ES2594102T3 - Mutantes por deleción de la flagelina y métodos para su uso - Google Patents

Mutantes por deleción de la flagelina y métodos para su uso Download PDF

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Alan R. Shaw
Robert S. Becker
Yi Zhang
Scott W. Umlauf
David N. Taylor
Ge LIU
Mark D. Yeager
Thomas J. Powell
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Abstract

Una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80,0% de identidad con la secuencia de aminoácidos contigua como se expone en SEQ ID NO: 29 (R3), en donde la secuencia de aminoácidos aislada activa un receptor de tipo Toll 5.

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Mutantes por deleción de la flagelina y métodos para su uso
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de las Solicitudes Provisionales de EE.UU. N.º 61/124.617, presentada el 18 de
5 abril de 2008 de 2008; 61/124.604, presentada el 18 de abril de 2008; 61/124.670, presentada el 18 de abril de 2008; 61/125.660, presentada el 25 de abril de 2008; 61/126.993, presentada el 8 de mayo de 2008; 61/126.978, presentada el 8 de mayo, 2008; 61/132.594, presentada el 20 de junio de 2008; 61/137.840, presentada el 4 de agosto de 2008; 61/199.793, presentada el 19 de noviembre de 2008 y 61/200.354, presentada el 26 de noviembre de 2008.
10 Antecedentes de la invención
La infección vírica puede conducir a la enfermedad y, en algunos casos, la muerte. Las estrategias para prevenir y tratar la enfermedad asociada con la infección vírica, tal como la infección por el virus de la gripe, incluye el uso de fármacos y composiciones de virus inactivados por calor o de antígenos del virus de la gripe en combinación con adyuvantes. El único adyuvante aprobado para su uso en vacunas de la gripe en seres humanos es el alumbre, que 15 es una composición basada en aluminio. En general, las composiciones de vacuna de la gripe pueden incluir antígenos a concentraciones que, en combinación con alumbre, en seres humanos pueden tener efectos secundarios variables, tales como dolor, inflamación y una eficacia menor de la adecuada. Además, los métodos actuales de fabricación de vacunas de la gripe en general son inadecuados para satisfacer la creciente demanda estacional y los cambios en los virus de la gripe, para prevenir la enfermedad consecuente por infección por virus de
20 la gripe. Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar composiciones nuevas, mejoradas y eficaces para su uso en métodos de prevención y tratamiento de la enfermedad asociada con, o consecuente a, la infección vírica, en particular, la infección por virus de la gripe.
“Sequencing and comparative analysis of flagellin genes fliC, fljB, and flpA from Salmonella.” Journal of Clinical Microbiology mayo de 2004, vol. 42, n.º 5, mayo de 2004 (2004-05), páginas 1923-1932.
25 Los documentos WO 2007/103322 A2 y US 2007/224205 A1 describen “composiciones que incluyen hemaglutinina, métodos de preparación y métodos de uso de las mismas".
Murthy Kanneganti G K et al.: “Identification of protein motifs and role of particular amino acids in biological activity of flagellin as an inducer of proinflammatory responses in human cells,” Faseb Journal, Fed. Of American Soc. For Experimental Biology, Bethesda, MD, US, vol. 17, n.º 4-5, 1 de marzo de 2003 (-03), página del
30 Resumen.
Eaves-Pyles T D et al.: “Salmonella flagellin-dependant proinflammatory responses are localised to the conserved amino and carboxyl regions of the protein”, Journal of Immunology, American Association of Immunologists, US, vol.167, n.º 12, 15 diciembre de 2001 (), páginas 7009-7016.
Smith K D et al.: “Toll-like receptor 5 recognises a conserved site on flagellin required for protofilament formation and
35 bacterial motility”, Nature Immunology, Nature Publishing Group, GB, vol. 4, n.º 12, 1 de diciembre de 2003 (01-122003), páginas 1247-1253.
El documento WO 2007/125535 Al describe “Gen de la flagelina recombinante y usos del mismo”. Salman et al.: “Salmonella-like bioadhesive nanoparticles”, Journal of Controlled Release, Elsevier, Amsterdam, NL, vol. 106, n.º 12, 18 de agosto de 2005 (), páginas 1-13.
40 Compendio de la invención
La presente invención en su sentido más amplio se define por las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención se refiere a composiciones, tales como composiciones que estimulan una respuesta inmunitaria protectora, y a métodos para preparar proteínas que estimulan una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto.
45 En una realización, la invención es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80,00 % de identidad con una secuencia de aminoácidos contigua como se expone en la SEQ ID NO: 29 (una construcción R3), en donde la secuencia de aminoácidos aislada activa un Receptor de tipo Toll 5.
En aún otra realización, la invención es una secuencia de aminoácidos como se expone en al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 29 (una construcción R3)
50 Una realización adicional, la invención es una proteína de fusión que comprende al menos una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 29 (una construcción R3) y al menos una porción de al menos un antígeno vírico, en donde el antígeno está entre los restos de aminoácido 190 y 191 de la SEQ ID NO: 29, y en donde la proteína de fusión activa un Receptor de tipo Toll 5.
imagen2
Se describe adicionalmente una proteína de fusión que comprende, en secuencia, al menos una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 29 (una construcción D3) y al menos una porción de al menos un antígeno vírico, en donde la proteína de fusión activa un Receptor de tipo Toll 5.
5 Una realización adicional de la invención es una proteína de fusión que comprende al menos una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 29 (una construcción R3-2xAg) y al menos una porción de al menos dos antígenos, en donde al menos un antígeno está entre los restos de aminoácido 190 y 191 de la SEQ ID NO: 29 y al menos otro antígeno está fusionado al resto de aminoácido 405 de la SEQ ID NO: 29, y en donde la proteína de fusión activa un Receptor de tipo Toll 5.
10 Una realización adicional de la invención es el uso de proteínas de fusión de la invención para estimular una respuesta inmunitaria, en donde la proteína de fusión se administra al ser humano en al menos una dosis seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente una dosis de 10,0 µg, aproximadamente una dosis de 5,0 µg, aproximadamente una dosis de 3,0 µg, aproximadamente una dosis de 2,5 µg, aproximadamente una dosis de 1,0 µg, aproximadamente una dosis de 0,5 µg, aproximadamente una dosis de 0,3 µg, aproximadamente una
15 dosis de 0,25 µg, aproximadamente una dosis de 0,1 µg, aproximadamente una dosis de 0,05 µg, aproximadamente una dosis de 0,025 µg y aproximadamente una dosis de 0,01 µg.
En otra realización, la invención es una proteína de fusión que incluye una porción de una proteína flagelina de origen natural, en donde la porción incluye, en secuencia, un amino-dominio 0, un amino-dominio 1, amino-dominio 2, un antígeno vírico, un carboxi-dominio 2, un carboxi-dominio 1 y un carboxi-dominio 0 (una construcción de R3,
20 una de R3-2xAg).
Una realización adicional de la invención es un método para preparar una proteína de fusión que activa un agonista del Receptor de tipo Toll 5, que comprende las etapas de separar una porción de una proteína de una flagelina de origen natural, para formar de este modo una porción de proteína, en donde la porción de proteína incluye, en secuencia, un amino-dominio 0, un amino-dominio 1, un amino-dominio 2, un carboxi-dominio 2, un carboxi
25 dominio 1 y un carboxi-dominio 0 (una construcción R3, una construcción R3-2xAg); transformar una secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora para preparar de este modo el agonista del Receptor de tipo Toll 5.
Otra realización de la invención es la secuencia de aminoácidos, la proteína de fusión o el método para producir la proteína de fusión que incluye adicionalmente al menos una nanopartícula asociada con la secuencia amino o la
30 proteína de fusión, y la proporción molar del antígeno con respecto a la flagelina en la proteína de fusión no es más mayor que aproximadamente 1.
Una realización adicional de la invención se refiere a proteínas de fusión de la invención para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una composición que incluye al menos una nanopartícula que comprende al menos una porción de al menos un agonista
35 del Receptor de tipo Toll y al menos una porción de al menos un antígeno, en donde el agonista del Receptor de tipo Toll y el antígeno están asociados con la nanopartícula y la proporción molar del agonista del Receptor de tipo Toll con respecto al antígeno no es mayor que aproximadamente 1.
Los métodos y las proteínas de la invención se pueden emplear para estimular una respuesta inmunitaria, en particular, una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto. Las ventajas de la invención reivindicada incluyen
40 métodos rentables y composiciones que pueden producirse en cantidades relativamente grandes y emplearse en dosis relativamente bajas, que maximizan una respuesta inmunogénica y minimizan los efectos secundarios adversos, sin el uso de adyuvantes. Las proteínas y métodos reivindicados se pueden emplear para prevenir, tratar y tratar la enfermedad asociada, o consecuente, a la infección vírica y, de este modo, evitar la dolencia grave y la muerte consecuentes a la infección o contacto con el virus de la gripe.
45 Breve descripción de las Figuras
La Figura 1 representa un esquema de la proteína de fusión STF2.HA1-2.
La Figura 2 representa las ubicaciones alternativas de la cabeza globular de la HA. En cada una de las construcciones de flagelina la cabeza globular está rodeada por un círculo.
La Figura 3 representa la antigenicidad relativa de diferentes construcciones de Viet Nam (VN). Las placas de ELISA
50 se recubrieron con las concentraciones molares indicadas de las diferentes proteínas. Las placas se sondearon con suero de hurón convaleciente (1:1000). Se representa la absorbancia media para los pocillos por duplicado.
La Figura 4 representa la reactividad relativa del anticuerpo monoclonal frente a construcciones de VN alternativas. Las placas de ELISA se recubrieron con aproximadamente 4 µg/ml de cada proteína por duplicado durante una noche, se bloquearon e incubaron con una dilución 1:5000 de cada uno de los anticuerpos monoclonales durante 55 2 horas a temperatura ambiente (un anticuerpo por placa), seguido de una incubación de 30 minutos de una dilución
imagen3
1:10.000 de IgG anti ratón de cabra-HRP durante 30 minutos, y se revelaron con TMB. Se representan la absorbancia media para los pocillos por duplicado.
La Figura 5 representa una inducción de anticuerpos de IHA en suero en ratones inmunizados con diversas construcciones de VN. Los ratones BALB/c se inmunizaron ya sea 3 veces (3X) a un intervalo de 2 semanas o 2 5 veces (2X) a un intervalo de 3 semanas. Las muestras de suero de ratón (n=10-15) obtenidos 12 días después del segundo (2º) o tercer (3º) refuerzo se trataron con EDR, se inactivaron por calor y se sometieron a una prueba IHA con virus de la gripe A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Los títulos de IHA se representaron de forma individual con las MGT (líneas horizontales) e IC del 95 % (barras). La línea discontinua representa un título de IHA de 4 veces sobre la línea basal. Las barras entre corchetes representan a los grupos comparados en un análisis
10 estadístico. *, p < 0,05, significativo en las pruebas de Kruskal-Wallis/Dunns; **, p < 0,01, muy significativo; ***, p < 0,001, extremadamente significativo.
Las Figures 6A y 6B representan la eficacia de las diferentes construcciones de la cabeza globular después de un régimen de tres o dos dosis de 3 µg. Se vacunaron s.c. ratones BALB/c hembra de 6 semanas de edad con 3 o 2 inmunizaciones de la construcción indicada, antes de la exposición. El día 0, los ratones se infectaron i.n. con
15 6,8 X104 DICT50/ratón de virus de la gripe A/Vietnam/1203/04 (VN04). Las observaciones clínicas del desarrollo de enfermedad y mortalidad se controlaron a intervalos regulares desde el día 0 hasta el día 21. Se muestra el porcentaje de supervivientes (Figura 6A) y se muestra el porcentaje de cambio del peso corporal a partir de la línea basal en el día 0 (Figura 6B). Claves de los Rótulos: STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451); STF2R0.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 453); STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452).
20 La Figura 7 representa los títulos de virus medidos en los lavados nasales de los hurones. Las muestras de lavado nasal se obtuvieron en los días 3 y 5 posinfección, de animales inmunizados solo con tampón (placebo), con STF2R3.HA1-2 VN (R3.HA1-2 VN) (SEQ ID NO: 452) o STF2R3.2x.HA1-2 VN (R3.2xHAl-2 VN) (SEQ ID NO: 455). Se representan los títulos medios de grupo ± ET.
Las Figuras 8A y 8B representan la temperatura y el consumo de alimento después de la inmunización con
25 STF2.4xM2e. La Figura 8A representa las temperaturas medidas en el día 0 del estudio, 2 h posinmunización con la dosis indicada de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457). Se representan los aumentos medios ± ET para cada grupo de 6 conejos. Las temperaturas de la medida basal se tomaron del grupo que recibió solo tampón y que fueron de 39,17 ºC.
La Figura 8B representa el consumo de alimento controlado desde el día 0 hasta el día 1. Los datos se presentan 30 como el consumo de alimento medio ± la desviación típica para 6 conejos por grupo.
La Figura 9 representa los niveles posvacunación de proteína C reactiva (CRP: sigla del inglés C reactive protein) de los conejos. El día 0 se inyectaron i.m. grupos de 6 conejos con la dosis indicada de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457). Aproximadamente 24 horas después de la vacunación se extrajo sangre de los conejos, se prepararon los sueros y se midió la proteína C reactiva (Immunology Consultants Laboratory, Newberg, OR). Los datos se presentan como
35 CRP media de grupo ± DT.
Las Figuras 10A-10H representan la reactogenicidad relativa para las construcciones STF2.HA1-2 (SEQ ID NO: 451), STF2R3.HA1-2 (SEQ ID NO: 452) y STF2R3.2x. HAl-2 VN (SEQ ID NO: 455). Se inmunizaron grupos de 6 conejos New Zealand White con la dosis indicada de: la proteína STF2.HA1-2 VN (natural) (SEQ ID NO: 451), STF2R3.HA1-2 VN (R3) (SEQ ID NO: 452), STF2R3.2x.HA1-2 VN (R3 2x) (SEQ ID NO: 455) o con solo el 40 tampón de formulación. Los sueros se recogieron 21 días después de la inmunización de sensibilización y se evaluaron las IgG específicas para HA mediante ELISA. Los títulos de IgG, informados en µg/ml de IgG, se representan en la Figura 10A. Los títulos mostrados son para sueros individuales, las medias de grupo se indican con una barra. Para permitir la comparación con la construcción 'natural', en las Figuras 10A-10D se representan las medias grupales ± 3 DT del consumo de alimento, temperatura y niveles de CRP, frente a los niveles de IgG para
45 STF2.HA1-2 (SEQ ID NO: 451) y STF2R3.HA1-2 (SEQ ID NO: 452) y en las Figuras 10E-10H se representan para STF2.HA1-2 (SEQ ID NO: 451) y STF2R3.2x.HA1-2 (SEQ ID NO: 455).
Las Figuras 11A-11C representan una comparación de los perfiles de reactogenicidad de STF2.HA1-2 PR8 (denominado como Natural en el rótulo) (SEQ ID NO: 460) y STF2R3.HA1-2 PR8 (denominado como R3 en el rótulo) (SEQ ID NO: 464). Se inmunizaron i.m. grupos de 6 conejos con las dosis indicadas de vacuna. El consumo
50 de alimento se midió dese el día de inmunización hasta 1 día después (Figura 11 A). La temperatura corporal se determinó de forma rectal a las 10 horas posinmunización (Figura 11B). A las 24 horas posinmunización se midió en los sueros la proteína C reactiva (CRP) (Figura 11C). Los puntos de datos representan los resultados de animales individuales mientras que las barras representan las medias.
La Figura 12 representa la protección frente a la exposición al virus por STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 460) y
55 STF2R3.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 464). Se inmunizaron ratones Balb/c (10 por grupo) con las dosis indicadas ya sea de STF2.HA1-2 o STF2R3.HA1-2 PR8, en los días 0 y 14. El día 42, los ratones se expusieron i.n. a 1000 DICT50 de virus de la gripe H1N1 PR/34/8. Se controlaron en los ratones la pérdida de peso y la supervivencia de forma diaria. Por protocolo, los ratones se sometieron eutanasia si perdían aproximadamente 20 % de peso.
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Las Figuras 13A y 13B representan una comparación de los perfiles de reactogenicidad de STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463) y STF2R3.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 465). Se inmunizaron conejos (6 por grupo) i.m. con las dosis indicadas de vacuna unida a STF2. La temperatura corporal se registró de forma rectal a las 6 horas posinmunización (Figura 13A). El consumo de alimento se registró desde el día de la inmunización hasta un día posinmunización
5 (Figura 13B). Los datos se representan con una gráfica como media de grupo, con las desviaciones típicas indicadas mediantes barras de error.
Las Figuras 14A y 14B representan una evaluación de los perfiles de reactogenicidad de STF2R3.HA1-2 B FLA (R3) (SEQ ID NO: 470) y STF2R3.HA1-2 B FLA (R3.2x) (SEQ ID NO: 471). Se inmunizaron grupos de 6 conejos i.m. con las dosis de vacuna indicadas. Se midió el consumo de alimento desde el día de la inmunización hasta 1 día
10 después (Figura 14A). A las 24 horas posinmunización se midió en los sueros la proteína C reactiva (CRP) (Figura 14B). Los puntos de datos representan los resultados de animales individuales, mientras que las barras representan las medias.
La Figura 15 representa una evaluación de la inmunogenicidad de STF2R3.HA1-2 B FLA (R3) (SEQ ID NO: 470) y STF2R3.2x.HA1-2 B FLA (R3.2x) (SEQ ID NO: 471). Se inmunizaron grupos de 6 conejos dos veces con las dosis
15 indicadas de vacuna i.m. Los sueros se recogieron 7 días después de la dosis de refuerzo y se evaluaron las IgG específicas para virus mediante ELISA. Los puntos de datos representan los resultados de animales individuales, mientras que las barras representan las medias.
Las Figuras 16A y 16B representan una comparación de la actividad para TLR5 de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457), STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472), STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463) STF2D2D3L.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 473).
20 La actividad específica para TLR5 de las proteínas de fusión se evaluó midiendo la inducción de la producción de TNF. Se cultivaron células RAW/h5 durante una noche en placas de microtitulación de 96 pocillos. Las células se trataron durante 5 h con las concentraciones de proteína indicadas. Se recogieron los sobrenadantes y se evaluó la expresión de TNF mediante ELISA. Se leyó absorbancia y se comparó con una curva patrón de referencia. Los resultados se informan en ng/ml.
25 Las Figuras 17A y 17B representan el consumo de alimento y los niveles de CRP posinmunización con STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) o STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472). La Figura 17A representa el consumo de alimento controlado desde el día 0 hasta el día 1. Los datos se presentan como el consumo de alimento medio  desviación típica para 6 conejos por grupo. La Figura 17B representa los niveles de CRP medidos 24 horas después de la inmunización. Los datos se presentan como niveles de CRP medios  desviación típica para 6 conejos por grupo.
30 Las Figuras 18A y 18B representan la inmunogenicidad y la Eficacia de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) y STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472). Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c (n=10) los días 0 y 14, con las dosis indicadas de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) o STF2D2D3L.4xM2e (o STF2.4xM2e) (SEQ ID NO: 472). Se recogieron sueros 7 días después de la dosis de refuerzo y se analizaron por ELISA las IgG específicas para M2e (Figura 18A). El día 28 los ratones se expusieron a 1xDL90 de virus PR8. Se controló la supervivencia de los ratones
35 durante 21 días después de la exposición (Figura 18B).
Las Figuras 19A y 19B representan la CRP y el consumo de alimento posinmunización con STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463) frente a STF2D2D3L.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 473). La Figura 19A representa los niveles CRP medidos 24 horas después de la inmunización. Los datos se presentan como niveles CRP medios + desviación típica para 6 conejos por grupo. La Figura 19B representa el consumo de alimento controlado desde el día 0 hasta el día 1. Los
40 datos se presentan como consumo de alimento medio  desviación típica para 6 conejos por grupo.
La Figura 20 representa las respuestas de IgG específicas para HA Solomon Island posinmunización con STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463) frente a STF2D2D3.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 473). Los niveles de CRP se midieron 24 horas después de la inmunización. Los datos se presentan como niveles de CRP medios  desviación típica para 6 conejos por grupo.
45 La Figura 21 representa la actividad para TLR5 de STF2R0.HA1-2 PR8. Las proteínas de fusión STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474) y STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463) (círculos en blanco) se diluyeron hasta las concentraciones indicadas y se mezclaron con células HEK293. 24 horas más tarde se recogieron los sobrenadantes y se analizó la IL-8 utilizando un ELISA de tipo sándwich (BD Pharmingen).
Las Figuras 22A-22C representan la reactogenicidad de STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474) en comparación con
50 STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 460). Se inmunizaron conejos (6 por grupo) i.m. en el Día 0, con las dosis equivalentes indicadas. La Figura 22A representa la Temperatura corporal (medida 6 horas después de la inmunización el Día 0, en grados C). La Figura 22B representa el Consumo de alimento (en g) medido entre los Días 0 y 1. La Figura 22C representa la proteína C reactiva de los sueros a las 24 horas (g/ml). Todos los datos mostrados son medias de grupo  desviación típica.
55 La Figura 23 las IgG específicas para PR8 después de la inmunización con STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474) en comparación con STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 460). Se inmunizaron conejos (6 por grupo) i.m. en el Día 0 con las dosis equivalentes indicadas. Se les extrajo sangre el Día 21 y se analizaron en el suero las IgG para virus PR8.
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Las placas de ELISA se recubrieron con virus (205 UHA/ml) junto con una curva patrón de IgG policlonales. Las IgG específicas para virus se calcularon utilizando de curva patrón ajustada con una ecuación logística de 4 parámetros. Los datos se presentan como IgG media de grupo (g/ml)  desviación típica.
Las Figuras 24A-24C representan la Proporción Reactogenicidad/Inmunogenicidad de STF2R0.HA1-2 PR8 (R0)
5 (SEQ ID NO: 474) en comparación con STF2.HA1-2 PR8 (Longitud Completa) (SEQ ID NO: 460). Se representan las IgG específicas para PR8 (eje X) frente a las medidas de reactogenicidad. La Figura 24A representa las IgG específicas frente a la temperatura corporal. La Figura 24B representa las IgG específicas frente al Consumo de Alimento. La Figura 24C representa las IgG específicas frente a la proteína C reactiva (CRP). Todos los resultados se muestran como medias de grupo  desviación típica.
10 La Figura 25 representa la supervivencia de ratones vacunados después del desafío con virus A/PR/8/34. Se inmunizaron grupos de 10 ratones BALB/c S.C. con STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 460), STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474) o tampón F147 a las dosis indicadas, en los días 0 y 14, y se expusieron i.n. (por vía intranasal) a DL90 de A/PR/8/34 en el día 34. La pérdida de peso y la mortalidad se observaron en los animales de forma diaria durante 21 días.
15 La Figura 26 representa los títulos de anticuerpos neutralizantes de sueros de ratones inmunizados con STF2.HA1 SI. Los resultados muestran la media geométrica  IC del 95 % (Barras) de 15 sueros individuales por grupo, así como los resultados de ratones individuales.
La Figura 27 representa los títulos de anticuerpos neutralizantes de los sueros posrefuerzo de ratones inmunizados con STF2.HA1 SI. Se recogieron los sueros y se evaluaron los títulos neutralizantes utilizando ensayo de micro
20 neutralización. Los resultados muestran la media geométrica de 15 sueros individuales por grupo. Un asterisco encima de la barra indica las respuestas significativas en comparación con el grupo sin tratamiento previo utilizando la prueba de ANOVA/Tukey. Los grupos conectados por corchetes se compararon también mediante la prueba de ANOVA/Tukey y se encontró que diferían estadísticamente. Los asteriscos indican el nivel de significación con *= p < 0,05; **= p < 0,01 y ***= p < 0,001 en la ANOVA.
25 Las Figuras 28A y 28B representan la Respuesta de IgG específica para HA de SI para STF2.HA1 SI en conejos. Se les proporcionó dos inmunizaciones con STF2.HA1 SI a seis conejos por grupo a las dosis indicadas, en los días 0 y
21. Los sueros se recogieron el día -1 (preextracción de sangre), el día 21 (postsensibilización, panel superior) y el día 28 (7 días posrefuerzo, panel inferior). Los sueros se unieron a las placas recubiertas con HA1-1 (SI) (baculovirus, 1 g/ml), en diluciones que variaban de 1:25 a 1:39.0625. Los valores de DO de las IgG específicas
30 para HA se convirtieron a g/ml utilizando una curva patrón ajustada de IgG policlonales con una curva logística de 4 parámetros (Softmax Pro 5.2, Molecular Devices). Se sustrajeron de cada grupo los valores preextracción de sangre. Los datos mostrados son medias +/-desviaciones típicas de 6 conejos por grupo.
La Figura 29 representa los títulos de Ac neutralizantes de sueros posrefuerzo de conejos inmunizados con STF2.HA1 SI (también conocida como STF2.HA1-2 (SI)) o Fluvirina. Se les proporcionó a seis conejos por grupos 35 dos inmunizaciones i.m. con STF2.HA1 SI o Fluvirina, a las dosis indicadas, el día 0 y 21. Se recogieron sueros 7 días después de la dosis de refuerzo y se evaluaron los títulos neutralizantes utilizando el ensayo de micro neutralización. Los resultados muestran la media geométrica de 6 sueros individuales por grupo. Un asterisco sobre la barra indica las respuestas significativas en comparación con el grupo sin tratamiento previo, utilizando la prueba de ANOVA/Tukey. Los grupos conectados mediante corchetes también se compararon mediante la misma prueba y
40 se encontró que diferían de estadísticamente. Los asteriscos indican el nivel de significación con *= p < 0,05; **= p n <0,01 y ***= p < 0,001 en la prueba de ANOVA/Tukey. Se incluyó como control positivo un antisuero de hurón de referencia obtenido del CDC y el título se proporciona en la parte inferior del gráfico.
La Figura 30 representa el efecto de STF2.HA1 SI sobre el consumo de alimento en conejos. Se inyectaron grupos de 6 conejos con la dosis indicada de STF2.HA1 SI i.m. (también conocida como STF2.HA1-2 (SI)) en el día 0. El
45 consumo de alimentos se controló desde el día 0 hasta el día 1. Los datos se presentan como el consumo de alimento medio de grupo  DT.
La Figura 31 representa el efecto de STF2.HA1 SI sobre los niveles de la CRP en conejos. Se inyectaron i.m. grupos de 6 conejos con la dosis indicada de STF2.HA1 SI (también conocida como STF2.HA1-2 (SI)) en el día 0. 24 horas después de la vacunación se extrajo sangre de los conejos, se preparó el suero y se midió la CRP (Immunology
50 Consultants Laboratory, Newberg, OR). Los datos se presentan como la CRP media de grupo + DT.
La Figura 32 representa el efecto de STF2.HA1 SI sobre la temperatura en conejos. Se inyectaron i.m. grupos de 6 conejos con la dosis indicada de STF2.HA1 SI. La temperatura se controló a las 2 horas posvacunación. Los datos se presentan como temperatura media desviación típica. Las temperaturas de medida basal se tomaron del grupo que recibió solo tampón y fueron de aproximadamente de 39,17 ºC.
55 La Figura 33 representa el aumento de temperatura a lo largo del tiempo después de la inmunización con STF2.HA1 SI. Se inmunizaron conejos i.m. con ya sea tampón F147 o con 150 μg de STF2.HA1 SI. La temperatura se midió en los puntos indicados utilizando un sistema de microplaca subcutáneo. Los resultados se presentan como medias de grupo de 6 animales. La Figura 34 representa el efecto de STF2.HA1 SI sobre la temperatura corporal. Se inmunizaron conejos i.m. con la dosis indicada de STF2.HA1 SI. El tampón F147 se representa como 0. La temperatura se midió de forma rectal a las 6 horas posinmunización. Los datos se muestran como medias de grupo más la desviación típica.
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5 La Figura 35 representa la neutralización de A/Solomon Islands/3/06 por suero inmune posrefuerzo en diluciones seriadas, las muestras de suero tratado con EDR se coincubaron con virus A/Solomon Islands/3/2006, después con células MDCK y se sometieron a ELISA con anticuerpo anti NP del virus de la gripe A. Los títulos de anticuerpos neutralizantes se definen como las diluciones inversas que están por encima de la señal específica calculada a partir de los valores de DO de los controles negativo y positivo. Los datos representan medias ± las DT del logaritmo
10 natural (LN, título neutralizante) con tasas respondedoras por encima (N=6).
La Figura 36 representa los títulos de microneutralización para el suero clínico VAX125. Las muestras de suero se mezclaron con virus Solomon Islands y después se añadieron a células MDCK. Después de 20 horas de incubación, se cuantificó la replicación de virus lisando las células y tiñendo para la expresión de nucleoproteína (NP). Los títulos de microneutralización se determinaron como la dilución más elevada que redujo la replicación del virus en ≥ 50 %.
15 Los resultados se muestran como títulos de sujetos individuales, con la barra representando la media geométrica de grupo.
Las Figuras 37A y 37B representan las IgG específicas para HA y flagelina por ELISA. Los sueros se diluyeron y se incubaron en placas recubiertas con ya sea HA1-1 recombinantes o STF2. Las IgG específicas para antígeno se detectaron utilizando anti ser humano HRP y TMB. Las IgG específicas se calcularon a partir de una curva patrón
20 utilizando una ecuación logística de 4 parámetros. Los datos se muestran como media de grupo, con las barras de error representando el error típico de la media (ETM).
Las Figuras 38A y 38B representan las IgG específicas de M2e después de la administración i.m. de VAX102 o de placebo a sujetos individuales, a la dosis de 0,3 μg y de 1,0 μg.
La Figura 39 representa la curva de anticuerpos de M2e como se define por los Media Geométrica de los Títulos 25 (MGT) medidos en el día 42, después de dos dosis de VAX102 proporcionadas los Días 0 y 28.
La Figura 40 representa las MGT de las IgG específicas para M2e a través de múltiples cantidades de dosis y vías de administración.
Las Figuras 41A-41C representan las IgG específicas para M2e (medias de grupo) en diversas vías de administración y dosis. i.d. = intradérmica. s.c. = subcutánea. i.m. = intramuscular.
30 Las Figuras 42A-42C representan la respuesta de anticuerpos IgG para las proteínas de fusión STF2Δ.RSVG en el Estudio de Inmunogenicidad n.º 2. Figura 42A -Ratones inmunizados de control. Figura 42B -Ratones inmunizados con STF2Δ.RSVG130-230 (SEQ ID NO: 621). Figura 42C -Ratones inmunizados con STF2Δ.RSVG130-230 (SEQ ID NO: 621). Las placas de ELISA se recubrieron con el péptido RSVG HPEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRI (SEQ ID NO: 627).
35 Las Figuras 43A-43B representan la respuesta de anticuerpos IgG para las proteínas de fusión STF2Δ.RSVG en el Estudio n.º 2, utilizando el ensayo de ELISA de RSV de célula entera. Figura 43A -Ratones inmunizados con STF2Δ.RSVG130-230 (SEQ ID NO: 621). Figura 43B -Ratones inmunizados con STF2Δ.RSVG66-298 (SEQ ID NO: 571).
Las Figuras 44A-44B representan la respuesta de anticuerpos IgG para RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 615) en el 40 Estudio de Inmunogenicidad n.º 3, en un ensayo de ELISA de célula entera.
La Figura 45 representa la inmunogenicidad de RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 615) en un ensayo de neutralización del virus RSV.
Las Figuras 46A-46D representan las respuestas de linfocitos T inducidas por STF2Δ.RSVM2 (SEQ ID NO: 625) en el Estudio de Inmunogeneicidad n.º 1, como de determinó por ensayo ELISPOT. Figura 46A -IFNγ (primaria). Figura
45 46B -IL-4 (primaria). Figura 46C -IFNγ (refuerzo). Figura 46D -IL-5 (refuerzo).
Las Figuras 47A hasta 47D representan las respuestas de IgG en suero, suscitadas en ratones después de la inmunización con las proteínas STF2Δ.DEN(1-4)EIII+ (SEQ ID NO: 628); (SEQ ID NO: 630); (SEQ ID NO: 632) y (SEQ ID NO: 634), como se determinó por ELISA utilizando proteínas DEN 80%EHisBv (SEQ ID NO: 636); (SEQ ID NO: 638); (SEQ ID NO: 640) y (SEQ ID NO: 642).
50 Las Figuras 48A hasta 48D representan la reactividad cruzada de las IgG en suero inmune con proteínas DEN 80%EHisBv heterólogas, como se determinó por ELISA.
Las Figuras 49A, 49B, 50A y 50B representan las respuestas de IgG en suero suscitadas en ratones después de la inmunización con proteínas STF2Δ.DEN(1-4)EIII+ (SEQ ID NO: 628); (SEQ ID NO: 630); (SEQ ID NO: 632) y (SEQ ID NO: 634), de forma individual (formulación monovalente) o combinada en una formulación tetravalente. Como se
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determinó por ELISA utilizando proteínas DEN 80%EHisBv (SEQ ID NO: 636); (SEQ ID NO: 638); (SEQ ID NO: 640) y (SEQ ID NO: 642).
La Figura 51 representa los anticuerpos neutralizantes de virus dengue suscitados después de la inmunización con la proteína STF2Δ.DEN2EIII+ (SEQ ID NO: 630). Como se determinó por ensayo PNRP.
Las Figuras 52A y 52B representan las respuestas de linfocitos T específicos para el antígeno E6 del HPV16 en ratones, después de una única inmunización con STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679), por ensayo ELISPOT de células positivas para IFN-γ (Figura 52A) y células positivas para IL-5 (Figura 52B).
Las Figuras 53A y 53B representan las respuestas de linfocitos T específicos para el antígeno E6 del HPV16 en ratones, después de dos inmunizaciones con STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679), por ensayo ELISPOT de células positivas para IFN-γ (Figura 52A) y células positivas para IL-5 (Figura 52B).
La Figura 54 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de la flagelina de longitud completa (FL) y una proteína de fusión que incluye los Dominios 0, 1, 2 y 3 y un Antígeno (Ag) fusionado al extremo carboxilo de la flagelina (Yonekura, et al., Nature 424: 643-650 (2003)).
La Figura 55 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 28) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el dominio 3, el carboxidominio 2 y el carboxi-dominio 1 de la flagelina, fusionados a un antígeno (Ag). La construcción de flagelina se denomina en esta memoria como “una construcción R0”.
La Figura 56 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 29) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 0, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2, el carboxi-dominio 1 y el carboxi-dominio 0 de la flagelina. El antígeno (Ag) está insertado entre el extremo amino y el extremo carboxilo del dominio 2 de la construcción de flagelina. La construcción de flagelina se denomina en esta memoria como “la construcción R3”. La SEQ ID NO: 29 es la secuencia de aminoácidos de una construcción R3 y una construcción D3, que difieren en el emplazamiento del antígeno fusionado.
La Figura 57 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 29) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 0, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2, el carboxi-dominio 1 y el carboxi-dominio 0 de la flagelina, fusionados a un antígeno (Ag). Está fusionado un antígeno (Ag) al aminoácido terminal del carboxi-dominio 0 de la construcción de flagelina. La construcción de flagelina se denomina en esta memoria como “la construcción D3”.
La Figura 58 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 30) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2 y el carboxi-dominio 1 de la flagelina. Está fusionado un antígeno (Ag) entre el amino-dominio 2 y el carboxi-dominio 2 de la construcción de flagelina. La construcción de flagelina se denomina en esta memoria como “la construcción R3D0”.
La Figura 59 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 30) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2 y el carboxi-dominio 1. Dos antígenos (Ag) están en la proteína de fusión representada en la SEQ ID NO: 30. Un antígeno está fusionado entre el amino-dominio 2 y el carboxi-dominio 2 de la construcción de flagelina y otro antígeno está fusionado al carboxi-dominio 1 de la construcción de flagelina. La construcción de flagelina se denomina en esta memoria como “la construcción R03”.
