면역 조절 효과는 뇌를 전통적인 요법, 예를 들면, 레보도파, 도파민 효현제, MAO-B 저해제, COMT 저해제, 글루타민산염 길항제, 또는 항콜린작용제에 더욱 감수성이도록 만들 수 있는데, 이들은 본 발명의 조성물과 조합으로 (연속적으로 또는 동시기에) 투여되는 예시적인 이차성 작용제이다.
본 발명의 조성물은 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다. 이런 적합한 부형제의 실례는 참고문헌 [84]에서 발견될 수 있다. 치료적 용도를 위한 허용되는 담체 또는 희석제는 제약 분야에서 널리 알려져 있고, 그리고 가령, 참고문헌 [85]에서 설명된다. 적합한 담체의 실례는 락토오스, 전분, 글루코오스, 메틸 셀룰로오스, 스테아르산마그네슘, 만니톨, 소르비톨 등을 포함한다. 적합한 희석제의 실례는 에탄올, 글리세롤 및 물을 포함한다. 제약학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 루트 및 표준 제약학적 관례에 대하여 선별될 수 있다. 제약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서, 또는 이것에 더하여 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 실례는 전분, 젤라틴, 자연 당, 예를 들면, 글루코오스, 무수성 락토오스, 자유 유동 락토오스, 베타-락토오스, 옥수수 감미료, 자연 및 합성 검, 예를 들면, 아카시아, 트래거캔스 또는 알긴산나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 윤활제의 실례는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨 등을 포함한다. 보존제, 안정제, 염료 및 심지어 풍미제가 제약학적 조성물에서 제공될 수 있다. 보존제의 실례는 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제 또한 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품 산물로서 조제될 수 있다. 가령, 식품 산물은 예로서, 영양 보충제에서 본 발명의 치료 효과에 더하여 영양적 유익성을 제공할 수 있다. 유사하게, 식품 산물은 본 발명의 조성물의 맛을 증강하거나, 또는 상기 조성물이 제약학적 조성물보다는 통상적인 식품과 더욱 유사함으로써 소비하기에 더욱 매력적으로 만들어지도록 조제될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 우유-기초된 산물로서 조제된다. 용어 "우유-기초된 산물"은 변하는 지방 함량을 갖는 임의의 액체 또는 반고체 우유- 또는 유장-기초된 산물을 의미한다. 우유-기초된 산물은 예로서, 우유, 산양유, 양유, 탈지된 우유, 전유, 어떤 처리도 없이 분말화된 우유 및 유장으로부터 재조합된 우유, 또는 가공된 산물, 예를 들면, 요구르트, 응유, 응유, 신 우유, 신 전유, 버터 우유 및 다른 신 우유 산물일 수 있다. 다른 중요한 군은 우유 음료, 예를 들면, 유장 음료, 발효유, 연유, 영아 또는 유아용 우유; 가미유, 아이스크림; 우유-내포 식품, 예를 들면, 사탕을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 한 가지 또는 그 이상의 세균 균주를 포함하고 임의의 다른 속으로부터 세균을 내포하지 않거나, 또는 다른 속으로부터 단지 최소한의 또는 생물학적으로 무관한 양의 세균을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 한 가지 또는 그 이상의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이것은 임의의 다른 속으로부터 세균을 내포하지 않거나, 또는 다른 속으로부터 단지 최소한의 또는 생물학적으로 무관한 양의 세균을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 한 가지 또는 그 이상의 세균 균주를 포함하고 임의의 다른 종으로부터 세균을 내포하지 않거나, 또는 다른 종으로부터 단지 최소한의 또는 생물학적으로 무관한 양의 세균을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 한 가지 또는 그 이상의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이것은 임의의 다른 종으로부터 세균을 내포하지 않거나, 또는 다른 종으로부터 단지 최소한의 또는 생물학적으로 무관한 양의 세균을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 한 가지 또는 그 이상의 세균 균주를 포함하고 임의의 다른 메가스파에라 (Megasphaera) 종으로부터 세균을 내포하지 않거나, 또는 다른 메가스파에라 (Megasphaera) 종으로부터 단지 최소한의 또는 생물학적으로 무관한 양의 세균을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 한 가지 또는 그 이상의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이것은 임의의 다른 메가스파에라 (Megasphaera) 종으로부터 세균을 내포하지 않거나, 또는 다른 메가스파에라 (Megasphaera) 종으로부터 단지 최소한의 또는 생물학적으로 무관한 양의 세균을 포함한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 단일 세균 균주 또는 종을 내포하고 임의의 다른 세균 균주 또는 종을 내포하지 않는다. 이런 조성물은 단지 최소한의 또는 생물학적으로 무관한 양의 다른 세균 균주 또는 종을 포함할 수 있다. 이런 조성물은 다른 종의 생물체가 실제적으로 없는 배양액일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 단일 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이것은 임의의 다른 균주로부터 세균을 내포하지 않거나, 또는 다른 균주로부터 단지 최소한의 또는 생물학적으로 무관한 양의 세균을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 요법에서 이용을 위한 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 단일 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공하는데, 이것은 임의의 다른 균주로부터 세균을 내포하지 않거나, 또는 다른 균주로부터 단지 최소한의 또는 생물학적으로 무관한 양의 세균을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 한 가지 이상의 세균 균주를 포함한다. 가령, 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종 내부로부터 한 가지 이상의 균주 (가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 45가지보다 많은 균주)를 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 임의의 다른 종으로부터 세균을 내포하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종 내부로부터 50가지보다 적은 균주 (가령, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3가지보다 적은 균주)를 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 임의의 다른 종으로부터 세균을 내포하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종 내부로부터 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 210, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25, 또는 31-50가지 균주를 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 임의의 다른 종으로부터 세균을 내포하지 않는다. 본 발명은 전술한 것들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구체예에서, 조성물은 미생물 컨소시엄을 포함한다. 가령, 일부 구체예에서, 조성물은 미생물 컨소시엄의 일부로서 메가스파에라 (Megasphaera) 공생 세균 균주를 포함한다. 가령, 일부 구체예에서, 메가스파에라 (Megasphaera) 공생 세균 균주는 이것이 생체내에서 장에서 공생하여 생존할 수 있는 다른 속으로부터 한 가지 또는 그 이상 (가령, 최소한 2, 3, 4, 5, 10, 15 또는 20가지)의 다른 세균 균주와 조합으로 존재한다. 가령, 일부 구체예에서, 조성물은 상이한 속으로부터 세균 균주와 조합으로 본 발명의 메가스파에라 (Megasphaera)의 공생 세균 균주를 포함한다. 일부 구체예에서, 미생물 컨소시엄은 단일 생물체, 예를 들면, 인간의 대변 표본으로부터 획득된 2가지 또는 그 이상의 세균 균주를 포함한다. 일부 구체예에서, 미생물 컨소시엄은 자연에서 함께 발견되지 않는다. 가령, 일부 구체예에서, 미생물 컨소시엄은 최소한 2가지의 상이한 생물체의 대변 표본으로부터 획득된 세균 균주를 포함한다. 일부 구체예에서, 2가지의 상이한 생물체는 동일한 종, 예를 들면, 2명의 상이한 인간으로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 2가지의 상이한 생물체는 영아 인간 및 성체 인간이다. 일부 구체예에서, 2가지의 상이한 생물체는 인간 및 비인간 포유동물이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 균주 MRX0029와 동일한 안전성 및 치료 효력 특징을 갖지만 MRX0029가 아닌, 또는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis)가 아닌 세균 균주를 부가적으로 포함한다.
본 발명의 조성물이 한 가지 이상의 세균 균주, 종 또는 속을 포함하는 일부 구체예에서, 개별 세균 균주, 종 또는 속은 별개의, 동시적 또는 순차적 투여를 위한 것일 수 있다. 가령, 조성물은 한 가지 이상의 세균 균주, 종 또는 속 모두를 포함할 수 있거나, 또는 이들 세균 균주, 종 또는 속은 별개로 보관되고 별개로, 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 한 가지 이상의 세균 균주, 종 또는 속은 별개로 보관되지만, 이용에 앞서 함께 혼합된다.
일부 구체예에서, 본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 성인 대변으로부터 획득된다. 본 발명의 조성물이 한 가지 이상의 세균 균주를 포함하는 일부 구체예에서, 모든 세균 균주는 성인 대변으로부터 획득되거나, 또는 만약 다른 세균 균주가 존재하면, 이들은 최소한의 양으로만 존재한다. 세균은 성인 대변으로부터 획득된 다음에 배양되고 본 발명의 조성물에서 이용될 수 있었다.
앞서 언급된 바와 같이, 일부 구체예에서, 한 가지 또는 그 이상의 메가스파에라 (Megasphaera) 공생 세균 균주는 본 발명의 조성물에서 유일한 치료적으로 활성제(들)이다. 일부 구체예에서, 조성물에서 상기 세균 균주(들)는 본 발명의 조성물에서 유일한 치료적으로 활성제(들)이다.
본 발명에 따른 용도를 위한 조성물은 시판 승인을 필요로 하거나 또는 필요로 하지 않을 수도 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 상기 세균 균주가 동결건조되는 상기 제약학적 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 상기 세균 균주가 분무건조되는 상기 제약학적 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 세균 균주가 동결건조되거나 또는 분무건조되고, 그리고 이것이 살아있는 상기 제약학적 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 세균 균주가 동결건조되거나 또는 분무건조되고, 그리고 이것이 생존가능한 상기 제약학적 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 세균 균주가 동결건조되거나 또는 분무건조되고, 그리고 이것이 장을 부분적으로 또는 완전히 집락화할 수 있는 상기 제약학적 조성물을 제공한다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 세균 균주가 동결건조되거나 또는 분무건조되고, 그리고 이것이 생존가능하고 장을 부분적으로 또는 완전히 집락화할 수 있는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일부 경우에, 동결건조된 세균 균주는 투여에 앞서 재구성된다. 일부 경우에, 재구성은 본원에서 설명된 희석제의 이용에 의한다.
본 발명의 조성물은 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고: 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제; 여기서 상기 세균 균주는 치료가 필요한 개체에게 투여될 때 신경변성 장애를 치료하는데 충분한 양으로 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 제약학적 조성물을 제공하고: 본 발명의 세균 균주; 및 제약학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제; 여기서 상기 세균 균주는 신경변성 장애를 치료하거나 또는 예방하는데 충분한 양으로 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 세균 균주의 양이 조성물의 중량에 대하여 그램당 약 1 x 103 내지 약 1 x 1011 집락 형성 단위인 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 조성물이 1 g, 3 g, 5 g 또는 10 g의 용량에서 투여되는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 조성물이 경구, 직장, 피하, 코, 협측 및 설하로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 투여되는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 락토오스, 전분, 글루코오스, 메틸 셀룰로오스, 스테아르산마그네슘, 만니톨 및 소르비톨로 구성된 군에서 선택되는 담체를 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 에탄올, 글리세롤 및 물로 구성된 군에서 선택되는 희석제를 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 전분, 젤라틴, 글루코오스, 무수성 락토오스, 자유 유동 락토오스, 베타-락토오스, 옥수수 감미료, 아카시아, 트래거캔스, 알긴산나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨 및 염화나트륨으로 구성된 군에서 선택되는 부형제를 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 보존제, 항산화제 및 안정제 중에서 최소한 한 가지를 더욱 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르로 구성된 군에서 선택되는 보존제를 포함하는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 상기 세균 균주가 동결건조되는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 조성물이 밀봉된 용기에서 약 4℃ 또는 약 25℃에서 보관되고 상기 용기가 50% 상대 습도를 갖는 공기에서 배치될 때, 집락 형성 단위에서 계측에서 세균 균주 중에서 최소한 80%가 최소한 약: 1 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년, 1.5 년, 2 년, 2.5 년 또는 3 년의 기간 후 남아있는 상기 제약학적 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 본원에서 설명된 바와 같은 조성물을 포함하는 밀봉된 용기에서 제공된다. 일부 구체예에서, 밀봉된 용기는 향주머니 또는 병이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 본원에서 설명된 바와 같은 조성물을 포함하는 주입기에서 제공된다.
본 발명의 조성물은 일부 구체예에서, 제약학적 제제로서 제공될 수 있다. 가령, 조성물은 정제 또는 캡슐로서 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, 캡슐은 젤라틴 캡슐 ("겔-캡")이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여된다. 경구 투여는 화합물이 위장관에 들어가도록 삼키기 및/또는 화합물이 입으로부터 직접적으로 혈류에 들어가는 협측, 설측 또는 설하 투여를 수반할 수 있다.
경구 투여에 적합한 제약학적 제제는 고체 플러그, 고체 미세미립자, 반고체 및 액체 (복수 상 또는 분산된 시스템 포함), 예를 들면, 정제; 복수- 또는 나노-미립자, 액체 (가령, 수성 용액), 유제 또는 분말을 내포하는 연성 또는 경성 캡슐; 로젠지 (액체-충전된 로젠지 포함); 츄; 겔; 빠른 분산 약형; 필름; 소란; 스프레이; 및 협측/점막점착성 패치를 포함한다.
일부 구체예에서 제약학적 제제는 경구 투여에 의한 본 발명의 조성물의 장으로의 전달에 적합한 장내 제제, 다시 말하면, 위저항성 제제 (가령, 위 pH에 내성)이다. 장내 제제는 세균 또는 조성물의 다른 성분이 산-민감성, 예를 들면, 위 조건 하에 분해되기 쉬울 때, 특히 유용할 수 있다.
일부 구체예에서, 장내 제제는 장용 코팅을 포함한다. 일부 구체예에서, 제제는 장-코팅된 약형이다. 가령, 제제는 장용정 또는 장-코팅된 캡슐, 또는 기타 유사한 것일 수 있다. 장용 코팅은 전통적인 장용 코팅, 예를 들면, 경구 전달을 위한 정제, 캡슐, 또는 기타 유사한 것에 대한 전통적인 코팅일 수 있다. 제제는 필름 코팅, 예를 들면, 장내 중합체, 예를 들면, 산-불용성 중합체의 박막 층을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 장내 제제는 생래적으로 장용성, 예를 들면, 장용 코팅에 대한 필요 없이 위저항성이다. 따라서, 일부 구체예에서, 제제는 장용 코팅을 포함하지 않는 장내 제제이다. 일부 구체예에서, 제제는 열겔화 물질로부터 만들어진 캡슐이다. 일부 구체예에서, 열겔화 물질은 셀룰로오스 물질, 예를 들면, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 히드록시프로필메틸셀룰로오스 (HPMC)이다. 일부 구체예에서, 캡슐은 어떤 필름 형성 중합체도 내포하지 않는 껍질을 포함한다. 일부 구체예에서, 캡슐은 껍질을 포함하고, 그리고 상기 껍질은 히드록시프로필메틸셀룰로오스를 포함하고 어떤 필름 형성 중합체도 포함하지 않는다 (참조: 가령 [86]). 일부 구체예에서, 제제는 생래적으로 장내 캡슐 (가령, Capsugel로부터 Vcaps®).
일부 구체예에서, 제제는 연성 캡슐이다. 연성 캡슐은 캡슐 껍질 내에 존재하는 연화제, 예를 들면, 예로서, 글리세롤, 소르비톨, 말티톨 및 폴리에틸렌 글리콜의 첨가로 인해, 일정한 탄력성 및 유연도를 가질 수 있는 캡슐이다. 연성 캡슐은 예로서, 젤라틴 또는 전분의 기초에서 생산될 수 있다. 젤라틴-기초된 연성 캡슐은 다양한 공급업체로부터 상업적으로 가용하다. 투여 방법, 예를 들면, 예로서, 경구 또는 직장 투여에 따라서, 연성 캡슐은 다양한 모양을 가질 수 있는데, 이들은 예로서, 원형, 난원형, 장방형 또는 어뢰-모양일 수 있다. 연성 캡슐은 전통적인 과정에 의해, 예를 들면, 예로서, Scherer 과정, Accogel 과정, 또는 비말 또는 취입 성형 과정에 의해 생산될 수 있다.
배양하는 방법
본 발명에서 이용을 위한 세균 균주는 가령, 참고문헌 [87], [] 및 [89]에서 상술된 바와 같이 표준 미생물학 기술을 이용하여 배양될 수 있다.
배양에 이용되는 고체 또는 액체 배지는 YCFA 한천 또는 YCFA 배지일 수 있다. YCFA 배지는 하기를 포함할 수 있다 (100ml마다, 근사 값): 카시톤 (1.0 g), 효모 추출물 (0.25 g), NaHCO3 (0.4 g), 시스테인 (0.1 g), K2HPO4 (0.045 g), KH2PO4 (0.045 g), NaCl (0.09 g), (NH4)2SO4 (0.09 g), MgSO4 ㆍ 7H2O (0.009 g), CaCl2 (0.009 g), 레자주린 (0.1 mg), 헤민 (1 mg), 비오틴 (1 μg), 코발라민 (1 μg), p-아미노벤조산 (3 μg), 엽산 (5 μg), 그리고 피리독사민 (15 μg).
백신 조성물에서 이용을 위한 세균 균주
본 발명자들은 본 발명의 세균 균주가 신경변성 장애를 치료하거나 예방하는데 유용하다는 것을 확인하였다. 이것은 본 발명의 세균 균주가 숙주 면역계에 대해 갖는 효과의 결과일 가능성이 높다. 이런 이유로, 본 발명의 조성물은 또한, 백신 조성물로서 투여될 때, 신경변성 장애를 예방하는데 유용할 수 있다. 일정한 이런 구체예에서, 본 발명의 세균 균주는 사멸되거나, 비활성화되거나 또는 약독화될 수 있다. 일정한 이런 구체예에서, 조성물은 백신 어쥬번트를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 조성물은 주사에 의한, 예를 들면, 피하 주사에 의한 투여를 위한 것이다.
일반적
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않으면, 당해 분야의 기술 내에 화학, 생화학, 분자생물학, 면역학 및 약리학의 전통적인 방법을 이용할 것이다. 이런 기술은 기존 문헌에서 완전히 설명된다. 참조: 가령, 참고문헌 [90] 및 [91,97] 등.
용어 "포함하는"은 "포함하는"뿐만 아니라 "구성되는"을 포괄한다, 예를 들면, X를 "포함하는" 조성물은 X로 배타적으로 구성될 수 있거나, 또는 추가로 무언가, 예를 들면, X + Y를 포함할 수 있다.
수치 값 x와 관련하여 용어 "약"은 임의선택적이고 예로서, x +10%를 의미한다.
단어 "실제적으로"는 "완전히"를 배제하지 않는다, 예를 들면, Y가 "실제적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우에, 단어 "실제적으로"는 본 발명의 정의로부터 제외될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 서열 사이에 서열 동일성 백분율에 대한 언급은 정렬될 때, 뉴클레오티드들의 상기 백분율이 이들 두 서열의 비교에서 동일하다는 것을 의미한다. 이러한 정렬 및 상동성 또는 서열 동일성 퍼센트는 당해 분야에서 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들면, 참고문헌 [98]의 섹션 7.7.18에서 설명된 것들을 이용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬은 12의 갭 개방 페널티 및 2의 갭 연장 페널티, 62의 BLOSUM 매트릭스에서 아핀 갭 검색을 이용한 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 참고문헌 [99]에서 개시된다.
특정적으로 언급되지 않으면, 다양한 단계를 포함하는 과정 또는 방법은 상기 방법의 시작 또는 종결 시점에서 추가 단계를 포함할 수 있거나, 또는 추가 개재성 단계를 포함할 수 있다. 또한, 단계는 적절하면, 조합되거나, 제외되거나, 또는 대안적 순서에서 수행될 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예가 본원에서 설명된다. 각 구체예에서 특정된 특질은 추가 구체예를 제공하기 위해 다른 특정된 특질과 조합될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 특히, 본원에서 적합한, 전형적인 또는 바람직한 것으로 부각된 구체예는 서로 조합될 수 있다 (이들이 상호간에 배타적일 때를 제외하고).
발명을 실행하기 위한 방식
실시예 1 - 신경보호제로서 행동하는 세균 접종물의 효력
요약
신경모세포종 세포는 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물로 처리되었다. 이용된 SH-SY5Y 신경모세포종 세포는 도파민을 생산하고, 그리고 신경변성 질환을 연구하기 위한 시험관내 모형으로서 충분히 확립된다. 신경증식을 증가시키는 세균 균주의 능력이 관찰되었다. 신경모세포종 세포는 신경모세포종 세포에서 파킨슨병의 영구적인 증상을 유도하는 도파민작용성 신경독 1-메틸-4-페닐피리디늄 (MPP)으로 처리되었다. MPP에 대항하여 신경보호제로서 행동하는 세균 균주의 능력이 조사되었다.
재료 및 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029; 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) MRX0005
세포주
SH-SY5Y 신경모세포종 세포는 ECCACC (카탈로그 번호: 94030304)로부터 구입되었고, 그리고 영양소 혼합물 F-12 Ham (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 N4888)으로 보충된 MEM (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 M2279)에서 성장되었다.
방법
일단 성장되면, SH-SY5Y 신경모세포종 세포는 96-웰 평판에서 11,000개 세포/웰로 도말되고 2 일 동안 배양되었다. 이들 세포는 이후, 분화 배지 (1%에서 FBS를 내포한다) 및 10 uM 레티노산 (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 R2625-100MG)으로 이전되었다. 분화 배지는 2 일마다 교체되었고, 그리고 세포는 분화의 7 일 시점에서 수확되었다. 세포는 MPP (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 D048-1G)와 함께 또는 이것 없이 8 시간 동안 사전 처리되었다. 차후에, 세포는 10% 세균 상층액으로 처리되고 하룻밤 동안 배양되었다. 세포 생존력은 CCK-8 시약 (Sigma Aldrich, 세포 계수 키트 - 8, 카탈로그 번호 96992-3000TESTS-F)을 이용함으로써 계측되고 450nm 파장에서 판독되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 1에서 도시된다. MRX0029 또는 MRX0005로 신경모세포종 세포의 처리는 뉴런의 증식에서 증가를 야기하였다. 상기 세균 균주와 함께 MPP로 처리된 신경모세포종 세포는 MPP 단독으로 처리된 세포 (감소된 생존력을 가졌다)와 비교하여 증가된 세포 생존력을 가졌다. 이러한 보호 효과는 MRX0029-처리된 세포의 경우에 더욱 컸는데, 이들 세포는 퀘르세틴으로 처리된 양성 대조 세포보다 많이 생존력을 구제하였다. 이들 데이터는 상기 세균 균주가 신경보호제로서 행동할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 2a - IL-6 분비를 감소시키는 세균 접종물의 효력.
요약
친염증성 사이토킨의 활성화는 신경변성 질환에서 뉴런 손상과 연관되었다. 지질다당류 (LPS)는 친염증성 사이토킨 IL-6의 공지된 자극기이다. 인간 교모세포종 성상세포종 세포는 IL-6의 수준을 조정하는 능력을 관찰하기 위해 LPS와 조합으로 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물로 처리되었다.
재료 및 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029; 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) MRX0005
세포주
MG U373은 악성 종양으로부터 유래된 인간 교모세포종 성상세포종이고, 그리고 Sigma-Aldrich (카탈로그 번호 08061901-1VL)로부터 구입되었다. MG U373 인간 교모세포종 성상세포종 세포는 10% FBS, 1% Pen Strep, 4mM L-Glut, 1X MEM 비 필수 아미노산 용액 및 1X 피루브산나트륨으로 보충된 MEM (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 M-2279)에서 성장되었다.
방법
일단 성장되면, MG U373 세포는 24-웰 평판에서 100,000개 세포/웰로 도말되었다. 이들 세포는 단독으로 또는 MRX0029 또는 MRX0005로부터 10%의 세균 상층액과 함께 LPS (1ug/mL)로 24 시간 동안 처리되었다. 대조 또한 수행되었는데, 여기서 이들 세포는 처리되지 않은 배지에서 배양되었다. 그 후에, 무세포 상층액이 수집되고, 4℃에서 3분 동안 10,000g에서 원심분리되었다. IL-6은 제조업체 사용설명서에 따라서 Peprotech로부터 인간 IL-6 ELISA 키트 (카탈로그 번호 #900-K16)를 이용하여 계측되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 2에서 도시된다. LPS 및 상기 세균 균주로 신경모세포종 세포의 처리는 분비된 IL-6의 수준에서 감소를 야기하였다.
실시예 2b - IL-8 분비를 조정하는 세균 접종물의 효력.
요약
신경염증이 신경변성 질환에서 중심적인 역할을 수행하고 IL-8이 신경-양성 효과를 갖는 것으로 나타났기 때문에, IL-8의 활성화에 대한 본 발명의 세균 균주 및 LPS를 포함하는 조성물의 효과가 사정되었다. 인간 교모세포종 성상세포종 세포는 IL-8의 수준을 조정하는 능력을 관찰하기 위해 LPS와 조합으로 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물로 처리되었다.
재료 및 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029; 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) MRX0005
세포주
MG U373은 악성 종양으로부터 유래된 인간 교모세포종 성상세포종이고, 그리고 Sigma-Aldrich (카탈로그 번호 08061901-1VL)로부터 구입되었다. MG U373 인간 교모세포종 성상세포종 세포는 10% FBS, 1% Pen Strep, 4mM L-Glut, 1X MEM 비 필수 아미노산 용액 및 1X 피루브산나트륨으로 보충된 MEM (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 M-2279)에서 성장되었다.
방법
일단 성장되면, MG U373 세포는 24-웰 평판에서 100,000개 세포/웰로 도말되었다. 이들 세포는 단독으로 또는 MRX0029로부터 10%의 세균 상층액과 함께 LPS (1ug/mL)로 24 시간 동안 처리되었다. 그 후에, 무세포 상층액이 수집되고, 4℃에서 3분 동안 10,000g에서 원심분리되었다. IL-8은 제조업체의 사용설명서에 따라서 Peprotech로부터 인간 IL-8 ELISA 키트 (카탈로그 번호 #900-K18)를 이용하여 계측되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 3에서 도시된다. 상기 세균 균주로 신경모세포종 세포의 처리는 LPS의 존재와는 관계없이 IL-8 분비에서 증가를 야기한다.
실시예 2C - α-시누클레인-유도된 염증을 감소시키는 세균 접종물의 효력.
요약
신경염증은 파킨슨병에서 중심적인 역할을 수행하고, 그리고 α-시누클레인은 생체내에서 신경염증을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, α-시누클레인-유도된 신경염증을 저해하는 본 발명의 세균 균주의 능력이 사정되었다. 인간 교모세포종 성상세포종 세포 및 신경모세포종 세포의 공동배양액이 야생형 α-시누클레인 및 돌연변이체 동종형 E46K와 A53T에 노출되고 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물로 처리되었다. 이후, IL-6의 α-시누클레인-유도된 분비를 저해하는 상기 세균 균주의 능력이 검사되었다.
재료 및 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029; 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) MRX0005
세포주
MG U373은 악성 종양으로부터 유래된 인간 교모세포종 성상세포종이고, 그리고 Sigma-Aldrich (카탈로그 번호 08061901-1VL)로부터 구입되었다. MG U373 인간 교모세포종 성상세포종 세포는 10% FBS, 1% Pen Strep, 4mM L-Glut, 1X MEM 비 필수 아미노산 용액 및 1X 피루브산나트륨으로 보충된 MEM (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 M-2279)에서 성장되었다.
SH-SY5Y는 악성 신경모세포종으로부터 유래된 인간 신경모세포종 세포주이고, 그리고 Sigma-Aldrich (카탈로그 번호 94030304-1VL)로부터 구입될 수 있다. 이들 세포는 2mM L-글루타민, 10% 열 비활성화된 FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 50 % MEM 및 50% 영양소 혼합물 F-12 Ham 배지에서 성장되었다. 성장 배지에서 세포는 96-웰 평판에서 11,000개 세포/웰로 도말되고 인큐베이터에 배치되었다. 2 일 후, 배지는 분화 배지 (1% FBS를 내포하는 성장 배지) 및 10 μM 레티노산으로 교체되었다. 분화 배지는 2 일마다 교체되었고, 그리고 세포는 7 일의 분화 후 이용되었다.
방법
SHSY5Y 세포는 12 웰 평판에서 50,000개 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 이들 세포는 2mM L-글루타민, 10% 열 비활성화된 FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 50 % MEM 및 50% 영양소 혼합물 F-12 Ham 배지에서 성장되었다. 성장 배지에서 세포는 96-웰 평판에서 11,000개 세포/웰로 도말되고 인큐베이터에 배치되었다. 2 일 후, 배지는 분화 배지 (1% FBS를 내포하는 성장 배지) 및 10 μM 레티노산으로 교체되었다. 분화 배지는 2 일마다 교체되었고, 그리고 세포는 7 일의 분화 후 이용되었다. U373은 12 트랜스웰 평판 (0.4μm 폴리에스테르 막, Costar)에서 72 시간 동안 50,000개 세포/웰의 밀도로 도말되었다. 세포는 분화 배지 (레티노산 없이 1% FBS를 내포하는 성장 배지)에서 처리 전 24 시간 동안 함께 공동배양되었다.
그 후에, 세포는 10% 세균 상층액의 존재 또는 부재에서 25μg/ml α-시누클레인 (Wt, A53T, E46K)으로 48 시간 동안 처리되었다. 무세포 상층액이 수집되고, 4℃에서 3 분 동안 10000g에서 스핀다운되고, 분취되고, -80 ℃에서 보관되었다. 인간 IL-6 및 IL-8은 상기에서 설명된 바와 같이 계측되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 4에서 도시된다. 야생형 α-시누클레인 및 돌연변이체 동종형 E46K와 A53T로 세포의 처리는 IL-6의 중간 정도의 분비를 유도하였다 (도 4a). IL-6의 α-syn-유도된 분비는 상기 세균 균주로 처리된 세포에서 저해되었다 (도 4a). IL-6 분비에서 감소는 MRX0029의 투여 시에 최대이었다.
실시예 3 - NFκB 활성화를 감소시키는 세균 접종물의 효력
요약
NFκB 프로모터의 활성화는 IL-1β, IL-1α, IL-18, TNFα 및 IL-6을 비롯한 친염증성 사이토킨의 생산을 야기한다. NFκB 프로모터는 TLR4 리간드를 자극함으로써 α-시누클레인 및 LPS에 의해 활성화될 수 있다. α-시누클레인에서 돌연변이, 예를 들면, α-시누클레인 A53T는 가족성 파킨슨병에 관여한다. LPS로 뉴런 세포의 처리는 환경 인자에 의해 유발된 파킨슨병을 모의한다. NFκB 프로모터의 활성화를 저해하는 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물의 능력이 조사되었다.