La Figura 60 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 29) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 0, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2, el carboxi-dominio 1 y el carboxi-dominio 0 de la flagelina. Dos antígenos (Ag) están en la proteína de fusión. Un antígeno está fusionado entre el amino-dominio 2 y el carboxi-dominio 2 de la construcción de flagelina. Otro antígeno está fusionado al aminoácido carboxilo terminal del Dominio 0 de la construcción de flagelina. La construcción de flagelina se denomina en esta memoria como “la construcción R3-2xAg”.
La Figura 61 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 31) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2, el carboxi-dominio 1 y el carboxi-dominio 0 de la flagelina, fusionados a un antígeno (Ag). La construcción de flagelina se denomina en esta memoria como “la construcción D3N”.
La Figura 62 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 32) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2, el carboxi-dominio 1 de la flagelina. La construcción de flagelina carece de una porción de un carboxi-dominio 0, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos VPQNVLSLLA (SEQ ID NO: 693). Está fusionado un antígeno al aminoácido carboxilo terminal de la construcción de flagelina. La construcción de flagelina se denomina en esta memoria como “la construcción D3NCs”.
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La Figura 63 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de la construcción de flagelina (SEQ ID NO: 33) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 1 y el carboxi-dominio 1 de la flagelina, fusionados a un antígeno (Ag). El antígeno está fusionado al aminoácido carboxilo terminal del carboxi-dominio 1 de la construcción de flagelina. La construcción de flagelina se denomina en esta memoria como “la construcción
5 D0D2D3” o “la construcción D1”.
La Figura 64 representa las proteínas de fusión que incluyen la flagelina y porciones de la proteína F del RSV.
La Figura 65 representa las uniones disulfuro en una proteína F del RSV (Smith, et al., Prot. Eng. 15: 365-371 (2001)).
La Figura 66 representa una proteína G del RSV (SEQ ID NO: 544).
10 La Figura 67 representa el genoma del HPV16.
La Figura 68 representa el genoma, el ARNm y las proteínas del HPV.
Descripción detallada de la invención
Las características y otros detalles de la invención, ya sea como etapas de la invención o como combinaciones de partes de la invención, se describirán ahora de forma más particular y se indicarán en las reivindicaciones.
15 La invención en general se dirige a composiciones que incluyen antígenos víricos, tales como antígenos del virus de la gripe (p.ej., proteína hemaglutinina (HA), proteína de la matriz 2 (M2), neuraminidasa), antígenos del virus respiratorio sincitial (RSV) (p. ej., proteína de fusión, glucoproteína de unión), antígenos del virus del papiloma (p. ej., virus del papiloma humano (HPV), tales como una proteína E6, proteína E7, proteína L1, proteína L2) y antígenos de flavivirus (p. ej., antígenos de virus Dengue, antígenos del virus del Nilo Occidental), proteínas de fusión que
20 incluyen los antígenos víricos y métodos para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto, tales como una respuesta inmunitaria protectora, empleando las composiciones descritas en la presente memoria.
En una realización, la invención es una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80,0 % de identidad con una secuencia de aminoácidos contigua, como se expone en la SEQ ID NO: 29 (una construcción R3), en donde la secuencia de aminoácidos aislada activa al Receptor de tipo Toll 5 (TLR5). Las secuencias de aminoácidos que
25 tienen, por ejemplo, al menos el 80,0 %, al menos el 85,0 %, al menos el 88,0 %, al menos el 90,0 %, al menos el 95,0 %, al menos el 98,0 % o al menos el 99,0 % de identidad con la SEQ ID NO: 29, se pueden emplear en las composiciones, proteínas de fusión y métodos de la invención. Las secuencias de aminoácidos ejemplares que tienen al menos el 80,0 % de identidad con la SEQ ID NO: 29 incluyen a las SEQ ID NO: 770-775.
Al menos un resto de aminoácido de la SEQ ID NO: 29 seleccionado del grupo que consiste en 84, 91, 95, 322 y
30 326, puede sustituirse por un aminoácido que no sea de origen natural, tal como al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en alanina, serina, glicina, ácido aspártico, ácido glutámico y lisina. Se cree que los aminoácidos sustituidos en las construcciones de flagelina descritos en la presente memoria están implicados en interacciones (p.ej., unión) con TLR5.
“Contiguo”, como se emplea en la presente memoria en referencia a secuencias de aminoácidos que tienen
35 identidad con las secuencias de aminoácido descritas en la presente memoria que activan al Receptor de tipo Toll 5 (p.ej., las SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32 y 33), se refiere a una secuencia de aminoácidos que no tiene ninguna inserción o deleción en ninguna parte de la secuencia de aminoácidos que comparte la identidad porcentual. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 29, no tendría un hueco (es decir, una deleción) en la secuencia de aminoácidos cuando se compara con la SEQ ID NO: 29, ni
40 tendría la secuencia de aminoácidos adicionales (es decir, una inserción) cuando se compara con la SEQ ID NO: 29.
“Activa,” cuando se hace referencia a una secuencia de aminoácidos o a una proteína de fusión, significa que la secuencia de aminoácidos, proteína de fusión o componente de la proteína de fusión (p.ej., una secuencia de aminoácidos) estimula una respuesta asociada con un TLR5, por ejemplo, respuestas inflamatorias del hospedador (Smith, K.D., et al., Nature Immunology 4:1247-1253 (2003)), tales como la producción de Interleucina-8 (IL-8),
45 producción de factor de necrosis tumoral (TNF) y activación de NK-KB, como se describe en la presente memoria.
La construcción R3 se puede fusionar con al menos un antígeno descrito en la presente memoria. Se muestran a continuación las construcciones R3 ejemplares (también denominadas en esta memoria como “construcciones de flagelina R3” o “forma R3 de la flagelina”) fusionadas con, por ejemplo, un antígeno de HA del virus de la gripe (SEQ ID NO: 499). La secuencia del antígeno de HA está subrayada.
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Datos de alineamiento:
Longitud de alineamiento: 667
5 Identidad (*): 323 es el 48,43 % Fuertemente similar (:) : 75 es el 11,24 % Débilmente similar (.) : 44 es el 6,60 % Diferente: 225 es el 33,73 % Secuencia 0001: fliCR3HAl_2SI (623 restos).
10 Secuencia 0002: fljBR3HAl_2SI (628 restos). Secuencia 0003: EcoliR3HAl_2SI (665 restos). Secuencia 0004: BsubR3HAl_2SI (526 restos).
Los patrones moleculares asociados a patógeno (PMAP), tales como una flagelina o una lipoproteína bacteriana, se refieren a una clase de moléculas (p.ej., proteína, péptido, carbohidrato, lípido, lipopéptido, ácido nucleico)
15 encontradas en microorganismos que, cuando se unen a un receptor de reconocimiento de patrón (RRP), pueden desencadenar una respuesta inmunitaria innata. El RRP puede ser un Receptor de tipo Toll (TLR).
Los TLR son el tipo de Receptor de Reconocimiento de Patrón (RRP) expresado en células presentadoras de antígeno (CPA) mejor caracterizado. Las CPA utilizan los TLR para reconocer el microentorno y detectar señales de infección patógena mediante la conexión con ligandos afines de los TLR, los PMAP. La activación del TLR
20 desencadena la respuesta inmunitaria innata, la primera línea de defensa frente a la agresión de patógenos, manifestada como la liberación de citocinas, quimiocinas y otros mediadores inflamatorios; la incorporación de células fagocíticas e importantes mecanismos celulares que conducen a la expresión de moléculas coestimuladoras, y el procesamiento eficaz y presentación de antígenos a los linfocitos T.
Los Receptores de tipo Toll se llamaron a base de la homología con la proteína Toll de Drosophila melanogaster.
25 Los Receptores de tipo Toll (TLR) son proteínas receptoras de señalización transmembrana de tipo I caracterizadas por un dominio de repetición rica en leucina extracelular y un dominio intracelular homólogo a un receptor de interleucina 1. Los Receptores de tipo Toll incluyen a TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11 y TLR12.
La unión de los PMAP a los TLR activa las rutas inmunitarias innatas. Las células diana pueden dar lugar a la
30 presentación de moléculas coestimuladoras en la superficie celular, así como de péptidos antigénicos en el contexto de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad. Las composiciones y proteínas de la invención incluyen un TLR (p.ej., TLR5), el cual promueve la diferenciación y maduración de la CPA, incluyendo la producción y presentación de señales coestimuladoras. Las proteínas de la invención pueden internalizarse mediante la interacción con el TLR y procesarse a través de la ruta lisosomal, para generar péptidos antigénicos, los que se
35 presentan en la superficie en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad.
Las secuencias amino y las proteínas de fusión de la invención pueden desencadenar acontecimientos celulares que dan como resultado la expresión de moléculas coestimuladoras, la secreción de citocinas y quimiocinas críticas, y el procesamiento y la presentación eficaces de antígenos a los linfocitos T. Como se discutió anteriormente, los TLR reconocen a los PMAP, que incluyen componentes de la pared celular bacteriana (p.ej., lipoproteínas y
40 lipopolisacáridos bacterianos), secuencias de ADN bacteriano que contienen restos CpG no metilados y a la flagelina bacteriana, que actúan como iniciadores de la respuesta inmunitaria innata y como guardianes de la respuesta inmunitaria adaptativa (Medzhitov, R., et al., Cold Springs Harb. Symp. Quant. Biol. 64:429 (1999); Pasare, C., et al., Semin, Immunol 16:23 (2004); Medzhitov, R., et al., Nature 388:394 (1997); Barton, G.M., et al., Curr. Opin. Immunol 14:380 (2002); Bendelac, A., et al., J. Exp. Med. 195: F19 (2002)).
45 Las secuencias amino y las proteínas de fusión de la invención pueden desencadenar rutas de transducción de señales del sistema inmunitario innato y adaptativo del sujeto para, de este modo, estimular el sistema inmunitario
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de del sujeto, para generar anticuerpos e inmunidad protectora para el componente antigénico de la composición lo que, a su vez, puede prevenir la infección por un virus, tal como el virus de la gripe, un virus respiratorio sincitial, un virus del papiloma y un flavivirus para, de este modo, tratar al sujeto o prevenir la enfermedad, dolencia y posiblemente, la muerte del sujeto en el sujeto.
En aún otra realización, la invención es una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 29 (R3).
La Figura 55 representa los dominios (de D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (p.ej., un componente de flagelina de una proteína de fusión) y una proteína de fusión (SEQ ID NO: 28) que incluye, en secuencia, el aminodominio 1, (también denominado en esta memoria como “D1N”), el amino-dominio 2 (también denominado en esta memoria como "D2N”), dominio 3 (también denominado en esta memoria como “D3”), el carboxi-dominio 2 (también denominado en esta memoria como “D2C”) y el carboxi-dominio 1 (también denominado en esta memoria como “D1C”), fusionados a un antígeno (Ag). El componente de flagelina de la proteína de fusión representada en la Figura 55 carece de los amino-y carboxi-dominios D0 de la flagelina (también denominados en esta memoria como “D0N” y “D0C”, respectivamente) y se denomina en esta memoria como una “construcción R0” o “forma R0 de la flagelina” o “construcción de flagelina R0”. “Construcción R0 (Dominio Reemplazado 0)” como se utiliza en esta memoria, significa que el Dominio 0 de la flagelina ha sido reemplazado por un antígeno descrito en la presente memoria.
“Proteínas de fusión,” como se emplea en la presente memoria, se refiere a una proteína que se genera mediante la unión de dos componentes (también denominado en esta memoria como “fusionado” o “unido”) (p.ej., una secuencia de aminoácidos que activa un TLR5 y al menos una porción de un antígeno vírico). Las proteínas de fusión de la invención se pueden generar mediante tecnologías del ADN recombinante o mediante conjugación química de los componentes de la proteína de fusión. Las tecnologías del ADN recombinante y las técnicas de conjugación química son procedimientos bien establecidos y conocidos para un experto en la técnica. Las técnicas ejemplares para generar proteínas de fusión que incluyan agonistas del Receptor de tipo Toll se describen en la presente memoria y en las solicitudes de EE.UU. N.º: 11/714.684 y 11/714.873.
En una realización, el extremo carboxilo del componente antigénico de la proteína de fusión está fusionado a un extremo amino de la secuencia de aminoácidos que activa un TLR5 o un componente de flagelina de la proteína de fusión. En otra realización, un extremo amino del componente antigénico de la proteína de fusión está fusionando a un extremo carboxilo de la secuencia de aminoácidos que activa un TLR5 o un componente de flagelina de la proteína de fusión.
“Componente,” como se emplea en esta memoria en referencia a las proteínas de fusión descritas en la presente memoria, se refiere a los constituyentes de la proteína de fusión. Por ejemplo, un “componente antigénico vírico”, como se emplea en esta memoria, se refiere a la parte del antígeno vírico que incluye al menos una porción o la totalidad de una proteína antigénica vírica. Así mismo, por ejemplo, un “componente de agonista del Receptor de tipo Toll”, como se emplea en esta memoria, se refiere a al menos la parte de la proteína de fusión que incluye al menos una porción de un agonista del Receptor de tipo Toll. El componente de agonista del Receptor de tipo Toll puede ser un componente de flagelina que incluye, por ejemplo, una construcción R0, una construcción R3, una construcción R3D0, una construcción D3N, una construcción D3NCs y una construcción D1. “Componente de flagelina”, como se utiliza en esta memoria, se refiere a al menos la parte de la proteína que incluye al menos una porción, o la totalidad, de una flagelina.
Los antígenos para su uso en las proteínas de fusión de la invención pueden incluir al menos una porción de al menos un antígeno de proteína vírica. El antígeno de proteína vírica puede incluir al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un antígeno de proteína vírica de la gripe (un antígeno de proteína vírica de la gripe A, un antígeno de proteína vírica de la gripe B, un antígeno de proteína vírica de la gripe C), un antígeno de proteína de flavivirus (p.ej., un antígeno de proteína del flavivirus virus del Nilo Occidental, un antígeno de proteína del flavivirus virus Dengue), un antígeno de proteína vírica del virus respiratorio sincitial y un antígeno de proteína del virus del papiloma.
“Al menos una porción,” como se emplea en esta memoria en referencia a compontes de las proteínas de fusión o composiciones de la invención, significa cualquier parte o la totalidad de los componentes. “Al menos una porción” también se denomina como “fragmento”.
Los antígenos del virus de la gripe para su uso en las composiciones y métodos de la invención pueden incluir al menos un antígeno de proteína integral de membrana. El antígeno de proteína integral de membrana puede incluir un antígeno de proteína integral de membrana del virus de la gripe, tal como al menos una porción de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una proteína hemaglutinina de membrana, una proteína neuraminidasa de membrana y una proteína de la matriz 2 de membrana. La proteína integral de membrana puede incluir al menos una porción de al menos una proteína hemaglutinina de membrana, tal como al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 228-281, 283-295, 454, 456, 481, 499, 662, 665, 813 y 826
831. La proteína integral de membrana puede incluir al menos una porción de al menos una proteína de la matriz 2 de membrana (p.ej., al menos cuatro proteínas de la matriz 2 de membrana, tal como la SEQ ID NO: 485), tal como al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 296, 298, 300-321, 323-336, 507 y
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Las proteínas de fusión de la invención se pueden designar por los componentes de las proteínas de fusión separados por un “.”. Por ejemplo, “STF2R3.HA1-2 PR8” se refiere a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de una construcción R3, tal como la SEQ ID NO: 29, fusionada a una porción de una proteína hemaglutinina HA1-2, de la cepa Puerto Rican 8. Las proteínas de fusión ejemplares de la invención incluyen antígenos del virus de la gripe (las SEQ ID NO: 451-453, 465, 470, 471 y 474); los antígenos del virus respiratorio sincitial (las SEQ ID NO: 615, 621, 623 y 625); antígenos del virus del papiloma (las SEQ ID NO: 157-180, 187-192, 204-209 y 216-227), antígenos de flavivirus (las SEQ ID NO: 628, 630, 632 y 634) y las proteínas de fusión descritas y enumeradas en el Listado de Secuencias en la presente memoria.
Las proteínas de fusión pueden incluir, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más secuencias de aminoácidos que activan al TLR5, tales como porciones de la flagelina (p.ej., las SEQ ID NO: 28-34) o agonistas del Receptor de tipo Toll (p.ej., al menos una porción de la flagelina) y dos, tres, cuatro, cinco, seis o más proteínas antigénicas. Cuando dos o más agonistas del TLR y/o dos o más proteínas comprenden proteínas de la investigación, también se denominan “multímeros”. Por ejemplo, un multímero de una proteína M2, tal como una proteína M2 del virus de la gripe o del RSV, pueden ser las SEQ ID NO: 485 y 551, respectivamente, que se denomina en la presente memoria como 4xM2.
Adicionalmente, las proteínas de la invención pueden incluir un enlazador entre al menos un componente de la proteína de fusión (p.ej., una proteína antigénica) y al menos otro componente de la proteína (p.ej., una secuencia de aminoácidos que activa un TLR5, un componente de flagelina) de la composición, un enlazador (p.ej., enlazador de aminoácidos) entre al menos dos componentes similares de la proteína (p.ej., entre dos antígenos) o cualquier combinación de los mismos. El enlazador puede estar entre el componente antigénico y el componente de agonista del Receptor de tipo Toll o el componente de flagelina de una proteína de fusión. “Enlazador”, como se emplea en esta memoria en referencia a una proteína de la invención, se refiere a un conector entre componentes de la proteína, de manera que los componentes de la proteína no estén unidos de forma directa. Por ejemplo, un componente de la proteína de fusión (p.ej., secuencia de aminoácidos que activa al TLR5, un componente de flagelina) puede estar unido a un componente distinto (p.ej., antígeno) de la proteína de fusión. Asimismo, pueden estar unidos por un enlazador al menos dos o más componentes similares o semejantes de la proteína de fusión (p.ej., dos secuencias de aminoácidos que activan un TLR5, tales como dos (2) secuencias R3); o dos componentes antigénicos pueden incluir adicionalmente un enlazador entre cada antígeno.
De forma adicional, o como alternativa, las proteínas de fusión de la invención pueden incluir una combinación de un enlazador entre distintos componentes de la proteína y componentes similares o semejantes de la proteína. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender al menos dos agonistas del TLR, tales como la flagelina o construcciones R0, R3, R3D0, D3N, D3NCs o D1, que incluyan adicionalmente un enlazador entre, por ejemplo, dos
o más construcciones de flagelina, al menos dos componentes de proteína antigénica que incluyan adicionalmente un enlazador entre ellos; un enlazador entre un componente de la proteína (p.ej., una construcción de flagelina) y otro componente distinto de la proteína de fusión, tal como el antígeno, o cualquier combinación de los mismos.
El enlazador puede ser un enlazador de aminoácidos. El enlazador de aminoácidos puede incluir restos de antiácidos sintéticos o de origen natural. El enlazador de aminoácidos empleado en las proteínas de la invención puede incluir al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un resto de lisina, un resto de ácido glutámico, un resto de serina y un resto de arginina.
En aún otra realización, la invención es una proteína de fusión que comprende al menos una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 29 (construcción R3) y al menos una porción de al menos un antígeno vírico, en donde el antígeno vírico está entre los restos de aminoácido 190 y 191 de la SEQ ID NO: 29 y en donde la proteína de fusión activa un Receptor de tipo Toll 5.
La Figura 56 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 29) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 0, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2, el carboxi-dominio 1 y el carboxi-dominio 0 de la flagelina. Un antígeno (Ag) está fusionado entre el amino-y el carboxi-dominio 2 de la construcción de flagelina. La construcción de flagelina de la proteína de fusión representada en la Figura 56 carece del dominio D3 de la flagelina y se denomina en la presente memoria como una “construcción R3” o la “forma R3 de la flagelina” o “construcción de flagelina R3”. “Construcción R3” (Dominio Reemplazado 3)”, como se emplea en esta memoria, significa que el Dominio 3 de la flagelina se ha reemplazado por un antígeno descrito en la presente memoria. Se puede emplear en las composiciones, proteínas de fusión y métodos de la invención, una secuencia de aminoácidos que activa un TLR5 y tiene al menos el 80,0 %, al menos el 85,0 %, al menos el 90,0 %, al menos el 95,0 %, al menos el 98,0 % y al menos el 99,0 % de identidad con una secuencia de aminoácidos contigua, sin ninguna inserción o deleción, como se expone en la SEQ ID NO: 29.
Se describe adicionalmente una proteína de fusión que comprende, en secuencia, al menos una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 29 (construcción D3) y al menos una porción de al menos un antígeno, en donde la proteína de fusión activa un Receptor de tipo Toll 5.
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La Figura 57 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una secuencia de aminoácidos de una porción de una flagelina (SEQ ID NO: 29) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 0, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2, el carboxi-dominio 1 y el carboxi-dominio 0 de la flagelina fusionados a un antígeno (Ag). El antígeno está fusionado al aminoácido terminal del carboxi-dominio 0 de la construcción de
5 flagelina. El componente de flagelina de la proteína de fusión representada en la Figura 57 carece del dominio D3 de la flagelina y se denomina en esta memoria como una “construcción D3” o la “forma D3 de la flagelina” o una “construcción de flagelina D3”. “Construcción D3”, como se emplea en esta memoria, significa que el Dominio 3 de la flagelina está ausente en el componente de flagelina, y el antígeno está unido al extremo carboxilo del Dominio 0 del componente de flagelina.
10 La Figura 58 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 30) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2 y el carboxi-dominio 1 de la flagelina. El antígeno (Ag) está fusionado entre el amino-dominio 2 y el carboxi-dominio 2 de la flagelina. El componente de flagelina de la proteína de fusión representada en la Figura 58 carece del dominio D3 de la flagelina y se denomina en esta memoria como una “construcción R3D0” o la “forma R3D0 de la flagelina” o
15 “construcción de flagelina R3D0”. “Construcción R3D0”, como se emplea en esta memoria, significa que el Dominio 3 de la flagelina está reemplazado por un antígeno y el Dominio 0 está ausente. Se puede emplear en las composiciones y proteínas de fusión una secuencia de aminoácidos que activa el TLR5 y tiene al menos aproximadamente el 50,0 %, al menos aproximadamente el 60,0 %, al menos aproximadamente el 80,0 %, al menos aproximadamente el 85,0 %, al menos aproximadamente el 90,0 %, al menos aproximadamente el 95.0 %, al menos
20 aproximadamente el 98,0 % y al menos aproximadamente el 99,0 % de identidad con una secuencia de aminoácidos contigua, sin ninguna inserción o deleción, como se expone en la SEQ ID NO: 30.
La Figura 59 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 30 y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2 y el carboxi-dominio 1 de la flagelina. Al menos una porción de un antígeno está fusionada entre el amino-y el carboxi25 dominio 2 de la construcción de flagelina y al menos una porción de otro antígeno está fusionada al carboxi-dominio 1 de la construcción de flagelina. La construcción de flagelina representada en la Figura 59 carece de los dominios D3 y D0 de la flagelina, y se denomina en esta memoria como una “construcción R03” o la forma R03 de la flagelina”
o “la construcción de flagelina R03”. “Construcción R03”, como se emplea en esta memoria, significa que el Dominio
3 de la flagelina está reemplazado por un antígeno y el Dominio 0 carboxilo terminal está reemplazado por un 30 segundo antígeno similar o distinto.
Cuando en las composiciones y las proteínas de fusión se emplea más de un antígeno, los antígenos pueden ser antígenos distintos o antígenos similares.
“Distinto,” como se emplea en esta memoria en referencia a los antígenos, significa que los antígenos son diferentes tipos de antígenos. Los antígenos distintos, por ejemplo, pueden ser antígenos de regiones diferentes de un virus o 35 de virus diferentes. Por ejemplo, un antígeno de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe (p.ej., SEQ ID NO: 499) y un antígeno de la proteína de matriz 2 del virus de la gripe (p.ej., SEQ ID NO: 485) son antígenos distintos para su uso en las proteínas de fusión de la invención. Asimismo, un antígeno del virus de gripe A y un antígeno del virus de gripe B son antígenos distintos. “Similar”, como se emplea en esta memoria en referencia a los antígenos, significa que los antígenos son antígenos de un tipo común. Por ejemplo, un antígeno de la proteína hemaglutinina
40 del virus de la gripe de la SEQ ID NO: 481 y un antígeno de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe de la SEQ ID NO: 499 son antígenos similares para su uso en las proteínas de fusión de la invención. Los antígenos similares empleados en las proteínas de fusión de la invención pueden también ser antígenos de la misma o idéntica secuencia de aminoácidos.
En aún otra realización, la invención es una proteína de fusión que comprende al menos una secuencia de
45 aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 29 (construcción R3-2xAg) y al menos una porción de al menos dos antígenos víricos, en donde al menos una antígeno vírico está entre los restos de aminoácido 190 y 191 de la SEQ ID NO: 29 y al menos otro antígeno vírico está fusionado al resto de aminoácido 405 de la SEQ ID NO: 29, y en donde la proteína de fusión activa un Receptor de tipo Toll 5.
La Figura 60 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 29) y una
50 proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 0, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2, el carboxi-dominio 1 y el carboxi-dominio 0 de la flagelina. La proteína de fusión representada en la SEQ ID NO: 29 tiene al menos una porción de al menos un antígeno y al menos una porción de al menos otro antígeno. Un antígeno está fusionado entre el amino-dominio 2 y el carboxi-dominio 2 de la construcción de flagelina. El otro antígeno está fusionado al aminoácido carboxilo terminal del dominio 0 de la construcción de
55 flagelina. La construcción de flagelina representada en la Figura 60 carece del dominio D3 de la flagelina, y se denomina en la presente memoria como una “construcción R3-2xAg” o la “forma R3-2xAg de la flagelina” o “construcción de flagelina R32x” o “R32x” o la “forma R32x de la flagelina” o “2xR3” o la “forma 2xR3 de la flagelina”
o la “forma R3/2x de la flagelina”. “Construcción R3-2xAg,” como se emplea en esta memoria, significa que el
Dominio 3 de la flagelina está reemplazado por un antígeno y otro antígeno está fusionado al extremo carboxilo del 60 Dominio 0.
Se representan a continuación las construcciones de flagelina R32x ejemplares fusionadas a un antígeno del virus de la gripe (HA1-2 (SI) (SEQ ID NO: 499)). La secuencia del antígeno HA está subrayada.
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5
Datos de alineamiento:
Longitud de alineamiento: 890 Identidad (*): 545 es el 61,24 % Fuertemente similar (:) : 76 es el 8,54 %
10 Débilmente similar (.) : 44 es el 4,94 % Diferente: 225 es el 25,28 % Secuencia 0001: fliCR32xHAl_2SI (846 restos). Secuencia 0002: fljBR32xHAl_2SI (851 restos). Secuencia 0003: EcoliR32xHAl_2SI (888 restos).
15 Secuencia 0004: BsubR32xHAl_2SI (749 restos).
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La Figura 61 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 31) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2, el carboxi-dominio 1 y el carboxi-dominio 0 de la flagelina fusionados a un antígeno (Ag). La construcción de flagelina representada en la Figura 61 carece del dominio de 3 y el amino-dominio 0 de la flagelina y se denomina en esta memoria como una “construcción D3N” o la “forma D3N de la flagelina” o “construcción de flagelina D3N”. “Construcción D3N”, como se emplea en esta memoria, significa que el extremo amino(N) del Dominio 0 está ausente, el Dominio 3 de la flagelina está ausente y el extremo carboxilo del Dominio 0 está fusionado a un antígeno descrito en la presente memoria. Se puede emplear en las composiciones, proteínas de fusión y métodos descritos en la presente memoria una secuencia de aminoácidos que activa al TLR5 y tiene al menos aproximadamente el 50,0 %, al menos aproximadamente el 60,0 %, al menos aproximadamente el 80,0 %, al menos aproximadamente el 85,0 %, al menos aproximadamente el 90,0 %, al menos aproximadamente el 95,0 %, al menos aproximadamente el 98,0 % y al menos aproximadamente el 99,0 % de identidad con una secuencia de aminoácidos contigua, sin ninguna inserción o deleción, como se expone en la SEQ ID NO: 31.
La Figura 62 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 32) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el carboxi-dominio 2, el carboxi-dominio 1 y al menos una porción del carboxi-dominio 0 de la flagelina. En una realización particular, la secuencia de aminoácidos VPQNVLSLLA (denominada como “DO-Cs”; SEQ ID NO: 693) se elimina del carboxidominio 0 de la flagelina y de la construcción de flagelina resultante fusionada a un antígeno (Ag). La construcción de flagelina representada en la Figura 62 carece del amino-dominio 0, carece del dominio 3 de la flagelina y tiene un carboxi-dominio 0 que carece de la secuencia de aminoácidos carboxilo terminal VPQNVLSLLA (SEQ ID NO: 693) de la flagelina, a la que está unida el antígeno. La construcción de flagelina resultante se denomina en esta memoria como una “construcción D3NCs” o la “forma D3NCs de la flagelina” o “construcción de flagelina de D3NCs”. “Construcción D3NCs”, como se emplea en esta memoria, significa que el extremo amino(N) del Dominio 0 está ausente, el Domino 3 de la flagelina está ausente, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 693 está ausente del carboxi-dominio 0 y el extremo carboxilo de la porción resultante de la flagelina está fusionado a un antígeno. Se puede emplear en las composiciones, proteínas de fusión y métodos descritos en la presente memoria, una secuencia de aminoácidos que activa un TLR5 y tiene al menos aproximadamente el 60,0 %, al menos aproximadamente el 70,0 %, al menos aproximadamente el 80,0 %, al menos aproximadamente el 85,0 %, al menos aproximadamente el 90,0 %, al menos aproximadamente el 95,0 %, al menos aproximadamente el 98,0 % y al menos aproximadamente el 99,0 % de identidad con una secuencia de aminoácidos contigua, sin ninguna inserción
o deleción, como se expone en la SEQ ID NO: 32.
La Figura 63 representa los dominios (D0, D1, D2, D3) de una construcción de flagelina (SEQ ID NO: 33) y una proteína de fusión que incluye, en secuencia, el amino-dominio 1 y el carboxi-dominio 1 de la flagelina fusionados a un antígeno (Ag). El antígeno está fusionado al aminoácido carboxilo terminal del carboxi-dominio 1 de la construcción de flagelina. La construcción de flagelina representada en la Figura 63 carece de todos los dominios (D0, D2, D3) excepto del amino-y carboxi-dominio 1 y se denomina en esta memoria como una "construcción D1” o la “forma D1 de la flagelina” o “construcción de flagelina D1”. “Construcción D1”, como se emplea en esta memoria, significa que el componente de flagelina consiste en el Dominio 1 fusionado a un antígeno descrito en la presente memoria. Se puede emplear en las composiciones, proteínas de fusión y métodos descritos en la presente memoria, una secuencia de aminoácidos que activa un TLR5 y tiene al menos aproximadamente el 50,0 %, al menos aproximadamente el 60,0 %, al menos aproximadamente el 70,0 %, al menos aproximadamente el 80,0 %, al menos aproximadamente el 85,0 %, al menos aproximadamente el 90,0 %, al menos aproximadamente el 95,0 %, al menos aproximadamente el 98,0 % y al menos aproximadamente el 99,0 % de identidad con una secuencia de aminoácidos contigua, sin ninguna inserción o deleción, como se expone en la SEQ ID NO: 33.
Las proteínas de fusión ejemplares de la invención que incluyen antígenos del virus de la gripe, tales como las SEQ ID NO: 451-453, 455, 457, 460, 463-465, 468, 470-474, 500-506, 511-518, 660, 664, 703, 705, 707, 709, 711, 713, 715, 717, 719, 721, 723, 725, 729, 731, 733, 735, 737, 739, 741, 743, 745, 747, 749, 751, 753, 755, 757, 759, 761, 763 y 801-812.
Se describe adicionalmente una composición que incluye al menos una porción de al menos un antígeno (p.ej., un antígeno del virus de la gripe, un antígeno del VPH y un antígeno del RSV, un antígeno de flavivirus) y al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una construcción R0, una construcción R3, una construcción R3D0, una construcción D3N, una construcción D3NCs y una construcción D0D2D3.
En todavía otra realización, la invención es el uso de una proteína de fusión de la invención para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto. Las proteínas de fusión pueden incluir al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 451-453, 455, 457, 460, 463-465, 468, 470-474, 500-506, 511-518, 660, 664, 703, 705, 707, 709, 711, 713, 715, 717, 719, 721, 723, 725, 729, 731, 733, 735, 737, 739, 741, 743, 745, 747, 749, 751, 753, 755, 757, 759, 761, 763 y 801-812. En una realización particular, la proteína de fusión se utiliza en al menos una dosis seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente una dosis de 10,0 µg, aproximadamente una dosis a 5,0 µg, aproximadamente una dosis de 3,0 µg, aproximadamente una dosis de 2,5 µg, aproximadamente una dosis de 1,0 µg, aproximadamente una dosis de 0,5 µg, aproximadamente una dosis de 0,3 µg, aproximadamente una dosis de 0,25 µg, aproximadamente una dosis de 0,1 µg, aproximadamente una dosis de 0,05 µg, aproximadamente una dosis de 0,025 µg y aproximadamente una dosis de 0,01 µg.
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“Estimulación de una respuesta inmunitaria,” como se emplea en esta memoria, se refiere a la generación de anticuerpos y/o linfocitos T para al menos una porción de un antígeno (p.ej., antígenos de HA, antígenos de M2, antígenos del RSV, antígenos del virus del papiloma humano (HPV), antígenos de flavivirus). Los anticuerpos y/o linfocitos T se pueden generar para al menos una porción de un antígeno. La estimulación de una respuesta
5 inmunitaria en un sujeto puede incluir la producción de respuestas inmunitarias humorales y/o celulares que sean reactivas frente al antígeno.
Las composiciones para su uso en los métodos para estimular respuestas inmunitarias en sujetos, pueden evaluarse por su capacidad para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto utilizando métodos bien establecidos. Los métodos ejemplares para determinar si las composiciones estimulan una respuesta inmunitaria en el sujeto, incluyen 10 medir la producción de anticuerpo específicos para el antígeno (p.ej., anticuerpos IgG) mediante una técnica adecuada tal como ensayos de ELISA; el potencial para inducir la potenciación dependiente de anticuerpos (PDA) de una infección secundaria; ensayos del tipo macrófago; neutralización evaluada utilizando la Prueba de Neutralización por Reducción de Placa (PNRP80) para antígenos del virus de la gripe y la capacidad para generar anticuerpos en suero en modelos no humanos (p.ej., ratones, conejos, monos) (Putnak, et al., Vaccine 23:4442-4452
15 (2005)).
“Estimula una respuesta inmunitaria protectora,” como se emplea en esta memoria, significa que la administración de las composiciones da como resultado la producción de anticuerpos para la proteína, para provocar de este modo que un sujeto sobreviva a la exposición a una dosis de una proteína viral, por ejemplo, consecuente al contacto del sujeto con un virus o a una dosis por lo demás letal de una proteína viral. También se estimularía en un sujeto una
20 respuesta inmunitaria protectora si el sujeto presentó signos mínimos de dolencia después del contacto con el virus.
Las técnicas para determinar las dosis de las composiciones y las proteínas de fusión que proporcionarían inmunidad protectora son conocidas para un experto en la materia (véase, por ejemplo, el documento WHO/CDS/CSR/NCS2002.5 (“Manual de la OMS sobre el Diagnóstico y la Vigilancia de la Gripe Animal” Organización Mundial de la Salud, Departamento de Vigilancia y Respuesta de Enfermedades Transmisibles, 25 Programa Global para la Gripe de la OMS; Harmon, M.W., et al., J. Clin. Microbiol. 26:333-337 (1988); Reed, L.J., et al., Am. J. Hyg. 27:493-497 (1938); Rose, T., et al., J. Clin. Microbiol. 37:937-943 (1999); Walls, H.H. et al., J. Clin. Microbiol. 23:240-245 (1986); Current Protocols in Immunology, 19.11.1-19.11.32, Cottey, R., et al., John Wiley & Sons, Inc (2001)). Las técnicas ejemplares para determinar una dosis letal pueden incluir la administración de dosis variables de un virus y una determinación del porcentaje de sujetos (p.ej., ratones) que sobreviven después de la 30 administración de la dosis de virus (p.ej., DL10, DL20, DL40, DL50, DL60, DL70, DL80, DL90). Por ejemplo, una dosis letal de un virus que da como resultado la muerte de aproximadamente el 50 % de una población de sujetos se denomina como una “DL50”; una dosis letal de un virus que da como resultado la muerte de aproximadamente el 80 % de una población de sujetos se denomina en la presente memoria como “DL80”; una dosis letal de un virus que da como resultado la muerte de aproximadamente el 90 % de una población de sujetos se denomina en la presente memoria
35 como “DL90”.