재료 및 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029
세포주
인간 Hek blue TLR4는 InvivoGen (카탈로그 번호 hkb-htlr4)으로부터 구입되었다. 인간 Hek blue TLR4는 10% FBS, 1% Pen Strep, 4mM L-Glut, 노르모신 및 1X HEK Blue 선별 용액으로 보충된 DMEM 높은 글루코오스 (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 D-6171)에서 성장되었다.
방법
일단 성장되면, 인간 Hek blue 세포는 4회 반복 검증에서 96 웰 평판에서 25,000개 세포/웰로 도말되었다. 한 세트의 세포는 단독으로 또는 MRX0029로부터 10%의 세균 상층액과 함께 α-시누클레인 A53T (1ug/mL)로 22 시간 동안 처리되었다. 두 번째 세트의 세포는 단독으로 또는 MR029로부터 10%의 세균 상층액과 함께 LPS (10 ng/mL, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움 (Salmonella enterica serotype Typhimurium)으로부터, Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 L6143)로 22 시간 동안 처리되었다. 이들 세포는 차후에 스핀다운되었고, 그리고 20ul의 상층액이 200ul의 Quanti Blue 시약 (InvivoGen, 카탈로그 번호 rep-qb2)와 혼합되고, 2 시간 동안 배양되고, 그리고 흡광도가 655nm에서 판독되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 5와 6에서 도시된다. 도 5는 α-시누클레인에 의한 NFκB 프로모터의 활성화가 MRX0029에 의해 저해되지 않는다는 것을 보여준다. 도 6은 LPS에 의한 NFκB 프로모터의 활성화가 MRX0029에 의해 저해된다는 것을 보여준다.
실시예 4 - 신경돌기 생장을 변경하는 세균의 효력
요약
신경돌기 생장은 뉴런 사이에 연결의 발달을 위한 중요한 과정이다. 이런 이유로, 신경돌기 생장을 유도하는 세균 균주 및 유기 산의 능력이 특이적인 뉴런 분화 마커인 미소관 연관된 단백질 MAP2의 전사 수준을 계측함으로써 검사되었다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029.
방법
SHSY5Y는 10cm 페트리 접시에서 2x106개 세포의 밀도로 도말되었다. 24 시간 후, 세포는 10% 세균 상층액 또는 YCFA+, 10uM RA, 200uM 헥산산 또는 200uM 발프로산을 포함하는 분화 배지 (RA 없이 1% FBS를 내포하는 성장 배지)에서 17 시간 동안 처리되었다. 그 이후, 대표적인 이미지가 40X/0.65 배율에서 위상차 EVOS XL 코어 현미경을 이용하여 촬영되었다. 세포는 수집되었고, 그리고 전체 RNA가 RNeasy 미니 키트 프로토콜 (Qiagen)에 따라서 단리되었다. cDNAs는 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 이용하여 만들어졌다. 유전자 발현은 qPCR을 이용하여 계측되었다. GAPDH가 내부 대조로서 이용되었다. 배수 변화는 2(-△△ct) 방법에 따라서 계산되었다.
면역형광 및 공초점 현미경검사
세포는 8 웰 챔버 슬라이드 (Marienfeld Laboratory Glassware) 위에 하룻밤 동안 5x104개 세포/웰로 파종되고, 그리고 24 시간 동안 10% 세균 상층액으로 처리되었다. 분화를 위해, 세포는 세균 상층액으로 처리하기 전 5 일 동안 10nM 레티노산으로 처리되었다. 세포는 이후, 실온 (RT)에서 20 분 동안 PBS에서 4% 파라포름알데히드로 고정되었다. 고정된 세포는 PBS로 세척되고, 그리고 10 분 동안 PBS에서 1% Triton X-100으로 투과화되었다. PBS로 세척한 후, 슬라이드는 4℃에서 12 시간 동안 1% BSA/PBS에서 희석된 항-MAP2 항체 (sc-74421, Santa Cruz Biotechnology Inc)를 첨가하기 전, 실온에서 1 시간 동안 차단 완충액 (4% BSA/PBS)과 함께 배양되었다. 이들은 이후, PBS로 2회 세척되고, 그 이후에 실온에서 1 시간 동안 Alexa Flour 488 접합된 항생쥐 (Molecular Probes Inc) 및 Alexa Flour 594 접합된 팔로이딘 (ab176757, Abcam)과 함께 배양되었다. PBS로 3X 세척한 후, 슬라이드는 DAPI (Sigma, Aldrich)를 내포하는 Vectorshield□가 적재되었다. 슬라이드는 이용된 플루오로크롬의 검출에 적합한 63x/1.2 W Korr 대물렌즈 및 필터 세트가 구비된 Zeiss Axioscope 현미경을 이용하여 개관되었다. MAP-2로 면역표지화된 이미지의 디지털 획득을 위한 수동 노출 시간은 일정하게 유지되어 상이한 웰 및 처리 사이에 비교를 허용하였다. 팔로이딘 (F-액틴) 및 DAPI 노출 시간은 시계에 알맞도록 변하였다. 무작위화된 시계는 Image Pro Plus 소프트웨어에 의해 제어되는 QImaging 카메라를 이용하여 획득되었다. 이미지는 TIFs로서 저장되고 Adobe Photoshop CC 2015.1.2에서 열렸고, 그리고 MAP-2, DAPI 및 팔로이딘 이미지의 오버레이가 덧씌워지고 병합되었다. 대표적인 이미지는 조사된 단백질의 존재비 및 위치에서 차이를 도해하도록 선별되었다.
결과
결과는 도 7에서 도시된다. 도 7a는 각각의 산 및 세균 상층액과 함께 배양된 미분화된 SHSY-5Y 세포의 대표적인 현미경검사 이미지를 보여준다. MRX0029로 세포의 처리는 뉴런-유사 표현형을 유도하고 레티노산 (이것은 신경모세포종 세포의 말기 분화에 이용된다)으로 처리된 세포와 유사한 특질을 보여주었는데, 여기서 세포체가 더욱 크고 피라미드-모양이고, 신경돌기 및 처리된 세포가 외부로 분지하여 이웃 세포와 네트워크를 형성한다. 도 7b는 MRx0029가 미분화된 신경모세포종 세포에서 MAP2를 유의미하게 상향조절한다는 것을 보여준다. 팔로이딘 (액틴 세포골격-결합 작용제) 염색은 MRx0029로 처리된 세포에서 세포골격 구조의 상이한 배열을 더욱 입증하였는데, 이것은 MRx0029에 대한 뉴런 분화 가설을 더욱 뒷받침한다 (도 7b).
실시예 5 - 항산화 용량을 변경하는 세균 접종물의 효력
요약
항산화 용량을 변경하는 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물의 능력. 상기 세균 균주의 항산화 용량은 널리 알려진 ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)) 검정을 이용하여 확립되었다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029
방법
세균 세포 (106개 또는 그 이상)가 수집되고 원심분리되었다. 이들은 검정 완충액에서 재현탁되었다 (3배의 펠렛 용적을 이용하여). 현탁액은 얼음 위에서 5 분 동안 초음파처리되고, 그리고 이후, 10 분 동안 12,000 x g에서 스핀다운되었다. 상층액은 제거되고, 그리고 제조업체의 사용설명서에 따라서, Sigma Aldrich에 의해 생산된 ABTS 검정 키트 (코드 CS0790)를 이용하여 계측되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 8에서 도시된다. 도 8은 MRX0029가 트롤록스와 비교하여 대략 2mM의 항산화 용량을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 6 - 지질 과산화 수준을 변경하는 세균 접종물의 효력
요약
지질 과산화 수준을 변경하는 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물의 능력이 조사되었다. 티오바르비툴산 반응성 물질 검정 (TBARs)이 지질 과산화의 부산물을 계측하는데 이용되었다.
재료 및 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029
방법
세균 세포 (106개 또는 그 이상)가 수집되고 원심분리되었고, 세척 단계가 등장성 식염수로 수행되었고, 이후 펠렛이 염화칼륨 검정 완충액에서 재현탁되었다. 현탁액은 10 분 동안 얼음 위에서 초음파처리되고, 그리고 이후, 10 분 동안 10,000 x g에서 스핀다운되었다. 상층액은 제거되었고, 그리고 지질 과산화의 수준이 티오바르비툴산 반응성 물질 검정을 이용하여 평가되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 9에서 도시된다. 도 9는 MRx0029가 지질 과산화를 대략 20 % 저해할 수 있다는 것을 보여주는데, 이것은 양성 대조, 부틸화된 히드록시톨루엔 (1% w/v)보다 높은 항산화 용량이다.
실시예 7a - 세포에서 산화 수준을 감소시키는 세균 접종물의 효력
배경
반응성 산소 종의 산출은 신경변성 질환의 병리에 기여한다. Tert-부틸 과산화수소 (TBHP)로 처리에 의해 산출된 반응성 산소 종 (ROS)으로부터, 분화된 SHSY-5Y 및 U373 세포를 보호하는 세균 균주의 능력이 조사되었다.
재료 및 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029
방법
SHSY-5Y 세포는 흑색 편평 바닥 96 웰 평판에서 5000개 세포/웰의 밀도로 도말되고 CO2 인큐베이터에서 배치되었다. 24 시간 후, 배지는 분화 배지 (1% FBS를 내포하는 성장 배지) 및 10 μM 레티노산으로 교체되었다. 분화 배지는 2 일마다 교체되었다. 10 일자에서 분화 배지는 제거되었고, 그리고 세포는 미리 가온된 PBS로 세척되고 1% FBS를 내포하는 성장 배지에서 20 분 동안 10uM DCFDA 분자 프로브로 염색되었다. 이후, 세포는 미리 가온된 PBS로 다시 한 번 세척되고 10% 세균 상층액의 존재 또는 부재에서 2 시간 동안 100uM TBHP로 처리되었다. 형광 강도는 TECAN 평판 판독기를 이용하여 Ex/Em 485/530 nm에서 계측되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 10에서 도시된다. 도 10b는 MRX0029가 분화된 SHSY-5Y 신경모세포종 세포에서 ROS 생산을 저해할 수 있다는 것을 보여준다. MRX0029는 U373 별아교교모세포종 세포에서 ROS의 산출에 대한 효과를 갖지 않았다 (도 10a). 이것은 항산화 효과의 이러한 양상이 뉴런-특이적이라는 것을 보여준다.
실시예 7b - 신경보호
RA-분화된 SHSY-5Y 세포는 PD 병리의 특질 중에서 일부를 시험관내에서 및 생체내에서 모의하는데 폭넓게 이용되는 화학물질인 MPTP의 활성 대사산물인 MPP+로 처리되었다. 세포 생존력은 미토콘드리아 호흡의 비율로서 계측되었다 (도 11). MRx0005 및 MRx0029 둘 모두 유의미한 효과를 보여주었고, 그리고 그 자체로, SHSY-5Y 세포에서 미토콘드리아 대사 활동의 증가를 증진한다. MRX0029는 MPP+로부터 완전한 보호를 보여주고, 세포 생존력을 처리되지 않은 세포와 거의 동일한 수준으로 및 퀘르세틴 양성 대조보다 높게 복원하였다. MRx0005 보호는 YCFA-MPP+ 처리된 표본과 비교하여 약 20%이었는데, 이것은 퀘르세틴 양성 대조에 대해 관찰된 것과 거의 동일하다 (도 11).
실시예 8 - 히스톤 탈아세틸화효소 활성에 대한 세균 접종물의 효력
요약
히스톤 탈아세틸화효소 활성을 변경하는 본 발명에 따른 세균 균주를 포함하는 조성물의 능력이 조사되었다. 히스톤 탈아세틸화효소의 조절장애는 연령-연관된 신경변성 질환과 연관된 발병에 연루되었다.
재료 및 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029
세포주
히스톤 탈아세틸화효소가 존재하기 때문에, 세포주 HT-29가 이용되었다.
방법
정지기 세균 배양액의 무세포 상층액이 원심분리 및 0.22 uM 필터에서 여과에 의해 단리되었다. HT-29 세포가 합류후 3 일에 이용되고, 그리고 실험의 시작 전 24 시간에 1 mL DTS에서 점감되었다. HT-29 세포는 DTS에서 희석된 10 % 무세포 상층액으로 공격되었고, 그리고 48 시간 동안 배양되도록 방치되었다. 이후, 뉴클레아제 단백질이 Sigma Aldrich 뉴클레아제 추출 키트를 이용하여 추출되었고, 그리고 표본은 HDAC 활성 계측에 앞서 즉시 동결되었다. HDAC 활성 키트는 Sigma Aldrich (UK) 키트를 이용하여 형광분석적으로 사정되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 12에서 도시된다. 도 12는 MRX0029가 히스톤 탈아세틸화효소 활성의 수준을 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 8a - 히스톤 탈아세틸화 저해의 기전의 추가 분석
도입
소화관 미생물 균총은 이의 막대한 다양성 및 물질대사 능력으로, HDAC 활성에 영향을 주는 잠재력을 갖는 방대한 다양한 분자의 생산을 위한 거대한 물질대사 보관소를 나타낸다. 극소수의 연구가 HDAC를 저해하는 것으로 밝혀졌고 헌팅턴병에서 운동 기능의 향상과 연관되는 부티르산염 이외에 미생물학적으로-유래된 대사산물의 HDAC 저해 활성을 사정하였다 [100]. 본 발명자들은 이런 이유로, 어떤 대사산물이 HDAC 저해에 대한 책임이 있는 지를 결정하고, 그리고 저해가 달성되는 기전을 더욱 석명하려 모색하였다.
재료 및 방법
세균 배양 및 무세포 상층액 수집
세균의 순수한 배양액은 이들이 그들의 정체 성장기에 도달할 때까지, YCFA 액상배지에서 혐기성으로 성장되었다. 배양액은 5 분 동안 5,000 x g에서 원심분리되었고, 그리고 무세포 상층액 (CFS)은 0.2 μM 필터 (Millipore, UK)를 이용하여 여과되었다. CFS의 1 mL 분취량이 이용 때까지 -80 ℃에서 보관되었다. 부티르산나트륨, 헥산산 및 발레르산은 Sigma Aldrich (UK)로부터 획득되었고, 그리고 현탁액은 YCFA 액상배지에서 제조되었다.
세균 상층액의 SCFA 및 MCFA 정량
세균 상층액으로부터 짧은 사슬 지방산 (SCFAs) 및 중간 사슬 지방산 (MCFAs)은 하기와 같이 분석되고 MS Omics APS에 의해 정량되었다. 표본은 염산염 산 및 중수소 표지화된 내부 표준 (첨가되는 경우에)을 이용하여 산성화되었다. 모든 표본은 무작위화된 순서로 분석되었다. 분석은 사중극 검출기 (59977B, Agilent)와 연계된 GC (7890B, Agilent)에서 설치된 높은 극성 칼럼 (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 칼럼 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm)을 이용하여 수행되었다. 상기 시스템은 ChemStation (Agilent)에 의해 제어되었다. 미가공 데이터는 Chemstation (Agilent)을 이용하여 netCDF 형식으로 전환되었고, 이후 상기 데이터는 [101]에서 설명된 PARADISe 소프트웨어를 이용하여 Matlab R2014b (Mathworks, Inc.)에서 이입되고 처리되었다.