Por ejemplo, la determinación de la DL90 para una composición o una proteína de fusión que incluye un antígeno del virus de la gripe se puede realizar en sujetos (p.ej., ratones) administrando dosis variables por vía intranasal (p.ej., diluciones, tal como diluciones logarítmicas o semilogarítmicas de aproximadamente 8 x 103 dosis infecciosa embrionaria (DIE)) seguido de una evaluación de la supervivencia de los sujetos aproximadamente 14 días hasta
40 aproximadamente 21 días después de la infección con el virus. La inmunidad protectora se puede evaluar por el aspecto físico del sujeto, el comportamiento general (activo), el peso (pérdida inicial de peso seguido de la vuelta a aproximadamente el peso del sujeto antes de infección con el virus) y la supervivencia después de aproximadamente 14 días a aproximadamente 21 días después de la infección con el virus.
La evaluación de la estimulación de la inmunidad protectora por los antígenos del virus de la gripe puede hacerse
45 también empleando ensayos que evalúan la capacidad de los anticuerpos producidos en respuesta a las composiciones (p.ej., una porción de la proteína del virus de origen natural, tal como una porción de proteína de la hemaglutinina) para neutralizar la unión de la proteína vírica (p.ej., proteína hemaglutinina) a una célula hospedadora (véase, por ejemplo, Protocols in Immunonology, 19.11.1-19.11.32, Cottey, R., et al., John Wiley & Sons, Inc (2001)). La evaluación de la estimulación de la inmunidad protectora también puede hacerse empleando
50 ensayos que miden la capacidad de los anticuerpos para inhibir la unión de la hemaglutinina (véase, por ejemplo, Burnett, F.M., et al., J. exp. Biol. Med. Sci. 25:227-233 (1947); Salk, J.E. J. Immunol. 49:87-98 (1944); Current Protocols in Immunology, 19.11.1-19.11.32, Cottey, R., et al., John Wiley & Sons, Inc (2001)).
Se cree que la inhibición de la unión de la hemaglutinina es indicativa de la capacidad de los anticuerpos, formados a partir de las composiciones y mediante los métodos descritos en la presente memoria, para neutralizar los sitios de
55 unión al ácido siálico de la hemaglutinina vírica de origen natural (“neutralización de la unión a HA”) y, de este modo, prevenir la infección de la célula hospedadora como una consecuencia de la estimulación de una respuesta inmunitaria protectora. La inhibición o neutralización de la unión a la hemaglutinina se cree que correlaciona con una capacidad de una respuesta inmunitaria para proteger frente a una dosis letal de un virus.
La neutralización de la unión de HA se puede evaluar mediante ensayos in vitro (véase, por ejemplo, Current 60 Protocols in Immunology 19.11.1-19.11.32, Cottey, R., et al., Sup. 42, John Wiley & Sons, Inc. (2001) y el Manual de la OMS sobre el Diagnóstico y Vigilancia de la Gripe Animal, Webster, R., et al., páginas 28-36, 48-54, 82-92 (2002)). Los ensayos de neutralización vírica ejemplares se basan en la capacidad del suero para unirse de forma específica y prevenir la replicación en cultivo del virus de la gripe, tal como en la línea celular de Riñón Canino Madin-Darby (MDCK). Brevemente, las células se cultivan en placas de 96 pocillos en presencia de un virus titulado
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5 de forma previa y se observa al microscopio el efecto citopático del virus replicante. Para analizar el suero, se preparan diluciones en serie del suero y se preincuban con la reserva de virus durante aproximadamente dos horas a 37ºC, antes de infectar las células MDCK. La mezcla se incuba durante dos horas adicionales después de lo cual la mezcla virus/suero se retira y se reemplaza por medio recién preparado. Las células se crecen durante 4 días. Los pocillos valoran como positivos para crecimiento viral si al menos aproximadamente el 50 % de las células están muertas en al menos aproximadamente la mitad de los pocillos para una dada dilución de suero. La inversa de la dilución más elevada de suero que protege de la muerte a aproximadamente la mitad de las células, en al menos aproximadamente la mitad de los pocillos, se considera el título de neutralización.
Como alternativa, para evaluar la neutralización de la unión a la HA se puede realizar un ensayo de microneutralización in vitro. Por ejemplo, el suero se diluye y preincuba con un título conocido de virus y se mezcla
15 con células MDCK, como se describió anteriormente. Después de dos días de incubación, las células se lavan y se fijan con acetona. Las placas se revelan como un ELISA, utilizando un anticuerpo monoclonal para el antígeno nuclear NP del virus de la gripe. El título de microneutralización se determina como la inversa de la dilución más elevada que produce menos de aproximadamente el 50 % de la lectura de anti NP de los pocillos de control con solo virus.
El ensayo de Inhibición de la Hemaglutinación (IHA) es a base del antígeno HA en la superficie de glóbulos rojos (GR) aglutinantes del virus de la gripe y la prevención de la precipitación de los glóbulos rojos. Los anticuerpos que se unen de forma específica a las regiones de unión a ácido siálico de la HA previenen la aglutinación, lo que permite la precipitación. El ensayo se realiza en placas de 96 pocillos con fondo en V, con GR de pollo recién obtenidos. Se titula una reserva de antígeno vírico de forma que esté presente un exceso de aproximadamente 4 25 veces de antígeno con respecto a la cantidad mínima necesaria para prevenir la precipitación. El suero de prueba, que puede ser de varias especies que incluyen ratón, hurón, aves de corral o seres humanos, se calienta hasta aproximadamente 56ºC para inactivar el complemento. Se realizan diluciones en serie con factor del suero inactivado y se mezclan con la reserva de HA. Después de aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente, se añaden los GR y la placa se incuba durante aproximadamente 30 a aproximadamente 45 minutos. Los resultados se valoran mediante observaciones: la aglutinación da como resultado pocillos turbios mientras que la inhibición da como resultado un “botón” de glóbulos rojos precipitados en el fondo del pocillo. Los controles incluyen GR sin HA, que forma un botón, y HA y GR sin suero, que permanecen turbios. El título de IHA de una muestra de suero particular es la inversa de la última dilución que previene la aglutinación (es decir, forma un botón). Por ejemplo, si una dilución de aproximadamente 1:128 se lee como un botón, pero la dilución 1:256 no, el título de IHA es de
35 aproximadamente 128.
Las técnicas ejemplares para determinar la inmunidad protectora de las composiciones y las proteínas de fusión que incluyen antígenos del HPV, incluyen la determinación de la DL90 en sujetos (p.ej., ratones) implantando dosis variables por vía subcutánea (p.ej., diluciones, tal como diluciones logarítmicas y semilogarítmicas) de células tumorales de pulmón de ratón TC-1, y midiendo volumen del tumor durante aproximadamente 5 a aproximadamente 6 semanas posimplantación. Se puede evaluar la inmunidad protectora en los ratones inmunizados de forma experimental en comparación con ratones no inmunizados, por ejemplo, midiendo una reducción de volumen del tumor, un retraso en el inicio del crecimiento del tumor o un aumento del tiempo de supervivencia del hospedador inmunizado de forma experimental en comparación con el hospedador no inmunizado (Bermudez-Humaran, Luis G, et al., J. Immunol., 175: 7297-7302 (2005); Qian, X, et al., Immunol Lett., 102:191-201 (2006)).
45 Las técnicas para evaluar la inmunidad protectora de las composiciones y proteínas de fusión que incluyen antígenos del RSV incluyen, por ejemplo, la determinación de la DL90 en sujetos (p.ej., ratones) administrando dosis variables por vía intranasal (p.ej., diluciones, tales como diluciones logarítmicas y semilogarítmicas) seguido de una evaluación de la supervivencia de los sujetos aproximadamente 14 días a aproximadamente 21 días después de la infección con el virus. La inmunidad protectora se puede evaluar por el aspecto físico del sujeto, el comportamiento general (activo), el peso (pérdida inicial de peso seguido del retorno a un peso aproximadamente el peso del sujeto antes de la infección con el virus) y la supervivencia después de aproximadamente 14 a aproximadamente 21 días después de la infección con el virus.
Por lo tanto, la administración de las composiciones y proteínas de fusión puede proporcionar inmunidad protectora frente a una infección consecuente a la exposición del ser humano a una fuente del antígeno. Las composiciones y
55 proteínas de fusión se pueden emplear como vacunas para prevenir la enfermedad y para minimizar los síndromes clínicos de la dolencia consecuente a la exposición al antígeno vírico.
Las construcciones de flagelina descritas en la presente memoria, por ejemplo, una construcción R3 y una construcción R3-2xAg, pueden tener perfiles de inmunogenicidad (p.ej., la capacidad para generar anticuerpos para el componente de flagelina y el componente antigénico de una proteína de fusión cuando la construcción está fusionada a un antígeno) y de reactogenicidad (p.ej., la producción de efectos secundarios) diferentes, que también pueden variar dependiendo del antígeno que está fusionado a la construcción de flagelina. Los perfiles de inmunogenicidad y de reactogenicidad variados pueden ser útiles en los métodos para estimular una respuesta inmunitaria o inmunidad protectora en sujetos asociados a diferentes experiencias inmunológicas.
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Por ejemplo, como se describe en la presente memoria, una proteína de fusión que incluye una construcción R3 y una porción de un antígeno de HA es moderadamente inmunogénica en un modelo de conejo y, de forma
5 importante, tiene baja reactogenicidad, lo que puede ser útil en composiciones en que el sujeto, desde el punto de vista inmunológico, no se ha expuesto previamente al antígeno (p.ej., el sujeto no se ha expuesto previamente al antígeno) y se necesitan grandes cantidades del antígeno para sensibilizar una respuesta; o cuando se utilizan múltiples antígenos para formar una vacuna multivalente y la carga total de flagelina es alta. En estos casos, la necesidad de una reactogenicidad baja supera la necesidad de una inmunopotenciación.
10 Las circunstancias de no exposición previa desde el punto de vista inmunológico pueden incluir, por ejemplo, la aplicación a una epidemia pandémica o la transmisión de un virus entre especies, tal como de un ave a un ser humano. Las circunstancias para la utilización una vacuna multivalente incluirían, por ejemplo, la gripe estacional, en donde se administran juntos, en una única vacuna, antígenos que corresponden a múltiples subtipos del virus de la gripe
15 Por el contrario, existen casos, o más específicamente antígenos, en los que es elevada la necesidad de una inmunopotenciación. Esto podría referirse a formas variables de un antígeno, tal como el virus de la gripe, para el que algunos de los subtipos son pobremente inmunogénicos, tales como el virus de la gripe B o H5. Como se describe en la presente memoria, una proteína de fusión que incluye una construcción R32x y una antígeno del virus de la gripe suscita una contundente respuesta inmunológica para el antígeno del virus de la gripe, con baja
20 reactogenicidad.
Adicionalmente, se describe una secuencia de ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos y las proteínas de fusión. La secuencia de ácido nucleico puede incluir la deleción de al menos un sitio de glucosilación en la secuencia de ácido nucleico aislada. La secuencia de ácido nucleico puede alterarse o mutarse para delecionar un sitio de glucosilación que incluya un supuesto sitio de N-glucosilación, que puede estar determinado por la 25 secuencia consenso NXS o NXT, donde la “X” es cualquier aminoácido. La mutación de un supuesto sitio de glucosilación puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en al menos una porción de al menos un componente de flagelina de una proteína de fusión, al menos una porción de un agonista del TLR (p.ej., agonista del TLR5) y al menos una porción de al menos un componente antigénico de la proteína de fusión. Por ejemplo, para delecionar el supuesto sitio de glucosilación se puede mutar al menos un miembro seleccionado del
30 grupo que consiste en los restos de aminoácido 19, 101, 292, 356 y 375 de SEQ ID NO: 29. La mutación del resto de asparagina (D) y en el supuesto de glucosilación puede ser una mutación en cualquier secuencia de aminoácidos, tal como glutamina (Q) o ácido aspártico.
Asimismo, para delecionar el supuesto sitio de glucosilación puede mutarse al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en los restos de aminoácido 19, 101, 292, 356 y 375 de la SEQ ID NO: 29.
35 Las secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser componentes de las composiciones. Una composición puede incluir al menos una porción de una proteína flagelina de origen natural, en donde la porción incluye, en secuencia, un amino-dominio 0, un amino-dominio 1, un amino-dominio 2, un carboxi-dominio 2, un carboxidominio 1 y un carboxi-dominio 0, por ejemplo, la SEQ ID NO:29.
“Al menos una porción,” como se emplea en esta memoria en referencia a una proteína flagelina de origen natural,
40 se refiere a una parte de la flagelina de origen natural que es menor que la flagelina de origen natural entera. “De origen natural”, como se emplea en esta memoria, se refiere a la flagelina entera, como aparece en la naturaleza. Una flagelina de origen natural tiene un amino-dominio 0, un amino-dominio 1, un amino-dominio 2, un dominio 3, un carboxi-dominio 2, un carboxi-dominio 1 y un carboxi-dominio 0 (véanse, por ejemplo, las SEQ ID NO: 12 y 22), como se muestra en la presente memoria. Una porción de una flagelina se designa a base de la estructura cristalina
45 de la flagelina, que representa el amino-dominio 0, el amino-dominio 1, el amino-dominio 2, el dominio 3, el carboxidominio 2, el carboxi-dominio 1 y el carboxi-dominio 0 de la flagelina de S. typhimurium, como se describe en Yonekura, K., et al., Nature 424: 643-650 (2003).
Las composiciones que incluyen las secuencias de aminoácidos de la invención pueden incluir, adicionalmente, al menos una porción de al menos un antígeno. La porción de la proteína flagelina de origen natural y el antígeno 50 pueden ser componentes de una proteína de fusión en la composición. En una realización, el antígeno puede estar fusionado a la porción de la proteína flagelina de origen natural entre el amino-dominio 2 y el carboxi-dominio 2 (una construcción R3), que puede incluir adicionalmente, de forma opcional, fusionar al menos una porción de al menos un antígeno adicional al carboxi-dominio 0 de la porción de la proteína flagelina de origen natural (una construcción R3-2XAg). El antígeno y el antígeno adicional (también denominado en esta memoria como “otro antígeno”) pueden
55 ser antígenos distintos o similares. En otra realización, el antígeno está fusionado al carboxi-dominio 0 de la porción de la proteína flagelina de origen natural (la construcción D3).
La flagelina en las composiciones, proteínas de fusión y métodos descritos en la presente memoria pueden tener al menos una porción de una flagelina de S. typhimurium (Número de Registro de GenBank AF045151); al menos una porción de la flagelina de S. typhimurium seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO: 15; al menos una porción de una flagelina de S. muenchen (Número de Registro de GenBank AB028476) que incluye al menos una porción de la SEQ ID NO: 16 y la SEQ ID NO: 17; al menos una porción de la flagelina de P. aeruginosa que incluye al menos una porción de la SEQ ID NO: 18; al menos una
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5 porción de una flagelina de Listeria monocytogenes que incluye al menos una porción de la SEQ ID NO: 19; al menos una porción de una flagelina de E. coli que incluye al menos una porción de la SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21; al menos una porción de una flagelina de Yersinia y al menos una porción de una flagelina de Campylobacter.
Las composiciones y proteínas de fusión descritas en la presente memoria incluyen secuencias de aminoácidos que
10 activan al Receptor de tipo Toll 5 (p.ej., las SEQ ID NO: 29-34) pueden incluir adicionalmente al menos un agonista del Receptor de tipo Toll (TLR) seleccionado del grupo que consiste en un agonista del Receptor de tipo Toll 2, un agonista del Receptor de tipo Toll 3 , un agonista del Receptor de tipo Toll 4, un agonista del Receptor de tipo Toll 6, un agonista del Receptor de tipo Toll 7, un agonista del Receptor de tipo Toll 8, un agonista del Receptor de tipo Toll 9 y un agonista del Receptor de tipo Toll 10, que se puede administrar a sujetos en combinación con las
15 secuencias de aminoácidos que activan al TLR5 y proteínas de fusión de la invención. Estos agonistas del TLR adicionales se pueden administrar en combinación o en secuencia con las construcciones de flagelina y las proteínas de fusión de la invención.
“Agonista,” como se emplea en esta memoria haciendo referencia a un TLR, significa una molécula que activa una ruta de señalización del TLR. Una ruta de señalización del TLR es una ruta intracelular de transducción de señales 20 empleada por un TLR en particular, que se puede activar mediante un ligando del TLR o un agonista del TLR. Los TLR emplean rutas intracelulares comunes e incluyen, por ejemplo, NF-KB, la quinasa Jun N terminal y la proteína cinasa activada por mitógeno. El agonista del Receptor de tipo Toll puede incluir al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un agonista del TLR1, un agonista del TLR2 (p.ej., Pam3Cys, Pam2Cys, lipoproteína bacteriana), un agonista de TLR3 (p.ej., ARNbc), un agonista del TLR4 (p.ej., lipopolisacárido bacteriano), un
25 agonista del TLR5 (p.ej., una flagelina), un agonista del TLR6, un agonista del TLR7, un agonista del TLR8, un agonista del TLR9 (p.ej., motivos de ADN no metilado), un agonista del TLR10, un agonista del TLR11 y un agonista del TLR12. Los componentes de agonista del Receptor de tipo Toll adecuados para su uso en la invención se describen, por ejemplo, en las Solicitudes de EE.UU. N.º: 11/820.148, 11/879.695, 11/714.873 y 11/714.684.
Adicionalmente, en las composiciones el agonista del Receptor de tipo Toll puede incluir al menos un resto de
30 cisteína en el aminoácido terminal del extremo amino y/o el aminoácido terminal del extremo amino o carboxilo del agonista del Receptor de tipo Toll. Por ejemplo, RGGSK (SEQ ID NO: 7) puede adicionalmente incluir al menos un resto de cisteína en un péptido unido al resto amino o carboxilo terminal.
Los agonistas del Receptor de tipo Toll para su uso en los métodos y composiciones también pueden ser un componente de agonista del Receptor de tipo Toll que sea al menos una porción de un agonista del receptor de tipo 35 Toll que incluya al menos un resto de cisteína en una posición donde no aparece una cisteína en el agonista del Receptor de tipo Toll natural y el componente de agonista del Receptor de tipo Toll active un Receptor de tipo Toll. El resto de cisteína puede ser un añadido al agonista del Receptor de tipo Toll natural, tal como el agonista del TLR5 (p.ej., flagelina) o a las construcciones de flagelina (p.ej., una construcción R0, una construcción R3, una construcción R3D0, una construcción R03, una construcción D3N, una construcción D3NCs, una construcción D1).
40 Como una alternativa, o de forma adicional, el resto de cisteína puede sustituirse por un aminoácido en la flagelina de origen natural o en un agonista del TLR5 o construcción de flagelina de la invención. La adición de una cisteína o la sustitución de la cisteína se puede lograr mediante métodos recombinantes, alternando secuencias de ácido nucleico para codificar restos de cisteína en la flagelina, TLR5 o construcción de flagelina, empleando técnicas bien conocidas.
45 El resto de cisteína que sustituye al menos un resto de aminoácido en una secuencia de aminoácidos de la flagelina de origen natural del componente de flagelina, puede estar alejado de al menos un aminoácido del sitio de reconocimiento del Receptor de tipo Toll 5 del componente de flagelina. “Sitio de reconocimiento del Receptor de tipo Toll 5”, significa la parte del ligando del TLR5 (p.ej., agonista del TLR5) que interactúa con el TLR5 para mediar una respuesta celular. “Sitio de reconocimiento del Receptor de tipo Toll 5” también se denomina como “sitio de
50 activación del Receptor de tipo Toll 5” y un “dominio de activación del Receptor de tipo Toll 5”.
Asimismo, “sitio de reconocimiento del Receptor de tipo Toll”, significa la parte del ligando del Receptor de tipo Toll (p.ej., un agonista del Receptor de tipo Toll) que interactúa con su respectivo TLR para mediar una respuesta celular. “Sitio de reconocimiento del Receptor de tipo Toll” también se denomina un “sitio de activación del Receptor de tipo Toll” y un “dominio de activación del Receptor de tipo Toll”.
55 El componente antigénico de una proteína de fusión puede estar conjugado a los componentes de flagelina de forma química (p.ej., construcción R3, construcción R3-2xAg) y los componentes de agonista del Receptor de tipo Toll. La conjugación química (también denominada en la presente memoria como “acoplamiento químico”) puede incluir conjugación por un grupo reactivo, tal como un grupo tiol (p.ej., un resto de cisteína) o por derivatización de un grupo primario (p. ej., un amino terminal) o secundario (p. ej., lisina). Se pueden utilizar distintos agentes de
60 entrecruzamiento para conjugar de forma química componentes de flagelina al componente antigénico. Los agentes
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de entrecruzamiento ejemplares están disponibles de forma comercial, por ejemplo, de Pierce (Rockland, Ill). Los métodos para conjugar de forma química el componente antigénico al componente de flagelina son bien conocidos e incluyen el uso de agentes de entrecruzamiento disponibles de forma comercial, tales como los descritos en la presente memoria.
Por ejemplo, la conjugación de un componente antigénico a un componente de flagelina, un componente de agonista del Receptor de tipo Toll o una construcción de flagelina (p. ej., una construcción R0, una construcción R3, una construcción R3D0, una construcción R03, una construcción D3N, una construcción D3NCs, una construcción D1) puede ser a través de al menos un resto de cisteína del componente de flagelina, el componente del Receptor de tipo Toll o la construcción de flagelina, y al menos un resto de cisteína de un componente antigénico, empleando técnicas establecidas. El componente antigénico se puede derivatizar con un agente entrecruzador específico de sulfhidrilo homobifuncional; desalar para eliminar el agente entrecruzador que no reaccionó y, después, añadir el compañero y conjugar a través de al menos un resto de cisteína. Los reactivos ejemplares para su uso en los métodos de conjugación pueden adquirirse de forma comercial de Pierce (Rockland, Ill), por ejemplo, BMB (N.º de Catálogo: 22331), BMDB (N.º de Catálogo: 22332), BMH (N.º de Catálogo: 22330), BMOE (N.º de Catálogo: 22323), BM[PEO]3 (N.º de Catálogo: 22336), BM[PEO]4 (N.º de Catálogo: 22337), DPDPB (N.º de Catálogo: 21702), DTME (N.º de Catálogo: 22335), HBVS (N.º de Catálogo: 22334).
Como alternativa, el componente antigénico también se puede conjugar a restos de lisina en componentes de flagelina, la flagelina, componentes de agonista del Receptor de tipo Toll, agonistas del Receptor de tipo Toll o construcciones de flagelina de la invención. Un componente de proteína que no contiene restos de cisteína se derivatiza con una amina heterobifuncional y un agente entrecruzador específico de sulfhidrilo. Después de desalar, se añade el compañero que contiene cisteína y se conjuga. Los reactivos ejemplares para su uso en los métodos de conjugación se pueden adquirir de Pierce (Rockland, Ill), por ejemplo, AMAS (N.º de Catálogo: 22295), BMPA (N.º de Catálogo: 22296), BMPS (N.º de Catálogo: 22298), EMCA (N.º de Catálogo: 22306), EMCS (N.º de Catálogo: 22308), GMBS (N.º de Catálogo: 22309), KMUA (N.º de Catálogo: 22211), LC-SMCC (N.º de Catálogo: 22362), LC-SPDP (N.º de Catálogo: 21651), MBS (N.º de Catálogo: 22311), SATA (N.º de Catálogo: 26102), SATP (N.º de Catálogo: 26100), SBAP (N.º de Catálogo: 22339), SIA (N.º de Catálogo: 22349), SIAB (N.º de Catálogo: 22329), SMCC (N.º de Catálogo: 22360), SMPB (N.º de Catálogo: 22416), SMPH (N.º de Catálogo: 22363), SMPT (N.º de Catálogo: 21558), SPDP (N.º de Catálogo: 21857), Sulfo-EMCS (N.º de Catálogo: 22307), Sulfo-GMBS (N.º de Catálogo: 22324), Sulfo-KMUS (N.º de Catálogo: 21111), Sulfo-LC-SPDP (N.º de Catálogo: 21650), Sulfo-MBS (N.º de Catálogo: 22312), Sulfo-SIAB (N.º de Catálogo: 22327), Sulfo-SMCC (N.º de Catálogo: 22322), Sulfo-SMPB (N.º de Catálogo: 22317), Sulfo-LC-SMPT (N.º de Catálogo:21568).
De forma adicional, o como alternativa, los componentes antigénicos también se pueden conjugar componentes de flagelina, componentes de agonista del Receptor de tipo Toll, tal como construcciones de flagelina, de la invención, mediante al menos un resto de lisina en ambos compañeros de conjugado. Los dos compañeros de conjugado se combinan junto con un agente entrecruzador específico de amina homo-bifuncional. Después, el heteroconjugado apropiado se purifica de agregados y homoconjugados no deseados. Los reactivos ejemplares para su uso en los métodos de conjugación se pueden adquirir de Pierce (Rockland, Ill), por ejemplo, BSOCOES (N.º de Catálogo: 21600), BS3 (N.º de Catálogo: 21580), DFDNB (N.º de Catálogo: 21525), DMA (N.º de Catálogo: 20663), DMP (N.º de Catálogo: 21666), DMS (N.º de Catálogo: 20700), DSG (N.º de Catálogo: 20593), DSP (N.º de Catálogo: 22585), DSS (N.º de Catálogo: 21555), DST (N.º de Catálogo: 20589), DTBP (N.º de Catálogo: 20665), DTSSP (N.º de Catálogo: 21578), EGS (N.º de Catálogo: 21565), MSA (N.º de Catálogo: 22605), Sulfo-DST (N.º de Catálogo: 20591), Sulfo-EGS (N.º de Catálogo: 21566), THPP (N.º de Catálogo: 22607).
De forma similar, los componentes de proteína que se pueden conjugar a los componentes de flagelina, componentes de agonista del Receptor de tipo Toll o las construcciones de flagelina de la invención mediante al menos un grupo carboxilo (p.ej., ácido glutámico, ácido aspártico, o el extremo carboxilo del péptido o proteína) en un compañero y las aminas en el otro compañero. Los dos compañeros de conjugación se mezclan juntos con el reactivo de entrecruzamiento heterobifuncional apropiado. Después, el heteroconjugado apropiado se purifica de agregados y de homoconjugados no deseados. Los reactivos ejemplares para su uso en los métodos de conjugación se pueden adquirir de Pierce (Rockland, Ill), por ejemplo, AEDP (N.º de Catálogo: 22101), EDC (N.º de Catálogo: 22980) y TFCS (N.º de Catálogo: 22299).
Al menos un resto de cisteína puede sustituirse por al menos un aminoácido en un componente de flagelina, flagelina o construcción de flagelina de la secuencia de aminoácidos de la flagelina de origen natural de la invención. El resto de cisteína puede sustituir al menos a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 1, 237, 238, 239, 240, 241 y 495 de la SEQ ID NO: 13; a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 1, 240, 241, 242, 243, 244 y 505 de la SEQ ID NO: 12; a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 1, 237, 238, 239, 240, 241 y 504 de la SEQ ID NO: 16; a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 1, 211, 212, 213 y 393 de la SEQ ID NO: 18; a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 1, 151, 152, 153, 154 y 287 de la SEQ ID NO: 19; a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 1, 238, 239, 240, 241, 242, 243 y 497 de la SEQ ID NO: 20; a al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 1, 237, 238, 239, 240, 241 y 495 de la SEQ ID NO: 13. La flagelina o construcciones de flagelina, tales como una construcción R0, una construcción R3, una construcción R3D0, una construcción R03, una construcción R3-2xAg, una construcción D3N, una construcción D3NCs y una construcción D1, en que una cisteína sustituye un aminoácido en una flagelina de origen natural, se puede utilizar para conjugar de forma química el componente de flagelina a un antígeno. Además, los restos de cisteína pueden añadirse a la secuencia de aminoácidos de origen natural de una flagelina o construcción de flagelina de la invención.
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5 Se puede poner un resto de cisteína dentro del dominio D1/D2, próximo al extremo amino y el extremo carboxilo, alejado del sitio de reconocimiento del TLR5. Como alternativa, o de forma adicional, el resto de cisteína se puede poner en el punto distal del dominio hipervariable en aproximadamente el aminoácido 237, aproximadamente 238, aproximadamente 239, aproximadamente 240 y aproximadamente 241 de la SEQ ID NO: 13. Sustituir aminoácidos polares o cargados es preferible a sustituir aminoácidos hidrófobos con restos de cisteína. La sustitución dentro del
10 sitio de reconocimiento de TLR5 es menos preferente.
La flagelina de Salmonella typhimurium STF1 (FliC) se representa en la SEQ ID NO: 13 (N.º de Registro: P06179). El sitio de reconocimiento del TLR5 está en aproximadamente los aminoácido 79 a aproximadamente 117 y aproximadamente 408 a aproximadamente 439 de la SEQ ID NO: 13. Los restos de cisteína pueden sustituir a, o incluirse en combinación con, aminoácidos fuera del sitio de reconocimiento del TLR5, por ejemplo, los aminoácidos
15 aproximadamente 237 a aproximadamente 241 de la SEQ ID NO: 13.
La flagelina STF2 (FljB) de Salmonella typhimurium se representa en la SEQ ID NO: 12. EL sitio de reconocimiento del TLR5 está en los aminoácidos aproximadamente 80 a aproximadamente 118 y aproximadamente 420 a aproximadamente 451 de la SEQ ID NO: 12. Los restos de cisteína pueden sustituir a, o incluirse en combinación con, aminoácidos fuera del sitio de reconocimiento del TLR5, por ejemplo, los aminoácidos aproximadamente 240 a
20 aproximadamente 244 de la SEQ ID NO: 12.
La flagelina de Salmonella muenchen se representa en la SEQ ID NO: 16 (N.º de Registro: n.º P06179). El sitio de reconocimiento del TLR5 está en los aminoácidos aproximadamente 79 a aproximadamente 117 y aproximadamente 418 a aproximadamente 449 de la SEQ ID NO: 16. Los restos de cisteína pueden sustituir a, o incluirse en combinación con, aminoácidos fuera del sitio de reconocimiento del TLR5, por ejemplo, los aminoácidos
25 aproximadamente 237 a aproximadamente 241 de la SEQ ID NO: 16.
La flagelina de Escherichia coli se representa en la SEQ ID NO: 20 (N.º de Registro: P04949). El sitio de reconocimiento del TLR5 está en los aminoácidos aproximadamente 79 a aproximadamente 117 y aproximadamente 410 a aproximadamente 441 de la SEQ ID NO: 20. Los restos de cisteína pueden sustituir a, o incluirse en combinación con, aminoácidos fuera del sitio de reconocimiento del TLR5, por ejemplo, los aminoácidos
30 aproximadamente 238 a aproximadamente 243 de la SEQ ID NO: 20.
La flagelina de Pseudomonas auruginosa se representa en la SEQ ID NO: 18. El sitio de reconocimiento del TLR5 está en los aminoácidos aproximadamente 79 a aproximadamente 114 y aproximadamente 308 a aproximadamente 338 de la SEQ ID NO: 18. Los restos de cisteína pueden sustituir a, o incluirse en combinación con, aminoácidos fuera del sitio de reconocimiento del TLR5, por ejemplo, los aminoácidos aproximadamente 211 a aproximadamente
35 213 de la SEQ ID NO: 18.
La flagelina de Listeria monocytogenes se representa en la SEQ ID NO: 19. El sitio de reconocimiento del TLR5 está en los aminoácidos aproximadamente 78 a aproximadamente 116 y aproximadamente 200 a aproximadamente 231 de la SEQ ID NO: 19. Los restos de cisteína pueden sustituir a, o incluirse en combinación con, aminoácidos fuera del sitio de reconocimiento del TLR5, por ejemplo, aminoácidos aproximadamente 151 a aproximadamente 154 de la
40 SEQ ID NO: 19.
Se han descrito en STF2 sitios de reconocimiento del TLR5 definidos de forma experimental (véase, por ejemplo, Smith, K.D., et al., Nature Immunology 4: 1247-1253 (2003)), en los aminoácidos aproximadamente 79 a aproximadamente 117 y aproximadamente 420 a aproximadamente 451. Además, Smith, K.D., et al., Nature Immunology 4: 1247-1253 (2003), a base de la homología de secuencia, identificaron sitios de reconocimiento del 45 TLR5 en otras flagelinas, tal como STF1, en los aminoácidos aproximadamente 79 a aproximadamente 117, aproximadamente 408 a aproximadamente 439; P. aeruginosa en los aminoácidos aproximadamente 79 a aproximadamente 117, aproximadamente 308 a aproximadamente 339; L. pneumophila en los aminoácidos aproximadamente 79 a aproximadamente 117, aproximadamente 381 a aproximadamente 419, E. coli en los aminoácidos aproximadamente 79 a aproximadamente 117, aproximadamente 477, aproximadamente 508;
50 S. marcesens en los aminoácidos aproximadamente 79 a aproximadamente 117, aproximadamente 265 a aproximadamente 296; B. subtilus en los aminoácidos aproximadamente 77 a aproximadamente 117, aproximadamente 218 a aproximadamente 249 y L. monocytogenes en los aminoácidos aproximadamente 77 a aproximadamente 115, aproximadamente 200 a aproximadamente 231.
Se ha determinado la estructura de alta resolución de STF1 (FliC) (SEQ ID NO: 13) y puede ser una base para el
55 análisis del reconocimiento del TLR5 por una flagelina y para el emplazamiento de sustituciones/adiciones de cisteína. La región de mayor homología de secuencia de las flagelinas está en el sitio de reconocimiento de TLR5, que incluye los dominios D1 y DO. Los dominios D1 y D2 1 y domino 0, que incluyen el sitio de reconocimiento del TLR5. La región de menor homología de secuencia entre las flagelinas es la región hipervariable.
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Se cree que la capacidad del componente de flagelina, el componente de agonista del Receptor de tipo Toll o la construcción de flagelina, para activar el TLR5, se puede lograr manteniendo los sitios de conjugación (restos de cisteína sustituidos por al menos un aminoácido en un componente de flagelina de la secuencia de aminoácidos de la flagelina de origen natural o por lo menos una porción de una secuencia de aminoácidos de la flagelina de origen natural, en combinación con el resto de cisteína), alejados del sitio de reconocimiento del TLR5 o del TLR. Por ejemplo, para STF1 (SEQ ID NO: 13), para la que está disponible una determinación estructural de alta resolución, esto puede conseguir en el dominio D1, el dominio D2 o en la región bisagra. En el dominio D1/D2 los extremos amino y carboxilo pueden estar alejados (también denominado en la presente memoria como “distales”) del sitio de reconocimiento del TLR5 y, apartándose del extremo amino o del carboxilo, se puede poner el sitio de conjugación más cerca del sitio de reconocimiento y se puede interferir con la actividad del TLR5. En la región bisagra, los aminoácidos aproximadamente 237 a aproximadamente 241 de la SEQ ID NO: 13 están aproximadamente en la otra punta del “bumerán” y están aproximadamente a la misma distancia del sitio de reconocimiento del TLR5 que los extremos amino y carboxilo. Este sitio también puede ser un emplazamiento que mantenga el reconocimiento del TLR5.
Para el emplazamiento de los sitios de conjugación se puede tener en consideración la identidad de aminoácidos. Es más probable que los aminoácidos polares y cargados (p.ej. serina, ácidos aspártico, lisina) estén expuestos en la superficie y sean susceptibles de unirse a un antígeno. Es más probable que los aminoácidos hidrófobos (p.ej. valina, fenilalanina) estén ocultos y que participen en interacciones estructurales, y deberían evitarse.
Las composiciones que incluyen componentes de flagelina con restos de cisteína o componentes de agonista del Receptor de tipo Toll con restos de cisteína, activan al TLR5 y pueden conjugarse de forma química a antígenos.
Pueden añadirse o sustituirse en antígenos restos de cisteína por aminoácidos (p.ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 restos de cisteína), para la configuración química en componentes de flagelina de la invención. Por ejemplo, los restos de cisteína en antígenos del HPV o del RSV, antígenos del virus de la gripe, antígenos de flavivirus, se pueden reemplazar (también denominado en esta memoria como “sustituir”) por un resto de serina o un resto de alanina.
La composición puede incluir al menos una porción de un antígeno y una flagelina o construcción de flagelina que sea al menos una porción de una flagelina, en donde al menos una lisina del componente de flagelina o construcción de flagelina se ha sustituido por al menos otro aminoácido, tal como una arginina, con lo que el componente de flagelina activa un Receptor de tipo Toll 5.
“Sustituido”, como se emplea en esta memoria en referencia a la flagelina, componente de flagelina, construcción de flagelina o componente de agonista del Receptor de tipo Toll, significa que al menos un aminoácidos, tal como una lisina del componente de flagelina, se ha modificado a otro resto de aminoácido, por ejemplo, una sustitución conservativa (p.ej. arginina, serina, histidina), para formar de este modo un componente de flagelina sustituido o componente de agonista del Receptor del tipo Toll sustituido. El componente de flagelina sustituido o componente de agonista del Receptor del tipo Toll sustituido, se puede preparar generando construcciones recombinantes que codifican la flagelina con las sustituciones, mediante medios químicos, mediante la generación de proteínas o péptidos de al menos una porción de la flagelina mediante técnicas de síntesis de proteínas, o cualquier combinación de los mismos.
El resto de lisina que está sustituido por un aminoácido (p.ej. arginina, serina, histidina) puede ser al menos un resto de lisina seleccionado del grupo que consiste en las lisinas 19, 41, 58, 135, 160, 177, 179, 203, 215, 221, 228, 232, 241, 251, 279, 292, 308, 317, 326, 338, 348, 357, 362, 369, 378, 384, 391 y 410 de la SEQ ID NO: 13.
La flagelina puede ser una flagelina de S. typhimurium que incluye la SEQ ID NO: 14. El resto de lisina que está sustituido por un aminoácido (p.ej. arginina, serina, histidina) puede ser al menos un resto de lisina seleccionado del grupo que consiste en las lisinas 20, 42, 59, 136, 161,177, 182, 189, 209, 227, 234, 249, 271, 281, 288, 299, 319, 325, 328, 337, 341, 355, 357, 369, 381, 390, 396, 403, 414 y 422 de la SEQ ID NO: 14.
La flagelina puede ser una fliC de E. coli que incluye la SEQ ID NO: 20. La flagelina puede ser una de S. muenchen, que incluye la SEQ ID NO: 17. La flagelina puede ser una flagelina de P. aeruginosa que incluye la SEQ ID NO: 18. La flagelina puede ser una flagelina de Listeria monocytogenes que incluye la SEQ ID NO: 19.
Determinados restos de lisina en la flagelina que están cerca de o en el dominio 1, pueden ser importantes en la unión de la flagelina al TLR5. Por ejemplo, los restos de lisina en los aminoácidos 58, 135, 160 y 410 de la SEQ ID NO: 13 pueden sustituirse por al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un resto de arginina, un resto de serina o un resto de histidina. La derivatización de tales restos de lisina a, por ejemplo, antígenos conjugados de forma química a flagelinas, puede disminuir la capacidad o la afinidad de unión de la flagelina al TLR5 y, así, reducir una respuesta inmunitaria innata mediada por el TLR5.
La sustitución de al menos un resto de lisina en una flagelina que pueda estar cerca de regiones de la flagelina que son importantes en la mediación de interacciones con el TLR5 (p.ej. dominio 1) por otro aminoácido (p.ej. arginina, serina, histidina), puede preservar o potenciar la unión de la flagelina al TLR5. En una realización particular, la sustitución de aminoácido es una sustitución de aminoácido conservativa por al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en arginina, serina e histidina. Los reactivos ejemplares disponibles de forma comercial para la
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conjugación química se describen en la presente memoria.
Determinados restos de lisina en la flagelina están en el dominio (dominio 1) y pueden ser importantes para la activación del TLR5. Por ejemplo, los restos de lisina en las posiciones 58, 135, 160 y 410 de la SEQ ID NO: 13 están en el domino 1. La derivatización de tales restos de lisina a, por ejemplo, antígenos conjugados de forma química, puede disminuir la bioactividad del TLR5 y, así, reducir una respuesta inmunitaria innata mediada por el TLR5.
Los restos de lisina que pueden sustituirse pueden incluir restos de lisina implicados en la activación del TLR5. Pueden ser adecuados para la sustitución los restos de lisina en el motivo N (aminoácidos 95-108 de la SEQ ID NO: 13) y/o el motivo C (aminoácidos 441-449 de la SEQ ID NO: 13). La sustitución de determinados restos de lisina en la flagelina (p.ej. lisina en la posición de aminoácido 19, 41) por, por ejemplo, una arginina, serina o histidina, puede mantener la unión de la flagelina al TLR5 y dejar otras lisinas disponibles para el conjugado químico a otra molécula, tal como un antígeno (p.ej. proteína) u otra molécula, tal como otra proteína, péptido o polipéptido.
La estructura cristalina por rayos X del fragmento F41 de la flagelina de Salmonella typhimurium muestran la estructura de dominios de la flagelina (Samatey, F.A., et al., Nature 410: 321 (2001)). La proteína flagelina de longitud completa contiene 4 dominios, designados como D0, D1, D2 y D3. Tres de estos dominios se muestran en la estructura cristalina debido a que la estructura se preparó con un fragmento proteolítico de la flagelina de longitud completa. Las secuencias de aminoácidos de la flagelina de Salmonella typhimurium para estas regiones, numeradas en relación a la SEQ ID NO: 13, son como sigue:
DO contiene las regiones A1 hasta A55 y S451 hasta R494
D1 contiene las regiones N56 hasta Q176 y T402 hasta R450
D2 contiene las regiones K177 hasta G189 y A284 hasta A401
D3 contiene la región Y190 hasta V282
Los restos de lisina ejemplares de la SEQ ID NO: 13 adecuados para la sustitución por, por ejemplo, arginina, histidina o serina, pueden incluir:
D0 contiene 2 restos de lisina; K19, K41 D1 contiene 4 restos de lisina; K58, K135, K160 y K410 D2 contiene 14 restos de lisina en las posiciones 177, 179, 292, 308, 317, 326, 338, 348, 357, 362, 369, 378, 384, 391 D3 contiene 8 restos de lisina en las posiciones 203, 215, 221, 228, 232, 241, 251, 279
Los restos de lisina ejemplares adecuados para la sustitución, incluyen lisinas en las posiciones 58, 135, 160 y 410 de la SEQ ID NO: 13 (Jacchieri, S. G., et. al., J. Bacteriol. 755: 4243 (2003); Donnelly, M.A., et al., J. Biol. Chem.
277: 40456 (2002)). Las secuencias se obtuvieron del Swiss-Prot Protein Knowledgebase, emplazado en línea en http://us.expasy.org/sprot/. Los restos de lisina que pueden modificarse se indican con un *.
Los restos de lisina ejemplares de la SEQ ID NO: 14 adecuados para la sustitución pueden incluir:
D0-con dos lisinas en las posiciones 20, 42; D1-con cinco lisinas en las posiciones 59, 136, 161, 414, 422; D2-con dieciséis lisinas en las posiciones 177, 182, 189, 299, 319, 325, 328, 337, 341, 355, 357, 369, 381, 390, 396, 403 y D3-con siete lisinas en las posiciones 209, 227, 234, 249, 271, 281, 288.
El antígeno para su uso en las proteínas de fusión de la invención puede ser un antígeno de proteína, tal como al menos un miembro seleccionado del grupo consiste en un antígeno de proteína bacteriana, un antígeno de proteína vírica, un antígeno de proteína parasitaria, un antígeno de proteína tumoral, un antígeno de proteína de micoplasma y un antígeno de proteína alergénica. El antígeno de proteína vírica puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un antígeno de proteína del virus de la gripe, un antígeno de proteína del virus respiratorio sincitial y un antígeno de proteína de flavivirus. El antígeno de proteína parasitaria puede ser un antígeno de proteína del parásito de la malaria.
El antígeno puede ser un antígeno que no sea una proteína, tal como al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un antígeno de polisacárido, un antígeno lipídico, un antígeno de ácido nucleico y un antígeno de lipopolisacárido. El antígeno de polisacárido puede incluir un antígeno de polisacárido tumoral.
El polisacárido capsular de serotipo 14 de Streptococcus pneumoniae (PS14) se puede activar mediante 1-ciano-4dimetilaminopiridinio tetrafluoroborato (CDAP) en presencia de trietilamina, y posteriormente derivatizar mediante hexanodiamina para convertir los hidroxilos libres a grupos amino libres. Los grupos amino libres pueden hacerse reaccionarse posteriormente con N-hidroxisuccinimidil bromoacetato. Una construcción de flagelina que contiene un resto de cisteína con un sulfhidrilo libre puede hacerse reactivar con el polisacárido activado para formar tioéter covalente (Lees, A., et al., Vaccine 14: 190 (1996)). Se puede controlar el grado de activación del polisacárido para variar la densidad de la flagelina conjugada al polisacárido. Mediante un método similar se pueden conjugar otros serotipos de polisacáridos capsulares. La unidad estructural repetida de un polisacárido de Streptococcus pneumoniae serotipo 14 (PS14) es  4)--D-Glcp-(1 6)-[-D-Galp-(1 4)]--D-GlcpNAc-(1 3)--D-Galp-(1 (Lindberg, B., et al., Carbohydr Res 58: 177-186 (1977)).
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La secuencia de aminoácidos y las proteínas de fusión de la invención se pueden asociar con una partícula, tal
5 como al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una nanopartícula, liposoma, una partícula vírica, una partícula fúngica, un polisacárido derivatizado y una proteína derivatizada. Las composiciones y proteínas de fusión se pueden administrar a un sujeto en al menos una dosis seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente una dosis de 10,0 µg, aproximadamente una dosis de 5,0 µg, aproximadamente una dosis de 3,0 µg, aproximadamente una dosis de 2,5 µg, aproximadamente una dosis de 1,0 µg, aproximadamente una dosis
10 de 0,5 µg, aproximadamente una dosis de 0,3 µg, aproximadamente una dosis de 0,25 µg, aproximadamente una dosis de 0,1, aproximadamente una dosis de 0,05 µg, aproximadamente una dosis de 0,025 µg y aproximadamente una dosis de 0,01 µg.
Las composiciones y proteínas de fusión se pueden utilizar para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto, tal como un ser humano, en una dosis única o en múltiples dosis (p.ej., dos dosis, tres dosis, cuatro dosis). Cuando las
15 composiciones y proteínas de fusión se utilizan en dos o más dosis, se puede administrar una segunda o más dosis de la composición o proteína de fusión aproximadamente 28 días después de la administración de una primera dosis.
En otra realización, la invención es un método para preparar un agonista del Receptor de tipo Toll 5, que comprende las etapas de separar una porción de una proteína a partir de una flagelina de origen natural para formar de este 20 modo una porción de proteína, en donde la porción de proteína incluye, en secuencia, un amino-dominio 0, aminodominio 1, un amino-dominio 2, un carboxi-dominio 2, un carboxi-dominio 1 y un carboxi-dominio 0 (R3, D3, R32xAg); transformar una secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora para preparar de esta forma el agonista del Receptor de tipo Toll 5. Un agonista del Receptor de tipo Toll 5 ejemplar preparado mediante este método incluye una construcción R3 como se expone en
25 la SEQ ID NO: 29.
Un dominio de proteína es una parte de una secuencia y estructura de proteína que puede evolucionar, funcionar y existir de forma independiente de otras porciones de la proteína. Cada dominio puede formar una estructura tridimensional y puede ser estable y plegarse independientemente. Muchas proteínas consisten en varios dominios estructurales. En general, los dominios de las proteínas pueden variar en longitud desde una longitud de entre
30 aproximadamente 25 aminoácidos hasta 500 aminoácidos.
El modelo atómico de alta resolución del flagelo de Salmonella typhimurium se ha obtenido del análisis de la estructura cristalina y la criomicroscopía electrónica (Yonekura et al., Nature 424(6949): 643-50 (2003)). La flagelina de Salmonella typhimurium (SEQ ID NO: 448) contiene cuatro dominios, llamados D0, D1, D2 y D3 como se representa en la Figura 54. El dominio D0 (también denominado en la presente memoria como “dominio D0” o “D0”) 35 forma el núcleo interno del filamento y el dominio D1 (también denominado en la presente memoria “dominio 1" o “D1”) forma el núcleo externo del filamento. Los dominios D2 (también denominado en la presente memoria como “dominio D2” o “D2”) y D3 (también denominado en la presente memoria como “dominio D3” o "D3”), se proyectan hacia la parte externa en la superficie del filamento de la flagelina para formar la “pala turbo” (también denominada en la presente memoria como “propulsor”) del filamento. Los cuatro dominios, D0, D1, D2 y D3, están conectados de 40 forma lineal desde el interior al exterior del filamento de flagelina. La cadena N terminal del monofilamento de flagelina comienza en D0, avanzando hasta D1 y D2 en secuencia y plegándose dentro de D3. Entonces, la cadena peptídica del monofilamento de flagelina vuelve hacia D2 y D1, y finalmente acaba en un carboxi-dominio 0. Aunque las conexiones entre dominios (D0 a D1, D1 y D2, D2 a D3) están formadas por pares de cadenas cortas antiparalelas, la que conecta los dominios D0 y D1 es más larga en comparación con las otras dos, y se puede
45 denominar como la “región radial”.
El modelo de alta resolución de la flagelina demuestra que el dominio D0 contiene un par de hélices α que forman un superenrollamiento de dos cadenas. Cada cadena procede de un péptido del extremo N y uno del extremo C. De forma más concreta, el péptido N terminal (1-33) (SEQ ID NO: 448) y el péptido C terminal (461-495) (SEQ ID NO:448) contribuyen al superenrollamiento de dos cadenas del dominio de 0 (SEQ ID NO: 448). En esta estructura
50 (SEQ ID NO: 448) la hélice N terminal es de aproximadamente 33 aminoácidos de longitud y la cadena C terminal es de aproximadamente 35 aminoácidos de longitud.
Cuando forman el tubo interno del flagelo, los dominios D0 de múltiples flagelinas se compactan unos contra otros en una espiral. Un par de enlazadores flexibles conectan a los dominios D0 y D1 (SEQ ID NO: 448). El enlazador proximal del extremo N (34-46, región radial) (SEQ ID NO: 448) es comparativamente más largo, conteniendo 55 aproximadamente 13 aminoácidos, mientras que el enlazador proximal C terminal (454-460) contiene siete aminoácidos (SEQ ID NO: 448). Además, se compactan unos contra otros múltiples dominios D1 cuando forman la estructura polimérica del flagelo. El dominio D1 es responsable de la formación del tubo externo del núcleo del flagelo. El dominio D1 tiene elementos α y β mezclados y ambos elementos estructurales están formados por péptidos proximales de los extremos N y C (SEQ ID NO: 448). El péptido proximal del extremo N (47-176) (SEQ ID 60 NO: 448) constituye más de aproximadamente el 70 % del dominio D1 e incluye dos hélices α y una lámina β de dos
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cadenas. El péptido proximal del extremo C (404-453) (SEQ ID NO: 448) forma una única hélice α de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud del dominio 1.
Tres hélices se compactan juntas para formar el sitio de unión al TLR5 (Smith et al., Nature Immunology; 22:12471253 (2003)). Los dominios D2 y D3 protruyen hacia la parte externa del núcleo de la flagelina. Dado que esta región 5 es altamente variable y que se emplaza en la región central de la secuencia principal, los dominios D2 y D3 se pueden denominar como la “región hipervariable” o la “región bisagra”. Estructuralmente, la mayoría de la región bisagra es la estructura β. Aparte de una hélice α corta (aproximadamente 10 aminoácidos), aproximadamente el 93 % del dominio D2 son láminas β conectadas por bucles y giros. El péptido proximal del extremo N (177-190) (SEQ ID NO: 448) contribuye a la única cadena β. El péptido proximal del extremo C (286-403) constituye la mayoría
10 (aproximadamente el 91 %) del dominio D2 (SEQ ID NO: 448). El dominio D3 se encuentra en la punta de la “pala turbo”. De forma similar al dominio D2, D3 está formado por elementos β. Ocho cadenas β forman tres conjuntos de láminas en el dominio D3 (SEQ ID NO: 448).
Como se muestra en la presente memoria, la secuencia de aminoácidos principal de varias flagelinas tiene dominios D0 y D1 relativamente conservados y dominios D2 y D3 relativamente variables. El alto grado de homología de D0 y 15 D1 entre diferentes flagelinas puede deberse a sus papeles estructurales compartidos en la formación del núcleo del flagelo. Los dominios de diferentes flagelinas de diversas especies pueden compartir los mismos elementos estructurales como se observó en el modelo de alta resolución descrito anteriormente. De forma más concreta, el dominio D0 debería contener un par de superenrollamientos que ocupen aproximadamente 30 aminoácidos. El dominio D1 contiene mezcladas hélices α, láminas β como hélices α y una lámina β de dos cadenas formada por un 20 péptido N terminal y una hélice α larga a partir del péptido C terminal. La región de unión al TLR5 comprende un péptido N terminal, un fragmento C terminal y se concentra en la región helicoidal D1. Los dominios D2 y D3 de la flagelina polimerizada forman la pala en el flagelo y también son las dianas principales para las respuestas inmunitarias del hospedador. La hipervariabilidad de estas regiones puede ser un mecanismo de escape que utilizan las bacterias para evadir las defensas del hospedador. Aunque los dominios D2 y D3 varían en secuencia primaria,
25 se cree que la organización estructural global es similar para las diferentes flagelinas. La flagelina de determinadas especies puede incluso carecer de parte de o de la región bisagra completa, que está formada por los dominios D2 y D3. Los límites de dominio entre los dominios D1 y D2 están bien definidos.
Solo la flagelina monomérica activa la respuesta inmunitaria innata del hospedador, a través del receptor TLR5 del hospedador. El flagelo, que es un apéndice de la bacteria similar a un látigo, se compone de flagelina polimérica que 30 no se une ni activa al TLR5. Como se describió anteriormente, la región de la flagelina que interactúa físicamente con el TLR5 se ha mapeado en el dominio D1 (Smith et al., Nature Immunology 22: 1247-1253 (2003)). Aunque no se ha demostrado que en los otros dominios estén implicadas regiones críticas en la interacción con el TLR5, incluyendo el dominio conservado D0, las alteraciones dentro de estos dominios pueden influir en esta interacción, lo que puede modular las respuestas inflamatoria e inmunitaria, como se describe en la presente memoria. Por
35 ejemplo, la actividad de una construcción de flagelina se asocia con la presencia de un dominio D0 intacto, como se mide por un ensayo de señalización del TLR5 in vitro y un modelo de reactogenicidad in vivo descritos en la presente memoria.
Las deleciones parciales o completas de este dominio reducen enormemente la actividad del TLR5 y, por lo tanto, podrían utilizarse para modular la señalización del TLR5, de forma que se proporcione una mínima estimulación del 40 TLR5. Como se describe en la presente memoria, cualquier deleción del dominio D3 o reemplazo del dominio D3 por un antígeno, proporciona una reducción del perfil de reactogenicidad, como se mide por el modelo de reactogenicidad in vivo. Las construcciones que tienen deleciones o reemplazos de D3 se pueden emplear para generar composiciones que incluyan antígenos combinados con o fusionados a las construcciones, lo que, a su vez, se puede emplear en composiciones para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto, en particular, una
45 respuesta inmunitaria protectora, que maximice la inmunogenicidad y minimice la reactogenicidad.
Las composiciones que emplean los agonistas del receptor de tipo Toll 5 descritas en la presente memoria, tales como las construcciones R3 (también denominadas en la presente memoria como “construcción de flagelina R3”, por ejemplo, las SEQ ID NO: 452, 457, 464, 465, 470 y 500-502) o la construcción R32x (también denominada en la presente memoria como “construcción de flagelina R32x”, por ejemplo, las SEQ ID NO: 455, 471 y 503-506), se 50 pueden utilizar en combinación con antígenos. Por lo tanto, las composiciones y proteínas de fusión pueden ser útiles en las composiciones de vacuna. Las vacunas basadas en estas construcciones, tales como la construcción R0 (p. ej., las SEQ ID NO: 453, 474 y 515-518), se pueden utilizar cuando el hospedador no tiene inmunidad preexistente para el antígeno unido a la vacuna (p.ej., no expuesto previamente desde el punto de vista inmunológico), tal como el virus de la gripe pandémico. La deleción simultánea de los dominios D2 y D3 (p.ej., las
55 SEQ ID NO: 472 y 473) proporciona una reducción significativa del perfil de reactogenicidad y una reducción moderada de la respuesta inmunitaria suscitada. Las vacunas basadas en estas construcciones serían moderada a sólidamente inmunogénicas, moderadamente reactogénicas y, probablemente, serían utilizadas cuando los hospedadores tuvieren inmunidad preexistente para el antígeno unido a la vacuna, tal como en el caso de una vacuna para el virus de la gripe estacional.
60 Se describen en la presente memoria múltiples variantes de flagelina con deleciones y reemplazos de los Dominios D0, D2 y D3. Las variantes por deleción se nombran con la letra D y las variantes de reemplazo se nombran con la
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letra R. Por ejemplo, STF2.R3D0 representa una construcción en donde el dominio D3 de la flagelina se reemplaza por un antígeno y el dominio D0 se deleciona. El modelo atómico utilizado para definir los límites de dominio fue el de la flagelina de Salmonella typhimurium (fliC, PDB: 1UCU) (SEQ ID NO: 448). Para el diseño, la secuencia de proteína de flijB de Salmonella typhimurium se alineó con la secuencia 1UCU utilizando CLUSTALW (Thompson, J.D., et al. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680 (1994)). Los datos experimentales presentados en la presente memoria demuestran que estos diseños se pueden aplicar a varios antígenos de vacuna distintos fusionados a la flagelina flijB (SEQ ID NO: 447). En el diseño de las construcciones de fljB, los límites de dominio de fliC (SEQ ID NO: 448) se mapearon en flijB mediante el alineamiento de las secuencias primarias. Los diseños de las diferentes variantes de flagelina (también denominadas en la presente memoria como “formas de flagelina”) pueden ser a base de los límites de dominio que se pueden mapear mediante el alineamiento de múltiples flagelinas.
Por ejemplo, para discernir los dominios correspondientes se puede alinear otra flagelina con dominios conocidos de STF2, tales como el amino-dominio 0, el amino dominio 1, el amino dominio 2, dominio 3, el carboxi dominio 2, el carboxi dominio 1 y el carboxi dominio 0. Se pueden identificar secuencias que comparten al menos aproximadamente el 50 % de identidad para los dominios. Las construcciones de flagelina resultantes pueden poseer propiedades de señalización y de reactogenicidad del hospedador para el TLR5, que son similares a las construcciones de fljB descritas en la presente memoria.
La identificación de los límites de dominio de la flagelina, de la flagelina de la bacteria común comensal E. coli se ilustra a continuación (n.º de Registro BAA85080). La Tabla 1 muestra el alineamiento de secuencia de fliC (SEQ ID NO: 448), fljB (SEQ ID NO: 447) y la flagelina E. coli (SEQ ID NO: 449) que se realizó utilizando CLUSTAL W en el sitio de Pole Biolnformatique Lyonnais (http.pbil.univ-lyonl.fr). Los componentes de dominio fliC de S. typhorium (SEQ ID NO: 448), determinados mediante el modelo de alta resolución, se indican mediante recuadros alternos. Los componentes de dominio están marcados en la parte superior del componente respectivo, tal como D0N, D1N, D2N, D3, D2C, D1C y D0C. Después, los mismos componentes se mapearon para fljB de S. typhorium (SEQ ID NO: 447) y la flagelina de E. coli (SEQ ID NO: 449) de acuerdo con el alineamiento. Por lo tanto, se determinó que D0N de fljB (SEQ ID NO: 447) ocupa los aminoácidos 1-46, y para la flagelina de E. coli (SEQ ID NO: 449) ocupa de 1-46. La región radial para ambos ocupa de 34-46. D1N de fljB (SEQ ID NO: 447) ocupa de 47-176 y la de E. coli ocupa de 47-176 (SEQ ID NO: 449). D2N ocupa de 177-190 para fljB (SEQ ID NO: 447) y 177-190 para E. coli (SEQ ID NO: 449). D3 ocupa de 191-291 para fljB (SEQ ID NO: 447) y 191-343 para E. coli (SEQ ID NO: 449). D2C ocupa de 292-414 para fljB (SEQ ID NO: 447) y 344-502 para E. coli (SEQ ID NO: 449). D1C ocupa de 415-464 para fljB (SEQ ID NO: 447) y 503-552 para E. coli (SEQ ID NO: 449), y D0C ocupa de 465-506 para fljB (SEQ ID NO: 447) y 553595 para E. coli (SEQ ID NO: 449).
Tabla 1: Los límites de dominio de la flagelina ejemplares (D0N, D1N, D2N, D3, D2C, D1C y D0C) se representan como sigue:
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Datos de alineamiento:
Longitud de alineamiento: 597
5 Identidad (*): 239 es el 40,03 % Fuertemente similar (:) : 78 es el 13,07 % Débilmente similar (.) : 65 es el 10,89 % Diferente: 215 es el 36,01 % Secuencia 0001: P06179_fliC (405 restos).
10 Secuencia 0002: P52616_fljB (506 restos). Secuencia 0003: BAA85080_Ecoli (595 restos).
Los límites de dominio de la flagelina de Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 450) se muestra en la Tabla 2. La flagelina de Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 450) tiene una deleción sustancial en la región bisagra mientras que los dominios D0 y D1 son aproximadamente el 65 % similares a S. typhorium. D0N de la flagelina de Bacillus subtilis está en los restos 15 de aminoácido 1-44 (SEQ ID NO: 4), D1N está en los restos de aminoácido 45-170 (SEQ ID NO: 450), D2N está en los restos de aminoácido 171-177 (SEQ ID NO: 450), D3 está en los restos de aminoácido 178-191 (SEQ ID NO: 450), D2C está en los restos de aminoácido 192-235 (SEQ ID NO: 450), D1C está en los restos de aminoácido 236-286 (SEQ ID NO: 450) y D0C está en los restos de aminoácido 286-317 (SEQ ID NO: 450). Como se ilustra en la Tabla 2, la flagelina de Bacillus subtilis tiene dominios D2N (7 aminoácidos) (SEQ ID NO: 450) y D3 (14
20 aminoácidos) (SEQ ID NO: 450) relativamente pequeños. El dominio D3 se ha perdido y está sustituido por un bucle simple o un elemento de estructura secundaria pequeño. Sin embargo, D0, D1 y la mayoría de D2 todavía son identificables. La Tabla 3 resume los hallazgos de los diferentes alineamientos mostrados en las Tablas 1 y 2.
Tabla 2: Límites de dominio de flagelina ejemplares
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Datos de alineamiento
Longitud de alineamiento: 508
5 Identidad (*) : 128 es el 25,20 % Fuertemente similar (:) : 70 es el 13,78 % Débilmente similar (.) : 44 es el 8,66 % Diferente: 266 es el 52,36 % Secuencia 0001: P06179_fliC (495 restos).
10 Secuencia 0002: P52616_fljB (506 restos). Secuencia 0003: ABN13608_Bsub (317 restos).
Tabla 3: Dominios ejemplares de flagelinas
Flagelina
Nombre de Registro de la Secuencia SEQ ID Número Límite de dominio
D0N
D1N D2N D3 D2C D1C D0C
fliC de
S.
47 177 191 286 404 454
typhimurium
P06179 448 1-46 176 190 285 403 453 460
flijB de S. typhimurium
P52616 447 1-46 47176 177190 191291 292414 415464 465506
47
177 191 344 503 553-
E. coli
BAA85080 449 1-46 176 190 343 502 552 595
45
171 178 192 236 286-
B. subtilis
ABN13608 450 1-44 177 177 191 235 286 317
La célula hospedadora empleada en los métodos descritos en la presente memoria puede ser una célula
15 hospedadora procariota o una célula hospedadora eucariota. La célula hospedadora procariota puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una célula hospedadora procariota de E. coli, una célula hospedadora procariota de Pseudomonas, una célula hospedadora procariota de Bacillus, una célula hospedadora procariota de Salmonella y una célula hospedadora procariota de P. fluorescens.
Las células hospedadoras eucariotas empleadas en los métodos de la invención pueden incluir una célula 20 hospedadora eucariota de Saccharomyces, una célula hospedadora eucariota de insecto (p.ej., al menos un
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miembro seleccionado del grupo que consiste en una célula de insecto infectada con Baculovirus, tal como células Spodoptera frugiperda (Sf9) o Trichhoplusia ni (High5); y una célula de insecto de Drosophila, tal como células Dme12), una célula hospedadora eucariota fúngica, una célula hospedadora eucariótica parasitaria (p.ej., una célula hospedadora eucariota de Leishmania tarentolae), células CHO, células de levadura (p.ej., Pichia) y una célula hospedadora de Kluyveromyces lactis.
Las células hospedadoras y los vectores eucariotas adecuados también pueden incluir células vegetales (p.ej., tomate; cloroplasto; células de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas; Arabidopsis thaliana; Hordeum vulgare; Zea mays; patata, tal como Solanum tuberosum; zanahoria, tal como Daucus carota L. y tabaco, tal como Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana (Gils, M., et al., Plant Biotechnol J. 5:613-20 (2005); He, D.M., et al., Colloids SurfB Biointerfaces, (2006); Huang, Z., et al., Vaccine 19:2163-71 (2001); Khandelwal, A., et al., Virology. 305:207-15 (2003); Marquet-Blouin, E., et al., Plant Mol Biol 57:459-69 (2003); Sudarshana, M.R., et al. Plant Biotechnol J. 4:551-9 (2006); Varsani, A., et al., Virus Res, 120:91-6 (2006); Kamarajugadda S., et al., Expert Rev Vaccines 5:83949 (2006); Koya V, et al., Infect Immun. 73:8266-74 (2005); Zhang, X., et al., Plant Biotechnol J. 4:419-32 (2006)).
En otra realización, las proteínas de la invención están preparadas en sistemas sin células.
Las proteínas preparadas mediante los métodos de la invención y las composiciones, se pueden purificar y caracterizar empleando métodos bien conocidos (p.ej., cromatografía en gel, cromatografía de intercambio iónico, SDS-PAGE), como se describe en la presente memoria.
El método para preparar el Receptor de tipo Toll 5 que incluye la porción de proteína, en secuencia, un aminodominio 0, un amino-dominio 1, un amino-dominio 2, un carboxi-dominio 2, un carboxi-domino 1 y un carboxidominio 0 (una construcción R3) puede incluir adicionalmente la etapa de unir operativamente una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno a la secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína (tal como las SEQ ID NO: 29, 699-701) para preparar de este modo una proteína de fusión que active un Receptor de tipo Toll 5. La segunda secuencia de ácido nucleico se puede unir al extremo 3’ de la secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína (una construcción D3). Adicionalmente, el método puede incluir la etapa de unir operativamente una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno, entre la secuencia de ácido nucleico que codifica el amino-dominio 2 y la secuencia de ácido nucleico que codifica el carboxi-dominio 2 de la secuencia de ácido nucleico que codifica la porción de proteína (una construcción R3), para fabricar de este modo una proteína de fusión que active un Receptor de tipo Toll 5, tal como las SEQ ID NO: 452, 457, 464, 465, 470 y 500-502.
El método de preparación del Receptor de tipo Toll 5 que incluye la porción de proteína, en secuencia, un aminodominio 0, un amino-dominio 1, un amino-dominio 2, un carboxi-dominio 2, un carboxi-dominio 1 y un carboxidominio 0 (una construcción R3) puede incluir adicionalmente la etapa de unir operativamente una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno entre el amino-dominio 2 y el carboxi-dominio 2 del ácido nucleico que codifica la porción de proteína para formar de este modo una segunda porción proteína; y unir operativamente una tercera secuencia de ácido nucleico, que codifica al menos un antígeno adicional al extremo 3’ de la secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda porción de proteína (una construcción R3-2xAg), para preparar de este modo una proteína de fusión que active un Receptor de tipo Toll 5, tal como las SEQ ID NO: 455, 471 y 503-506. En una realización, el antígeno adicional que codifica la tercera secuencia de ácido nucleico, es similar al antígeno que codifica la segunda secuencia de ácido nucleico. En otra realización, el antígeno adicional que codifica la tercera secuencia de ácido nucleico es distinto del antígeno que codifica la segunda secuencia de ácido nucleico.
El ácido nucleico que codifica un antígeno empleado en los métodos descritos en la presente memoria pueden codificar al menos una porción de un antígeno vírico, tal como un antígeno del virus de la gripe (p.ej., HA, M2), un antígeno del RSV (p.ej., RSVG, RSVF y RSVM2), un antígeno del HPV (p.ej., E1, E2, E4, E6, E7, E6E7, L1 y L2) y un antígeno de flavivirus (p.ej., del flavivirus Dengue, del flavivirus del Nilo Occidental, del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, del virus de la encefalitis Japonesa, del flavivirus Langat, del flavivirus Kunjin, del flavivirus del Valle de Murray y del flavivirus Hepatitis C), como se describe en la presente memoria. Los antígenos de HA ejemplares pueden incluir las SEQ ID NO: 228-281, 283-295, 456, 481, 499, 662 y 665. Una porción ejemplar de una proteína M2 puede incluir el ectodominio de M2 (también denominado en esta memoria como “M2e”), tales como las SEQ ID NO: 298, 300-321, 323-336, 485, 507 y 666. Los antígenos del RSV ejemplares incluyen las SEQ ID NO: 519, 522, 524, 526-544, 546-551, 577-580, 582, 586, 611, 612, 617, 627, 694 y 840-843. Los antígenos del HPV ejemplares incluyen las SEQ ID NO: 50-52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 80, 81, 83, 85, 87, 89, 90, 92, 94, 96, 98, 100-102, 104, 106-113, 122-144 y 193-197 y 680. Los antígenos del virus Dengue ejemplares incluyen las SEQ ID NO: 339, 343, 345, 347, 351-355, 371, 381-384, 387-390, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656 y 658. Los antígenos del virus del Nilo Occidental ejemplares incluyen las SEQ ID NO: 341, 356, 358-361, 379, 443 y 444. Los antígenos de flavivirus adicionales ejemplares incluyen las SEQ ID NO: 337, 349, 362-370, 372, 373, 375, 377, 380, 385, 386, 391-442 y 445. Las secuencias de aminoácidos y secuencias de ácido nucleico ejemplares que codifican los agonistas del Receptor de tipo Toll, antígenos y proteínas de fusión de la invención se describen y proporcionan en el Listado de Secuencia.
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Se describe adicionalmente una composición que comprende al menos una partícula que incluye al menos una porción de al menos un agonista del Receptor de tipo Toll y al menos una porción de al menos un antígeno, en donde el agonista del Receptor de tipo Toll y el antígeno están asociados con la partícula y una proporción molar del agonista del Receptor de tipo Toll con respecto al antígeno no es mayor de aproximadamente 1. En una realización,
5 la partícula no es una partícula de alumbre, no es un adenovirus, no es un poxvirus, no es un alfavirus, no es un ácido nucleico y no es un ADN plasmídico.
Se describe adicionalmente una composición que comprende al menos una nanopartícula que incluye al menos una porción de al menos un agonista del Receptor de tipo Toll (p.ej., un agonista del TLR5, tal como la flagelina, STF 2 (SEQ ID NO: 12-14, 16-22, 447-450, 661 y 836), STF2Δ (SEQ ID NO: 34 y 487), una construcción R3 y al menos 10 una porción de al menos un antígeno, en donde el agonista del Receptor de tipo Toll y el antígeno están asociados con la nanopartícula y la proporción molar del agonista del Receptor de tipo Toll con respecto al antígeno no es más grande de aproximadamente 1, por ejemplo, una proporción molar se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,1, aproximadamente 0,05, aproximadamente 0,01, aproximadamente 0,005, aproximadamente 0,001, aproximadamente 0,0005, aproximadamente 0,0001, aproximadamente 0,00005 y
15 aproximadamente 0,00001.