특정한 HDAC 활성 분석
특정한 HDAC 저해 활성은 각 유형의 HDAC에 대한 형광원 검정 키트 (BPS Bioscience, CA)를 이용하여 HDAC1, 2, 3, 4, 5, 6, 9에 대해 분석되었다. 검정은 제조업체의 사용설명서에 따라서 수행되었고, 그리고 각 표본은 반복 검증으로 수행되었다. 무세포 상층액은 방법 사이에 일관성을 유지하기 위해 10분의 1로 희석되고 키트에 담겨 제공된 특정한 HDAC 단백질에 노출되었다.
결과
히스톤 탈아세틸화효소-저해 소화관 공생 미생물 대사산물은 부티르산염 및 발레르산이다
상층액이 HT29 전체 세포 또는 HT29 세포 용해물을 이용한 검정에서 강한 HDAC 저해를 보여주었던 MRx0029는 각각, 5.08 mM 및 1.60 mM의 평균 농도에서 발레르산 및 헥산산을 생산하였다 (도 13a와 c).
어떤 대사산물이 균주-유도된 HDAC 저해에 대한 책임이 있는 지를 조사하기 위해, 상이한 농도의 헥산산, 발레르산 및 부티르산나트륨이 전체 HT-29 세포 및 HT-29 세포 용해물에 대한 그들의 HDAC 저해에 대해 계측되었다. 도 13b에서 결과는 전체 세포에서뿐만 아니라 세포 용해물에서 부티르산나트륨에 의한 HDAC 활성의 유의미한 (P<0.05) 저해를 보여주고, 반면 헥산산은 유의미한 저해 활성을 보여주지 않았다. 발레르산은 전체 HDAC 활성을 저해하였다 (* (p<0.05), ** (p<0.005), *** (P<0.001), **** (p<0.0001)).
조사된 강력한 전체 HDAC 저해제는 클래스 I HDACs를 표적으로 한다.
검사 세균 균주의 특정한 HDAC 저해 프로필이 조사되었다. 특정한 HDAC 저해 검정 (BPS Bioscience, CA)이 클래스 I 및 클래스 II HDACs에 대해 실행되었다. HDAC 효소를 저해하는 세균 균주의 능력이 부티르산염, 헥산산 및 발레르산과 비교되었다 (도 14와 15). 우리의 결과는 MRX0029가 클래스 1 HDAC 효소 (HDAC1, 2 및 3)의 매우 강력한 저해제라는 것을 증명한다. 클래스 II HDACs의 저해는 유의미하지 않았다 (데이터 제시되지 않음).
논의
HDAC 저해 활성을 갖는 균주는 유의미한 양의 발레르산 및 헥산산뿐만 아니라 유의미한 양의 부티르산나트륨을 생산하였다 (도 13c). 순수한 물질로서 검사될 때, 발레르산 및 부티르산나트륨은 유의미한 HDAC 저해 (p<0.0001)를 유발하였다.
흥미롭게도, 특정한 HDAC 활성에 대한 결과는 검사된 균주가 클래스 I HDACs, 그리고 특히 HDAC2의 강력한 저해제이라는 것을 보여준다. 클래스 I HDACs (HDAC1, 2, 3 및 8)는 핵 안에 있고, 그리고 여러 인간 세포 유형에서 편재성으로 발현된다. HDACs 1-3은 50% 이상의 상동성을 공유하지만, 상이한 구조 및 세포 기능을 갖는다 [102]. 이들은 세포 생존, 증식 및 분화에 일차적으로 관련되고, 그리고 따라서, 이들의 저해는 질환의 넓은 어레이에서 유용할 수 있다 [103]; [104]; [105]; [106]; [107].
실시예 9 - 세균에서 인돌 생산의 수준
요약
인돌을 생산하는 본 발명의 세균의 능력이 조사되었다. 인돌은 염증 및 산화 스트레스를 약화시키는데 연루되었다.
재료 및 방법
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029
ATCC 11775는 인돌을 생산하는 것으로 알려져 있는 세균 표준 균주이다.
방법
정지기에서 무손상 세균 세포가 6mM 트립토판과 함께 48 시간 동안 배양되었다. 효소 트립토판분해효소를 소유하는 세균 종은 트립토판을 기질로서 활용하여 인돌을 생산할 것이다. 48 시간 배양 기간 이후에, 상층액이 제거되고 인돌의 정량을 위해 코바크 시약에 첨가되었다. 표준, 원액 및 시약은 인-하우스 검증된 표준화된 방법을 이용하여 제조되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 16에서 도시된다. 도 16은 MRX0029가 대략 0.2mM의 농도에서, 트립토판으로부터 인돌을 생산하는 능력을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 10 - 세균에서 키뉴레닌 생산의 수준
요약
키뉴레닌을 생산하는 본 발명의 세균의 능력이 조사되었다. 키뉴레닌 경로의 조절장애는 면역계의 활성화 및 잠재적으로 신경독성 화합물의 축적을 야기할 수 있다. 키뉴레닌 물질대사에서 변경은 파킨슨병의 발달에 관련될 수 있다.
세균 균주
메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) MRX0029
DSM 17136은 키뉴레닌을 생산하는 것으로 알려져 있는 박테로이데스 코프리콜라 (Bacteroides copricola)의 균주이다.
방법
정지기 세균 배양액의 무세포 상층액이 원심분리 및 0.22 uM 필터에서 여과에 의해 단리되고 이용 때까지 동결되었다. 키뉴레닌 표준, 원액 및 시약은 인-하우스 검증된 표준화된 방법을 이용하여 제조되었다. 표본은 트리클로로아세트산으로 처리되고 4℃에서 10 분 동안 10,000xg에서 원심분리되었다. 상층액이 수집되고 96 웰 평판 내로 분여되었다. 에를리히 시약이 키뉴레닌 검출에 이용되고 1:1의 비율에서 추가되었다.
결과
이들 실험의 결과는 도 17에서 도시된다. 도 17은 MRX0029가 대략 40 μM의 농도에서 키뉴레닌을 생산하는 능력을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 11 - 세균-처리된 MPTP 생쥐에서 선조체에서 도파민, DOPAC 및 HVA의 수준
파킨슨병은 가장 중요한 임상적 특질이 진전, 움직임의 느려짐, 경직 및 자세 불안정을 포함하는 통상적인 신경변성 장애이다. 이들 증상은 흑색질 치밀부에서 도파민 뉴런의 변성 및 선조체에서 이들의 돌출 신경 섬유의 결과적인 상실에 주로 기인한다 [108]. MPTP (1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘)로 처리된 생쥐는 유의미한 숫자의 흑질선조체 도파민 뉴런을 선별적으로 상실한다 [109]. 흑색질에서 도파민 세포의 MPTP 유도된 상실은 파킨슨병에서 임상적 상태를 모방하고, 그리고 이런 이유로, 항파킨슨병 약물을 검사하기 위한 유용한 모형이다.
본 연구의 목적은 MPTP 손상된 생쥐를 이용하여 MRX0029 혐기성 세균의 효과를 평가하는 것이었다.
48마리 수컷 생쥐가 4가지 상이한 치료군 (군 A, B, E 및 I, 각 군에서 n=12 동물)에 할당되었다. 치료군은 아래의 표 1에서 도시되고, 그리고 프로젝트 시간 코스는 아래에 개설된다.
표 1: 치료군


군

n 		치료 손상

물질 		안전성 수준
용량
루트
일정
물질
용량
루트
일정
A 12 운반제 (PBS) - - p.o. 18 일: (-14)일자 - 3 일자 운반제 (0.9% 식염수) i.p. 0 일자
B 12 운반제 (PBS) - - p.o. 18 일: (-14)일자 - 3 일자 MPTP 4x 20 mg/kg i.p. 0 일자

E
12		 MRx0029 메가스파에라 (Megasphaera) 종
(gly)
S1/S2
2 x 10^8 세균
p.o.
18 일: (-14)일자 - 3 일자
MPTP
4x 20 mg/kg
i.p.
0 일자

I
12		 운반제 (PBS) - - p.o. 18 일: (-14)일자 - 3 일자
MPTP
4x 20 mg/kg
i.p.
0 일자
7-니트로인다졸 - 50 mg/kg i.p. 0 일자 (2x i.p.)
군 A, B, E 및 I는 경구 위관영양에 의해 세균 (MRx0029 - 군 E), 또는 운반제 (PBS)로 18 일 동안 매일 치료되었다. 경구 치료는 MPTP 손상 전 14 일에 시작되었다. 군 I 동물은 일일 운반제 (PBS) p.o. (경구) 치료를 제공받았고, 그리고 0 일자에서 첫 번째 MPTP 전 30 분 및 후 90 분에 참조 약물이 i.p. (복막내) 주사되었다. p.o. 및 운반제 치료를 위한 적용 용적은 생쥐마다 200 μl이었다. 군 E의 세균 균주는 글리세롤 스톡 (gly)으로부터 유래되었다. 경구 치료의 경우에, 적용을 위한 위관영양물은 70% 에탄올을 내포하는 바이알에서 보관되고, 그리고 각 이용 전후에 증류수가 쏟아졌다. 모든 치료군은 자체의 위관영양물과 에탄올 바이알 및 증류수 바이알을 가졌다. 이들 튜브 및 위관영양물은 군 사이에서 변화되지 않았다. 치료 직전에 각 주입기는 N2가 쏟아졌다.
0 일자에서 MPTP (20 mg/kg 체중 (b.w.) 4 회, 2 시간 처리간 간격)가 군 B, E 및 I의 동물에서 i.p. 주사되었다. 동물의 한 가지 군 (A)은 MPTP 운반제 (0.9% 식염수)의 i.p. 투여에 의해 허위 손상되었다. 적용 용적은 체중 g마다 10 μl이었다. 실제 체중에 따라서 동물에게 투약하기 위해, 동물의 계량이 MPTP 처리 전 수행되었다. 그 후에, 동물은 매일 p.o. 치료를 제공받았다.
투약을 위한 제조물 및 투약을 위한 글리세롤 스톡의 제조물의 조제
Figure pct00001
치료군 E (MRx0029)의 경우
1.) 1 글리세롤 스톡이 -80 ℃ 냉동기로부터 취해지고. 그리고 해동하기 위해 37℃에서 혐기성 조건 (향주머니가 달린 무산소 배양통) 하에 배치되었다 (이것은 30-40 분이 소요된다).
2.) 완전히 해동된 글리세롤 스톡은 실온에서 10 분 동안 6000 x g에서 원심분리되었다.
3.) 상층액은 펠렛을 교란하지 않으면서 폐기되었다 (가령, 피펫을 이용하여).
4.) 4.22 mL의 무균 미리 가온된 (37 ℃) 1 x PBS가 첨가되고, 그리고 피펫을 이용하여 온화하게 혼합되었다.
5.) 생쥐는 200 μL의 세균 용액이 투약되었다. 이들 동물은 PBS로 펠렛의 재현탁 후 15 분 이내에 투약되었다.
참조 약물 군 제제
Figure pct00002
50 mg/kg의 최종 농도에 도달하기 위해, 온당한 양의 7-니트로인다졸이 낙화생유에서 용해되었다.
재료와 방법
동물
Figure pct00003
동물의 특별한 취급 및 무작위배정
장갑이 각 치료군 사이에 교체되었고, 그리고 동물이 취급될 때 (가령: 치료, 행동 검사, 청소 및 조직 표본추출)는 언제든지 오염 위험을 최소화하기 위해 동일한 군의 각 케이지 사이에서 70% 에탄올 용액이 분무되었다.
치료는 동일한 군이 매일 동시에 치료되는 것을 예방하기 위해, 무작위로 진행되고 매일 교대되었다. 동물은 조직 표본추출에서 케이지에 따라서 무작위배정되었다.
조직 표본추출 및 처리
4 일자에서 모든 군의 동물이 희생되었고, 그리고 뇌가 수집되었다. 이런 이유로, 생쥐는 펜토바르비탈 주사 (600mg/kg)에 의해 깊게 마취되었다.
혈액 (대략 500 μl)이 심장 천자에 의해 수집되었다. 생쥐는 이후, 0.9% 식염수로 경심 관류되었고, 그리고 뇌가 제거되고 2등분되었다. 왼쪽 반구는 선조체 조직 (HPLC를 위해), 흑색질 조직뿐만 아니라 잔여 뇌로 세분화되고, 계량되고, 즉시 동결되고, -80℃에서 보관되었다. 동물과 접촉한 기기 및 표면은 그 다음 동물이 절개되기 전 70% 에탄올로 청소되어야 했다.
선조체에서 HPLC로 도파민, DOPAC 및 HVA 수준의 생화학적 분석
선조체 표본 (각 치료군으로부터 n=6; 전체 24개 표본)은 100 μM EDTA-2Na를 포함하는 0.2 M 과염소산과 1:10 (w/v)의 비율에서 혼합되고, 그리고 0 ℃에서 유리- 페스틀마이크로 (pestlemicro)-균질기에서 균질화되었다. 얼음 위에서 30 분 동안 방치한 이후에, 균질액은 냉동된 원심분리기 Biofuge Fresco (Heraeus Instruments, Germany)에서 10 분 동안 10,000 RPM에서 원심분리되었다. 상층액은 신중하게 흡인되고, 비율 1:2 (v/v)에서 0.4 M Na-아세트산염 완충액, pH 3과 혼합되고, 그리고 4 ℃에서 4 분 동안 14 000 g에서 0.22 μm 원심 필터 (Merck Millipore, Germany)를 통해 여과되었다. 여과액은 HPLC 분석 전 -80 ℃에서 보관되었다.
HPLC 분석
선조체 표본에서 DA, DOPAC 및 HVA의 농도는 전기화학적 검출과 함께 칼럼 액체 크로마토그래피에 의해 결정되었다 [110;111]. 펄스-없는 미소유량 펌프, 디개서 및 +0.45 V에서 작동하는 유리질-탄소 전극 대 Ag/AgCl 기준 전극이 구비된 전류측정 검출기를 포함하는 HPLC 시스템 (HTEC-500, Eicom Corp., Kyoto, Japan)이 이용되었다. 표본은 CMA/200 냉장된 마이크로샘플러 (CMA/Microdialysis, Stockholm, Sweden)의 이용에 의해 주입되었다. 크로마토그램은 컴퓨터화 자료 획득 시스템 (DataApex, Prague, Czech Republic)의 이용에 의해 기록되고 통합되었다. DA, DOPAC 및 HVA는 150 x 2.1 i.d. mm 칼럼 (CA5-ODS, Eicom Corp., Kyoto, Japan)에서 분리되었다. 이동상은 pH 6.0에서 0.1 M 인산염 완충액, 0.13 mM EDTA, 2.3 mM 나트륨-1-옥탄술폰산염 및 20 % (v/v) 메탄올로 구성되었다. DA에 대한 검출 한계 (신호 대 잡음 비율 = 3)는 칼럼 위에 주입된 15 μl에서 0.5 fmol (0.03 nM)인 것으로 추정되었다.
결과
세균 균주의 투여는 동물에 의해 충분히 내약성이었다. MPTP 손상 일자 및 필요하면 그 후에 당일에 적색광이 동물을 가온하는데 이용되었다. 만약 동물의 상태가 나쁘면 (한기를 느낌, 탈수, 이상 행동), 이들은 습성 사료 및 필요하면, 피하 식염수 치료가 공급되었다.