El agonista del Receptor de tipo Toll puede estar asociado con la superficie externa o la superficie interna de la partícula. El antígeno puede estar asociado con una superficie interna o la superficie interna de la partícula. Las proteínas de fusión de la invención pueden estar asociadas con la superficie externa o la superficie interna de la partícula. Uno o más agonistas del Receptor de tipo Toll (p.ej., TLR5, TLR7, TLR8) pueden estar asociados con uno
20 o más antígenos distintos o similares (p.ej., HA, M2e, proteína F del RSV, proteína G del RSV, proteína de la cápside del HPV, supresor tumoral del HPV, proteína de unión).
En otra realización, una proteína de fusión de la invención puede estar asociada con una partícula y un antagonista del Receptor de tipo Toll y/o antígeno pueden también estar asociados con la partícula. El agonista del Receptor de tipo Toll puede ser similar a, o distinto del agonista del TLR que es un componente de la proteína de fusión.
25 Asimismo, el antígeno puede ser similar a, o distinto del antígeno que es un componente de la proteína de fusión. Por ejemplo, puede estar asociada con una partícula una proteína de fusión que incluye una construcción R3 y un antígeno de HA (p.ej., STF2.HA1-2(SI)) y un antígeno de M2e (p.ej., 4xM2e) que no está fusionada al agonista del TLR.
El diámetro promedio de la nanopartícula empleada en las composiciones descritas en la presente memoria pueden
30 ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 20 nanómetros, aproximadamente 25 nanómetros, aproximadamente 30 nanómetros, aproximadamente 40 nanómetros, aproximadamente 50 nanómetros, aproximadamente 75 nanómetros, aproximadamente 100 nanómetros, aproximadamente 125 nanómetros, aproximadamente 150 nanómetros, aproximadamente 175 nanómetros y aproximadamente 200 nanómetros. En otra realización, el diámetro promedio de la partícula es al menos un
35 miembro seleccionado del grupo que consiste en entre aproximadamente 10 a aproximadamente 200 nanómetros, entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 micrómetros y entre aproximadamente 5 a aproximadamente 10 micrómetros. En otra realización, el diámetro promedio de la partícula se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 0,1 µm, aproximadamente 0,2 µm, aproximadamente 0,4 µm, aproximadamente 0,5 µm, aproximadamente 1 µm y aproximadamente 2 µm.
40 Las nanopartículas para su uso en las composiciones se pueden preparar a partir de lípidos u otros ácidos grasos (véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N. º 5.709.879; 6.342.226; 6.090.406; Lian, et al., J. of Pharma. Sci. 90:667-680 (2001) y van Slooten, et al., Pharm Res. 77:42-48 (2000)) y composiciones no lipídicas (véase, por ejemplo, Kreuter, J. Anat. 189:503-505 (1996), las enseñanzas de todas las cuales se incorporan por la presente como referencia en su totalidad). Las composiciones pueden ser liposomas de bicapa o multilamelares y basados en
45 fosfolípidos. Nanopartículas polimerizadas, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.º 7.285.289.
Las nanopartículas de óxido metálico para su uso en las composiciones pueden sustituirse de forma química con al menos un residuo reactivo con la capacidad de formar un enlace tioéter, empleando técnicas convencionales como se describe en la presente memoria y en la patente de EE. UU. N.º 6.086.881. El antígeno descrito en la presente memoria puede acoplarse en una única etapa sobre partículas de óxido metálico mediante la formación de al menos 50 un enlace tioéter, o puede sintetizarse o ensamblarse progresivamente sobre las partículas de óxido metálico después de la formación del enlace tioéter inicial. Los reactivos de derivatización química para las partículas de óxido metálico pueden incluir reactivos de organosilano que proporcionen funcionalidad tioalcano u otros grupos que pueden convertirse fácilmente en tioles o restos tiol reactivos. Los reactivos de organosilano que pueden utilizarse para este fin pueden ser, pero sin limitación, 3-mercaptopropiltrimetoxisilano, 3-aminopropiltrietoxisilano, 355 iodopropiltrimetoxisilano, 2-cloroetiltriclorosilano, 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano, viniltriclorosilano y 3acriloxipropiltrimetoxisilano. También pueden unirse a la superficie de la partícula de óxido metálico, residuos que incluyen uno o más componentes disulfuro y, de este modo, proporcionar el correspondiente residuo reactivo que tiene la capacidad de entrar en, y formar, un enlace y unión tioéter. Las nanopartículas ejemplares para su uso en las composiciones de la invención incluyen al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en poli(d,l
60 láctido-co-glicólido, también denominado como “poli(ácido láctido-co-glicólido) y bisacriloxipropilcisteína.
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Las nanopartículas para su uso en las composiciones pueden prepararse de material inorgánico. Las nanopartículas para su uso en las composiciones pueden prepararse de un material polimérico, tal como al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en poliestireno, poliestireno bromado, ácido poliacrílico, poliacrilonitrilo, poliamida, poliacrilamida, poliacroleína, polibutadieno, policaprolactona, policarbonato, poliéster, polietileno,
5 polietileno tereftalato, polidimetilsiloxano, poliisopropeno, poliuretano, polidivinilacetato, polivinilcloruro, polivinilpiridina, polivinilbencilcloruro, poliviniltolueno, cloruro de polivinilideno, polidivinilbenceno, polimetilmetacrilato, poliláctido, poliglicólido, poli(láctido-co-glicólido), polianhídrido, poliortoéster, polifosfaceno, polifosfato, un carbohidrato, carboximetil celulosa, hidroxietil celulosa, agar, gel, polímero proteináceo, polipéptido, células eucariotas y procariotas, virus, lípido, metal, resina, látex, goma, silicona (p.ej., polidimetildifenil siloxano), vidrio, cerámica, carbón vegetal, caolinita y bentonita.
Las partículas que están asociadas con los antagonistas del TLR y los antígenos, tales como las nanopartículas, pueden evaluarse microscópicamente, pueden evaluarse la interacción de las preparaciones de partículas con células in vivo y puede evaluarse la inducción de anticuerpos frente a los antígenos en animales (p.ej., conejos y ratones), las respuestas de linfocitos T y la inducción de las respuestas innatas mediadas por el TLR, in vitro,
15 utilizando métodos bien establecidos.
Las composiciones descritas en la presente memoria pueden incluir la asociación de proteínas de fusión que incluyan los antígenos en la superficie de la nanopartícula. Después, la composición puede evaluarse en experimentos de respuesta a la dosis para determinar si la multimerización de la vacuna sobre partículas potencia la inmunogenicidad de la vacuna a dosis más bajas.
Se puede poner más de un antígeno (p.ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) en la superficie de una partícula, para exponer múltiples antígenos en la superficie de la partícula, lo que puede aumentar la potencia de los linfocitos T y/o B.
Los ligamientos (también denominados en la presente memoria como “asociación”) de antígenos a las partículas en las composiciones descritas en la presente memoria, pueden ser ligamientos covalentes, tales como grupos carboxilo, amino y sulfihidrilo. Los agonistas del TLR, tales como al menos una porción de una flagelina con ácido
25 poliglutamínico en su extremo carboxilo y/o al menos un resto de cisteína, pueden servir como el punto de un ligamiento covalente orientado del antígeno a la partícula. Además, pueden emplearse asociaciones no covalentes para unir el antígeno a una partícula en las composiciones, tales como los enlaces iónicos. Por ejemplo, podría añadirse el ácido poliglutamínico a al menos una porción de una flagelina para su uso en el enlace iónico.
Las partículas para su uso en las composiciones descritas en la presente memoria pueden tener un diámetro promedio de entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 micrómetros y entre aproximadamente 5 a aproximadamente 10 micrómetros. La partícula puede ser la menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un liposoma, un polímero (p.ej., dextrano), una partícula vírica, una partícula fúngica (p.ej., una partícula fúngica, tal como una partícula fúngica de polisacárido), un polisacárido derivatizado, una proteína derivatizada, una micropartícula (p.ej., al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una micropartícula de
35 poliestireno y una micropartícula de poliviniltolueno). La micropartícula puede tener un diámetro promedio de micropartícula seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 0,1 µm, aproximadamente 0,2 µm, aproximadamente 0,4 µm, aproximadamente 0,5 µm, aproximadamente 1 µm y aproximadamente 2 µm.
“Partícula,” como se emplea en esta memoria, se refiere a una agregación suficiente de tantos átomos o moléculas que pueda asignárseles propiedades macroscópicas, tales como volumen y densidad. La partícula puede ser una partícula soluble o una partícula insoluble. En una realización particular, la partícula es soluble en una solución acuosa o líquido biológico, tal como sangre o suero.
En una realización, la partícula puede ser un polímero, tal como un polímero que sea soluble en líquidos biológicos (p.ej., sangre, suero, mucosidad). El polímero soluble puede ser dextrano. Los agonistas del Receptor de tipo Toll de la invención (p.ej., agonistas del TLR5, tal como la flagelina, STF2, STF2Δ, una construcción R0, una construcción 45 R2, una construcción R3D0, una construcción D3N, una construcción D3NCs y una construcción D1, en combinación con antígenos, pueden estar acoplados a, o asociados con, el polímero soluble. Además, las proteínas de fusión de la invención pueden estar acopladas con un polímero soluble. Las composiciones que incluyen el polímero soluble, antígeno y TLR5, incluyendo proteínas de fusión de la invención, pueden administrarse a sujetos para estimular una respuesta inmunitaria, en particular una respuesta inmunitaria protectora para el componente antigénico de la composición o la proteína de fusión. Las técnicas para acoplar polímeros solubles a proteínas son conocidas para un experto en la materia e incluyen acoplamiento de forma covalente (véase, por ejemplo, Du, Jin, et al., Applied Radiation and Isotopes 53:443-448 (2000) y Eisner, H.I. et. al., J. of Immunological Methods 181:65-73 (1995)). Los agonistas del TLR 5 y antígenos se pueden acoplar al polímero soluble en una proporción molar del agonista del TLR5 con respecto al antígeno que no sea mayor de aproximadamente 1, como se describe en la
55 presente memoria.
En una realización, como polímero soluble se puede emplear dextrano para administrar proporciones variables de antígeno acoplado de forma covalente, tal como HA, M2e, fragmentos de escisión del virus de la gripe, antígenos del RSV, antígenos del HPV y antígenos de flavivirus y flagelina, como una macromolécula de dextrano conjugada. El dextrano natural puede fraccionarse en dextrano de bajo peso molecular (aproximadamente 30 a aproximadamente 100 kDa), dextrano de peso molecular intermedio (aproximadamente 100 a aproximadamente 300 kDa) y dextrano de alto peso molecular (mayor de aproximadamente 300 kDa). Se pueden elegir fracciones de dextrano dimensionadas para conseguir las proporciones finales deseadas del péptido con respecto a la flagelina. Los polímeros de dextrano contienen un único aldehído terminal. Este aldehído puede activarse mediante
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5 cianoborohidruro en condiciones alcalinas y hacerse reaccionar con una flagelina recombinante que contiene cisteínas C terminales, consiguiendo una única molécula de flagelina unida de forma covalente a una única molécula de polímero de dextrano. Posteriormente, el dextrano conjugado con flagelina puede hacerse reaccionar con concentraciones variables de cloruro de 2,2,2-trifluoroetanosulfonilo (cloruro de tresilo), para activar grupos hidroxilo libres en el polímero de dextrano. Después, los péptidos que contienen cisteínas carboxilo terminales pueden hacerse reaccionar con el dextrano, formando conjugados covalentes de flagelina y antígenos. La proporción de antígeno con respecto a la construcción de flagelina (a diferencia de la proporción de flagelina con respecto al antígeno) puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 3, aproximadamente 10, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 250, aproximadamente 500 y aproximadamente 1000.
15 En una realización, el diámetro promedio de la partícula empleada en las composiciones puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en entre aproximadamente 10 a aproximadamente 200 nanómetros, entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 micrómetros y entre aproximadamente 5 a aproximadamente 10 micrómetros.
La partícula puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un liposoma, una partícula vírica, una partícula fúngica (p.ej., una proteína fúngica de polisacárido), un polisacárido derivatizado y una proteína derivatizada.
“Derivatizado,” como se emplea en esta memoria, en referencia a un polisacárido o proteína, significa que el polisacárido o proteína está relacionado estructuralmente a un polisacárido o proteína que ha experimentado un proceso de conversión química.
25 La partícula puede ser una micropartícula, tal como al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una micropartícula de poliestireno y una micropartícula de poliviniltolueno. El diámetro promedio de la micropartícula se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 0,1 µm, aproximadamente 0,2 µm, aproximadamente 0,4 µm, aproximadamente 0,5 µm, aproximadamente 1 µm y aproximadamente 2 µm.
El agonista del Receptor de tipo Toll asociado con la partícula, tal como una nanopartícula, puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un agonista del Receptor de tipo Toll 2, un agonista del Receptor de tipo Toll 4, un agonista del Receptor de tipo Toll 5, un agonista del Receptor de tipo Toll 7, un agonista del Receptor de tipo Toll 8 y un agonista del Receptor de tipo Toll 9.
En una realización particular, el agonista del Receptor de tipo Toll asociado con la partícula es al menos una porción de al menos un agonista del Receptor de tipo Toll 5, tal como al menos una porción de una flagelina (las SEQ ID
35 NO: 22 y 28-34). La flagelina puede incluir al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en flagelina de Salmonella typhimurium, una flagelina de E. coli, una flagelina de S. muenchen, una flagelina de Yersinia, una flagelina de P. aeruginosa y una flagelina de L. monocytogenes. La flagelina adecuada para su uso en las composiciones que emplean partículas incluyen al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una flagelina de Salmonella typhimurium (p.ej., las SEQ ID NO: 12-15, 22, 447-448, 661 y 863), una flagelina de E. coli, una flagelina de S. muenchen, una flagelina de Yersinia, una flagelina de P. aeruginosa y una flagelina de L. monocytogenes.
“Al menos una porción”, como se emplea en esta memoria en referencia a una flagelina (p.ej., fliC de S. typhimurium, fliC de E. coli, fliC de S. muenchen), se refiere a cualquier parte de la flagelina (p.ej., dominio 1, 2, 3) o a la totalidad de la flagelina que puede iniciar una ruta de transducción de señales intracelular para un Receptor de
45 tipo Toll 5.
La flagelina para su uso en las composiciones descritas en la presente memoria, tales como composiciones que incluyen partículas (p.ej., nanopartículas), puede ser una flagelina que carece de al menos una porción de la región bisagra (p.ej., las SEQ ID NO: 34 y 487). Las regiones bisagra son las regiones hipervariables de una flagelina. Las regiones bisagra de una flagelina incluyen el dominio 2 y el dominio 3 de una flagelina, y también se denominan en la presente memoria como “dominio propulsor o región propulsora”, “dominio o región hipervariable” y "dominio o región variable”. “Carece” de una región bisagra de un flagelina, significa que está ausente en la flagelina al menos un aminoácido o al menos un codón de ácido nucleico que codifica al menos un aminoácido que comprende la región bisagra de la flagelina. Los ejemplos de regiones bisagra incluyen los aminoácidos 176-415 de la SEQ ID NO: 12, que codifican los ácidos nucleicos 528-1245 de la SEQ ID NO: 23; los aminoácidos 174-422 de SEQ ID NO: 20,
55 que codifican los ácidos nucleicos 522-1266 de la SEQ ID NO: 26 o los aminoácidos 173-464 de la SEQ ID NO: 16, que codifican los ácidos nucleicos 519-1392 de SEQ ID NO: 25. Por lo tanto, si los aminoácidos 176-415 estaban ausentes de la flagelina de la SEQ ID NO: 12, la flagelina carecería de una región bisagra. Una flagelina que carece de al menos una porción de una región bisagra también se denomina en esta memoria como una “versión truncada” de una flagelina.
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“Al menos una porción de una región bisagra”, como se emplea en esta memoria, se refiere a cualquier parte de la región bisagra de la flagelina o a la totalidad de la región bisagra. “Al menos una porción de una región bisagra” también se denomina en la presente memoria como un “fragmento de una región bisagra”. Al menos una porción de la región bisagra de fljB/STF2 pueden ser, por ejemplo, los aminoácidos 200-300 de SEQ ID NO: 12. Por lo tanto, si
5 los aminoácidos 200-300 están ausentes de la SEQ ID NO: 12, la secuencia de aminoácidos resultante de STF2 carecería de al menos una porción de una región bisagra.
Como alternativa, al menos una porción de una flagelina de origen natural puede reemplazarse por al menos una porción de una región bisagra artificial.
La región bisagra de origen natural es la región bisagra que está presente en la flagelina natural. Por ejemplo, los
10 aminoácidos 176-415 de la SEQ ID NO: 12, los aminoácidos 174-422 de la SEQ ID NO: 20 y los aminoácidos 173464 de SEQ ID NO: 16, son los aminoácidos que corresponden con la región bisagra natural de STF2, fliC de E. coli y la flagelina de S. muenchen, fliC, respectivamente. “Artificial,” como se emplea en esta memoria en referencia a una región bisagra de una flagelina, significa una región bisagra que está inserta en la flagelina natural en cualquier región de la flagelina que contiene la región bisagra natural.
15 La región bisagra de una flagelina puede delecionarse y reemplazarse por al menos una porción de una proteína antigénica descrita en la presente memoria (p.ej., antígenos víricos de HA, antígenos víricos de M2, antígenos víricos de M2e, antígenos del HPV, antígenos del RSV). En una realización, una flagelina que carece al menos de una porción de una región bisagra, se puede asociar con una partícula y al menos un antígeno.
En una flagelina que carece al menos de una porción de una región bisagra se puede emplear una región bisagra
20 artificial, lo que puede facilitar la interacción de los extremos carboxilo y amino de la flagelina en la unión al TLR5 y, así, en la activación de la ruta de transducción de señales innata del TLR5. Una flagelina que carece de al menos una porción de una región bisagra se designa por el nombre de la flagelina seguido de una “Δ”. Por ejemplo, una STF2 (p.ej., la SEQ ID NO: 12) que carece al menos de una porción de una región bisagra se indica como “STF2 Δ”
o “fljB/ STF2 Δ” (p.ej., la SEQ ID NO: 15).
25 En una realización, la asociación del agonista del Receptor de tipo Toll y el antígeno con la partícula, tal como una nanopartícula, puede incluir un enlace covalente (p.ej., un enlace no polar o un enlace polar). En otra realización, la asociación del agonista del Receptor de tipo TolI y el antígeno con la nanopartícula es un enlace no covalente, tal como al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un enlace de hidrógeno, una interacción de van der Waals, un enlace iónico, una interacción hidrófoba y un enlace dipolo-dipolo.
30 Las composiciones pueden incluir una partícula que sea de un tamaño suficiente para permitir al agonista del Receptor de tipo Toll unirse a un Receptor de tipo Toll sobre una célula, por ejemplo, aproximadamente 20 nm a aproximadamente 2000 nm (p.ej., 20 nm, 50 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm). Las partículas empleadas en las composiciones tales como una nanopartícula, pueden ser de un tamaño que permita la entrada en la célula, aproximadamente 20 nm a aproximadamente 1000 nm. El tamaño de partícula puede permitir la entrada de la
35 partícula en la célula. El tamaño de la partícula puede permitir la entrada parcial en la célula. Por ejemplo, la partícula puede entrar de forma parcial en la célula, de una manera que permita que una porción de la partícula asociada con el antígeno, tal como un antígeno del virus de la gripe, un antígeno del RSV, un antígeno del HPV y un antígeno de flavivirus, permanezca sobre la superficie extracelular de la célula, permitiendo de este modo que el antígeno se presente de una manera que se promueve una respuesta inmunitaria adaptativa.
40 En una realización, el antígeno asociado con la partícula puede ser un antígeno de proteína, tal como al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un antígeno de proteína bacteriana, un antígeno de proteína vírica, un antígeno de proteína parasitaria, un antígeno de proteína de micoplasma, un antígeno de proteína tumoral y un antígeno de proteína alergénica. El antígeno de proteína vírica puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un antígeno de proteína del virus de la gripe, un antígeno de proteína del virus respiratorio
45 sincitial (p.ej., las SEQ ID NO: 519, 522, 524, 526-544, 546-551, 577-580, 582, 586, 611, 612, 617, 627 y 840-843) y un antígeno de proteína de flavivirus (p.ej., las SEQ ID NO: 339, 343, 345, 347, 351-355, 371, 381-384, 387-390, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 341, 356, 358-361, 379, 443, 444, 337, 349, 362-370, 372, 373, 375, 377, 379, 380, 385, 386 y 391-442).
El antígeno del virus de la gripe puede incluir al menos un antígeno de proteína integral de membrana, tal como al
50 menos una porción de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una proteína hemaglutinina de membrana (p.ej., al menos una porción de tres proteínas hemaglutinina de membrana están asociadas con la partícula), una proteína neuraminidasa de membrana y una proteína de la matriz 2 de membrana (p.ej., al menos 4 proteínas de la matriz 2 de membrana). Las proteínas hemaglutinina ejemplares para su uso en las composiciones con las partículas incluyen las SEQ ID NO: 228-281, 283-295, 456, 481, 499, 662, 665, 813 y 826-831. Las proteínas
55 de la matriz 2 ejemplares para su uso en invención incluyen las proteínas del ectodominio de M2 (M2e), tales como 296, 298, 300-321, 323-336, 485, 507 y 666.
Las partículas para su uso en la invención pueden ser partículas biodegradables. “Biodegradable”, como se emplea en esta memoria, significa que la partícula tiene la capacidad de descomponerse en condiciones naturales o
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biológicas, tales como en un líquido corporal (p.ej., sangre, mucosidad nasal, piel) de un mamífero.
Los Receptores de tipo Toll y el antígeno en las composiciones que incluyen una partícula, pueden ser componentes de una proteína de fusión asociada con la partícula. Las composiciones que tienen al menos una partícula e incluyen al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una construcción R0, una construcción R3, una construcción R3D0, una construcción R3-2xAg, una construcción D3N, una construcción D3NCs y una construcción D1, y al menos una porción de al menos un antígeno, asociado con la partícula, que tienen una proporción molar de la construcción de flagelina con respecto al antígeno no mayor de aproximadamente 1, pueden incluir adicionalmente alumbre, liposomas, adyuvantes, excipientes, virus (p.ej., adenovirus, poxvirus, alfavirus), bacterias o un ácido nucleico (p.ej., ADN plasmídico).
Los lípidos bicapa pueden formarse en estructuras de tipo carcasa esféricas cerradas denominadas liposomas. Los liposomas empleados en las composiciones de la invención pueden prepararse usando una variedad de técnicas establecidas de preparación de liposomas. Por ejemplo, ultrasonido, diálisis con quelantes, homogeneización, infusión con disolventes acoplada a extrusión, extrusión por congelación-descongelación y microemulsificación, como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.º 4.728.578. 4.728.575. 4.533.254 y 4.737.323; y en Mayer et al., Biochimica et Biophysica Acta, 858: 161-168 (1986), Hope et al., Biochimica et Biophysica Acta,
812: 55-65 (1985), Mahew et al., Methods In Enzymology, 149: 64-77 (1987), Mahew et al., Biochimica et Biophysica Acta, 75: 169-174 (1984) and Cheng et al., Investigative Radiology, 22: 47-55 (1987).
Los materiales para preparar liposomas para su uso en las composiciones descritas en la presente memoria pueden incluir materiales naturales o sintéticos. Dichos materiales incluyen lípidos de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en colesterol, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, lisolípidos, ácidos grasos, esfingomielina, glicoesfingolípidos, glucolípidos, glicolípidos, sulfatidas, ácidos grasos ligados a éster y lípidos polimerizables. Los liposomas pueden sintetizarse en ausencia o en presencia de glicolípido, complejos de hidrato de carbono, polímeros de proteína o sintéticos, incorporados, empleando procedimientos convencionales. La superficie de un liposoma también puede modificarse con un polímero, por ejemplo, con polietilenglicol (PEG). Los lípidos incorporados en una matriz lipídica deben formar un liposoma en condiciones fisiológicamente relevantes, con propiedades de biodistribución y eliminación adecuadas.
Los liposomas polimerizados son agregados autoensamblados de moléculas lipídicas que ofrecen versatilidad en el tamaño de partícula y química de superficie. Los liposomas polimerizados se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.º 5.512.294 y 6.132.764. Los grupos de cola hidrófobos de los lípidos polimerizables se derivatizan con grupos polimerizables, tales como grupos diacetileno, que se reticulan, o polimerizan, de manera irreversible, cuando se exponen a luz ultravioleta o a otra especie iniciadora, radical, aniónica o catiónica, manteniendo al mismo tiempo la distribución de grupos funcionales en la superficie del liposoma. La partícula de liposoma polimerizada resultante se estabiliza contra la fusión con las membranas celulares u otros liposomas y se estabilizan hacia la degradación enzimática. El tamaño de los liposomas polimerizados puede controlarse por extrusión u otros métodos conocidos por los expertos en la materia. Los liposomas polimerizados pueden comprender lípidos polimerizados, pero también pueden incluir lípidos saturados e insaturados, no alcalinos. Los liposomas polimerizados pueden ser una mezcla de lípidos que proporcionan diferentes grupos funcionales en la superficie expuesta hidrófila, tal como biotina, aminas, ciano, ácidos carboxílicos, isotiocianatos, tioles, disulfuros y alquil hidracinas. Estos grupos pueden usarse para la asociación del componente antigénico en una proteína de fusión de la invención.
Los liposomas también pueden prepararse usando una cualquiera de una variedad de técnicas convencionales de preparación de liposomas, tales como, ultrasonido, diálisis con quelantes, homogeneización, infusión con disolventes acoplada a extrusión, extrusión por congelación-descongelación y microemulsificación, como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.º 4.728.578; 4.533.254; 4.728.575; 4.737.323; 4.753.788 y 4.935.171.
Los materiales que pueden utilizarse en la preparación de los liposomas incluyen cualquiera de los materiales o combinaciones adecuadas en la construcción de liposomas, ya sea de origen natural o sintético. Dichos materiales incluyen lípidos de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en colesterol, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, lisolípidos, ácidos grasos, esfingomielina, glicoesfingolípidos, glucolípidos, glicolípidos, sulfatidas, lípidos con amida, éter, ácidos grasos ligados a éster y lípidos polimerizables.
Una composición puede contener partículas múltiples fabricadas de diferentes materiales o diferentes proporciones de los mismos materiales y/o diferir en propiedades tales como tamaño o forma.
Diversos polímeros, por ejemplo, polímeros biocompatibles, que pueden ser biodegradables, pueden usarse para preparar las partículas como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos n.º: 20080069857. Los polímeros pueden ser homopolímeros, copolímeros (incluyendo copolímeros de bloque), de cadena lineal, ramificada o reticulada. Los polímeros biocompatibles adecuados, muchos de los cuales son biodegradables incluyen, por ejemplo, poli(lactidas), poli(glicolidas), poli(lactida-co-glicolidas), poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), poli(ácido-láctico-co-ácidos glicólicos), policaprolactona, policarbonatos, poliesteramidas, poli(betaaminoésteres), polianhídridos, poli(amidas), poli(aminoácidos), polietilenglicol y derivados de los mismos,
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poliortoésteres, poliacetales, policianoacrilatos, polieterésteres, poli(dioxanonas), poli(alquilen alquilatos), copolímeros de polietilenglicol y poliortoésteres, poliuretanos biodegradables. Otros polímeros incluyen poli(éteres) tales como poli(óxido de etileno), poli(etilenglicol) y poli(óxido de tetrametileno); polímeros de vinilo -poli(acrilatos) y poli(metacrilatos) tales como metilo, etilo, otros alquilos, hidroxietil metacrilato, ácidos acrílico y metacrílicos y otros tales como poli(alcohol vinílico), poli(vinil pirrolidona) y poli(acetato de vinilo); poli(uretanos); celulosa y sus derivados, tales como alquilo, hidroxialquilo, éteres, ésteres, nitrocelulosa, y diversos acetatos de celulosa, poli (siloxanos). Otros materiales poliméricos incluyen los basados en materiales de origen natural tales como polisacáridos (por ejemplo, alginato quitosano, agarosa, ácido hialurónico), gelatina, colágeno, y/u otras proteínas y mezclas y/o formas modificadas de las mismas. En las composiciones descritas en la presente memoria también pueden emplearse derivados químicos o biológicos de cualquiera de los polímeros desvelados en la presente memoria (por ejemplo, sustituciones, adición de grupos químicos, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones y otras modificaciones realizadas de manera rutinaria por los expertos en la técnica).
Los ejemplos de polímeros adicionales incluyen derivados de celulosa tales como carboximetilcelulosa, policarbamatos o poliureas, poli(acetato de vinilo) reticulado y similares, copolímeros de éster de etilenvinilo, copolímero de etilenvinil hexanoato, copolímero de etilenvinil propionato, copolímero de etilenvinil butirato, copolímero de etilenvinil pentantoato, copolímero de etilenvinil trimetilacetato, copolímero de etilenvinil dietilacetato, copolímero de etilenvinil 3-metilbutanoato, copolímero de etilenvinil 3-3-dimetilbutanoato y copolímero de etilenvinil benzoato, o mezclas de los mismos.
También se describe una composición que comprende al menos una nanopartícula que incluye al menos un agonista del receptor de tipo Toll 7, al menos un agonista del receptor de tipo Toll 5 y al menos un antígeno, en donde el agonista del receptor de tipo Toll 7 y el antígeno están incluidos en la nanopartícula y el agonista del receptor de tipo Toll 5 está asociado con una superficie externa de la nanopartícula, que puede, opcionalmente, incluir además al menos un agonista del receptor de tipo Toll adicional seleccionado del grupo que consiste en un agonista del receptor de tipo Toll 8 y un agonista del receptor de tipo Toll 9. Un cambio en un pH dentro de la célula con respecto a un pH extracelular puede disociar al menos un agonista del receptor de tipo Toll adicional de la nanopartícula. Una proporción molar que consiste en una suma de una concentración molar del agonista del receptor de tipo Toll 7 y del agonista del receptor de tipo Toll 5 con respecto a una concentración molar de antígeno puede que no sea mayor que aproximadamente 1.
En una realización adicional, se describe una composición que comprende al menos una partícula que incluye al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll 5, al menos una porción de al menos un antígeno, y al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll adicional seleccionado del grupo que consiste en un agonista del receptor de tipo Toll 7, un agonista del receptor de tipo Toll 8 y un agonista del receptor de tipo Toll 9, en donde el agonista del receptor de tipo Toll adicional y, opcionalmente, el antígeno, están incluidos en la partícula y el agonista del receptor de tipo Toll 5 está asociado con una superficie externa de la partícula.
En otra realización más, se describe un método de preparación de una composición de nanopartículas, que comprende las etapas de combinar al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll con al menos una porción de al menos una nanopartícula para formar una asociación entre el agonista del receptor de tipo Toll y la nanopartícula; y combinar al menos una porción de al menos un antígeno con el agonista del receptor de tipo Toll asociado con la nanopartícula, en donde una proporción molar del agonista del receptor de tipo Toll con respecto al antígeno no es mayor que aproximadamente 1, formando de este modo la composición de nanopartículas.
En otra realización adicional, se describe un método de preparación de una composición de nanopartículas, que comprende las etapas de asociar al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll 5 con una nanopartícula; conteniendo al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll seleccionada del grupo que consiste en un agonista del receptor de tipo Toll 7, un agonista del receptor de tipo Toll 8 y un agonista del receptor de tipo Toll 9 dentro de la nanopartícula; y combinar la nanopartícula que contiene el agonista del receptor de tipo Toll con al menos una porción de al menos un antígeno, formando de este modo la composición de nanopartículas.
Otra realización descrita, es un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una composición que incluye al menos una nanopartícula que comprende al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll y al menos una porción de al menos un antígeno, en donde el agonista del receptor de tipo Toll y el antígeno se asocian con la nanopartícula y la proporción molar del agonista del receptor de tipo Toll con respecto al antígeno no es mayor que aproximadamente 1.
Una realización adicional descrita, es un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una composición que incluye al menos una nanopartícula que comprende al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll 7, al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll 5 y al menos una porción de al menos un antígeno, en donde el agonista del receptor de tipo Toll 7 y el antígeno están incluidos en la nanopartícula y el agonista del receptor de tipo Toll 5 está asociado con una superficie externa de la nanopartícula. Adicionalmente la nanopartícula incluye al menos una
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porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll adicional seleccionado del grupo que consiste en un agonista del receptor de tipo Toll 8 y un agonista del receptor de tipo Toll 9.
En una realización adicional, se describe un método de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende la etapa de administrar al sujeto una composición que incluye al menos una nanopartícula que comprende al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll 5, al menos una porción de al menos un antígeno y al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll adicional seleccionado del grupo que consiste en un agonista del receptor de tipo Toll 7, un agonista del receptor de tipo Toll 8 y un agonista del receptor de tipo Toll 9, en donde el agonista del receptor de tipo Toll adicional y, opcionalmente, el antígeno están incluidos en la nanopartícula y el agonista del receptor de tipo Toll 5 está asociado con una superficie de la nanopartícula. El antígeno y el agonista del receptor de tipo Toll 5 están asociados con una superficie externa de la nanopartícula. El diámetro promedio de la partícula es al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en entre aproximadamente 10 a aproximadamente 200 nanómetros, entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 micras y entre aproximadamente 5 a aproximadamente 10 micras.
La partícula para su uso en los métodos descritos en la presente memoria puede ser una nanopartícula, un liposoma, una partícula vírica, un plásmido, una partícula fúngica (por ejemplo, una partícula fúngica de polisacárido), una micropartícula, tal como al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una micropartícula de poliestireno y una micropartícula de poliviniltolueno. El diámetro promedio de la micropartícula puede ser al menos un diámetro seleccionado del grupo que consiste en, aproximadamente 0,1 μm, aproximadamente 0,2 μm, aproximadamente 0,4 μm, aproximadamente 0,5 μm, aproximadamente 1 μm y aproximadamente 2 μm.
Una composición comprende al menos una partícula que incluye al menos una porción de al menos un regulador de señal intracelular y al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll, en donde el regulador de señal intracelular está incluido en la partícula y el agonista del receptor de tipo Toll está asociado con una superficie externa de la partícula. Una proporción molar del agonista del receptor de tipo Toll con respecto al regulador de señal intracelular no es mayor que aproximadamente 1. El tamaño de la partícula puede permitir la entrada de la partícula en la célula. Una vez en la célula, un cambio en un pH dentro de la célula con respecto a un pH extracelular disocia el regulador de señal intracelular de la partícula.
Las composiciones que comprenden al menos una partícula que incluye al menos una porción de al menos un regulador de señal intracelular y al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll 5, una construcción de flagelina, tal como una construcción R3, una construcción R3-2xAg, o una proteína de fusión de la invención que incluye un agonista de TLR 5, pueden incluir adicionalmente al menos un agonista del receptor de tipo Toll adicional seleccionado del grupo que consiste en un agonista del receptor de tipo Toll 7, un agonista del receptor de tipo Toll 8 y un agonista del receptor de tipo Toll 9 incluidos en la partícula.
También se describe un método de preparación de una composición de partículas, que comprende las etapas de contener al menos una porción de al menos un regulador de señal intracelular con al menos una partícula; y asociar al menos una porción de al menos un agonista del receptor de tipo Toll con la partícula, formando de este modo la composición de partículas.
Los antígenos para su uso en las proteínas de fusión, composiciones y métodos de la invención, incluyen antígenos víricos, tales como antígenos del virus de la gripe, antígenos del RSV, antígenos del HPV y antígenos flavivíricos.
Los antígenos del virus de la gripe pueden ser antígenos de HA, antígenos de M2 y antígenos de neuraminidasa. La hemaglutinina (HA) es una glicoproteína de superficie en un virus (por ejemplo, un virus de la gripe) que es responsable de la unión al ácido N-acetilneuramínico (NeuNAc; también denominado “ácido siálico”) en células hospedadoras y de la fusión posterior de las membranas del virus y del hospedador. La HA adquirió su nombre en virtud de su capacidad para hacer que los glóbulos rojos se aglomeren, o aglutinen. La HA de la gripe es un trímero que consiste en tres subunidades monoméricas (HA0). La HA realiza dos funciones críticas durante el proceso de infección: unión a un receptor sialiloligosacárido de superficie celular y fusión de la membrana celular del virus y del hospedador. Después de la unión del trímero de HA con la membrana plasmática de una célula hospedadora, la membrana de la célula hospedadora engulle al virus en un endosoma e intenta digerir el contenido del endosoma acidificando su interior y transfiriéndolo a un lisosoma en la célula hospedadora. Sin embargo, el entorno ácido del lisosoma desestabiliza la HA, dando como resultado un desplegamiento parcial de HA0 que expone un sitio sensible a proteasas (el sitio de escisión maduracional) que se escinde mediante una proteasa hospedadora para formar las subunidades HA1 y HA2 que están conectadas mediante un solo enlace disulfuro (Wiley, D. C., et al., Annu. Rev. Biochem. 56: 365-394 (1987)). La escisión se produce en un resto de aminoácido específico y genera un extremo amino hidrófobo para la subunidad HA2. Este extremo hidrófobo de HA2 actúa como mediador en la fusión entre la envoltura vírica y la membrana endosómica de la célula hospedadora y libera el contenido del virión en el citoplasma de la célula, un proceso conocido como denudación. Por tanto, la escisión del polipéptido de HA es un requisito para la infectividad.
La estructura cristalina de diversas hemaglutininas víricas se ha determinado (véase, por ejemplo, Wilson, I.A., et al., Nature 289: 366-373 (1981); Chen, J., et al., Cell 95: 409-417 (1998); Ha, Y., et al., The EMBO Journal 21: 865-875
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(2002); Russell, R.J., et al., Virology 325: 287-296 (2004); y Cox, N.J., et al., In: Toply and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, eds. B.W.J. Mathy, et al., Vol. 1 (9ª ed.) Nueva York, NY, Oxford Univ. Press, capítulo 32, p. 634 (1998)). Las estructuras cristalográficas de rayos X muestran que la HA está plegada en dos componentes o dominios estructurales – una cabeza globular y un tallo fibroso. La cabeza globular incluye la HA1, incluyendo esa porción de HA1 que se une al ácido siálico (también denominada “sitio o dominio de unión al receptor” o “sitio o dominio de unión al ácido siálico”), y láminas β antiparalelas. El tallo fibroso es más proximal a la membrana vírica y consiste en toda la HA2 y porción de la HA1, incluyendo el sitio de escisión entre HA1 y HA2.
Se conocen quince subtipos de HA de gripe A (H1-H15) que comparten una identidad de secuencia de entre aproximadamente 40 a aproximadamente 60 % (Organización Mundial de la Salud BULL. World Health Organ., 58: 585-591 (1980)). Los virus de la gripe que contienen los 15 subtipos de HA se han aislado de especies de aves (H5, H7, y H9), equinos (H3 y H7), focas (H3, H4 y H7), ballenas (H1 y H13) y cerdos (H1, H3, y H9). Los subtipos del virus de la gripe A se nombran generalmente de acuerdo con los determinantes antigénicos particulares de HA (H, 15 tipos principales) y de neuraminidasa (N, aproximadamente 9 tipos principales). Por ejemplo, los subtipos incluyen gripe A (H2N1), A(H3N2), A(H5N1), A(H7N2), A(H9N2), A(H1N1), A(H3N1) y A(H5N2). En el último siglo, tres subtipos de gripe A produjeron pandemia: H1 en 1918 y 1977; H2 en 1957 y H3 en 1968. En 1997, un virus aviar H5 y en 1999, un virus H9, produjeron brotes de enfermedad respiratoria en Hong Kong. La HA del virus de la gripe de tipo B se ha aislado de seres humanos y de focas y no se divide en subtipos.
Un hospedador infectado con el virus de la gripe puede generar una respuesta de anticuerpos contra la cabeza globular de la HA que protege a ese hospedador de una infección posterior con la misma cepa de virus, bloqueando la interacción entre la HA y la célula hospedadora, es decir, neutralizando la infectividad del virus. Debido a la baja fidelidad y a la alta tasa de replicación del ARN de la gripe, el virus experimenta constantemente mutaciones minoritarias en el gen de HA que preservan a la estructura de la cabeza globular y la interacción de la célula hospedadora, pero que pueden permitir que la descendencia del virus escape de la vigilancia inmunitaria. Estas mutaciones puntuales se denominan “deriva antigénica”. Además, si un solo hospedador se infecta simultáneamente con dos cepas diferentes de gripe A, puede emerger un nuevo subtipo de virus como resultado de la redistribución, o del intercambio de los segmentos de ARN, o genes, entre diferentes cepas de virus de la gripe A. Los virus emergentes de redistribución presentan el sistema inmunitario humano con una nueva experiencia antigénica que normalmente da como resultado una alta morbilidad y mortalidad. Este tipo de cambio antigénico drástico se conoce como “deriva antigénica”. Dado que los virus de la gripe de tipo B circulan casi exclusivamente en seres humanos, estos virus no pueden experimentar redistribución con cepas animales y, por tanto, solo cambian por deriva antigénica.
La inmunidad contra la HA puede reducir la probabilidad de infección y la gravedad de la enfermedad si se produce infección. La HA es una diana antigénica importante y la eficacia de las vacunas depende de la equivalencia antigénica entre la cepa de la vacuna y la cepa circulante. Dado que la proteína hemaglutinina experimenta fácilmente deriva antigénica y deriva para evadir las defensas inmunitarias del hospedador, las vacunas tradicionales deben basarse en cepas gripales actualmente circulantes y anualmente actualizadas. Las actualizaciones anuales de las vacunas de la gripe no son solo costosas sino también requieren cantidades significativas de tiempo de producción e infraestructura de fabricación. Una composición de vacuna basada en regiones invariables del virus puede proporcionar, en general, protección de reacción cruzada.
A diferencia de la cabeza globular de la HA, los cambios en los restos de aminoácidos que rodean el sitio de escisión maduracional de la HA están limitados debido a restricciones funcionales. Los restos de aminoácidos que rodean el sitio de escisión maduracional de la HA influyen en el reconocimiento y por lo tanto en la escindibilidad del sitio por la proteasa del hospedador. Dado que el virus no codifica la proteasa, los cambios en los restos de aminoácidos que rodean el sitio de escisión maduracional están restringidos. Como una consecuencia, un péptido de aproximadamente 20 aminoácidos, que abarca el sitio de escisión maduracional, permanece genéticamente estable entre los virus de la gripe del mismo subtipo de HA (documento WO 2004/080403; Bianchi, et al. J Virol 79: 7380-7388 (2005)) o como péptidos ramificados (Horvath, et al Immunol Letters 60: 127-136(1998), Nagy, et al Scand J Immunol 40:281-291 (1994)).
La proteína de HA del virus de la gripe A puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en H1, H2, H3, H5, H7 y H9. La porción de un antígeno de HA para su uso en la invención puede estar en la cabeza globular de una HA. La frase “una cabeza globular”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una porción de una proteína de una hemaglutinina vírica de origen natural que incluye las regiones de unión al receptor o al ácido siálico. En la presente memoria la “cabeza globular” también recibe el nombre de “dominio globular”. La cabeza globular de las proteínas de hemaglutinina víricas se ha determinado basándose en la cristalografía de rayos X como describen, por ejemplo, Wilson I.A., et al. Nature 289: 366-373 (1981); Chen, J., et al., Cell 95: 409-417 (1998); Ha Y., et al., The EMBO Journal 27: 865-875 (2002); Russell, R.J., et al., Virology 325: 287-296 (2004); y Cox, N.J., et al., En: Toply y Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, eds. BWJ Mathy, et al, Vol. 1 (9ª ed.) Nueva York, NY, Oxford Univ. Press, capítulo 32, p. 634 (1998). La cabeza globular de una hemaglutinina vírica de origen natural es un componente de la subunidad HA1, por ejemplo, de la hemaglutinina del virus de la gripe. Además del dominio de unión al receptor, la cabeza globular puede incluir el subdominio E-y el subdominio F-como describen, por ejemplo, Ha, Y., et al. The EMBO Journal 21: 865-875 (2002).
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Las proteínas de HA para su uso en la invención incluyen HA PR8 (SEQ ID NO: 228) (Gamblin, et al., Science 303: 1838-1842 (2005) Número de registro PDB 1RU7); HA madura A/Viet Nam 1203/2004 (SEQ ID NO: 229); HA de Indonesia (SEQ ID NO: 230); HA de Nueva Caledonia (H1NC; SEQ ID NO: 231); A/Sur de Carolina/1/18 (SEQ ID NO: 232); HA de Wisconsin (H3Wis; SEQ ID NO: 233); y H3N2 subtipo A/X31 (H3X31; SEQ ID NO: 234; Número de registro PDB: 1VIU)). Como ejemplos de antígenos de HA se incluyen antígenos de HA1-1, antígenos de HA1-2 y antígenos de HA1-3. En la solicitud de Estados Unidos n.º: 11/714.873 se describen ejemplos de métodos para preparar los antígenos HA1-1, HA 1-2 y HA 1-3.
“HA1-1,” como se usa en la presente memoria, se refiere a una porción de proteína de una hemaglutinina vírica que incluye al menos aproximadamente un sándwich β que incluye el sitio de unión al sustrato, que incluye al menos aproximadamente dos láminas β, al menos aproximadamente de dos a aproximadamente tres hélices α cortas, al menos una lámina β pequeña y al menos un sándwich β pequeño adicional en la parte inferior de la molécula y al menos aproximadamente cuatro enlaces disulfuro. El sándwich β que incluye el sitio de unión al sustrato de la HA1-1 incluye al menos aproximadamente cuatro cadenas β como la lámina superior y al menos aproximadamente de tres a aproximadamente cuatro cadenas β como la lámina inferior. Al menos aproximadamente una hélice α de la porción HA1-1 se localiza al lado del sándwich β que incluye el sitio de unión al sustrato y al menos de aproximadamente uno a aproximadamente dos se localizan en la parte inferior del sándwich β que incluye el sitio de unión al sustrato. El sándwich β pequeño de la HA1-1 puede incluir al menos de aproximadamente dos a aproximadamente tres cadenas β en cada lámina β; o de aproximadamente tres a aproximadamente cuatro cadenas β. Como ejemplos de porciones de la proteína HA1-1 se incluyen las SEQ ID NO: 235-248, 456 y 662.
“HA1-2,” como se usa en la presente memoria, se refiere a una porción de proteína de una hemaglutinina vírica que incluye al menos aproximadamente un sándwich β que incluye el sitio de unión al sustrato, al menos aproximadamente de dos a aproximadamente tres hélices α cortas, al menos aproximadamente una lámina β pequeña en la parte inferior de la molécula y al menos aproximadamente dos enlaces disulfuro. Una cadena β en una hemaglutinina vírica puede incluir entre aproximadamente de dos a aproximadamente 15 aminoácidos. Una cadena β pequeña puede incluir aproximadamente dos aminoácidos; o entre aproximadamente de dos a aproximadamente tres aminoácidos; o entre aproximadamente de dos a cuatro aminoácidos o entre aproximadamente de dos a aproximadamente cinco aminoácidos. Una lámina β pequeña puede incluir entre aproximadamente de dos a aproximadamente tres cadenas β; o entre aproximadamente de tres a aproximadamente cuatro cadenas β. El sándwich β que incluye el sitio de unión al sustrato de HA1-2 puede incluir adicionalmente al menos aproximadamente cuatro cadenas β como la lámina superior y al menos aproximadamente de tres a aproximadamente cuatro cadenas β como la lámina inferior. Al menos aproximadamente una hélice α de la porción HA1-2 se localiza al lado del sándwich β que incluye el sitio de unión al sustrato y al menos de aproximadamente uno a aproximadamente dos se localizan en la parte inferior del sándwich β que incluye el sitio de unión al sustrato. Como ejemplos de porciones de la proteína HA1-2 se incluyen las SEQ ID NO: 249-263, 481 y 499.
“HA1-3,” como se usa en la presente memoria, ser refiere a una porción de proteína de una hemaglutinina vírica que incluye al menos un sándwich β que incluye el sitio de unión al sustrato, al menos aproximadamente dos hélices α cortas y al menos un enlace disulfuro. “sándwich β,” como se usa en la presente memoria, se refiere a al menos aproximadamente dos conjuntos de láminas β que forman al menos aproximadamente una capa interactiva. “Sitio de unión al sustrato”, como se usa en la presente memoria en referencia al sándwich β, significa cualquier porción de la hemaglutinina viral de origen natural que tiene la capacidad de interaccionar o unirse a una molécula. Por ejemplo, el sándwich β que incluye un sitio de unión al sustrato de la porción puede incluir una porción que se une a ácido siálico. El sándwich β que incluye el sitio de unión al sustrato de HA1-3 puede incluir adicionalmente al menos aproximadamente cuatro cadenas β como la lámina superior y al menos aproximadamente tres cadenas β como la lámina inferior. Al menos aproximadamente una hélice α de la porción HA1-1 se localiza al lado del sándwich β que incluye el sitio de unión al sustrato y al menos otra hélice α se localiza en la parte inferior del sándwich β que incluye el sitio de unión al sustrato. Una hélice α corta puede incluir menos de aproximadamente 5 giros (2, 3, 4, 5 giros) en una hélice α. Una hélice α en una hemaglutinina vírica puede tener entre uno a aproximadamente 15 giros; o entre aproximadamente dos a 15 giros. Como ejemplos de porciones de la proteína HA1-3 se incluyen las SEQ ID NO: 264 -273.
El sitio de escisión de maduración de HA puede emplearse en las composiciones, proteínas de fusión y métodos de la invención. El antígeno del sitio de escisión maduracional puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en (SEQ ID NO: 274-281 y NVPEKQTRGIFGAIAGFIE (H3) (SEQ ID NO: 283), NIPSIQSRGLFGAIAGFIE (H1) (SEQ ID NO: 284), PAKLLKERGFFGAIAGFLE (GRIPE B) (SEQ ID NO: 285), RERRRKKRGLFGAIAGFIE (H5) (SEQ ID NO: 286), RGLXGAIAGFIE (SEQ ID NO: 287), RGLXGAIAGFIE (SEQ ID NO: 288), RGLFGAIAGFIE (región conservada de la gripe A) (SEQ ID NO: 289) y RGFFGAIAGFLE (región conservada de la gripe B) (SEQ ID NO: 290). El antígeno del sitio de escisión maduracional también se denomina en la presente memoria “fragmento de escisión”, “FE”, “sitio de escisión” o “SE”. Como ejemplos de secuencias de péptidos de sitios de escisión de maduración de HA también pueden incluirse los péptidos indicados a continuación:
Secuencia Subtipo
NVPEKQTRGIFGAIAGFIE A/H3N2 (SEQ ID NO: 291)
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NVPQIESRGLFGAIAGFIE A/H2N1 (SEQ ID NO: 292)
NIPSIQSRGLFGAIAGFIE A/H1N1 (SEQ ID NO: 293)
RERRRKKRGLFGAIAGFIE A/H5N1 (SEQ ID NO: 294)
PAKLLKERGFFGAIAGFLE B/HA (SEQ ID NO: 295)
5 En las composiciones, proteínas de fusión y métodos descritos en la presente memoria puede emplearse al menos una porción de una proteína de matriz 2 (M2) de la gripe. En una realización particular, la porción de la proteína M2 incluye el ectodominio de la proteína M2 (M2e).
La proteína de la matriz 2 (M2 o proteína M2) es una proteína del canal de iones de la membrana integral selectiva de protones del virus de la gripe A. M2 es una proteína de 97 aminoácidos expresada a bajos niveles en viriones 10 maduros y a niveles mucho más altos en células infectadas. La proteína M2 forma un homotetrámero que funciona como un canal de iones que es crítico para la replicación de los virus, es decir, las mutaciones en el ectodominio de la proteína M2, M2e, no se toleran bien como mutaciones en la HA. La proteína M2 se expresa abundantemente en la membrana plasmática de células infectadas por virus, pero generalmente está infraexpresada por viriones. Por ejemplo, una porción de una secuencia de M2 de la gripe A es la SEQ ID NO: 296, que está codificada por la SEQ 15 ID NO: 297. La forma nativa de la proteína M2 es un homotetrámero (es decir, cuatro moléculas de proteína M2 idénticas unidas por enlaces disulfuro). Cada una de las unidades son hélices estabilizadas por dos enlaces disulfuro. La M2 está activada a un pH bajo. Cada una de las moléculas de la proteína M2 en el homotetrámero consta de tres dominios: un dominio externo de 24 aminoácidos o N (amino)-terminal (por ejemplo, SEQ ID NO: 298; también denominada en la presente memoria “secuencia consenso humana”), que está codificado por la SEQ ID
20 NO: 299; una región transmembrana de 19 aminoácidos hidrófobos y un dominio interno de 54 aminoácidos o C (carboxi)-terminal. La proteína M2 puede variar dependiendo del subtipo de virus de la gripe (por ejemplo, subtipos H1 y H5 de la gripe A) y de la fuente del virus de la gripe (por ejemplo, Puerto Rico, Tailandia, Nueva York, Hong Kong), como se muestra, por ejemplo, en las secuencias amino-terminales ejemplares de las proteínas M2 (SEQ ID NO: 300-321, 323-336, 485, 507 y 666) y como se describe en la PCT/US2005/046662 (W02006/069262).
25 La proteína M2 tiene una función importante en el ciclo de la vida del virus de la gripe A. Esto es importante en la fase de denudación donde se permite la entrada de protones al interior de la partícula vírica, lo que disminuye el pH dentro del virus, dando como resultado la disociación de la proteína de la matriz M1 vírica de la ribonucleoproteína RNP. Como una consecuencia, la envoltura del virus se retira y el contenido del virus se libera del endosoma al interior del citoplasma de la célula hospedadora para la infección.
30 La función del canal M2 puede inhibirse con fármacos antivirales, tales como amantadina y rimantadina, que impiden que el virus infecte la célula hospedadora. Dichos fármacos antivirales normalmente se unen a la región transmembrana de la proteína M2 y bloquean estéricamente el canal de iones creado por la proteína M2, que impide que los protones entren y se desnude el virión.
La proteína M2 para su uso en las composiciones y métodos descritos en la presente memoria puede incluir al
35 menos una porción de la SEQ ID NO: 298 codificada por la SEQ ID NO: 299 o al menos una porción de la SEQ ID NO: 300, codificada por la SEQ ID NO: 322. La proteína M2 puede incluir adicionalmente al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 325; SEQ ID NO: 326 (aislado de Gripe A H5N1 M2e, 2004 de Viet Nam que reemplaza serina con cisteína); SEQ ID NO: 327 (aislado de Gripe A H5N1 M2e, 2004 de Viet Nam); SEQ ID NO: 328 (aislado de Gripe A H5N1 M2e, Hong Kong 97 que
40 reemplaza serina con cisteína); SEQ ID NO: 329 (aislado de Gripe A H5N1 M2e, Hong Kong 97); SEQ ID NO: 330 (aislado de Gripe A H7N2 M2e de pollo /Nueva York 95 que reemplaza serina con cisteína); SEQ ID NO: 331 (aislado de Gripe A H7N2 M2e de pollo /Nueva York 95); SEQ ID NO: 332 (aislado de Gripe A H9N2 M2e, Hong Kong 99 que reemplaza serina con cisteína); y SEQ ID NO: 333 (aislado de Gripe A, Hong Kong 99). Determinados restos de cisteína, por ejemplo, los aminoácidos 16 y 18 de SEQ ID NO: 327; los aminoácidos 17 y 19 de SEQ ID
45 NO: 329, 331 y 333 en la secuencia de origen natural de al menos una porción de la proteína de M2 pueden reemplazarse con una serina (véanse, las SEQ ID NO: 328, 330, 332 y 300, respectivamente).
Las composiciones que incluyen agonistas del receptor de tipo Toll 5, proteínas de fusión y composiciones descritas en la presente memoria pueden incluir al menos un antígeno vírico y al menos un antígeno vírico adicional que es distinto o similar al antígeno vírico. Por ejemplo, una proteína de fusión que incluye el agonista del receptor de tipo
50 Toll 5, R32x, puede incluir un péptido del sitio de escisión maduracional, una porción de un antígeno vírico de HA (por ejemplo, HA1-1, HA1-2) y al menos una porción de una proteína M2.
Como ejemplos de proteínas M2e se incluyen SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDP (M2e de la gripe humana (SEQ ID NO: 334)); GSGAGSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDP (M2e de la gripe de Vietnam (SEQ ID NO: 335)) y GSGAGSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSDP (M2e de la gripe de Hong Kong (SEQ ID NO: 336)).
55 El antígeno incluido en las composiciones y empleado los métodos descritos en la presente memoria pueden ser al menos una porción de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una proteína del virus del Nilo Occidental, una proteína del virus de Langat, una proteína del virus de Kunjin, una proteína del virus de la encefalitis de Murray Valley, una proteína del virus de la encefalitis japonesa, una proteína del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, una proteína del virus del dengue 1, una proteína del virus del dengue 2, una proteína del virus del dengue 3, una proteína del virus del dengue 4, una proteína del virus de la hepatitis C y una proteína del virus de la fiebre amarilla (véase, por ejemplo, PCT/US2006/001623 (W02006/078657)).
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5 El género flavivirus pertenece a la familia de virus Flaviviridae y consiste en aproximadamente 70 virus. La mayoría de estos virus se transmiten por mosquitos o garrapatas. Diversos flavivirus son patógenos humanos significativos, incluyendo los cuatro virus del dengue (Den1, Den2, Den3 y Den4), de la fiebre amarilla (YF, Yellow Fever), de la encefalitis japonesa (JE, Japanese Encephalitis), del Nilo Occidental (WN, West Nile, también conocido como “WNV” en la presente memoria) y de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE, Tick-Borne Encephalitis) (Weaver S.C.,
10 et al., Nat Rev Microbiol 10: 789-801 (2004)). El género flavivirus se divide en diversos serogrupos basándose en ensayos de neutralización cruzada, incluyendo el serogrupo del dengue que contiene cuatro virus distintos desde el punto de vista serológico y genético, denominados DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4.
Los flavivirus son virus pequeños, con envoltura, con cápsides icosaédricas. El genoma de los flavivirus es un ARN de sentido positivo monocatenario (de aproximadamente 11 kb) que la maquinaria de la célula hospedadora traduce 15 directamente después de la infección. El genoma del virus se traduce como un solo polipéptido que se experimenta escisión cotraduccional y postraduccional mediante enzimas víricas y celulares para generar tres proteínas estructurales del flavivirus (las proteínas de la cápside (C), de la membrana (M) y de la envoltura (E)); y siete proteínas no estructuradas (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, y NS5) (Weaver, et al, Annu Rev Microbiol 1990: 44-649 (2004)). La cápside del virus está compuesta por la proteína C, mientras que tanto la proteína de la envoltura
20 E como de la membrana M se localizan en la superficie de la envoltura del virión (Weaver, S.C., et al., Nat. Rev. Microbiol. 70: 789-801 (2004); Chambers et al., Annu Rev. Microbiol. 44: 649-688 (1990)). Un inmunógeno principal para los flavivirus es la proteína de la envoltura de la membrana.
Un flavivirus puede entrar en una célula hospedadora cuando la proteína de la envoltura del virus se une a un receptor y responde por reordenación conformacional al pH reducido de un endosoma. El cambio conformacional
25 incluye la fusión de las membranas del virus y de la célula hospedadora.
La envoltura de un flavivirus puede funcionar como una proteína de unión al receptor y facilitar la fusión de las membranas del virus y de la célula hospedadora. Las proteínas de la envoltura de los flavivirus tienen características estructurales (dominios I, II y III) y funcionales (funciones de unión al receptor del virus y célula hospedadora y de fusión) comunes y son glucoproteínas de fusión de clase II (Lescar et al., Cell 105: 137-148 (2001)).
30 En la conformación prefusión, las proteínas de la envoltura forman homodímeros en la superficie externa de las partículas del virus (Rey, et al., Nature 375: 291-298); Kuhn, et al., Cell 108:111-125 (2002); Mukhopadhyay, et al., Science 302: 248 (2003)). Cada monómero de la proteína de la envoltura se pliega en tres dominios estructurales (dominios I, II y III) predominantemente compuestos de cadenas β. El dominio I (también denominado en la presente memoria “I” o “DI”) se localiza centralmente en la estructura y tiene un sitio de N-glucosilación en las proteínas de
35 envoltura glucosiladas. El dominio II (también denominado en la presente memoria “II” o “DII) de la proteína de la envoltura promueve la dimerización y tiene un bucle de fusión que se inserta en la membrana del hospedador diana durante la fusión de los virus dependiente del pH (Modis, et al., Nature 427: 313-319 (2004); Bressanelli, et al., EMBO J23: 728-738 (2004)). El dominio III (también denominado en la presente memoria “III” o “DIll”) está en el extremo carboxilo de la proteína de la envoltura. El dominio III también se denomina “dominio B” en estudios previos
40 de mapeo antigénico. El dominio III tiene diversos epítopos que pueden suscitar anticuerpos neutralizantes de virus (Roehrig, Adv Virus Res 59:141-175 (2003)).
El dominio I de la proteína de la envoltura de la encefalitis transmitida por garrapatas corresponde a los aminoácidos 1-51, 137-189 y 285-302 de SEQ ID NO: 337; el dominio II de la proteína de la envoltura de la encefalitis transmitida por garrapatas corresponde a los aminoácidos 52-136 y 190-284 de la SEQ ID NO: 337; y el dominio III corresponde 45 a los aminoácidos 303-395 de la SEQ ID NO: 337. (Rey, F.A., et al, Nature 375: 291-298 (1995)). La SEQ ID NO: 337 está codificada por la SEQ ID NO: 338. El dominio I de la proteína de la envoltura del flavivirus del dengue 2 corresponde a los aminoácidos 1-52, 132-193 y 280-296 de la SEQ ID NO: 339; el dominio II corresponde a los aminoácidos 53-131 y 194-279 de la SEQ ID NO: 339; y el dominio III corresponde a los aminoácidos 297-495 de la SEQ ID NO: 339 (Modis, Y., et al., Nature 427: 313-319 (2004)). La localización de los dominios I, II y III de otros 50 flavivirus (por ejemplo, virus del Nilo Occidental, encefalitis japonesa, virus del Dengue 1, virus del Dengue 3 y virus del Dengue 4) se basa en la homología de los dominios de la proteína de envoltura de la encefalitis transmitida por garrapatas y de los dominios de la proteína de envoltura del Dengue 2. Por tanto, en la presente memoria la referencia a los dominios de las proteínas de flavivirus, en particular, flavivirus distintos de los las proteínas de envoltura de flavivirus de la encefalitis transmitida por garrapatas y proteínas de envoltura de flavivirus del Dengue 2,
55 se basan en la homología con los dominios en la proteína de envoltura de flavivirus de la encefalitis transmitida por garrapatas y en la proteína de envoltura de flavivirus del Dengue 2.
El dominio III de la proteína de envoltura de los flavivirus DEN codifica la mayoría de los epítopos neutralizantes críticos/dominantes contiguos específicos de tipos de flavivirus (Roehring, J.T., Adv. Virus Res. 59: 141 (2003)), incluyendo los cuatro virus DEN (DEN1, DEN2, DEN3, DEN4). Las proteínas de la envoltura de flavivirus son muy
60 homólogas. Son ejemplos de secuencias de proteínas de envoltura las SEQ ID NO: 341, 339, 343, 345, 347 y 349.
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El virus del Nilo Occidental (WNV) es un de virus con envoltura de ARN monocatenario de sentido positivo. Se aisló e identificó por primera vez en la región de Uganda del Nilo Occidental en 1937 procedente de una mujer adulta con fiebre (Smithbum, et al., Am J Trop MedHyg 5: 9-18 (1954)).
El virus de la encefalitis japonesa (JE) se localizó en Asia y en Australia boreal (aproximadamente 50.000 casos con 5 aproximadamente 10.000 muertes al año).
La enfermedad del dengue (DEN) está causada por cuatro flavivirus serológicamente relacionados, transmitidos por mosquitos, conocidos como DEN-1 (también denominado en la presente memoria “Den1” o Den 1”), DEN-2 (también denominado en la presente memoria “Den2” o “Den 2”), DEN-3 (también denominado en la presente memoria “Den3” o “Den 3”) y DEN-4 (también denominado en la presente memoria “Den4” o Den 4”).
10 Las composiciones, proteínas de fusión y polipéptidos pueden incluir Den 1 SEQ ID NO: 351; Den 1 PR 94 (Puerto Rico, 1994) SEQ ID NO: 352; Den 3 SEQ ID NO: 354 y Den 4 SEQ ID NO: 355. Las SEQ ID NO: 351, 352, 353, 354 y 355 son porciones del dominio III de los flavivirus Den1, Den2, Den3 y Den4. Como ejemplos de porciones de los virus del dengue para su uso en las composiciones, proteínas de fusión y métodos incluyen las SEQ ID NO: 339, 343, 345, 347, 351-355, 371, 381-384, 387-390, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656 y 658. “El”,
15 “ElI” y “EIII”, como se usa en la presente memoria, se refiere a los dominios I, II y III, respectivamente, de la proteína de envoltura de flavivirus del Nilo Occidental. “JEI”, “JEII” y “JEIII”, como se usa en la presente memoria, se refiere a los dominios I, II y III, respectivamente, de la proteína de envoltura de flavivirus de la encefalitis japonesa. “Den1 I”, “Den1 II” y “Den1 III,” como se usa en la presente memoria, se refiere a los dominios I, II y III, respectivamente, de la proteína de envoltura de flavivirus del Dengue 1. Del mismo modo, las denominaciones para los dominios de las
20 proteínas de envoltura de otros flavivirus se indican con el nombre del flavivirus seguido del número del dominio (por ejemplo, (transmitido por garrapata) TBI (Tick-Borne), TBII, TBIII, Den2 I, Den2 II, Den2 III).
La porción de una proteína de envoltura de un flavivirus puede incluir al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en al menos una porción del dominio I, al menos una porción del dominio II y al menos una porción del dominio III. Cuando un dominio se designa con una “+,” por ejemplo, “EIII+” o “JEIII+,” la porción de la proteína de 25 envoltura indicada como “III” es un componente del total de ese dominio mas al menos uno de al menos una porción de cualquiera o ambos dominios I y II. Por ejemplo, “EIII+,” como se usa en la presente memoria, significa que las composiciones, proteínas de fusión y polipéptidos de la invención incluyen el dominio III y al menos una porción del dominio I. “EIII+” también se refiere a “EI/III.” “JEIII+” también se refiere a “JEI/III.” De manera similar, cuando las composiciones incluyen dominios de proteínas de envoltura de flavivirus, los dominios pueden ser cualquier 30 combinación de los dominios I, II y III y pueden designarse basándose en el dominio. Por ejemplo, EI/II incluye el dominio I y II del flavivirus del Nilo Occidental. La ausencia de un “+” en referencia a un dominio (por ejemplo, EIII, JEIII, Den1 III) de una proteína de envoltura empleada en las composiciones, proteínas de fusión y polipéptidos significa que la composición, proteína de fusión y polipéptido incluye el dominio indicado. Por ejemplo, “Den1 III” significa que las composiciones, proteínas de fusión y polipéptidos incluyen el dominio III, no los dominios I y II, del
35 virus del Dengue 1.
La proteína de envoltura del virus del Nilo Occidental puede incluir al menos una parte de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 356, que es una secuencia de aminoácidos de EIII+, los aminoácidos en cursiva son el dominio I de la proteína de envoltura y el resto de la secuencia es el dominio III de la proteína de envoltura; la SEQ ID NO: 358, virus del Nilo Occidental, Stanford, CT, también denominado “S Nilo
40 Occidental”; la SEQ ID NO: 359, virus del Nilo Occidental, Nueva York, NY, también denominado “NY Nilo Occidental”; y la SEQ ID NO: 360, la SEQ ID NO: 357 codifica la SEQ ID NO: 356.
LTSGHLKCRVKMEKLQLKGT péptido E 001 del virus del Nilo Occidental (SEQ ID NO: 361). Las porciones ejemplares de los virus del Nilo Occidental para su uso en las composiciones, proteínas de fusión y métodos descritos en la presente memoria incluyen la SEQ ID NO: 341, 356, 358-361, 379, 443 y 444.
45 La proteína de envoltura del virus de Langat para su uso en las composiciones, proteínas de fusión y polipéptidos puede incluir al menos una porción de la SEQ ID NO: 362.
La proteína de envoltura del virus de Kunjin puede incluir al menos una porción de la SEQ ID NO: 363. La proteína de envoltura de la encefalitis del Valle de Murray puede incluir al menos una porción de la SEQ ID NO: 364. La proteína de envoltura de la encefalitis japonesa puede incluir al menos un miembro seleccionado del grupo que 50 consiste en al menos una porción de la SEQ ID NO: 365 y SEQ ID NO: 366. La proteína de envoltura de la encefalitis transmitida por garrapatas puede incluir al menos una porción de la SEQ ID NO: 367. La proteína de envoltura del virus de la fiebre amarilla puede incluir al menos una porción de la SEQ ID NO: 368. La proteína de envoltura de un flavivirus puede incluir al menos una porción de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 369 y SEQ ID NO: 370. Las SEQ ID NO: 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369 y 370
55 son porciones del dominio III de la proteína de envoltura vírica. EAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFKK (SEQ ID NO: 371) péptido E del dengue 2, SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDP BCRABL (SEQ ID NO: 372) péptido de tipo silvestre.
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Las porciones ejemplares adicionales de flavivirus para su uso en las composiciones, proteínas de fusión y métodos incluyen las SEQ ID NO: 337, 349, 362-370, 372, 373, 375, 377, 379, 380, 385, 386 y 391-442. Las proteínas de fusión y los antígenos de virus ejemplares adicionales para su uso en las composiciones y métodos incluyen lo siguiente:
Los ejemplos de antígenos de la gripe, proteínas de fusión y ácidos nucleicos que codifican los antígenos y las proteínas de fusión incluyen:
SEQ ID NO: 452 STR2R3. HA1-2 (VN)
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10 SEQ ID NO: 454 HA0 (VN)
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SEQ ID NO: 455 STF2R3.2x.HA1-2 (VN) SEQ ID NO: 456 HA1-1 (VN)
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SEQ ID NO: 459 secuencia de ácido nucleico para HA1-2 PR8
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SEQ ID NO: 462 secuencia de ácido nucleico para HA1-2 SI SEQ ID NO: 465 STR2R3.HA1-2 SI
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SEQ ID NO: 466 secuencia de ácido nucleico para STF2R3.HA1-2 B/Fla (optimizada por codones) SEQ ID NO: 467 secuencia de ácido nucleico para HA1-2 B/Fla (optimizada por codones) SEQ ID NO: 469 secuencia de ácido nucleico para STF2R3.2x.HA1-2 B/Fla (optimizada por codones)
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SEQ ID NO: 470 STF2F3.HA1-2 B/Fla
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SEQ ID NO: 471 STF2R3.2x.HA1-2 B/Fla
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SEQ ID NO: 475 secuencia de ácido nucleico para STF2R3.HA1-2 B/Fla (tipo silvestre) SEQ ID NO: 476 secuencia de ácido nucleico para HA1-2 B/Fla (tipo silvestre) SEQ ID NO: 478 secuencia de ácido nucleico para STF2.R3. HA1-2 PR8 SEQ ID NO: 480 secuencia de ácido nucleico para STF2.R32x.HA1-2 VN SEQ ID NO: 481 proteína HA1-2 VN
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SEQ ID NO: 482 secuencia de ácido nucleico para HA1-2 VN
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SEQ ID NO: 484 secuencia de ácido nucleico para 4xM2e SEQ ID NO: 485 proteína 4xM2e
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SEQ ID NO: 488 secuencia de ácido nucleico para fljb SEQ ID NO: 489 secuencia de ácido nucleico para STF2R3.HA1-2 PR8 SEQ ID NO: 490 secuencia de ácido nucleico para STF2R3.HA1-2 SI
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SEQ ID NO: 29 proteína R3 SEQ ID NO: 36 secuencia de ácido nucleico para R3
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SE
SEQ ID NO: 29 proteína 2x antigénica R3
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SEQ ID NO. 36 secuencia de ácido nucleico para 2x antigénica R3
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SEQ ID NO: 499 HA1-2 SI
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SEQ ID NO: 500 STF2fliCR3.HA1-2 (SI); el antígeno se indica subrayado SEQ ID NO: 501 E. coliR3.HA1-2 (SI); el antígeno se indica subrayado
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SEQ ID NO: 502 Bacillus subtilis R3.HA1-2 (SI); el antígeno se indica subrayado
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SEQ ID NO: 503 STF2fliCR32x.HA1-2 (SI); el antígeno se indica subrayado SEQ ID NO: 504 STF2fljBR32x.HA1-2 (SI); el antígeno se indica subrayado
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SEQ ID NO: 505 E. coliR32x.HA1-2 (SI); el antígeno se indica subrayado SEQ ID NO: 506 Bacillus subtilisR32x.HA1-2 (SI); el antígeno se indica subrayado
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SEQ ID NO: 507 péptido M2e
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SEQ ID NO: fliC R3
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SEQ ID NO: 700 E. coli R3
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SEQ ID NO: 701 Bacillus subtilis R3
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SEQ ID NO: 826 HA longitud completa SI
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SEQ ID NO: 827 secuencia A de longitud completa HA/ Nueva Caledonia/ 20/ 99 SEQ ID NO: 828 secuencia A de longitud completa de HA/ Wisconsin 67e5/ 2005
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SEQ ID NO: 829 secuencia A de longitud completa de HA/ Viet Nam/ 1203/ 2004 SEQ ID NO: 830 secuencia B de longitud completa de HA/ Florida/ 4/ 2006
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SEQ ID NO: 831 secuencia B de longitud completa de Ha/ Malasia/ 2506/ 2004
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En otra realización, la invención es una secuencia de aminoácidos que codifica la secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 84,0 %, al menos 80,0 %, al menos 85,0 %, al menos 86,0 %, al menos 88,0 %, al menos 90,0 %, al menos 95,0 %, al menos 98,0 % y al menos 99,0 % con una secuencia de aminoácidos contigua, sin ninguna inserción ni deleción, como se expone en la SEQ ID NO: 29.