도파민, DOPAC 및 HVA 수준의 분석을 위해, 치료군마다 6마리 동물의 선조체 조직이 이용되었다. 데이터는 크러스칼 왈리스 검증, 그 이후에 듄의 다중 비교 사후 검증 또는 일원 분산 분석, 그 이후에 본페로니 사후 검증 (A 대 전체(*), B 대 전체, I 대 전체 (#))을 이용함으로써 분석되었다. */# = p<0.05; ** = p<0.01; *** = p<0.001.
군 A에서 건강한 동물은 높은 수준의 도파민, DOPAC 및 HVA를 가졌고, 반면 군 B에서 MPTP 처리는 이것을 감소시켰고, 그리고 양성 대조 (군 I)는 생산을 얼마간 회복하였다 (도 21). 군 I의 동물은 세균 치료군 및 군 B보다 더욱 높은 도파민 수준을 갖는 경향이 있었다 (도 21a). DOPAC (도파민 대사산물) 수준은 일반적으로, 군 A의 손상되지 않은 동물의 DOPAC 수준과 비교하여 군 B의 동물에서 훨씬 낮았다 (도 21b).
유의미하게는, MRx0029로 치료 (군 E)는 도파민 및 DOPAC의 생산을 회복시키는 것으로 밝혀졌다 (각각, 도 21a와 21b). MRx0029로 치료는 이런 이유로, 신경변성 장애를 치료하거나 예방하는데 유용할 수 있다.
실시예 12 - 안정성 검사
본원에서 설명된 최소한 하나의 세균 균주를 내포하는 본원에서 설명된 조성물은 25℃ 또는 4℃에서 밀봉된 용기에서 보관되고, 그리고 상기 용기는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 95% 상대 습도를 갖는 공기에서 배치된다. 1 개월, 2 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년, 1.5 년, 2 년, 2.5 년 또는 3 년 후, 세균 균주 중에서 최소한 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 표준 프로토콜에 의해 결정된 집락 형성 단위에서 계측될 때 남아있을 것이다.
실시예 13 - SHSY-5Y 세포에서 BDNF 분비의 수준
배경
뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF)는 신경 발달, 신경보호 및 신경재생과 연관된 뇌에서 편재성 분자이다. BDNF는 PD 또는 AD로 진단된 환자 사이에서 상당히 공통적인 신경변성뿐만 아니라 정신 장애, 예를 들면, 우울증 및 불안으로부터 보호한다.
방법
SH-SY5-SY는 24 웰 평판에서 60,000개 세포/웰의 밀도로 도말되고 인큐베이터에서 배치되었다. 24 시간 후, 배지는 분화 배지 (1% FBS를 내포하는 성장 배지) 및 10 μM 레티노산으로 교체되었다. 분화 배지는 2 일마다 교체되었고, 그리고 세포가 분화의 10 일자에서 이용되었다. 처리를 위해 분화 배지는 제거되고 450ul의 완전 성장 배지로 교체되었고, 그리고 50 μl의 세균 SN이 처리된 웰에 첨가되거나, 또는 YCFA+가 음성 대조로서 첨가되었다.
결과
결과는 도 18에서 도시되는데, 이것은 레티노산과 조합으로 MRX0029의 투여가 분화된 신경모세포종 세포로부터 BDNF의 분비를 증가시킨다는 것을 보여준다. 공생균 및 유기 산을 포함하는 조성물은 이런 이유로, 요법에서 유용할 수 있다.
실시예 14 - 대사산물 생산 - 뇌에서 대사산물
배경
세균 상층액 내에 존재하는 대사산물은 산화 스트레스에 대한 숙주 반응, 세포-대-세포 통신 및 신경보호에 직접적으로 영향을 줄 수 있다. 신경학적 과정에서 핵심적인 역할을 수행하는 대사산물이 MRx0005 및 MRx0029가 급이된 생쥐의 뇌 조직에서 탈체 선별검사 동안 계측되었다.
방법
동물
BALBc (Envigo, UK) 성체 수컷 생쥐는 12 시간 명암 주기 하에 집단 수용되었다; 표준 설치류 사료 및 물이 무제한으로 가용하였다. 모든 실험은 University College Cork Animal Ethics Experimentation Committee에 의한 승인 이후에 유럽 지침에 따라서 수행되었다. 동물은 실험의 시작 시점에서 8 주령이었다.
연구 설계
동물은 동물 단위 내로 도착 후 1 주 동안 그들의 홀딩 룸에 순치하도록 허용되었다. 이들은 6 연일 동안 15:00 및 17:00 사이에 1 X 109 CFU의 용량에서 살아있는 생체치료제의 경구 위관영양 (200μL 용량)을 제공받는다. 7 일자에서, 이들 동물은 머리가 제거되고, 그리고 실험을 위해 조직이 수확된다.
조직 수집
동물은 치료 및 검사 조건에 관하여 무작위 방식으로 희생되었다; 표본추출은 9.00 a.m. 및 1:00 p.m 사이에 일어났다. 체간 혈액이 칼륨 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 튜브에서 수집되고 4000 g에서 15 분 동안 회전되었다. 혈장이 단리되고 추가 분석을 위해 -80 ℃에서 보관되었다. 뇌가 빠르게 절제되고, 절개되고, 그리고 각 뇌 영역이 드라이아이스에서 즉시 동결되고 추가 분석을 위해 -80 ℃에서 보관되었다. 비장이 제거되고 탈체 면역 자극을 위해 도태 직후에 처리되었다. 장관 조직 (맹장에 가장 가까운 회장 및 결장의 2 cm 분절이 절제되었고, 그리고 맹장으로부터 가장 먼 1cm의 조직이 이용되었다)이 장관 투과성 검정을 위해 Ussing 챔버 내로 적재되었다. 맹장이 제거되고, 계량되고, 그리고 SCFAs 분석을 위해 -80 ℃에서 보관되었다.
모노아민 분석
신경전달물질 농도가 뇌간으로부터 표본에서 HPLC에 의해 분석되었다. 간단히 말하면, 뇌간 조직이 내부 표준으로서 4 ng/40 μl의 N-메틸 5-HT (Sigma Chemical Co., UK)로 스파이크된 500 μl의 냉각된 이동상에서 초음파처리되었다. 이동상은 0.1 M 구연산, 5.6 mM 옥탄-1-술폰산 (Sigma), 0.1 M 인산이수소나트륨, 0.01 mM EDTA (Alkem/Reagecon, Cork) 및 9% (v/v) 메탄올 (Alkem/Reagecon)을 내포하고, 그리고 4 N 수산화나트륨 (Alkem/Reagecon)을 이용하여 pH 2.8로 조정되었다. 균질액은 이후, 4 ℃에서 15 분 동안 22,000 x g로 원심분리되었고, 그리고 40 μl의 상층액이 SCL 10-Avp 시스템 제어장치, LECD 6A 전기화학적 검출기 (Shimadzu), LC-10AS 펌프, CTO-10A 오븐, SIL-10A 자기주입기 (표본 냉각기가 40 C에서 유지됨) 및 온라인 Gastorr 디개서 (ISS, UK)로 구성되는 HPLC 시스템 위에 주입되었다. 30 ℃에서 유지된 역상 칼럼 (Kinetex 2.6 u C18 100 x 4.6 mm, Phenomenex)이 분리 (유속 0.9 ml/분)에서 이용되었다. 유리질 탄소 작업 전극이 +0.8 V에서 작동된 Ag/AgCl 기준 전극 (Shimdazu)과 조합되었고, 그리고 산출된 크로마토그램이 Class-VP 5 소프트웨어 (Shimadzu)를 이용하여 분석되었다. 신경전달물질은 표본 분석 동안 규칙적인 간격에서 이행되는 표준 주입에 의해 결정될 때 그들의 특징적인 체류 시간에 의해 확인되었다. 피분석물 대 내부 표준의 피크 높이의 비율이 계측되고 표준 주입과 비교되었다. 결과는 조직의 생중량 g마다 ng의 신경전달물질로서 표현되었다.
대사산물 분석
GC-대사산물 분석을 위해, 세균 상층액의 표본이 [112]에서 설명된 프로토콜의 약간 변형된 버전을 이용하여 메틸 클로로포름산염으로 유도체화되었다. 모든 표본은 무작위화된 순서로 분석되었다. 분석은 사중극 검출기 (59977B, Agilent)와 연계된 GC (7890B, Agilent)를 이용하여 수행되었다. 상기 시스템은 ChemStation (Agilent)에 의해 제어되었다. 미가공 데이터는 Chemstation (Agilent)을 이용하여 netCDF 형식으로 전환되었고, 이후 상기 데이터는 [101]에서 설명된 PARADISe 소프트웨어를 이용하여 Matlab R2014b (Mathworks, Inc.)에서 이입되고 처리되었다.
지방산 분석을 위해 표본은 염산염 산 및 중수소 표지화된 내부 표준 (첨가되는 경우에)을 이용하여 산성화되었다. 모든 표본은 무작위화된 순서로 분석되었다. 분석은 사중극 검출기 (59977B, Agilent)와 연계된 GC (7890B, Agilent)에서 설치된 높은 극성 칼럼 (Zebron™ ZB-FFAP, GC Cap. 칼럼 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm)을 이용하여 수행되었다. 상기 시스템은 ChemStation (Agilent)에 의해 제어되었다. 미가공 데이터는 Chemstation (Agilent)을 이용하여 netCDF 형식으로 전환되었고, 이후 상기 데이터는 [101]에 의해 설명된 PARADISe 소프트웨어를 이용하여 Matlab R2014b (Mathworks, Inc.)에서 이입되고 처리되었다.
결과 - 신경전달물질 생산
결과는 도 19에서 도시되는데, 이것은 MRx0029가 급이된 생쥐의 뇌에서, 노르아드레날린 수준이 증가되고 (p=0.0507), 세로토닌 및 5-HIAA의 약간 증가가 동반된다는 것을 보여준다. 이들 데이터는 아래에 명시된 대사산물 분석을 뒷받침하고, MRx00029가 공지된 항산화제인 4-히드록시페닐아세트산의 주요 생산자라는 것을 암시한다 [113]. 더욱 중요하게는, 4-히드록시페닐아세트산은 도파민 및 노르에피네프린의 합성 중간체 및 중요한 생리활성 분자이다 [114]. 실제로, PD에서, 변성 변화는 도파민계 너머까지 미치고 세로토닌 시스템 및 노르아드레날린 시스템에 동등하게 영향을 주고, 이것은 차례로 선조체 및 외선조체 구조 둘 모두에서 감소된 수준의 세로토닌 (5-히드록시트립타민, 5-HT) 및 노르아드레날린 (노르에피네프린)을 야기한다 [115]. L-DOPA는 주로 PD의 도파민-관련된 특질을 표적으로 하지만, 이것은 5-HT 및 노르아드레날린 둘 모두에서 감소를 해소하지 못한다. 이것에 더하여, L-DOPA 치료의 지속 기간이 더욱 길수록, 다양한 운동 및 비운동 합병증 (가령, 이상운동증, 정신의학적 증상)이 더욱 가시적이다 [116]. 이런 이유로, 이들 데이터는 유기 산, 예를 들면, 4-히드록시페닐아세트산을 생산하는 세균이 요법에서, 특히 신경변성 질환의 치료에서 유용할 수 있다는 것을 증명한다.
결과 - 대사산물 생산
세균 상층액 내에 존재하는 대사산물은 특정한 조직에서 산화 스트레스에 대한 숙주 반응, 세포-대-세포 통신 및 신경보호에 직접적으로 영향을 줄 수 있다. MRX0029 및 MRX0005의 배양액의 상층액에서 대사산물이 분석되었고, 그리고 결과는 도 20에서 도시된다.
소수의 대사산물은 분석된 이들 2가지 균주 사이에 두드러진 차이를 보여주었다. 숙신산의 농도는 MRx0005에서 특히 상승되었다. 흥미롭게도, 4-히드록시페닐아세트산에 대한 표본/배지 비율은 MRx0029에서 훨씬 높았다 (도 20A).
상층액에서 지방산 분석은 이들 2가지 균주에서 흥미로운 양분을 드러냈다: MRx0005는 주로 아세트산 및 프로판산을 생산하였고, 반면 MRx0029는 부탄산, 펜탄산 및 헥산산 (선형 및 분지된 형태 둘 모두)을 생산하였다 (도 20B). 이들 2가지 균주는 매우 상이한 것처럼 보였고, 그리고 특히, MRx0005 및 MRx0029에 의한 숙신산 및 4-히드록시페닐아세트산의 생산은 각각 주목할 만하였다 (도 20A). 게다가, MRx0005는 더욱 많은 C2와 C3 짧은 사슬 지방산을 생산하는 것으로 보이고, 반면 MRx00029는 더욱 많은 C4 (부티르산염) 및 헥산산을 비롯한 선형 및 분지된 중간 사슬 지방산 둘 모두를 생산하였다.
숙신산은 산화 인산화에 관련된 Krebs 주기 대사산물이다. 산화성 인산화 복합체는 단백질 및 소포의 근위 및 원위 영역으로의 시냅스 트래피킹을 위한 핵심 단계이다 [117]. 이의 기능장애가 알츠하이머병, 파킨슨병 및 척수소뇌 실조증 유형 1을 비롯한 신경변성 장애에서 보고되었다 [63]. 이들 조사 결과는 특히 흥미로운데, 그 이유는 숙신산이 미토콘드리아 활성을 증강하고 PD를 비롯한, 오접힘된 단백질에 관련된 신경변성 질환에서 취약한 뉴런을 뒷받침할 수 있기 때문이다 [65]. BDNF 및 숙신산은 둘 모두, PD 또는 AD로 진단된 환자 사이에서 상당히 공통적인 신경변성에서뿐만 아니라 정신 장애, 예를 들면, 우울증 및 불안에서 유사한 보호 활성을 갖는다.
도 20B는 또한, MRX0029가 부티르산염 (부탄산) 생산자이라는 것을 증명한다. 이것은 유의미할 수 있는데, 그 이유는 부티르산염이 신경보호 효과를 갖는 혈액 뇌 장벽의 불투과성을 감소시키는데 있어서 역할을 갖기 때문이다 [118]. MRx0029 (및 다른 신경보호 세균)의 이러한 성질은 이의 효력에 기여할 수 있다.
실시예 15 - MRx0029에 의한 치밀 이음 단백질의 mRNA 발현의 조정
최근 증거가 장관 기능장애 및 염증이 PD와 연관된 비운동 증상이라는 것을 암시하기 때문에, 임의의 장관 장벽 기능장애를 유발하는 본 발명의 세균 균주의 능력이 조사되었다. HT29-mtx 상피, 점액소-생산 세포 단층 [119]이 MRx0005 및 MRx0029로 치료 이후에 소화관 장벽 붕괴 및 면역 자극을 평가하기 위한 시험관내 모형으로서 이용되었다. 포르볼 12-미리스트산염-13-아세트산염 (PMA)에 노출된 분화된 HT29-mtx 세포는 유의미한 양의 IL-8을 분비하였다; 대조적으로 MRx005 및 MRx0029 세균 상층액으로 24 시간 동안 처리는 처리되지 않은 세포 및 YCFA-처리된 세포 둘 모두와 비교하여 IL-8의 훨씬 낮은 분비를 유도하였다 (도 22a).
소화관 장벽 형성에 관련된 단백질의 발현 및 국부화에 관련된 세포내 신호 전달을 변경함으로써 상피 투과성을 조절하는 MRx0005 및 MRx0029의 능력이 이후 조사되었다.