10 El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos (o de dos secuencias de ácido nucleico) puede determinarse alineando las secuencias con fines comparativos óptimos (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia). La secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico en posiciones correspondientes se comparan después, y el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas que comparten las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones
15 idénticas/ total número de posiciones x 100). La longitud de la proteína o del ácido nucleico codificante que puede alinearse con fines comparativos es de al menos de aproximadamente 30,0 %, al menos de aproximadamente 40,0 %, al menos de aproximadamente 50,0 %, al menos de aproximadamente 60,0 %, al menos de aproximadamente 70,0 %, al menos de aproximadamente 75,0 %, al menos de aproximadamente 80 %, al menos de aproximadamente 85,0 %, al menos de aproximadamente 90,0 %, al menos de aproximadamente 95,0 %, al menos
20 de aproximadamente 98,0 %, al menos de aproximadamente 99,0 % o 100 %, de la longitud de la secuencia de referencia, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de un antígeno (por ejemplo, SEQ ID NO: 114-120, 523, 525, 545, 645, 647, 649, 651, 618, 459, 462, 476, 484), agonista del receptor de tipo Toll (por ejemplo, SEQ ID NO: 34, 22, 27) o proteína de fusión (por ejemplo, SEQ ID NO: 667-672, 553, 555, 569, 628, 630, 632, 634, 451-453, 455, 457, 463-465, 660 y 664).
25 La comparación real de las dos secuencias puede realizarse por métodos bien conocidos, por ejemplo, usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante preferido de dicho algoritmo matemático se describe en Karlin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993). Dicho logaritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX (versión 2.2) como se describe en Schaffer et al. (Nucleic Acids Res., 29: 2994-3005 (2001). Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST con huecos, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN; disponible en el sitio web del National Center for Biotechnology Information). En una realización, la base de datos de búsqueda es una base de datos no redundante (NR), y los parámetros para la
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5 comparación de secuencias pueden establecerse a: sin filtros; valor esperado de 10; tamaño de palabra de 3; la matriz es BLOSUM62; y los costes por hueco tienen una existencia de 11 y una extensión de 1.
Otro algoritmo matemático empleado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete del programa informático de alineación de secuencias GCG (Accelrys, San Diego, California). Cuando se utiliza el programa 10 ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se usa una tabla de restos por peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12, y una penalización de hueco de 4. En la técnica se conocen algoritmos adicionales de análisis de secuencias e incluyen ADVANCE y ADAM como se describe en Torellis y Robotti (Comput. Appl. Biosci.,
10: 3-5 (1994); y FASTA descrito en Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85: 2444-2448 (1988).
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también puede realizarse usando el programa GAP
15 en el paquete informático GCG (Accelrys, San Diego, California) usando la matriz Blossom 63 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 2, 3 o 4. En otra realización adicional, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico puede realizarse usando el programa GAP en el paquete informático GCG (Accelrys, San Diego, California), usando un peso de hueco de 50 y un peso de longitud de 3.
La secuencia de ácido nucleico que codifica un componente proteico antigénico descrito en la presente memoria, o
20 un componente de flagelina de la invención, polipéptidos, secuencias de aminoácidos y proteínas de fusión de la invención pueden incluir secuencias de ácido nucleico que se hibridan con secuencias de ácido nucleico o complementos de secuencias de ácido nucleico y secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos y proteínas de fusión de la invención en condiciones de hibridación selectivas (por ejemplo, condiciones de hibridación muy rigurosas). Como se usa en la presente memoria, las expresiones “se hibrida en condiciones de
25 rigurosidad baja”, “se hibrida en condiciones de rigurosidad media”, “se hibrida en condiciones de rigurosidad alta” o “se hibrida en condiciones de rigurosidad muy alta”, describen condiciones de hibridación y lavado de las secuencias de ácido nucleico. En Aubusel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (2001), cuyas enseñanzas se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad, puede encontrarse una orientación sobre cómo efectuar reacciones de hibridación, que pueden incluir métodos acuosos y no acuosos.
30 Para aplicaciones que requieren alta selectividad, pueden emplearse condiciones de rigurosidad relativamente altas para formar híbridos. En las soluciones usadas para algunas hibridaciones basadas en membrana, la adición de un disolvente orgánico, tal como formamida, permite que se produzca la reacción a una temperatura más baja. Las condiciones de rigurosidad alta son, por ejemplo, condiciones salinas relativamente bajas y/o a alta temperatura. Una rigurosidad alta se proporciona con NaCl de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,10 M, a
35 temperaturas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C. Las condiciones de rigurosidad alta permiten limitar el número de emparejamientos erróneos entre las dos secuencias. Para conseguir condiciones menos rigurosas, la concentración salina puede aumentarse y/o la temperatura puede disminuirse. Las condiciones de rigurosidad media se consiguen a una concentración salina de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,25 M de NaCl y a una temperatura de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 55 °C, mientras que las condiciones de
40 rigurosidad baja se consiguen a una concentración salina de aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M de NaCl y a una temperatura que varía de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 55 °C. Los expertos en la técnica saben cómo seleccionar bien los componentes y las condiciones para llevar a cabo una hibridación y se revisan en Ausubel  . (1997, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York N.Y., Units 2,8-2,11, 3,18-3,19 y 4-64,9).
45 Un “sujeto,” como se usa en la presente memoria, puede ser un mamífero, tal como un primate o un roedor (por ejemplo, una rata, un ratón). En una realización particular, el sujeto es un ser humano.
Una “cantidad eficaz”, cuando se hace referencia a la cantidad de una composición y proteína de fusión, se refiere a esa cantidad o dosis de la composición y proteína de fusión que, cuando se administra al sujeto, es una cantidad suficiente para obtener una eficacia terapéutica (por ejemplo, una cantidad suficiente para estimular una respuesta
50 inmunitaria en el sujeto, una cantidad suficiente para proporcionar inmunidad protectora en el sujeto). Las composiciones y proteínas de fusión pueden administrarse en una sola dosis o en dosis múltiples.
Los métodos descritos pueden realizarse mediante la administración de las composiciones y proteínas de fusión que se describen en la presente memoria, por medios enterales o parenterales. Específicamente, la vía de administración es por ingestión oral (por ejemplo, en forma de bebida, comprimido, cápsula) o inyección
55 intramuscular de la composición y proteína de fusión. Otras vías de administración también pueden incluir la administración intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea y la administración intranasal. También pueden emplearse supositorios o parches transdérmicos.
Las composiciones, proteínas de fusión y proteínas descritas pueden administrarse ex vivo a células dendríticas autólogas de un sujeto. Después de poner en contacto las células dendríticas a la composición y proteína, dichas
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células pueden administrarse al sujeto.
Las composiciones, proteínas de fusión y proteínas descritas pueden administrarse en solitario o pueden coadministrarse al paciente. La coadministración significa incluir administración simultanea o secuencial de la composición, proteína o polipéptido individualmente o en combinación. Cuando la composición y la proteína se 5 administran individualmente, el modo de administración puede realizarse de una manera suficientemente próxima con respecto al tiempo, una con respecto a la otra, (por ejemplo, la administración de la composición próxima con respecto al tiempo a la administración de la proteína de fusión) de tal manera que los efectos sobre la estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto sean máximos. También se contempla que, para administrar las composiciones y proteínas descritas, puedan usarse vías de administración múltiples (por ejemplo, intramuscular,
10 oral, transdérmica).
Las composiciones, proteínas de fusión y proteínas descritas pueden administrarse en solitario o como mezclas con excipientes convencionales, por ejemplo, sustancias transportadoras, orgánicas o inorgánicas, farmacéutica o fisiológicamente aceptables, adecuadas para la aplicación enteral o parenteral que no reaccionan perjudicialmente con el extracto. Entre los transportadores adecuados, farmacéuticamente aceptables, se incluyen agua, soluciones 15 salinas (tales como solución de Ringer), alcoholes, aceites, gelatinas e hidratos de carbono, tales como lactosa, amilosa o almidón, ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidina. Dichas preparaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, tales como lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para ejercer influencia sobre la presión osmótica, tampones, colorantes, y/o sustancias aromáticas y similares que no reaccionan perjudicialmente con las composiciones, proteínas o
20 polipéptidos de la invención. Las preparaciones también pueden combinarse, cuando se desee, con otras sustancias activas para reducir la degradación metabólica. Las composiciones y proteínas descritas pueden administrarse por administración oral, tal como en forma de una bebida, inyección intramuscular o intraperitoneal o a través de la nariz. Las composiciones y proteínas en solitario, o cuando se combinan con una mezcla, pueden administrarse en una sola dosis o en más de una dosis durante un periodo de tiempo que confiere el efecto deseado.
25 Cuando se necesite o se desee realizar una aplicación parenteral, las mezclas particularmente adecuadas para las composiciones, proteínas de fusión y proteínas son soluciones inyectables, estériles, preferentemente oleaginosas o acuosas, así como suspensiones, emulsiones o implantes, incluyendo supositorios. En particular, los transportadores para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de dextrosa, solución salina, agua pura, etanol, glicerol, propilenglicol, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, polímeros de bloque de polioxietileno y
30 similar.
Las ampollas con dosificaciones unitarias convenientes. Las composiciones, proteínas o polipéptidos también pueden administrarse mediante bombas o parches transdérmico. Las mezclas farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención son muy conocidas por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Pharmaceutical Sciences (17ª Ed., Mack Pub. Co., Easton, PA) y en el documento WO 96/05309.
35 Las composiciones, proteínas de fusión y proteínas descritas pueden administrarse a un sujeto en un soporte que presente las composiciones, proteínas y proteínas de fusión al sistema inmunitario del sujeto, para generar una respuesta inmunitaria en el sujeto. La presentación de las composiciones, proteínas y proteínas de fusión descritas incluirían preferentemente la exposición de porciones antigénicas de la proteína del virus para generar anticuerpos. Los componentes (por ejemplo, PAMP y una proteína viral) de las composiciones, proteínas y proteínas de fusión de
40 lo descrito, pueden estar en estrecha proximidad física entre sí en el soporte. El soporte es biocompatible. “Biocompatible,” como se usa en la presente memoria, significa que el soporte no genera una respuesta inmunitaria del sujeto (por ejemplo, la producción de anticuerpos).
La dosificación y frecuencia (dosis sencillas o múltiples) administradas a un sujeto, pueden variar dependiendo de diversos factores, incluyendo la exposición previa a un antígeno vírico, a una proteína vírica, la duración de la 45 infección vírica, el tratamiento previo de la infección vírica, la vía de administración de la composición, la proteína o polipéptido, el tamaño, la edad, sexo, salud, peso corporal, índice de masa corporal y dieta del sujeto; naturaleza y grado de los síntomas de la exposición vírica, infección vírica y el virus particular responsable de la infección vírica o tratamiento o infección de un antígeno vírico, del tipo de tratamiento simultáneo, de las complicaciones de la exposición vírica, de la infección o de la exposición vírica u otros problemas relacionados con la salud. Junto con los 50 métodos y composiciones, proteínas o polipéptidos de la invención, pueden usarse otros regímenes o agentes terapéuticos. Por ejemplo, la administración de las composiciones y proteínas puede realizarse mediante otros agentes terapéuticos o mediante el uso de agentes para tratar los síntomas de una afección asociada a, o consecuente con, la exposición de los virus, y el antígeno o infección vírica, por ejemplo. El ajuste y la manipulación de las dosificaciones establecidas (por ejemplo, frecuencia y duración) se encuentran bien dentro de la habilidad de
55 los expertos en la técnica.
En una realización, al sujeto (por ejemplo, un ser humano) se le puede administrar las composiciones, proteínas y proteínas de fusión de la invención en al menos una dosis seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente una dosis de 10,0 μg, aproximadamente una dosis de 5,0 μg, aproximadamente una dosis de 3,0 μg, aproximadamente una dosis de 2,5 μg, aproximadamente una dosis de 1,0 μg, aproximadamente una dosis de 60 0,5 μg, aproximadamente una dosis de 0,3 μg, aproximadamente una dosis de 0,25 μg, aproximadamente una dosis
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de 0,1 μg, aproximadamente una dosis de 0,05 μg, aproximadamente una dosis de 0,025 μg y aproximadamente una dosis de 0,01 μg.
Las composiciones y/o dosis de las composiciones, proteínas y proteínas de fusión, pueden administrarse al ser humano en una sola dosis o en dosis múltiples, tal como al menos en dos dosis. Cuando al sujeto se le administran 5 dosis múltiples, después de la dosis inicial se puede administrarse una segunda dosis o una dosis además de la dosis inicial durante días (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7), semanas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), meses (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) o años (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Por ejemplo, puede administrarse una segunda dosis de la composición al cabo de aproximadamente 7 días, aproximadamente 14 días
o aproximadamente 28 días después de la administración de una primera dosis.
10 Las composiciones y métodos de empleo de las composiciones pueden incluir adicionalmente una proteína transportadora. La proteína transportadora puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un toxoide tetánico, un toxoide de Vibrio cholerae, un toxoide diftérico, un mutante de reacción cruzada del toxoide de la difteria, una subunidad B de E. coli de una enterotoxina termolábil, una proteína de recubrimiento del virus del mosaico del tabaco, una proteína de envoltura del virus de la rabia, una glicoproteína de envoltura del virus de la
15 rabia, una tiroglobulina, una proteína 60 de choque térmico, una hemocianina de lapa californiana y un antígeno secretado temprano de tuberculosis de 6kDA
Un “transportador”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula (por ejemplo, proteína, péptido) que puede potenciar la estimulación de una respuesta inmunoprotectora. Los transportadores pueden unirse físicamente (por ejemplo, ligarse por tecnología recombinante, síntesis peptídica, conjugación química o reacción
20 química) a una composición o mezclarse con la composición.
Los transportadores para su uso en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria pueden incluir, por ejemplo, al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un toxoide tetánico (TT), un toxoide de Vibrio cholerae, un toxoide diftérico (TD), un mutante de reacción cruzada (MRC) del toxoide diftérico, una enterotoxina de E. coli, la subunidad B de E. coli de una enterotoxina termolábil (LTB), una proteína de recubrimiento 25 del virus del mosaico del tabaco (TMV), una proteína (glucoproteína) de envoltura del virus de la rabia (RV), tiroglobulina (Thy), proteína de choque térmico HSP de 60 kDA, hemocianina de lapa californiana (KLH), un antígeno secretado temprano de la tuberculosis de 6 kDA (ESAT-6), exotoxina A, un coleragenoide, un antígeno principal de la hepatitis B y el complejo de proteínas de la membrana externa de N. meningiditis (OMPC) (véase, por ejemplo, Schneerson, R., et al., Prog Clin Biol Res 47: 77-94 (1980); Schneerson, R., et al., JExp Med 152: 361-76 (1980); 30 Chu, C., et al., Infect Immun 40: 245-56 (1983); Anderson, P.,  233-238 (1983); Anderson, P., et al., J Clin Invest 76: 52-59 (1985); Que, J.U., et al. Infect Immun 56: 2645-9 (1988); Que, J.U., et al. Infect Immun 56: 2645-9 (1988); Murray, K., et al., Biol Chem 380: 277-283 (1999); Fingerut, E., et al., Vet Immunol Immunopathol
112: 253-263 (2006); y Granoff, D.M., et al., Vaccine 11: Suppl 1: S46-51 (1993)).
Los ejemplos de proteínas transportadoras para su uso en los métodos y composiciones que se describen en la
35 presente memoria pueden incluir al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un mutante de reacción cruzada (MRC) de la toxina diftérica (SEQ ID NO: 41), una proteína de envoltura del virus del mosaico del tabaco (TMV) (SEQ ID. NO: 42), una proteína de envoltura del virus del mosaico de la alfalfa (AMV) (SEQ ID NO: 43), una proteína de envoltura del virus X de la patata (SEQ ID NO: 44), porinas de Neisseria sp, tales como la proteína de membrana externa de clase I de Neisseria meningitides (SEQ ID NO: 45), proteína de la subunidad
40 fimbrial principal de tipo I (fimbrilina) (SEQ ID NO: 46), lipopéptido activador de macrófagos fermentadores de micoplasma (MALP-2) (SEQ ID NO: 47), y la proteína p19 de Mycobacterium tuberculosis (SEQ ID NO: 48).
Las composiciones, proteínas y proteínas de fusión descritas en la presente memoria pueden incluir adicionalmente al menos un adyuvante. Los adyuvantes contienen agentes que pueden potenciar la respuesta inmunitaria contra sustancias que son poco inmunogénicas en sí mismas (véase, por ejemplo, Immunology Methods Manual, vol. 2, 1. 45 Lefkovits, ed., Academic Press, San Diego, CA, 1997, ch. 13). El Immunology Methods Manual está disponible como un conjunto de cuatro volúmenes, (código de producto Z37,435-0); en CD-ROM, (código de producto Z37,436-9); o ambas cosas, (código de producto Z37,437-7). Los adyuvantes pueden ser, por ejemplo, mezclas de compuestos naturales o sintéticos que, cuando se administran con las composiciones de la invención, tales como proteínas que estimulan una respuesta inmunoprotectora fabricadas por los métodos descritos en la presente memoria, potencian 50 adicionalmente la respuesta inmunitaria contra la proteína. Las composiciones que adicionalmente incluyen adyuvantes pueden aumentar también la respuesta inmunoprotectora estimulada por la composición mediante, por ejemplo, la estimulación de una respuesta celular y/o humoral (es decir, protección de enfermedad frente a producción de anticuerpos). Los adyuvantes pueden actuar potenciando la captación y localización de las proteínas, la ampliación y prolongación de la liberación de las proteínas, la activación de macrófagos y la estimulación de
55 linfocitos T y B. Los adyuvantes para su uso en los métodos y composiciones que se describen en la presente memoria pueden ser sales minerales, emulsiones en aceite, productos micobacterianos, saponinas, productos sintéticos y citocinas. Los adyuvantes pueden unirse físicamente (por ejemplo, ligarse por tecnología recombinante, mediante síntesis peptídica o reacción química) a una composición descrita en la presente memoria o mezclada con las composiciones descritas en la presente memoria.
60 A continuación se indica una descripción de ejemplos de realizaciones de la invención.
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Ejemplos
EJEMPLO 1: LAS VACUNAS DE CABEZA GLOBULAR DE HA H5 QUE UTILIZAN LAS FORMAS R3 Y 2XR3 DE LA FLAGELINA PROPORCIONAN UNA EFICACIA SUPERIOR Y UNA INMUNOGEINICIDAD MEJORADA A
PROPORCIONES DE REACTOGENEICIDAD
5 Materiales y Métodos
Producción de vacunas
Clonación de genes HA recombinantes. STF2.HA1-2 (VN): para la expresión de la hemaglutinina (HA) recombinante en E. coli, los genes sintéticos optimizados por codones del dominio de la cabeza globular de HA de la gripe A/Vietnam/1203/04 se fusionaron directamente con el extremo C de la secuencia de longitud completa de fljB 10 (flagelina de fase 2) S , STF2 (SEQ ID NO: 447) (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA) para producir (SEQ ID NO: 451) o se usaron para reemplazar bien el dominio 3 de STF2 (aa191-aa292, (SEQ ID NO: 447)) para producir (SEQ ID NO: 452) o el dominio 0 de STF2 (aa1 -aa46 y aa465 -aa506, HA1-2 fusionado al aa464 de SEQ ID NO: 447) para producir (SEQ ID NO: 453). Para la construcción de la fusión C terminal (SEQ ID NO: 451 y 477), el último aminoácido de flagelina, R506, se mutó a A506 para reducir la degradación proteolítica. Las construcciones
15 resultantes se clonaron en los vectores pET24a. Los plásmidos se usaron para transformar células BLR3 (DE3) para generar bancos de células de trabajo (Novagen, San Diego, CA). STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452 y 478).
Para generar STF2R3.HA1-2 VN, se usó una reacción PCR de dos etapas para reemplazar el dominio D3 de STF2 con HA1-2 (VN). En la primera etapa, el ADN de pET24a-STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 477) se usó como molde de ADN, YZ015, YZ123 e YZ124, YZ140 se usaron como cebadores para amplificar el extremo N y extremo C de
20 STF2 respectivamente, los cebadores YZ122 e YZ125 se usaron para amplificar HA 1-2 (VN). En la segunda etapa, los fragmentos STF2 y HA1-2 (VN) purificados en gel, se usaron como moldes de ADN, YZ015 e YZ140 se usaron como cebadores para la reacción de PCR solapante en la 2ª etapa. El producto de la PCR final se sometió a digestión con Ndel y Xhol, se purificó en gel y se ligó mediante extremos compatibles con pET24a para generar la construcción STF2R3.HA1-2 VN (SEQ ID NO: 478).
25 STF2R0.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 453 y 479):
Para la construcción del gen STF2R0.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 479) el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina (HA) de la gripe A /Viet Nam/1203/2004 se usó para reemplazar el dominio D0 de fljB (flagelina de fase 2) de Salmonella typhimurium. Para retirar el dominio D0 de STF2.HA1-2 (VN) se usó PCR de dos etapas. En la primera etapa, el ADN de pET24a-STF2.HA1-2 VN (SEQ ID NO: 477) se usó como un molde de ADN y se usaron
30 cebadores para amplificar un fragmento de STF2 sin dominio 0 y el fragmento de HA1-2 (VN) respectivamente. En la segunda etapa, los dos fragmentos de la PCR de la 1ª etapa se purificaron en gel y se usaron como moldes de ADN. Se emplearon cebadores para la 2ª etapa que se solapaban en la reacción PCR. El producto de la PCR final se sometió a digestión con NdeI y XhoI, se purificó en gel y se ligó mediante extremos compatibles con pET24a para generar la construcción STF2R0.HA1-2 VN.
35 STF2R3.2xHA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 455 y 480).
Para la construcción del gen STF2R3.2xHA1-2 VN (SEQ ID NO: 455), el ADN de pET24a-STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 477) se sometió a digestión con Ndel y Mfel, el fragmento de 6,6 kb se purificó y se usó como el vector. El ADN de pET24a-STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 478) se sometió a digestión con Ndel y Mfel, el fragmento de 1,4 kb se purificó como el inserto. El vector y ADN inserto se ligaron para generar la construcción STF2R3.2xHA1-2 VN
40 (SEQ ID NO: 480).
Expresión y purificación de las proteínas de fusión de flagelina-cabeza globular de HA: se fabricaron proteínas de fusión que incluían agonistas del receptor de tipo Toll 5 (denominadas también en la presente memoria “proteínas de fusión a flagelina”) utilizando un proceso de fermentación semicontinuo en E. coli. Después de agotar por completo la glucosa disponible durante la fase discontinua, se bombearon cuatro litros de medio de alimentación sintético 45 enriquecido a una velocidad controlada durante 10,5 h más (para un proceso total el tiempo fue de 30,3 h). Las expresiones de la proteína diana se indujeron con IPTG 2,1 mM (concentración final). Las células se sedimentaron por centrifugación y la pasta celular se conservó a -20 °C. La pasta celular se descongeló y se diluyó a 15 % de sólidos en Tris 50 mM, NaCl 25 mM (pH 8). La suspensión se homogeneizó tres veces con una PSI de 12 k. STF2.HA1-2 (SEQ ID NO: 451) y STF2R0.HA1-2 (SEQ ID NO: 453) se localizaron tanto en el sobrenadante como
50 en el sedimento. Solamente se procesó el sobrenadante.
Se descubrió que la mayor parte de STF2R3.HA1-2 (SEQ ID NO: 452) estaba en el sedimento. Únicamente se procesaron los cuerpos de inclusión. Para el proceso del sobrenadante, las fracciones de proteína que contenían la proteína de fusión se precipitaron con polietilenglicol (PEG) al 10 % o (NH4)2SO4 4 M. Los sedimentos se disolvieron en urea 8 M a un pH de 4 para solubilizar la proteína diana. Las proteínas solubles se extrajeron en la fase de 55 sobrenadante por centrifugación. Los sobrenadantes se unieron a una columna CEX (Tosoh SP650M) en urea 6 M, con una baja concentración de sal. Las proteínas diana se eluyeron en condiciones de elución en etapa de NaCl. Las proteínas recogidas se replegaron mediante dilución rápida usando Tris 20 mM, urea 0,5 M, trehalosa 0,1 M,
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CaCl2 2 mM, cisteína 3 mM, cistina 0,3 mM, EDTA 1 mM, PS-80 al 0,1 %, pH 8,0 con agitación constante durante una noche.
Las proteínas replegadas se concentraron a 1 litro y el tampón se cambió usando Tris 50 mM, PS80 al 0,05 %, trehalosa 0,1 M (pH 8). Se realizó cromatografía de intercambio aniónico Q para retirar las impurezas permanentes. 5 Las fracciones pico de eluato Q que contenían cantidades elevadas de proteína se seleccionaron para procesamiento posterior. Como una etapa de purificación final para aislar la forma monomérica purificada de las proteínas diana se realizó cromatografía de exclusión por tamaño. Para el proceso de sedimentación, los cuerpos de inclusión se lavaron con Triton X-100 al 1 % y se solubilizaron con urea 8 M. La proteína se replegó por dilución rápida usando la misma condición. La purificación adicional sigue las mismas etapas que el proceso de 10 sobrenadante. La proteína final en bruto se conservó a -70 °C como partes alícuotas de 1 ml. La endotoxina residual se ensayó usando el ensayo del lisado de amebocitos de Limulus cromogénico (Cambrex, Walkersville, MD) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para las proteínas producidas por baculovirus etiquetadas con 6 histidinas se empleó una columna quelante metálica. La proteína se cargó en una columna de Ni-NTA equilibrada en Tris 20 mM, pH 8, NaCl 0,5 M y se eluyó en un gradiente de imidazol 0-0,5 M. Adicionalmente la proteína diana se
15 purificó en una columna de exclusión por tamaño (10/300 GF, GE/Amersham). Las fracciones pico se agruparon, se concentraron y se dializaron contra 1 x PBS. La solución de la proteína dividida en alícuotas se conservó a -80 °C.
Caracterización de las proteínas de fusión de la cabeza globular de HA -flagelina
Transferencia de Wenstern: la proteína de fusión STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451) purificada, expresada en E. coli  
20 específico para flagelina (6H11; Inotek, Fexington, MA) o suero inmunitario de hurón convaleciente suscitado contra el virus de la gripe A /Vietnam/1203/2004 (VN04) (proporcionado por el U.S. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA).
Bioensayo TLR5: la actividad específica de TLR5 de las proteínas de fusión se evaluó midiendo la inducción de la producción de IL-8 por células HEK 293 (ATCC). Las células se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos
25 (Costar) a una densidad de siembra de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 x 104 células en 100 μl/pocillo en medio DMEM complementado con FCS al 10 % y antibióticos. Al día siguiente, las células se trataron durante 5 horas con diluciones en serie de proteínas de ensayo comenzando a aproximadamente 5 μg/ml. Al finalizar el ensayo, los sobrenadantes se recogieron y la expresión de IL-8 se evaluó por ELISA (Invitrogen, Carlsbad, CA).
La DO450 se midió en un espectrofotómetro de microplaca (Molecular Devices-MDS, Sunnyvale, CA).
30 Evaluación de la inmunogenicidad y eficacia
Animales: todos los estudios realizados con animales fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee y se llevaron a cabo de acuerdo con la normativa de la NIH. Se adquirieron ratones BALB/c en Harlan (Indianápolis, Indiana). La vacunación e implantación de los transpondedores para el registro telemétrico de la temperatura se realizó en una instalación para animales de nivel de bioseguridad (ABSL, Animal Biosafety Level)-2.
35 La infección con el virus H5N1 se realizó en una instalación ABSL-4.
Vacunación: ratones hembra BALB/c de seis semanas de vida (Harlan) se vacunaron por vía subcutánea (s.c.) con dos o tres dosis de vacuna (día -28, -14) o (-42, -28,-14) en 40 μl de vehículo (DPBS). Se extrajo la sangre de los animales los días 7 o 12 después de la última vacunación. Después se evaluó la seroconversión mediante ensayo IHA (véase Inhibición de la hemaglutinación). Para estudios de eficacia, la infección con H5N1 se realizó
40 posteriormente (véase Exposición). Las observaciones clínicas del desarrollo y mortalidad de la enfermedad se monitorizaron diariamente durante el periodo de prevacunación de la siguiente manera: día -28 a -1 (ensayos con dos dosis de vacuna) o día -42 a -1 (ensayos con tres dosis de vacuna). Los pesos se registraron periódicamente.
Exposición: antes de la infección con el virus, se realizó la anestesia usando isofluorano al 5 %. Después, los ratones se infectaron por vía intranasal (i.n.) con gripe A/Vietnam/1203/04 a una dosis determinada en unidades de 45 aproximadamente el 50 % de dosis infecciosa del cultivo tisular (DICT50) por animal de H5N1 en 40 μl de PBS (día 0). La retrotitulación del inóculo se realizó para determinar la dosis suministrada (véase ensayo DICT50) proporcionada en las figuras. Las observaciones clínicas del desarrollo y mortalidad de la enfermedad se monitorizaron diariamente durante la prevacunación (véase Vacunación) o después del periodo de exposición (del día 0 al día +20-21) y los pesos se registraron a los tiempos indicados en las leyendas de las figuras. Todos los 50 animales que desarrollaron parálisis y que no pudieron llegar a los comederos o bebederos se sometieron a eutanasia. Se realizó un análisis estadístico de la supervivencia de todos los grupos durante el periodo de tiempo indicado usando un ensayo de rango logarítmico a un nivel de significancia de α < 0,05 en GraphPad® Prism (San Diego, CA). Para la comparación por pares de la supervivencia de los grupos tratados y no tratados (o tratados de manera simulada) se realizó el ensayo exacto de Fisher a un nivel de significancia de α < 0,05 en GraphPad® Prism.
55 Los valores de p (ensayos de rango logarítmico y exacto de Fisher) se proporcionan en la leyenda de la figura. El nivel del virus infeccioso en los órganos se evaluó después de la preparación de un homogeneizado al 10 % (véase ensayo DICT50).
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Definiciones clínicas de la enfermedad: diariamente, los técnicos veterinarios experimentados realizaban datos estandarizados. Los resultados monitorizados fueron la muerte y el desarrollo de encefalitis o parálisis usando las siguientes definiciones: encefalitis, desarrollo de descoordinación, ataxia o espasmos transitorios conservando la capacidad de beber y alimentarse; parálisis, parálisis de patas traseras (hemipléjica) o tetrapléjica, sin posibilidad de
5 llegar al comedero o al bebedero.
ELISA H5: se recubrieron placas ELISA con cada una de las proteínas de HA a las concentraciones indicadas en PBS durante una noche a 4 °C, se bloquearon con 200-300 μl/pocillo de tampón de dilución de ensayo (ADB; BD Pharmingen, San Diego, CA) durante 2-3 horas a 23-27 °C. Después de la incubación con los anticuerpos de detección indicados, se añadió anticuerpo antirratón de cabra marcado con HRP (Jackson Immunochemical, West
10 Grove, PA) diluido en ADB y las placas se incubaron a 23-27 °C durante 1-2 horas. Todos los lavados entre las etapas de adición de reactivo se realizaron tres veces con 1X PBS/Tween-20 al 0,05 %. Después de la adición de sustrato Ultra TMB (Pierce, Rockford, IL) y de monitorizar el revelado del color, la reacción se detuvo con H2SO4 1 M y la DO450  
Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (IHA): en una instalación BSL3 (Southern Research Institute;
15 Birmingham, AL) se midió el título del anticuerpo IH contra la gripe A/Vietnam/1203/04 (VN04) mediante un método convencional, como se describe en la presente memoria. El antígeno se preparó y las unidades de HA totales de la reserva se determinaron como se describe en el ensayo de hemaglutinación (Bright, R.A., et al., PLOSI 3: 1501 (2008)). Los sueros se trataron con enzima destructora de receptores, se diluyeron y se incubaron con 4 unidades de HA (UHA) del virus de la gripe A/Vietnam/1203/04 en aproximadamente 25 μl durante aproximadamente 45
20 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron eritrocitos de caballo (al 1 %) (50 μl/pocillo), se mezcló brevemente y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Los títulos de IHA de las muestras de suero se ofrecieron como la cantidad recíproca de la dilución más alta a la cual la hemaglutinación se inhibió por completo.
Estudios de reactogenicidad
Animales: se realizaron estudios con conejos blancos de Nueva Zelanda hembra y macho de Covance Research 25 Products (Denver, PA).
Evaluaciones de reactogenicidad: los conejos se inmunizaron (6/grupo) por vía intramuscular (i.m) los días 0 y 21. Los sueros se recogieron 1 día después de la inmunización de sensibilización para realizar las mediciones de CRP (kit ELISA CRP, Immunology Consultants Laboratory, Newberg, Oregón). Se midió el consumo de alimentos desde el día 0 al día 1.
30 Resultados y análisis
Diseño de STL2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451): el dominio de la cabeza globular de HA contiene el sitio de unión al receptor de superficie celular y la mayoría de los epítopos neutralizantes de anticuerpos (Takeda et al., Annu Rev Immunol 27: 335-76(2003); Ben-Yedidia et al., Expert Rev Vaccines 6(6): 939-48) (2007)). Se diseñó una vacuna subunitaria que incluía los epítopos neutralizantes de la cabeza globular de HA A/Vietnam/1203/2004 y que también 35 contenía los elementos estructurales necesarios para el plegamiento espontaneo y eficiente para desplegar correctamente estos epítopos después de la expresión de las proteínas recombinantes en E. coli. El límite de dominio se colocó entre los restos G62 y E284 para generar la subunidad de HA denominada HA1-2 VN (SEQ ID NO: 481 y 482). Posteriormente la subunidad HA1-2 se fusionó genéticamente al extremo C de la flagelina de tipo 2 de Salmonella typhimurium (STF2) para formar STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451 y 477). La Figura 1 muestra un
40 diagrama de cintas de una fusión C terminal de un dominio de cabeza globular de HA fusionado al extremo C de la flagelina.