RNA가 단리되었고, 그리고 MRx0005 및 MRx0029와 함께 배양 동안 치밀 이음 단백질의 유전자 발현에서 변화를 특징짓기 위해 정량적 RT-PCR (qRT-PCR) 분석이 수행되었다. MRx0029의 투여는 2 시간 배양 후 오클루딘, 빌린, 치밀 이음 단백질 1 및 2 (각각 TJP1 및 TJP2) mRNA 발현을 증강시켰다 (도 22b). 대조적으로, MRx0005에 노출은 치밀 이음 단백질의 유전자 발현을 변경하지 않았는데, 이것은 이들 2가지 균주가 장관 장벽에서 차별적으로 행동한다는 것을 지시한다.
이들 시험관내 결과는 MRx0005 및 MRx0029가 급이된 생쥐의 소화관에서 탈체 병렬 분석으로부터 데이터와 비교되었다. TJP2 및 오클루딘의 유전자 발현이 결장 및 회장에서 정량되었다. 탈체 데이터는 시험관내 데이터를 완벽하게 반영하는데, 그 이유는 MRx0029가 뮤린 장의 결장 영역에서 TJP1 및 오클루딘 (p=0.073)을 유의미하게 상향조절할 수 있었기 때문이다 (도 22c+22d). MRx0029는 또한, 동일한 생쥐의 결장에서 투과성 기능을 감소시킬 수 있었다 (도 22e+22f).
재료와 방법 - RNA 추출 및 qPCR 분석
전체 RNA가 제조업체의 사용설명서에 따라서 RNeasy 미니 키트 (Qiagen, Manchester, JUK)를 이용하여 추출되었고, 그리고 RNA 농도가 분광광도계 (nano-Drop ND-1000; Thermo Scientific, Wilmington, DE)를 이용하여 260/280nm에서 흡광도에 의해 결정되었다. mRNA 발현 분석을 위해, cDNA가 제조업체의 사용설명서에 따라서 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems, UK)를 이용하여 전체 RNA로부터 제조되었다. 역전사 반응은 10 분 동안 25℃, 120 분 동안 37℃ 및 5 분 동안 85℃, 4℃에서 유지에서 유전자증폭기 (Biometra, Germany)에서 수행되었다. 결과의 cDNA는 SYBR-Green PCR 검정에 의해 이중으로 증폭되었고, 그리고 산물은 프라이머에 따라서, 표준화된 프로필 (10 분 동안 95℃의 초기 변성, 그 이후에 95℃에서 15 초의 변성 및 60/65℃에서 60 초의 어닐링/연장의 40회 주기를 이용하여 QuantStudio 6 플렉스 실시간 PCR 기계 (Applied Biosystems, UK)에서 검출되었다. 용융 곡선을 산출하기 위해 40회 주기 후 해리 단계가 추가되었다. 분석은 Applied Biosystems QuantStudio 실시간 PCR 소프트웨어 v1.2를 이용하여 수행되었다. 액틴, 빌린, 오클루딘 TJP1 및 TJP2에 대한 프라이머 서열은 서열 목록에서 제공된다.
실시예 16
방법
동물
이용된 동물 및 연구 설계는 실시예 14에서와 동일하였다.
세균 균주
ㆍ 755: 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) (MRX005)
ㆍ 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) (MRX0029)
조직 수집
동물은 치료 및 검사 조건에 관하여 무작위 방식으로 희생되었다; 표본추출은 9.00 a.m. 및 2:30 p.m 사이에 일어났다. 체간 혈액이 칼륨 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 튜브에서 수집되고 4000 g에서 15 분 동안 회전되었다. 혈장이 단리되고 추가 분석을 위해 -80 ℃에서 보관되었다. 뇌가 빠르게 절제되고, 절개되고, 그리고 각 뇌 영역이 드라이아이스에서 즉시 동결되고 추가 분석을 위해 -80 ℃에서 보관되었다. 비장이 제거되고, 5 mL RPMI 배지 (L-글루타민 및 중탄산나트륨, R8758 Sigma + 10 % FBS (F7524, Sigma) + 1% Pen/Strep (P4333, Sigma) 포함)에서 수집되고, 탈체 면역 자극을 위해 도태 직후에 처리되었다. 장관 조직 (맹장에 가장 가까운 회장 및 결장의 2 3cm 분절이 절제되었고, 그리고 맹장으로부터 가장 먼 1cm 2cm의 조직이 이용되었다)이 장관 투과성 검정을 위해 Ussing 챔버 내로 적재되었다. 맹장이 제거되고, 계량되고, 그리고 SCFAs 분석을 위해 -80 ℃에서 보관되었다.
모노아민 분석
신경전달물질 농도는 실시예 10에서 설명된 바와 같이 분석되었다
비장 사이토킨 검정
비장이 희생 이후에 5mL RPMI 배지에서 즉시 수집되고 즉시 배양되었다. 비장세포는 먼저, 이러한 RPMI 배지에서 균질화되고, 그 이후에 1ml의 RBC 용해 완충액 (11814389001 ROCHE, Sigma)과 함께 5 분간 배양되었다. 추가 10 ml의 RPMI 배지가 첨가되고, 그 이후에 5 분 동안 200G 원심분리가 뒤따랐다. 상층액이 이후, 40um 여과기를 통해 여과되었다. 세포는 계수되고 파종되었다 (4,000,000/mL 배지). 2.5 시간의 적응 후, 세포는 24 시간 동안 지질다당류 (LPS-2 μg/ml) 또는 콘카나발린 A (ConA-2.5 μg/ml)로 자극되었다. 자극 이후에, 친염증성 패널 1 (생쥐) V-PLEX 키트 (Meso Scale Discovery, Maryland, USA)를 이용하여 TNFα, IL-10, IL-1β, 인터페론 γ, CXCL2 및 IL6에 대한 사이토킨 방출을 사정하기 위해 상층액이 수확되었다. 이들 분석은 MESO QuickPlex SQ 120, SECTOR 영상장치 2400, SECTOR 영상장치 6000, SECTOR S 600을 이용하여 수행되었다.
유전자 발현 분석
전체 RNA가 제조업체 권고에 따라서 mirVana™ miRNA 단리 키트 (Ambion/Llife technologies, Paisley, UK) 및 처리된 DNA분해효소 (Turbo DNA-없는, Ambion/life technologies)를 이용하여 추출되었다. RNA가 제조업체의 사용설명서에 따라서 NanoDrop™ 분광광도계 (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, Delaware, USA)를 이용하여 정량되었다. RNA 품질이 제조업체의 절차에 따라서 Agilent 바이오분석기 (Agilent, Stockport, UK)를 이용하여 사정되었고, 그리고 RNA 무결성 숫자 (RIN)가 계산되었다. RIN 값 >7을 갖는 RNA가 차후 실험에 이용되었다. RNA는 제조업체의 사용설명서에 따라서 Applied Biosystems 높은 수용력 cDNA 키트 (Applied Biosystems, Warrington, UK)를 이용하여 cDNA로 역전사되었다. 간단히 말하면, Multiscribe 역전사효소 (50 U/μL) (1)(2)(1)(10)가 RT 마스터 믹스의 일부로서 첨가되고, 25℃에서 10 분 동안, 37℃에서 2 시간 동안, 85℃에서 5 분 동안 배양되고, 그리고 4℃에서 보관되었다. β-액틴을 내인성 대조로서 이용하면서, 생쥐 특이적인 표적화된 유전자에 대해 Applied Biosystems에 의해 설계된 프로브 (6 카르복시 플루오레세인 - FAM)를 이용하여 정량적 PCR이 실행되었다. 증폭 반응물은 1 μl cDNA, 5 μl의 2X PCR 마스터 믹스 (Roche), 900 nM의 각 프라이머를 내포하고, 그리고 RNA분해효소-없는 물의 첨가에 의해 총 10 μl가 되었다. 모든 반응은 LightCycler®480 시스템에서 96-웰 평판을 이용하여 삼중으로 수행되었다. 열 주기 조건은 55회 주기 동안 제조업체 (Roche)에 의해 권장된 바와 같았다. 앰플리콘 오염을 점검하기 위해, 각 실행은 이용된 각 프로브에 대해 삼중으로 주형 없음 대조를 내포하였다. 주기 역치 (Ct) 값이 기록되었다. 데이터는 β-액틴을 이용하여 정규화되고, 2-△△CT 방법을 이용하여 변환되고, 그리고 대조 군과 대비하여 배수 변화로서 제시되었다.
맹장 내용물에서 짧은 사슬 지방산 분석
맹장 내용물은 혼합되고, MilliQ 물과 함께 와동되고, 실온에서 10 분 동안 배양되었다. 상층액이 세균 및 다른 고체를 펠렛팅하기 위한 원심분리 (10000 g, 5 분, 4 ℃) 및 0.2μm에 의한 여과에 의해 획득되었다. 이것은 투명한 GC 바이알로 이전되었고, 그리고 2-에틸부티르산 (Sigma)이 내부 표준으로서 이용되었다. SCFA의 농도는 ZB-FFAP 칼럼 (30 m x 0.32 mm x 0.25 mm; Phenomenex)이 구비된 Varian 3500 GC 불꽃-이온화 시스템을 이용하여 분석되었다. 표준 곡선이 아세트산염, 프로피온산염, 이소-부티르산염, n-부티르산염, 이소발레르산염 및 발레르산염을 내포하는 상이한 농도의 표준 혼합물 (Sigma)로 구축되었다. 피크는 Varian Star 크로마토그래피 워크스테이션 버전 6.0 소프트웨어를 이용함으로써 통합되었다. 모든 SCFA 데이터는 μmol/g로서 표현된다.
통계학적 분석
정규적으로 분포된 데이터는 평균 ± SEM으로서 제시된다; 비파라미터 데이터세트는 사분위수간 범위를 갖는 중간값으로서 제시된다. 비대칭 양측 t 검증이 파라미터 데이터를 분석하는데 적용되었고, 그리고 만 휘트니 검증이 비파라미터에 이용되었다. 스피어먼의 순위 상관 계수가 모아진 데이터세트에서 상관 분석에 이용되었다. p 값 < 0.05는 모든 사례에서 유의미한 것으로 간주되었다.
결과 - 신경전달물질 생산
도 23에서 결과는 생쥐의 뇌에서 신경전달물질의 농도에 대한 MRx005 치료의 효과를 보여준다. 특히, MRx005로 치료는 도파민에서 감소를 야기한다.
결과 - 유전자 발현
신경전달물질 수용체 [세로토닌 수용체 1a(5-HTR1a), 도파민 D1 수용체, GABA 수용체 아단위 B1, GABAA 수용체, NMDA2A (Grin2A) 및 NMDA2B (Grin2b) 수용체], 염증성 마커 [IL-1β, IL6, CD11b, TNFα 및 TLR4], 그리고 내분비 마커 [코르티코스테론 방출 인자 (CRF), 코르티코스테론 방출 인자 수용체 1과 2 (CRFR1, CRFR2), 뇌-유래된 뉴로트로핀 인자 (BDNF), 바소프레신 수용체, 옥시토신 수용체, 글루코코르티코이드 수용체 및 광물코르티코이드 수용체]에 대한 유전자의 발현이 해마, 편도 및 전전두엽 피질로부터 뇌 조직에서 분석되었다.
도 24-38은 해마, 편도 및 전전두엽 피질에서 MRX005 또는 MRX0029 치료 후 유전자 발현에서 변화를 보여준다. MRx0029로 치료는 편도에서 글루코코르티코이드 수용체 발현에서 증가를 야기하였다 (도 31C). 도 32A는 MRx005는 편도에서 BDNF의 발현을 유의미하게 증가시킨 반면, MRx0029로 치료는 편도에서 TLR4의 발현을 유의미하게 증가시켰다는 것을 보여준다 (도 32).
MRx005 및 MRx0029 둘 모두 편도에서 CD11b의 발현을 증가시킬 수 있고 (도 33A), 반면 IL-6, Grin2a 및 Grin2b의 발현은 MRx005 치료 후 감소된다 (도 33B-D). 이에 더하여, MRx005 및 MRx0029는 GABRA2의 발현을 유의미하게 증가시켰고, 그리고 편도에서 GABBR1의 발현을 증가시켰다.
MRx005로 치료는 전전두엽 피질에서 BDNF의 발현에서 유의미한 증가를 야기하였다 (도 35B).
논의
MRx005 및 MRx0029 투여는 특히, 편도에서 유전자 발현에서 변화를 유발하였다.
결과 - Tph1 및 IDO-1 발현에 대한 효과
도 39는 MRx0029가 결장에서 트립토판 수산화효소- 1 (Tph1)의 발현을 유의미하게 증가시킬 수 있고, 그리고 MRX005 치료가 결장에서 IDO-1 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다. MRX005로 치료는 회장에서 Tph1 및 IDO1의 발현을 증가시켰다 (도 40).
인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제-1 (IDO-1)는 트립토판/키뉴레닌 경로에서 첫 번째 및 속도 제한 효소이고, 반면 효소 트립토판 수산화효소의 동종형인 트립토판 수산화효소 1 (Tph1)은 세로토닌의 합성에 대한 책임이 있다. 이들 데이터는 MRx0029 및 MRx005가 세로토닌 수준 및 트립토판/키뉴레닌 경로에 영향을 줄 수 있다는 것을 암시한다.
결과 - 트립토판 대사산물 수준에 대한 효과
도 41은 순환하는 키뉴레닌 및 트립토판의 수준에 대한 MRx005로 치료 효과를 보여준다.
결과 - 비장세포로부터 사이토킨 발현에 대한 효과
탈체 비장세포 검정은 비장세포 (비장 - 면역 방어에 관련된 주요 장기로부터 단리된 세포)를 세균- 또는 바이러스-모방체로 공격 접종하는 것을 수반한다.
MRX005는 LPS로 공격 접종 이후에 비장세포에서 인터페론-γ의 수준을 유의미하게 감소시켰다 (도 42). 이에 더하여, MRX005는 LPS로 공격 접종 후 인터류킨-6 및 종양 괴사 인자의 수준을 감소시켰다 (각각, 도 44와 45). MRx0029로 치료는 LPS로 공격 접종 이후에 인터페론-γ, 인터류킨-1β 및 인터류킨-6에서 감소를 야기하였다 (각각, 도 42, 43 및 44).
MRx005 및 MRx0029로 치료는 화학유인물질 CXCL1의 수준에서 증가를 야기하였다 (도 47).
결과 - 맹장 짧은 사슬 지방산 수준에 대한 효과
짧은 사슬 지방산 (SCFAs)은 식이로부터 비소화성 섬유소가 소화관 내에 세균에 의해 발효될 때 생산된다. MRX005 투여의 효과는 도 48에서 도시된다.
실시예 17- 유전자 발현 수준에서 MRX029 및 MRX005-유도된 변화의 추가 분석
방법
세포주
SH-SY5Y 세포
세균 균주
ㆍ 755: 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) (MRX005)
ㆍ 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) (MRX0029)
qPCR
SHSY5Y는 10cm 페트리 접시에서 2x106개 세포의 밀도로 도말되었다. 24 시간 후, 세포는 10% 세균 상층액 또는 YCFA+, 10uM RA, 200uM 헥산산 또는 200uM 발프로산을 포함하는 분화 배지 (RA 없이 1% FBS를 내포하는 성장 배지)에서 17 시간 동안 처리되었다. 그 이후, 대표적인 이미지가 40X/0.65 배율에서 위상차 EVOS XL 코어 현미경을 이용하여 촬영되었다. 세포는 수집되었고, 그리고 전체 RNA가 RNeasy 미니 키트 프로토콜 (Qiagen)에 따라서 단리되었다. cDNAs는 높은 수용력 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 이용하여 만들어졌다. 유전자 발현은 qPCR을 이용하여 계측되었다. GAPDH가 내부 대조로서 이용되었다. 배수 변화는 2(-△△ct) 방법에 따라서 계산되었다. MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PINK1, PARK7 및 NSE에 대한 프라이머 서열은 서열 목록에서 제공된다.
면역표지화 및 세포 영상화
세포는 8-웰 챔버 슬라이드 (Marienfeld Laboratory Glassware) 위에 하룻밤 동안 5x104개 세포/웰로 파종되고, 그리고 24 시간 동안 10% 세균 상층액으로 처리되었다. 분화를 위해, 세포는 24 시간 동안 무세포 세균 상층액으로 처리하기 전 5 일 동안 10 nM RA로 처리되었다. 세포는 이후, 실온 (RT)에서 20 분 동안 PBS에서 4% 파라포름알데히드로 고정되었다. 고정된 세포는 PBS로 세척되고, 그리고 10 분 동안 PBS에서 1% Triton X-100으로 투과화되었다. PBS로 세척한 후, 슬라이드는 4℃에서 12 시간 동안 1% BSA/PBS에서 희석된 항-MAP2 항체 또는 β3-튜불린 (각각 sc-74421 및 sc-80005, Santa Cruz Biotechnology Inc)을 첨가하기 전, 실온에서 1 시간 동안 차단 완충액 (4% BSA/PBS)과 함께 배양되었다. 이들은 이후, PBS로 2회 세척되고, 그 이후에 실온에서 1 시간 동안 Alexa Flour 488 접합된 항생쥐 (Molecular Probes Inc) 및 Alexa Flour 594 접합된 팔로이딘 (ab176757, Abcam)과 함께 배양되었다. PBS로 3X 세척한 후, 슬라이드는 DAPI로 염색되고 Vectashield® (Vector laboratories)가 적재되었다. 슬라이드는 이용된 플루오로크롬의 검출에 적합한 63x/1.2 W Korr 대물렌즈 및 필터 세트가 구비된 Axioskop 50 현미경 (Zeiss)을 이용하여 개관되었다. MAP-2로 면역표지화된 이미지의 디지털 획득을 위한 수동 노출 시간은 일정하게 유지되어 상이한 웰 및 처리 사이에 비교를 허용하였다. 팔로이딘 (F-액틴) 및 DAPI 노출 시간은 시계에 알맞도록 변하였다. 무작위화된 시계는 Image Pro Plus 소프트웨어에 의해 제어되는 QImaging 카메라를 이용하여 획득되었다. 이미지는 TIFF 파일로서 저장되고 Adobe Photoshop CC 2015.1.2에서 열렸다. MAP-2, DAPI 및 팔로이딘 이미지의 이미지는 덧씌워지고 병합되었다. 대표적인 이미지는 조사된 단백질의 존재비 및 위치에서 차이를 도해하도록 선별되었다.
면역블롯팅
SH-SY5Y 세포는 전술된 지시된 조건 하에 배양되고, MRx0005 및 MRx0029로 24 시간 동안 처리되고, 그리고 이후, 프로테아제 저해제의 칵테일을 내포하는 RIPA 완충액 (Roche Diagnostics, UK)에서 용해되었다. 단백질 농도는 BCA 단백질 검정 키트 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 이용하여 추정되고, SDS-PAGE에 의해 분리되고, PVDF 막으로 이전되었다. 막은 이후, 5% 탈지분유 또는 5% BSA로 차단되고, 그리고 4℃에서 하룻밤 동안 일차 항체 (각각 MAP2 및 β3-튜불린)와 함께 배양되었다. 블롯은 이후, 온당한 양고추냉이 과산화효소 (HRP)-접합된 이차 항체와 함께 배양되었고, 그리고 단백질이 화학발광 검출 키트 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)에 의해 검출되었다. MAP2 및 β3-튜불린 둘 모두의 경우에, β-액틴은 표본 사이에서 단백질 부하 가변성을 모니터링하기 위한 대조로서 역할을 하였다.
결과 및 논의
유전자 발현
도 7a (그래프 삽입물) 및 49는 액틴, 빌린, 오클루딘 TJP1, TJP2, MAP2, DRD2, GABRB3, SYP, PINK1, PARK7 및 NSE의 발현 수준에서 MRx0029 및 MRX005-유도된 변화를 보여준다.
현미경검사 및 면역블롯팅
도 50은 공초점 현미경검사에 의해 결정될 때 SHSY5Y 세포에서 MAP2의 발현 수준에서 변화를 보여준다. MAP2 및 B3-튜불린의 발현 수준은 또한, 면역블롯 분석에 의해 정량되었다. 도 50M과 50N에서 도시된 결과는 MRX029가 MAP2의 발현 수준에서 증가를 유도한다는 것을 지시한다.
서열
서열 번호: 1 (16S 리보솜 RNA에 대한 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 유전자, 부분적인 서열, 균주: NP3 - JX424772.1)
1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac
61 gagaagagat gagaagcttg cttcttatca attcgagtgg caaacgggtg agtaacgcgt
121 aagcaacctg cccttcagat ggggacaaca gctggaaacg gctgctaata ccgaatacgt
181 tctttccgcc gcatgacggg aagaagaaag ggaggccttc gggctttcgc tggaggaggg
241 gcttgcgtct gattagctag ttggaggggt aacggcccac caaggcgacg atcagtagcc
301 ggtctgagag gatgaacggc cacattggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg
361 cagcagtggg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgaacga
421 tgacggcctt cgggttgtaa agttctgtta tatgggacga acagggcatc ggttaatacc
481 cggtgtcttt gacggtaccg taagagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg
541 taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggcgc gcaggcggca
601 tcgcaagtcg gtcttaaaag tgcggggctt aaccccgtga ggggaccgaa actgtgaagc
661 tcgagtgtcg gagaggaaag cggaattcct agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg
721 aggaacacca gtggcgaaag cggctttctg gacgacaact gacgctgagg cgcgaaagcc
781 aggggagcaa acgggattag ataccccggt agtcctggcc gtaaacgatg gatactaggt
841 gtaggaggta tcgactcctt ctgtgccgga gttaacgcaa taagtatccc gcctggggag
901 tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagtat
961 gtggtttaat tcgacgcaac gcgaagaacc ttaccaagcc ttgacattga ttgctacgga
1021 aagagatttc cggttcttct tcggaagaca agaaaacagg tggtgcacgg ctgtcgtcag
1081 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccctat cttctgttgc
1141 cagcacctcg ggtggggact cagaagagac tgccgcagac aatgcggagg aaggcgggga
1201 tgacgtcaag tcatcatgcc ccttatggct tgggctacac acgtactaca atggctctta
1261 atagagggac gcgaaggagc gatccggagc aaaccccaaa aacagagtcc cagttcggat
1321 tgcaggctgc aactcgcctg catgaagcag gaatcgctag taatcgcagg tcagcatact
1381 gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgaa agtcattcac
1441 acccgaagcc ggtgaggcaa ccgcaaggaa ccagccgtcg aaggtggggg cgatgattgg
1501 ggtgaagtcg taacaaggt
서열 번호: 2 (메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 균주 MRX0029에 대한 공통 16S rRNA 서열)
TGAGAAGCTTGCTTCTTATCGATTCTAGTGGCAAACGGGTGAGTAACGCGTAAGCAACCTGCCCTTCAGATGGGGACAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGAATACGTTCTTTCCGCCGCATGACGGGAAGAAGAAAGGGAGGCCTTCGGGCTTTCGCTGGAGGAGGGGCTTGCGTCTGATTAGCTAGTTGGAGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTAGCCGGTCTGAGAGGATGAACGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCTGTTATATGGGACGAACAGGACATCGGTTAATACCCGGTGTCTTTGACGGTACCGTAAGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGCAGGCGGCATCGCAAGTCGGTCTTAAAAGTGCGGGGCTTAACCCCGTGAGGGGACCGAAACTGTGAAGCTCGAGTGTCGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTTTCTGGACGACAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCCAGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCTGGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGAGGTATCGACTCCTTCTGTGCCGGAGTTAACGCAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGCCTTGACATTGATTGCTACGGAAAGAGATTTCCGGTTCTTCTTCGGAAGACAAGAAAACAGGTGGTGCACGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTCTGTTGCCAGCACCTCGGGTGGGGACTCAGAAGAGACTGCCGCAGACAATGCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGGCTTGGGCTACACACGTACTACAATGGCTCTTAATAGAGGGAAGCGAAGGAGCGATCCGGAGCAAACCCCAAAAACAGAGTCCCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCAGGAATCGCTAGTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAAAGTCATTCACACCCGAAGCCGGTGAGGCAACCGCAAG
qPCR에 이용된 프라이머 (서열 번호는 괄호 안에 있음)
Figure pct00004
서열 번호: 17 (파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) 균주 MRX0005에 대한 공통 16S rRNA 서열)
AMCCGGGTGGCGACCGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTATGCAACTTGCCTATCAGAGGGGGATAACCCGGCGAAAGTCGGACTAATACCGCATGAAGCAGGGATCCCGCATGGGAATATTTGCTAAAGATTCATCGCTGATAGATAGGCATGCGTTCCATTAGGCAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAACCGACGATGGATAGGGGTTCTGAGAGGAAGGTCCCCCACATTGGTACTGAGACACGGACCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGGCGTGAGCCTGAACCAGCCAAGTCGCGTGAGGGATGAAGGTTCTATGGATCGTAAACCTCTTTTATAAGGGAATAAAGTGCGGGACGTGTCCCGTTTTGTATGTACCTTATGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGCCTTTTAAGTCAGCGGTGAAAGTCTGTGGCTCAACCATAGAATTGCCGTTGAAACTGGGAGGCTTGAGTATGTTTGAGGCAGGCGGAATGCGTGGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATCACGCAGAACCCCGATTGCGAAGGCAGCCTGCCAAGCCATTACTGACGCTGATGCACGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCAGTAAACGATGATCACTAGCTGTTTGCGATACACTGTAAGCGGCACAGCGAAAGCGTTAAGTGATCCACCTGGGGAGTACGCCGGCAACGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAACATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGTTTGAACGCATTCGGACMGAKGTGGAAACACATTTTCTAGCAATAGCCATTTGCGAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCGGCTTAAGTGCCATAACGAGCGCAACCCTTGCCACTAGTTACTAACAGGTAAAGCTGAGGACTCTGGTGGGACTGCCAGCGTAAGCTGCGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCAGCACGGCCCTTACATCCGGGGCGACACACGTGTTACAATGGCGTGGACAAAGGGAAGCCACCTGGCGACAGGGAGCGAATCCCCAAACCACGTCTCAGTTCGGATCGGAGTCTGCAACCCGACTCCGTGAAGCTGGATTCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGGAGCCGGGGGTACCTGAAGTCCGTAACCGCGAGGATCGGCCTAGGGTAAAACTGGTGACTGGGGCTAAGTCGTACGGGG
탈체 qPCR에 이용된 프라이머 및 프로브 (서열 번호는 괄호 안에 있음)
탈체 :
Figure pct00005
qPCR에서 이용된 추가 프라이머 (서열 번호는 괄호 안에 있음)
Figure pct00006
참고문헌
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> 4D PHARMA RESEARCH LIMITED <120> COMPOSITIONS COMPRISING BACTERIAL STRAINS <130> P072872 <141> 2018-06-13 <150> 1805991.5 <151> 2018-04-11 <150> 1805990.7 <151> 2018-04-11 <150> 1805989.9 <151> 2018-04-11 <150> 1806780.1 <151> 2018-04-25 <150> 1806779.3 <151> 2018-04-25 <160> 37 <170> SeqWin2010, version 1.0 <210> 1 <211> 1519 <212> DNA <213> Megasphaera massiliensis strain NP3 <400> 1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60 gagaagagat gagaagcttg cttcttatca attcgagtgg caaacgggtg agtaacgcgt 120 aagcaacctg cccttcagat ggggacaaca gctggaaacg gctgctaata ccgaatacgt 180 tctttccgcc gcatgacggg aagaagaaag ggaggccttc gggctttcgc tggaggaggg 240 gcttgcgtct gattagctag ttggaggggt aacggcccac caaggcgacg atcagtagcc 300 ggtctgagag gatgaacggc cacattggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 360 cagcagtggg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgaacga 420 tgacggcctt cgggttgtaa agttctgtta tatgggacga acagggcatc ggttaatacc 480 cggtgtcttt gacggtaccg taagagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 540 taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggcgc gcaggcggca 600 tcgcaagtcg gtcttaaaag tgcggggctt aaccccgtga ggggaccgaa actgtgaagc 660 tcgagtgtcg gagaggaaag cggaattcct agtgtagcgg tgaaatgcgt agatattagg 720 aggaacacca gtggcgaaag cggctttctg gacgacaact gacgctgagg cgcgaaagcc 780 aggggagcaa acgggattag ataccccggt agtcctggcc gtaaacgatg gatactaggt 840 gtaggaggta tcgactcctt ctgtgccgga gttaacgcaa taagtatccc gcctggggag 900 tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagtat 960 gtggtttaat tcgacgcaac gcgaagaacc ttaccaagcc ttgacattga ttgctacgga 1020 aagagatttc cggttcttct tcggaagaca agaaaacagg tggtgcacgg ctgtcgtcag 1080 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccctat cttctgttgc 1140 cagcacctcg ggtggggact cagaagagac tgccgcagac aatgcggagg aaggcgggga 1200 tgacgtcaag tcatcatgcc ccttatggct tgggctacac acgtactaca atggctctta 1260 atagagggac gcgaaggagc gatccggagc aaaccccaaa aacagagtcc cagttcggat 1320 tgcaggctgc aactcgcctg catgaagcag gaatcgctag taatcgcagg tcagcatact 1380 gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgaa agtcattcac 1440 acccgaagcc ggtgaggcaa ccgcaaggaa ccagccgtcg aaggtggggg cgatgattgg 1500 ggtgaagtcg taacaaggt 1519 <210> 2 <211> 1398 <212> DNA <213> Megasphaera massiliensis strain MRX0029 <400> 2 tgagaagctt gcttcttatc gattctagtg gcaaacgggt gagtaacgcg taagcaacct 60 gcccttcaga tggggacaac agctggaaac ggctgctaat accgaatacg ttctttccgc 120 cgcatgacgg gaagaagaaa gggaggcctt cgggctttcg ctggaggagg ggcttgcgtc 180 tgattagcta gttggagggg taacggccca ccaaggcgac gatcagtagc cggtctgaga 240 ggatgaacgg ccacattggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300 ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgaacg atgacggcct 360 tcgggttgta aagttctgtt atatgggacg aacaggacat cggttaatac ccggtgtctt 420 tgacggtacc gtaagagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 480 ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggcg cgcaggcggc atcgcaagtc 540 ggtcttaaaa gtgcggggct taaccccgtg aggggaccga aactgtgaag ctcgagtgtc 600 ggagaggaaa gcggaattcc tagtgtagcg gtgaaatgcg tagatattag gaggaacacc 660 agtggcgaaa gcggctttct ggacgacaac tgacgctgag gcgcgaaagc caggggagca 720 aacgggatta gataccccgg tagtcctggc cgtaaacgat ggatactagg tgtaggaggt 780 atcgactcct tctgtgccgg agttaacgca ataagtatcc cgcctgggga gtacggccgc 840 aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagta tgtggtttaa 900 ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagc cttgacattg attgctacgg aaagagattt 960 ccggttcttc ttcggaagac aagaaaacag gtggtgcacg gctgtcgtca gctcgtgtcg 1020 tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tcttctgttg ccagcacctc 1080 gggtggggac tcagaagaga ctgccgcaga caatgcggag gaaggcgggg atgacgtcaa 1140 gtcatcatgc cccttatggc ttgggctaca cacgtactac aatggctctt aatagaggga 1200 agcgaaggag cgatccggag caaaccccaa aaacagagtc ccagttcgga ttgcaggctg 1260 caactcgcct gcatgaagca ggaatcgcta gtaatcgcag gtcagcatac tgcggtgaat 1320 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga aagtcattca cacccgaagc 1380 cggtgaggca accgcaag 1398 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 3 gatcaagatc attgctcctc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 4 ttgtcaagaa agggtgtaac 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 5 ggtatcgtgg aaggactcat g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 6 atgccagtga gcttcccgtt c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 7 ctcagcaccg ctaacagagg 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 8 cattggcgct tctctcctc 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 9 aagaggaatt ttgacactgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 10 gccatgtact cttcactttc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 11 aagtcacact ggtgaaatcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 12 ctcttgctgc caaactatct 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 13 ccctcccctg gatcaggat 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 14 gccatcaaac tcgtccatca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 15 cattacctgc tctacgtttg 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 16 agatggacat aagatgaggt g 21 <210> 17 <211> 1403 <212> DNA <213> Parabacteroides distasonis strain MRX0005 <400> 17 amccgggtgg cgaccggcgc acgggtgagt aacgcgtatg caacttgcct atcagagggg 60 gataacccgg cgaaagtcgg actaataccg catgaagcag ggatcccgca tgggaatatt 120 tgctaaagat tcatcgctga tagataggca tgcgttccat taggcagttg gcggggtaac 180 ggcccaccaa accgacgatg gataggggtt ctgagaggaa ggtcccccac attggtactg 240 agacacggac caaactccta cgggaggcag cagtgaggaa tattggtcaa tgggcgtgag 300 cctgaaccag ccaagtcgcg tgagggatga aggttctatg gatcgtaaac ctcttttata 360 agggaataaa gtgcgggacg tgtcccgttt tgtatgtacc ttatgaataa ggatcggcta 420 actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga ggatccgagc gttatccgga tttattgggt 480 ttaaagggtg cgtaggcggc cttttaagtc agcggtgaaa gtctgtggct caaccataga 540 attgccgttg aaactgggag gcttgagtat gtttgaggca ggcggaatgc gtggtgtagc 600 ggtgaaatgc atagatatca cgcagaaccc cgattgcgaa ggcagcctgc caagccatta 660 ctgacgctga tgcacgaaag cgtggggatc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 720 cagtaaacga tgatcactag ctgtttgcga tacactgtaa gcggcacagc gaaagcgtta 780 agtgatccac ctggggagta cgccggcaac ggtgaaactc aaaggaattg acgggggccc 840 gcacaagcgg aggaacatgt ggtttaattc gatgatacgc gaggaacctt acccgggttt 900 gaacgcattc ggacmgakgt ggaaacacat tttctagcaa tagccatttg cgaggtgctg 960 catggttgtc gtcagctcgt gccgtgaggt gtcggcttaa gtgccataac gagcgcaacc 1020 cttgccacta gttactaaca ggtaaagctg aggactctgg tgggactgcc agcgtaagct 1080 gcgaggaagg cggggatgac gtcaaatcag cacggccctt acatccgggg cgacacacgt 1140 gttacaatgg cgtggacaaa gggaagccac ctggcgacag ggagcgaatc cccaaaccac 1200 gtctcagttc ggatcggagt ctgcaacccg actccgtgaa gctggattcg ctagtaatcg 1260 cgcatcagcc atggcgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcaagcc 1320 atgggagccg ggggtacctg aagtccgtaa ccgcgaggat cggcctaggg taaaactggt 1380 gactggggct aagtcgtacg ggg 1403 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 18 gattactgct ctggctccta g 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 19 gactcatcgt actcctgctt g 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 20 ctggcctcac tgtccacctt cc 22 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 21 aatggtgaag gtcggtgtg 19 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 22 gtggagtcat actggaacat gtag 24 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 23 tgcaaatggc agccctggtg 20 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 24 gctgccttga tgtttacttt gac 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 25 gcaaccgaag tatgaaataa cca 23 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 26 accaggtgag aagagtgatg accatcc 27 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> <400> 37 ggcttcatgg catcaacttc a 21

Claims (74)

  1. 하기를 포함하는 조성물:
    (i) 공생 세균 균주, 그리고
    (ii) 하기 화학식을 갖는 한 가지 또는 그 이상의 유기 산:
    Rn-COOH; 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르.
  2. 청구항 1에 있어서, Rn은 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 아릴 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, Rn은 선형, 분지된, 환상, 부분적으로 환상 또는 방향족 탄화수소인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, Rn은 최소한 5개의 탄소 원자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, Rn은 5 내지 20개 범위의 탄소를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, Rn은 R1이고, 그리고 R1은 5개의 탄소를 포함하는 알킬 기인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, Rn은 R1이고, 그리고 R1은 알킬이고 5개의 탄소 원자로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 한 가지 또는 그 이상의 유기 산은 헥산산 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, Rn은 R2이고, 그리고 R2는 페닐 기를 포함하는 아릴 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 페닐 기는 히드록실 치환체를 포함하고, 여기서 임의선택적으로 상기 히드록실 기는 위치 4에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 한 가지 또는 그 이상의 유기 산은 4-히드록시페닐아세트산을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, Rn은 R3이고, 그리고 R3은 분지된 알킬 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, Rn은 R3이고, 그리고 R3은 최소한 5개의 탄소 원자를 포함하고, 여기서 임의선택적으로 R3은 5 내지 9개 범위의 탄소 원자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 청구항 12 내지 13 중에서 어느 한 항에 있어서, R3은 부틸 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 청구항 12 내지 14 중에서 어느 한 항에 있어서, R3은 프로필 기를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 한 가지 또는 그 이상의 유기 산은 발프로산 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, Rn은 R4이고, 그리고 R4는 부분적으로 환상 알케닐 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서, R4는 14 내지 21개 범위의 탄소를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 청구항 17 내지 18 중에서 어느 한 항에 있어서, R4는 1 내지 8개 범위의 치환체 메틸 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 청구항 17 내지 19 중에서 어느 한 항에 있어서, R4는 1 내지 8개 범위의 탄소-대-탄소 이중 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 한 가지 또는 그 이상의 유기 산은 레티노산 또는 이의 유도체, 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, Rn은 R5이고, 그리고 R5는 4개의 탄소 원자를 포함하는 알킬 기인 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, Rn은 R5이고, 그리고 R5는 4개의 탄소 원자로 구성되는 알킬 기인 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 한 가지 또는 그 이상의 유기 산은 발레르산, 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 하기와 같이 구성되는 목록에서 선택되는 한 가지 또는 그 이상의 생리학적 기능을 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물: 신경돌기 생장, 신경회복, 신경보호의 증진, 히스톤 탈아세틸화의 저해, BDNF 활성화의 증가, 인돌 생산의 증가, IL-6 활성화의 감소 및 IL-8 활성화의 증가.
  26. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 공생 세균 균주는 짧은 사슬 지방산을 생산하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 청구항 26에 있어서, 짧은 사슬 지방산은 부티르산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 공생 세균 균주는 숙신산을 생산하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 공생 세균 균주는 박테로이데스 (Bacteroides), 엔테로코쿠스 (Enterococcus), 에스케리키아 (Escherichia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 락토바실루스 (Lactobacillus), 메가스파에라 (Megasphaera), 클로스트리듐 (Clostridium), 프로테우스 (Proteus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 살모넬라 (Salmonella), 파에칼리박테리움 (Faecalibacterium), 펩토스트렙토코쿠스 (Peptostreptococcus) 또는 펩토코쿠스 (Peptococcus)로 구성되는 목록에서 선택되는 속으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 균주, 또는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 균주인 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 세균 균주는 서열 번호: 2와 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 공생균은 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 NCIMB에서 기탁된 균주인 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 공생균은 위장관에 투여될 때 IL-8의 활성화를 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 약제에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 개체에서 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 공생 세균 균주를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 조성물은 유기 산, 또는 이의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르와 조합으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 개체에서 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 한 가지 또는 그 이상의 유기 산 또는 이들의 제약학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 조성물은 공생 세균 균주와 조합으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 청구항 35 내지 36 중에서 어느 한 항, 또는 청구항 35 내지 36 중에서 어느 한 항에 의존할 때 청구항 37에 있어서, 유기 산은 하기 화학식을 갖고: R-COOH, 여기서 R은 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 아릴 기를 포함하고 4 내지 20개 범위의 탄소 원자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 개체에서 신경변성 장애의 치료 또는 예방에서 이용을 위한 공생균의 균주를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 균주는 하기 화학식을 갖는 한 가지 또는 그 이상의 유기 산을 생산하고: Rx-COOH,
    여기서 Rx는 4 내지 11개 범위의 탄소를 포함하는 알킬 기를 포함하거나,
    또는 여기서 Rx는 치환체 히드록실 기를 갖는 페닐 기를 포함하고, 임의선택적으로 여기서 히드록실 기는 위치 4에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 개체에서 뇌 손상의 치료에서 이용을 위한 공생균의 균주를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 균주는 하기 화학식을 갖는 한 가지 또는 그 이상의 유기 산을 생산하고: Rx-COOH,
    여기서 Rx는 4 내지 11개 범위의 탄소를 포함하는 알킬 기를 포함하거나,
    또는 여기서 Rx는 치환체 히드록실 기를 갖는 페닐 기를 포함하고, 임의선택적으로 여기서 히드록실 기는 위치 4에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 청구항 39 또는 청구항 40에 있어서, 균주는 헥산산을 생산하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 청구항 39 내지 41 중에서 어느 한 항에 있어서, 균주는 4-히드록시페닐아세트산을 생산하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 청구항 39 내지 42 중에서 어느 한 항에 있어서, 균주는 발레르산을 생산하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 청구항 39 내지 43 중에서 어느 한 항에 있어서, 균주는 헥산산, 발레르산 및 4-히드록시페닐아세트산을 생산하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 청구항 39 내지 44 중에서 어느 한 항에 있어서, 균주는 또한, 짧은 사슬 지방산을 생산하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 청구항 45에 있어서, 짧은 사슬 지방산은 부티르산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 청구항 36 내지 46 중에서 어느 한 항에 있어서, 균주는 또한, 숙신산을 생산하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  48. 청구항 39 내지 47 중에서 어느 한 항에 있어서, 균주는 메가스파에라 (Megasphaera) 속의 균주, 또는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 균주인 것을 특징으로 하는 조성물.
  49. 청구항 39 내지 48 중에서 어느 한 항에 있어서, 세균 균주는 서열 번호: 2와 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 청구항 39 내지 49 중에서 어느 한 항에 있어서, 공생균은 위장관에 투여될 때 IL-8의 활성화를 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  51. 청구항 39 내지 50 중에서 어느 한 항에 있어서, 공생균은 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 NCIMB에서 기탁된 균주인 것을 특징으로 하는 조성물.
  52. 청구항 39 내지 51 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 공생균의 2가지 또는 그 이상의 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  53. 청구항 52에 있어서, 조성물은 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) 종의 균주 및 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  54. 청구항 53에 있어서, 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) 종의 균주는 서열 번호: 17과 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖거나, 또는 파라박테로이데스 디스타소니스 (Parabacteroides distasonis) 종의 균주는 서열 번호: 17에 의해 대표되는 16s rRNA 서열을 갖고, 그리고 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 균주는 서열 번호: 2와 최소한 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖거나, 또는 메가스파에라 마스일리엔시스 (Megasphaera massiliensis) 종의 균주는 서열 번호: 2에 의해 대표되는 16s rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  55. 청구항 54에 있어서, 수탁 번호 NCIMB 42787 하에 NCIMB에서 기탁된 균주 및 수탁 번호 NCIMB 42382 하에 NCIMB에서 기탁된 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  56. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 신경변성 장애를 치료하는데 이용을 위한 것이고, 그리고 신경변성 장애는 진행성 핵상 마비, 진행성 핵상 마비, 스틸-리처드슨-올스제브스키 증후군, 정상압 수두증, 혈관 또는 동맥경화성 파킨슨증 및 약물 유발된 파킨슨증을 비롯한 파킨슨병; 벤손 증후군을 비롯한 알츠하이머병; 다발성 경화증; 헌팅턴병; 근위축성 측삭 경화증; 루게릭병; 운동 뉴런 질환; 프리온 질환; 척수소뇌 실조증; 척수 근위축증; 루이체 치매, 혈관성 치매 및 전두측두엽 치매를 비롯한 치매; 원발성 진행형 실어증; 경미한 인지 장애; HIV-관련된 인지 장애, 진행성 염증성 신경병증 및 피질기저 퇴행으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  57. 청구항 56에 있어서, 조성물은 파킨슨병을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  58. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 조기 발생 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  59. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 신경변성 장애의 발생 또는 진행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  60. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 신경변성 질환의 치료 또는 예방에서 염증을 감소시키는 방법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  61. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 뉴런 사멸을 감소시키거나 또는 뉴런을 보호하는데 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  62. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 신경변성 장애의 발생 또는 진행을 예방하거나 또는 지연시키는 방법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  63. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 신경변성 질환의 치료 또는 예방에서 IL-6-매개된 염증을 감소시키는 방법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  64. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 신경변성 장애의 치료 또는 예방에서 IL-6 수준 및/또는 NFκB 수준을 감소시키는 방법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  65. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 신경변성 질환의 치료 또는 예방에서 개체에서 신경돌기생성을 증가시키는 방법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  66. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 MAP2 활성을 유도함으로써 신경돌기생성을 증가시키는 방법에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  67. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 개체에서 뉴런 사멸을 감소시키는데 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  68. 청구항 1 내지 39 중에서 어느 한 항에 있어서, 조성물은 개체에서 뇌 손상의 치료에서 이용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  69. 청구항 40 또는 청구항 68에 있어서, 조성물은 뇌 손상의 치료에서 이용을 위한 것이고, 그리고 뇌 손상은 뇌졸중, 예를 들면 대뇌 허혈, 국소 대뇌 허혈, 허혈성 뇌졸중 또는 출혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 조성물.
  70. 청구항 39 내지 69 중에서 어느 한 항에 있어서, 공생 세균 균주는 유기 산을 생산하도록 가공되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  71. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항의 이용을 위한, 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항의 조성물을 포함하는 식품 산물.
  72. 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항의 이용을 위한, 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항의 조성물을 포함하는 백신 조성물.
  73. 신경변성 장애를 치료하거나 또는 예방하는 방법에 있어서, 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항의 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 뇌 손상을 치료하는 방법에 있어서, 임의의 전술한 청구항 중에서 어느 한 항의 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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