Eficacia asociada con STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451) proporcionada en un régimen de dos dosis: la eficacia de esta vacuna se evaluó en un modelo de exposición letal de ratón. Para estos estudios, los ratones se expusieron por vía intranasal con aproximadamente 10xLD90 de la cepa A/Vietnam/1203/2004 (VN04) altamente patógena. La
45 supervivencia y desarrollo de la enfermedad se monitorizaron durante 20-21 días después de la exposición. Estudios previos de exposición con H5N1 en ratones indican que los ratones sintomáticos desarrollan hipotermia aproximadamente 8 horas después de la infección, por tanto también se realizó una monitorización telemétrica periódica en estos estudios para proporcionar una indicación del desarrollo de la enfermedad.
En el primer estudio de eficacia realizado, grupos de 15 ratones BALB/c se inmunizaron dos veces a un intervalo de
50 dos semanas con 1, 3, o 10 μg de la vacuna STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451) suministrada por vía s.c. Dos semanas después de la dosis de refuerzo, los ratones se expusieron con el virus VN04. Se observó una disminución dependiente de la dosis, estadísticamente significativa (ensayo de rango logarítmico, p < 0,0001), en enfermedad severa y muerte con respecto al grupo de control tratado con placebo, con tasas de supervivencia de los ratones de 18, 40 y 73 % respectivamente, para los grupos tratados con dosis de 1, 3 y 10 μg. Los animales de control
55 (vacunados de manera simulada y no vacunados) desarrollaron enfermedad grave y posteriormente sucumbieron a la exposición (Tabla 4, estudio 1).
La clara relación entre el nivel de la dosis y la eficacia de este primer estudio sugirió que la eficacia podría mejorarse adicionalmente con dosis de STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451) mayores de aproximadamente 10 μg. Por lo tanto, se evaluó la posibilidad de aumentar la protección aumentando adicionalmente el nivel de la dosis de la vacuna. Sin embargo, dosificaciones de hasta 30 μg de STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451) no parecieron mejorar la supervivencia global.
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La posibilidad de aumentar la protección se evaluó también usando tres inmunizaciones de la vacuna (Tabla 4,
5 estudio 2). En este estudio, se suministraron dosis de 1, 3, y 10 μg de STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451) a los 42, 28 y 14 días previos a la exposición. Se observaron tasas de supervivencia más elevadas en todos los grupos de dosis, con porcentajes de supervivencia de los ratones a la exposición de 87 %, 93 % y 100 %. Ninguno de los animales en el grupo de control tratado con placebo (vacunados de manera simulada) sobrevivieron a la exposición y la supervivencia media fue de 7 días.
10 El estudio 2 se repitió con la evaluación adicional de títulos de virus en los órganos de cinco animales previamente seleccionados al azar por grupo. Se observaron tasas de supervivencia altas de 87 %, 80 % y 93 %. El grupo de control sucumbió a la enfermedad en un promedio de 6 días. (Tabla 4, estudio 3).
Tabla 4: tasas de supervivencia después de 2 o 3 inmunizaciones de STF2.HA1-2 VN (SEQ ID NO: 451)
Grupo de dosis
Estudio 1 % de supervivencia Estudio 2 % de supervivencia Estudio 3 % de supervivencia
10 μg (N=15)
73 100 93
3 μg (N=15)
40 93 87
1 μg (N=15)
18 87 80
Placebo (N=30)
0 0 0
15 En los ratones, se ha observado que el amplio tropismo tisular de los virus de HPAI (gripe aviar altamente patógena, del inglés Highly pathogenic avian influenza ) está asociado con un sitio de escisión polibásico que permite que el virus se escinda fácilmente con proteasas en sitios extrapulmonares y realizar sustituciones de aminoácidos específicos en la proteína PB2 (Hatta et al., Science 7: 293(5536) (2001): 1840-2; Katz et al., J Virol 74 (22): 1080710 (2000)). Aunque el tropismo tisular y la patogénesis de estos virus no está igualmente definida en seres
20 humanos, hay informes de infección sistémica en seres humanos (Beigel et al., N Engl J Med 35: 1374-85 (2005)). Por lo tanto fue relevante estudiar las cargas de virus en los animales vacunados tanto en tejido pulmonar como cerebral. En el estudio 2, se extrajeron órganos de animales previamente seleccionados al azar (N=5) el día +6 y se evaluaron los niveles de los virus infecciosos. En la Tabla 5 se muestran los valores individuales, así como los promedios / desviación típica de los grupos.
25 Tabla 5: cargas de virus en cerebro y pulmón 6 días después de la exposición
Cerebro
Pulmón
Grupo
Titulo promedio DT No detectable Titulo promedio DT No detectable
Proporción
Porcentaje Proporción Porcentaje
10 μg (N=5)
0,00E+00 0,00 E+00 5/5 100 3,00E+04 6,71E+04 4/5 80
3 μg (N=5)
0,00E+00 0,00 E+00 5/5 100 2,00E+04 4,47E+04 4/5 80
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Cerebro
Pulmón
Grupo
Titulo promedio DT No detectable Titulo promedio DT No detectable
1 μg (N=5)
0,00E+00 0,00 E+00 5/5 100 2,20E+05 4,38E+05 3/5 60
Placebo (N=5)
8,10E+04 6,50 E+04 0/5 0 3,53+07 6,43E+07 0/5 0
Se midió una diferencia de al menos aproximadamente cinco log10 en el título promedio en cerebro entre los grupos vacunados y los tratados con placebo, independientemente de la dosis de la vacuna (1, 3 o 10 μg). El virus estaba por debajo del límite de detección (aproximadamente menor de <1 x 104 DICT50/g de tejido) en los cerebros de todos 5 los animales vacunados, mientras que en el grupo tratado con placebo, el título promedio fue de aproximadamente 4,9 (±4,8) log10 DICT50/g. En los pulmones, se detectó una diferencia de 2,2-3,2 log10 en el título; en los animales vacunados, el título promedio estaba entre aproximadamente 4,3 y aproximadamente 5,3 (± 4,7-5,6) log10 DICT50/g, mientras que el promedio del grupo tratado con placebo fue de 7,6 (± 7,8) log10 DICT50/g. El virus no pudo detectarse en el 60 % de los pulmones de los animales vacunados con aproximadamente 1 μg y aproximadamente en el 80 %
10 de los vacunados con 3 o 10 μg de STF2.HA1-2 (VN). Por otro lado, el virus pudo detectarse en el 100 % de los pulmones y cerebros de los animales tratados con placebo. Basándose en los resultados del grupo tratado con la dosis de 3 μg, el nivel de protección fue comparable entre el primer y segundo ensayo con las 3 dosis.
Por tanto, cuando la vacuna STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451) se usó en un régimen de 3 dosis, proporcionó una protección significativa, coherente con lo que demuestran las tasas de supervivencia de ≥ 80 % en dos estudios
15 independientes, y redujo el título del virus en el cerebro y pulmones.
Las formas R3 y 2xR3 de flagelina mejoran la antigenicidad e inmunogenicidad de las vacunas de cabeza globular de VN
Diseño de construcciones alterativas: los datos de ensayos clínicos en fase I de vacunas de virus inactivadas contra los virus H9N2, H5N3 y H5N1 indican que las vacunas contra los virus de la gripe aviar puede que no sean 20 óptimamente inmunogénicas y pueden requerir dosis múltiples y/o la inclusión de un adyuvante para inducir una respuesta inmunoprotectora (Treanor, et al., New Eng. J. Med. 354: 1343-1351 (2006)). La escasa inmunopotencia de estas vacunas se ha atribuido en gran medida al hecho de que, desde el punto de vista inmunológico, las personas no se han expuesto previamente a los antígenos de HA asociados con los subtipos aviares. Otros factores contribuyentes pueden ser que los antígenos HA aviares son realmente menos antigénicos que los de las HA de los
25 subtipos H1, H3 o B. Se suscitaron títulos neutralizantes escasos por infección subletal con aislados aviares y se realizaron estudios de inmunogenicidad que comparaban la fuerza de las HA de aves y seres humanos en modeles animales sin exposición previa.
Se han realizado observaciones similares con respecto a la antigenicidad relativa de las vacunas de H1 y H5. Por ejemplo, en los estudios de eficacia descritos anteriormente, el hecho de que se necesitasen tres inmunizaciones de 30 STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451) para obtener un 100 % de protección, sugieren que la cabeza globular de H5 no se presentaba óptimamente al sistema inmunitario cuando se fusionaba con el extremo C de la flagelina. Modelos cristalográficos y criomicroscópicos electrónicos de alta resolución, muestran que los péptidos N y C terminales de la flagelina se reúnen para formar un superenrollamiento de dos cadenas que se denomina dominio D0 (Yonekura et al., Nature 424: 643-50 (2003)). Cuando se forman los flagelos, el dominio D0 está altamente estructurado y
35 constituye el tubo central de los flagelos mientras que el dominio D1 adyacente se alinea para formar el tubo externo. La estructura superenrollada del dominio D0 se conserva bien a través de las interacciones intermoleculares extensivas entre dominios D0 adyacentes y dominios D0 y D1. Es posible que sin estas restricciones intermoleculares, la estructura del dominio D0 no sea estable.
En solución, el dominio D0 de la flagelina monomérica no está estructurado, dejando apenas 65 restos del extremo
40 N y 45 restos del extremo C como un péptido flexible extendido (Vonderviszt et al. J Mol Biol 209: 121-33 (1989)). La flexibilidad del péptido precedente a la cabeza de HA fusionada puede permitir interacciones intra o intermoleculares que ocultan la presentación antigénica óptima de la cabeza globular de HA. El grado de estas interacciones inter-o intramoleculares puede ser diferente entre las moléculas de HA dependiendo de la química de la superficie de la cabeza globular.
45 Se diseñaron construcciones de Viet Nam adicionales. Con el primer diseño, el dominio D0 flexible se reemplazó con la cabeza globular de HA para generar STF2R0.HA1-2 VN (SEQ ID NO: 453). Con el segundo diseño, ambos extremos del dominio de la cabeza globular de HA se unieron a la flagelina reemplazando el dominio D3 de la molécula de flagelina con la cabeza globular para generar STF2R3.HA1-2 VN (SEQ ID NO: 452) y con el tercer diseño se reemplazó el dominio D3 con la cabeza globular y una cabeza globular se colocó en el extremo C del dominio D0. La Figura 2 muestra los diagramas de cintas con las colocaciones alternativas de la cabeza globular de HA.
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Antigenicidad comparativa de construcciones alternativas: la antigenicidad relativa de las diferentes construcciones 5 alternativas se evaluó por ELISA. Placas ELISA se recubrieron con concentraciones en disminución de las diferentes preparaciones de proteínas de Viet Nam. Los equivalentes molares de las diferentes proteínas se controlaron.
HA0 (SEQ ID NO: 454), es una proteína producida usando el sistema de expresión de baculovirus y se incluyó como un control positivo. HA0 corresponde al ectodominio completo de la proteína de HA. Las placas ELISA recubiertas con las proteínas se examinaron con sueros de convalecientes suscitados en hurones y se obtuvieron en el CDC
10 (Atlanta, GA). Los resultados se muestran en la Figura 3. Se observó la reactividad más fuerte para la construcción de control positiva, HA0 (SEQ ID NO: 454). Las construcciones R3 (SEQ ID NO: 452) y 2x.R3 (SEQ ID NO: 455) reaccionaron muy fuertemente con los sueros de convalecientes. Un tanto sorprendente, la proteína STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451) reaccionó relativamente mal con los sueros de convalecientes al igual que lo hizo la construcción R0 (SEQ ID NO: 453).
15 En una segunda serie de experimentos, las diferentes construcciones de Viet Nam se examinaron con un panel de cinco anticuerpos monoclonales neutralizantes específicos para epítopos localizados dentro del dominio de la cabeza globular de la HA de Viet Nam (Rockland Immunochemicals, Inc., Gilbertsville, PA). El control positivo en este experimento fue la proteína HA1-1 producida por baculovirus (SEQ ID NO: 456). La HA1-1 comprende la cabeza globular de HA y parte del tallo de HA. Cuando se examinó con los anticuerpos monoclonales específicos de
20 VN, la reactividad tanto de la construcción STF2.R3,2x.HA1-2 (SEQ ID NO: 455) como de la STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452), fue comparable con la de la HA1-1 producida por baculovirus (Figura 3). En cambio, STF2R0.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 453) y STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451) no reaccionaron tan bien y en algunos casos muy mal con cada uno de los cinco anticuerpos monoclonales ensayados (Figura 4). Estos resultados están en consonancia con que la cabeza globular de HA se presentó mejor en la construcción R3 (SEQ ID NO: 452).
25 Ninguna de las construcciones ensayadas interaccionó con mAb977 y esto podría deberse a la ausencia del epítopo específico en estas construcciones.
Actividad de TLR5 comparativa de construcciones alternativas: la bioactividad de TLR5 se evaluó usando un ensayo in vitro. En resumen, en placas de microtitulación de 96 pocillos (Costar) se cultivaron células HEK 293 (ATCC) a una densidad de siembra de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 x 104 células en 100 μl/pocillo en medio
30 DMEM complementado con FCS al 10 % y antibióticos. Al día siguiente, las células se trataron durante 5 horas con diluciones en serie de proteínas de ensayo comenzando a 5 μg/ml. Al finalizar el ensayo, los sobrenadantes se recogieron y la expresión de IL-8 se evaluó por ELISA (Invitrogen, Carlsbad, CA). La DO450 se midió en un espectrofotómetro de microplaca (Molecular Devices-MDS, Sunnyvale, CA).
La construcción STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451) de fusión C terminal, y las construcciones STF2R3.HA1-2 (VN)
35 (SEQ ID NO: 452) y STF2R3.2x.HA1-2 VN (SEQ ID NO: 455) indujeron una fuerte secreción de IL-8 en este ensayo, lo que es indicativo de una fuerte actividad de TLR5 (Tabla 6). Sin embargo, STF2R0.HA1-2 (SEQ ID NO: 453) se comportó mal en este ensayo y coherente con informes previos indica que al menos una porción o todo el dominio D0 de la flagelina puede influir significativamente en la interacción de TLR5.
Tabla 6: actividad de TLR5 de las proteínas de la cabeza globular alternativas de HA de la flagelina VN
Proteína
IL-8 (ng/ml)
STE2.HA1-2 VN
2349
STF2R3.HA1-2 VN
2960
STF2R3,2x.HA1-2 VN
1713
STF2R0.HA1-2 VN
18
40
Eficacia comparativa en ratones de dos dosis frente a tres de STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 4511), STF2R0.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 4531 o STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452): en un estudio de eficacia comparativo, se suministraron dosis de 3 o 0,3 μg de STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451), STF2R0.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 453) o STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452) los días 42, 28 y 14 (con un intervalo de 2 semanas entre las dosis) previos 45 a la exposición o los días 42 y 21 (con un intervalo de tres semanas entre las dosis ) previos a la exposición. Se recogieron muestras de suero 12 días después del último refuerzo y se sometieron a un ensayo de IHA convencional contra A/Vietnam/1203/04 (Figura 5). La construcción STF2R0.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 453) no pudo suscitar niveles significativos de anticuerpos IHA en suero después dos o tres inmunizaciones. Esto es coherente con la baja actividad de TLR5 de STF2R0.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 453) como se muestra en la Tabla 6. Sin embargo, la 50 construcción R0 puede ser útil para determinadas composiciones cuando puede que no se desee una respuesta de
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TLR5 fuerte y contundente, como se comenta en la presente memoria. Estas serían composiciones en las que, desde el punto de vista inmunológico, el sujeto no se ha sensibilizado o se ha expuesto previamente, donde se requiere poca inmunopotenciación y se desea mucho una baja reactogenicidad. Además, como se muestra en la presente memoria, la inmunogenicidad que predice una ventana terapéutica para su uso en seres humanos (es
5 decir, inmunogenicidad, baja reactogenicidad) puede variar en un modelo animal, como se muestra en la presente memoria.
STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452) suscitó los títulos de IHA más altos con valores MGT de 63 y 35 después de 3 y 2 inmunizaciones de 3 μg, respectivamente. Se suscitaron niveles significativamente más bajos de anticuerpos IHA con 0,3 μg de STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452) (MGT=8) en comparación con 3 μg. Con los dos
10 regímenes de inmunización, STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452) fue el único inmunógeno que indujo niveles significativos de anticuerpos IHA. Los títulos de IHA de las muestras STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452) agrupadas fueron de aproximadamente 160, de aproximadamente 20, y de aproximadamente 80 para 3 inmunizaciones de 3 μg, 0,3 μg, y 2 inmunizaciones de 3 μg, respectivamente. STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451) indujo niveles intermedios de anticuerpos IHA.
15 Dos (3 inmunizaciones) o tres semanas (2 inmunizaciones) después de la última dosis de refuerzo, los ratones se expusieron por vía intranasal con aproximadamente 10xDL90 de la cepa A/Vietnam/1203/2004 altamente patógena. Se controlaron la supervivencia y el desarrollo de la enfermedad durante 20-21 días después de la exposición (Tabla 7 y Figura 9A y 9B).
Tabla 7: tasas de supervivencia y pérdida de peso después de 3 o 2 dosis de diferentes construcciones de cabeza 20 globular
% de supervivencia% de supervivencia% de supervivenciaGrupo y dosis Día 5 Día 7 Día 9
Régimen de tres dosis
STF2.HA1-2 (VN) 3 μg 100 100 100(N=10)
STF2R3.HA1-2 (VN) 3 μg 100 100 100(N=10)
STF2R0.HA1-2 (VN) 3 μg
1000 0(N=10)
STF2.HA1-2 (VN) 0,3 μg
100 60 60(N=10)
STF2R3.HA1-2 (VN) 0,3 μg 100 100 80(N=10)
STF2R0.HA1-2 (VN) 0,3 μg
100 10 10(N=10)
Régimen de dos dosis
STF2.HA1-2 (VN) 3 μg
100 30 30(N=10)
STF2R3.HA1-2 (VN) 3 μg 100 100 100(N=10)
STF2R0.HA1-2 (VN) 3 μg
1000 0(N=10)
Placebo 1000 0 (N=30)
La construcción alternativa SFT2R0.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 453), fue muy poco eficaz, con solo un porcentaje de 0 a aproximadamente 10 % de supervivencia de los ratones en cada uno de los diferentes grupos. Esto recalca la importancia de un ligando TLR funcional en la conducción de una fuerte respuesta inmunoprotectora cuando desde el punto de vista inmunológico, el animal o el sujeto no se ha expuesto previamente; o más específicamente no tiene
25 inmunidad preexistente contra el inmunógeno. Ninguno de los animales en el grupo de control tratado con placebo (vacunado de manera simulada) sobrevivió a la exposición y la supervivencia media fue de 6 días.
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Similar a los resultados anteriores, el 100 % de los animales que recibieron 3 dosis de 3 μg de la vacuna STF2.HA12 (VN) (SEQ ID NO: 451) sobrevivieron a la exposición, mientras que tan solo aproximadamente el 30 % de los animales sobrevivió a la exposición después de 2 inmunizaciones de 3 μg de la vacuna STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451). En comparación, el 100 % de los animales sobrevivió a la exposición después de recibir cualquiera de 2 o
5 3 dosis de 3 μg de la vacuna STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452). Por tanto, la vacuna STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452) proporciona una eficacia notablemente mejorada contra la exposición aviar altamente patógena. Las curvas de supervivencia y de pérdida de peso después de la exposición se muestran en las Figuras 6 y 6B para los grupos tratados con dosis de 3 μg.
En resumen, el reemplazo del dominio 3 de la flagelina con la cabeza globular de HA VN mejoró sustancialmente la 10 inmunopotencia y eficacia de la vacuna contra una exposición letal en el modelo de ratón.
Eficacia comparativa de STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452) y STF2R3.2x.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 455) en hurones: en un estudio de eficacia comparativo, se administraron dosis de 15 o 45 μg de STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452) o de STF2R3.2x.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 455) dos veces a un intervalo de 3 semanas a grupos de seis hurones. El día 56 del estudio, o 7 semanas después de la dosis de refuerzo, los hurones se expusieron con
15 10XDL50 (específicamente, 10 veces la dosis de virus a la cual el 50 % de los hurones sucumbiría a la infección) del virus del Viet Nam 1203/2004. Se evaluó la supervivencia y títulos de virus en los lavados nasales (Tabla 8 y Figura 7). Como se esperaba, 5 de los 6 hurones en el grupo tratado con placebo sucumbió a la exposición, mientras que todos los animales en los grupos vacunados sobrevivieron a la exposición.
Tabla 8: resumen de las tasas de supervivencia después de exposición letal de los hurones
Grupos
Dosis (μg) N Supervivientes
Placebo
6 1
STF2.R3.HA1-2 (VN)
15 6 6
STF2.R3.HA1-2 (VN)
45 6 6
STF2.R3.2xHA1-2 (VN)
15 6 6
STF2.R3.2xHA1-2 (VN)
45 6 6
20
Los días 3 y 5 posinfección se obtuvieron lavados nasales de los hurones infectados y se evaluaron los títulos de los virus, medidos por infección de embriones e indicado como dosis infecciosa embrionaria del 50 % (o DIE50).
Desarrollo de un modelo de reactogenicidad en conejos: el ensayo clínico en fase I VAX102 de VaxInnate utilizó una construcción de flagelina de longitud completa fusionada en su extremo C con cuatro copias en tándem del 25 ectodominio de la proteína del canal iónico de la gripe, M2e (STF2.4xM2e) (SEQ ID NO: 457). Aunque la vacuna se toleró bien a dosis menores de aproximadamente 3 μg, a dosis más altas de la vacuna, diversos sujetos tuvieron dolor de cabeza 90 minutos después de la inmunización de sensibilización con la vacuna. Otros síntomas incluyeron escalofríos, náuseas, vómito y/o diarrea. Algunos sujetos tuvieron temperatura elevada. También se examinaron diversos sujetos afectados para determinar niveles elevados de proteína C reactiva (CRP) el día 1 después de la
30 vacunación.
Esta constelación de síntomas es coherente con la elaboración de una respuesta proinflamatoria intensa. Se sabe que, en el hombre, la proteína C reactiva (CRP) aumenta drásticamente durante los procesos inflamatorios en el organismo, más frecuentemente en respuesta a un aumento en la citocina IL-6 proinflamatoria. La señalización de TLR inicia la producción de una cascada de citocina proinflamatoria que comienza con la producción de IL-1, TNF-α
35 e IL-6. Se piensa que este tipo de respuesta es necesaria para suscitar respuestas inmunoadaptativas contundentes y de acuerdo con esto, se observaron respuestas contundentes de IgG específicas de M2e en sujetos ensayados en el estudio VAX102. Los acontecimientos adversos observados en los estudios clínicos pueden deberse a una cascada proinflamatoria transitoria iniciada por la señalización de TLR5 en respuesta al residuo de flagelina de la vacuna VAX102 (SEQ ID NO: 457).
40 Se estableció un modelo de reactogenicidad en conejos. Se encontró que la fiebre, el consumo de alimentos y los niveles de CRP, medidos 1 día después de la inmunización (kit ELISA CRP, Immunology Consultants Laboratory, Newberg, Oregón), eran mediciones fiables de una respuesta proinflamatoria. Un objetivo fue establecer una correlación entre las observaciones clínicas y este modelo de reactogenicidad en conejos y usar después este modelo para predecir la ventana terapéutica de una vacuna determinada en el entorno clínico. Más específicamente,
45 para predecir la dosis a la cual la vacuna era tanto inmunogénica como no reactogénica.
Se realizaron estudios no clínicos usando dosis de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) en torno a la dosis clínica de VAX102 asociada con acontecimientos adversos. La temperatura y el consumo de alimentos se monitorizaron y los resultados se muestran en las Figuras 8, A y B. Los animales que recibieron 15 o 5 μg de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) mostraron un aumento bajo de aproximadamente 0,5 °F, que en este modelo no se consideró significativo. Según el modelo de pirogenicidad en conejo de la USP los aumentos en la temperatura de aproximadamente 1,04 °F, o mayores, se consideran significativos. Las temperaturas medias del grupo para los grupos que recibían
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5 dosis de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) por debajo de 5 μg fueron indiferenciables de las del grupo de control. En este estudio también se midió el consumo de alimento. El consumo para los grupos tratados con dosis de 15 y 5 μg se redujo con respecto a la línea basal, los animales en los grupos de dosis menor de aproximadamente 5 μg estaban esencialmente en la línea basal. Por tanto, la temperatura elevada y el consumo de alimentos reducido en el conejo, observados a una dosis que agrupaba la dosis clínica asociada con los acontecimientos adversos, indicaba que existía una correlación entre el conejo y el ser humano para estas medidas.
Para establecer adicionalmente al conejo como un modelo relevante para la selección de ambas dosis clínicas, se ampliaron después los estudios con conejos para una evaluación de los niveles de CRP. Los conejos se inmunizaron con dosis de STF2.4xM2e que variaban de 15 a 0,5 μg. Se recogieron los sueros en el tiempo 0 y 24 horas después de la inmunización de sensibilización y se midieron los niveles de CRP por ELISA. Se descubrió que
15 la CRP era elevada en conejos 24 horas después de la vacunación con STF2.4xM2e (Figura 9). A las dosis más altas, los niveles de CRP aumentaron aproximadamente 20 veces (promedio de 28 μg/ml a 600 μg/ml) aunque a las dosis más bajas, los niveles aumentaron aproximadamente 10 veces. Estas elevaciones en el conejo son a dosis clínicamente relevantes de 5 y 15 μg. Estos resultados confirman el desarrollo de la evaluación CRP en el modelo de conejo como un posible marcador predictivo que confirma la selección de la dosis.
Los resultados demuestran que, en el conejo, la vacuna VAX102 está asociada con temperaturas elevadas, con una ausencia de consumo de alimentos y con niveles elevados de CRP. Todos estos efectos están relacionados con la dosis. Se observa fiebre, una ausencia de consumo de alimentos y niveles de CRP elevados para dosis dentro del intervalo de dosis clínico original de 10 a aproximadamente 100 μg para VAX102. Los efectos retornan o tienden a la línea basal a dosis de 5 μg o menores. Posteriormente, se descubrió que dosis bajas de microgramos de VAX102
25 (SEQ ID NO: 547), como se predecía en este modelo de conejo, eran inmunogénicas y no reactogénicas en el entorno clínico.
Las formas alternativas de la flagelina proporcionan perfiles de reactogenicidad mejorados
Comparación de los perfiles de reactogenicidad para STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451). STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452) y STF2R3.2x.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 455): los perfiles de reactogenicidad de STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451), STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452) y STF2R3.2x.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 455) se compararon en un estudio comparativo. Grupos de 6 conejos se inmunizaron con 1,5, 15 o 150 μg de STF2.HA1-2 VN (SEQ ID NO: 451), STF2R3.HA1-2 VN (SEQ ID NO: 452) o STF2R3.2x.HA1-2 VN (SEQ ID NO: 455). La temperatura se midió una vez 2 horas después de la inmunización mientras que el consumo de alimentos y los niveles de CRP se midieron 24 horas después de la inmunización. Los resultados se muestran en las Figuras 10A a
35 10H.
Coherente con las observaciones en el modelo de ratón, los resultados muestran una mejora en la inmunogenicidad de las construcciones R3 y R3.2x en comparación con STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 451). Inesperadamente, los resultados también muestran una mejora en el perfil de reactogenicidad para la construcción STF2R3.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 452) a todas las dosis en comparación con la construcción STF2.HA1-2 estándar (SEQ ID NO: 451). Incluso se observaron mejoras más importantes en el perfil de reactogenicidad para la construcción STF2R3.2x.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO: 455), particularmente para las mediciones de temperatura y CRP.
Conclusión
Estos datos muestran que la inmunogenicidad y eficacia pueden mejorarse sustancialmente aunque se reduzca la reactogenicidad en un perfil de vacuna pandémica reemplazando el dominio 3 de la flagelina con la cabeza globular
45 de HA. La adición de una segunda cabeza globular a la construcción mejoró adicionalmente el perfil de reactogenicidad de la vacuna.
EJEMPLO 2: las vacunas de cabeza globular de HA H1 utilizando las formas R3 de la flagelina mejoran los perfiles de reactogenicidad manteniendo al mismo tiempo la inmunopotencia
Materiales y métodos
Producción de la vacuna
Clonación de genes de STF2.HA1-2 PR8 y STF2R3.HA1-2 PR8 recombinantes:
Para la construcción del gen de STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 458), el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina (HA) de PR8 se fusionó genéticamente con el extremo C de la secuencia de longitud completa de fljB (flagelina de fase 2) de Salmonella typhimurium, STF2 codificada por un gen de 1,5 kb (SEQ ID NO: 488). Primero 55 se construyó un subfragmento del gen de HA que codificaba PR8 HA1-2 (aa 62-284 de SEQ ID NO: 459), como un gen sintético optimizado por codones en fusión con STF2 (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA). La secuencia heptamérica
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Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser (SGSGSGS) (SEQ ID NO: 498) se incorporó en el punto de unión de STF2 y HA como un enlazador flexible. Los fragmentos de 2,2 kb correspondientes al gen sintético de flagelina-HA1-2 se escindieron del plásmido apropiado con Nde I y Blpl, se purificaron en gel y se ligaron por extremos compatibles a pET24a para generar la construcción STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 458).
5 Para la construcción del gen STF2R3.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 489), se usó una reacción PCR de dos etapas para reemplazar el dominio D3 de STF2 con HA1-2 (PR8) (SEQ ID NO: 458). En la primera etapa, el ADN de pET24a-STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 458) se usó como un molde de ADN y se usaron cebadores para amplificar el extremo N y el extremo C de STF2, respectivamente. Los cebadores se usaron para amplificar la cabeza globular de PR8 HA1-2. En la segunda etapa PCR, los fragmentos STF2 y HA1-2 (PR8) purificados en gel, se usaron como
10 moldes de ADN. Cebadores en una reacción PCR solapante. El producto PCR final se digirió con las enzimas de restricción Ndel y EcoRI, se purifico en gel y se ligó por extremos compatibles a pET24a para generar la construcción STF2R3.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 489).
Las construcciones se verificaron por secuenciación de ADN y se usaron para transformar la cepa hospedadora de expresión, BLR3 (DE3) (Novagen, San Diego, CA; n.º de catálogo 69053). Se seleccionaron transformantes en
15 placas que contenían kanamicina (50 μg/ml), tetraciclina (5 μg/ml) y glucosa (0,5 %).
Clonación de genes de STF2.HA1-2 SI y STF2R3.HA1-2 SI recombinantes:
Para la construcción del gen de STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 461) el dominio de la cabeza globular de hemaglutinina (HA) de A/Islas Salomón/3/2006 (SI) se fusionó genéticamente con al extremo C de la secuencia de longitud completa de fljB (flagelina de fase 2) de Salmonella typhimurium, STF2 codificada por un gen de 1,5 kb (SEQ ID NO:
20 488). Primero se construyó un subfragmento del gen de HA que codificaba SI HA1-2 (aa 62-284) (SEQ ID NO: 462) como un gen sintético optimizado por codones en fusión con STF2 (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA). Los fragmentos de 2,2 kb correspondientes al gen sintético de flagelina –HA1-2 se escindieron del plásmido apropiado con  I y Blpl, se purificaron en gel y se ligaron por extremos compatibles a pET24a para generar la construcción STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 461).
25 Para la construcción del gen de STF2R3.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 490) se usó una PCR de dos etapas para reemplazar el dominio D3 de STF2 con HA1-2 (SI). En la primera etapa, el ADN de pET24a-STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 461) se usó como un molde de ADN, los cebadores se usaron para amplificar respectivamente el extremo N y el extremo C de STF2. Cebadores para amplificar la cabeza globular de SI HA1-2. En la segunda etapa de PCR, los fragmentos STF2 y HA1-2 (SI) purificados en gel se usaron como moldes de ADN. Cebadores en una reacción PCR
30 solapante. El producto PCR final se digirió con enzimas de restricción Ndel y EcoRI, se purificaron en gel y se ligaron mediante extremos compatibles a pET24a para generar la construcción STF2R3.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 490).
Las construcciones se verificaron por secuenciación de ADN y se usaron para transformar la cepa hospedadora de expresión, BLR3 (DE3) (Novagen, San Diego, CA; n.º de categoría 69053). Los transformantes se seleccionaron en placas que contenían kanamicina (50 μg/ml), tetraciclina (5 μg/ml) y glucosa (0,5 %).
35 Purificación de las proteínas: los clones STF2.HA1-2 PR8, STF2R3.HA1-2 PR8, STF2.HA1-2 SI, y STF2R3.HA1-2 SI se cultivaron durante una noche y el cultivo se usó para inocular medio LB reciente complementado con kanamicina 25 μg/ml, tetraciclina 12,5 μg/ml y glucosa al 0,5 %. A una DO600 = 0,6 se indujo la expresión de la proteína con IPTG 1 mM durante aproximadamente 3 h a aproximadamente 37 °C. Las células se recogieron por centrifugación (8000 x g durante 7 minutos) y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato 2 x (2 x PBS:
40 KH2P04/Na2HP04 24 mM, NaCl 274 mM, KCl 5,4 mM), glicerol al 1 %, DNAsa, PMSF 1 mM, cóctel inhibidor de proteasa y lisozima 1 mg/ml. El sedimento se disolvió en urea 8 M, NaCl 25 mM y acetato 50 mM, pH 4,0 y se aplicó a una columna Fast Flow de sefarosa SP de 30 ml (XK16, GE/Amersham) previamente equilibrada con acetato 50 mM, NaCl 25 mM y urea 8 M, pH 4,0. La fracción pico se concentró y se cambió el tampón a Tris 50 mM, NaCl 25 mM y urea 8 M, pH 8,0. El replegamiento de la proteína se realizó mediante dilución rápida (1:10) en tampón Tris
45 HCl 100 mM (pH 8,0), y se cargó en una columna Source Q de 45 ml (XK16, GE/Amersham). La proteína unida se eluyó con un gradiente salino lineal de 0 a 1,0 M de NaCl en Tris-HCl 100 mM, pH 8,0.
Para las preparaciones finales y la retirada de endotoxina, se agruparon fracciones pico y se cargaron directamente en una columna de filtración en gel Superdex 200 (10/300 GL, GE/Amersham) previamente equilibrada en Tris 100 mM Tris, NaCl 150 mM, glicerol al 1 % y desoxicolato sódico al 1 %. La endotoxina residual se ensayó usando el
50 ensayo de lisado de amebocitos de Limulus cromogénico (Cambrex, Walkersville, MD) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las fracciones pico del volumen incluido de la columna se agruparon, se dializaron frente 1 x PBS y se conservaron a -80 °C.
Caracterización de las proteínas: las proteínas se caracterizaron con respecto a la pureza, identidad, contenido de endotoxina y actividad biológica, usando los siguientes ensayos.
55 SDS-PAGE: las proteínas (típicamente aproximadamente 5 μg) se diluyeron en tampón de muestra SDS-PAGE (SDS al 1 %, Tris-HCl 30 mM, pH 6,8, glicerol al 4 %, azul de bromofenol 0,1 mg/ml) con y sin β-mercaptoetanol 5 mM. Las muestras se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel de poliacrilamida SDS al 4-20 %. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con azul de coomassie para visualizar las bandas de proteínas.
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Ensayo de endotoxina: la endotoxina residual se ensayó usando el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus cromogénico convencional (Cambrex, Walkersville, MD) siguiendo las indicaciones del fabricante.
Ensayo de proteínas: las concentraciones de las proteínas se determinaron con el kit de reactivo de ensayo de proteína MicroBCA en un formato de 96 pocillos usando BSA como un patrón (Pierce Biotechnology), siguiendo las 5 instrucciones del fabricante.
ELISA de flagelina: la integridad y concentración de las proteínas se examinaron mediante un ELISA con anticuerpos específicos de flagelina. Placas ELISA (96 pocillos) se recubrieron durante una noche a 4 °C con diluciones en serie de cada proteína diana, en PBS comenzando a 5 μg/ml. Las placas se bloquearon con 200 μl/pocillo de tampón diluyente ensayo (ADB; BD Pharmingen) durante una hora a temperatura ambiente y 10 después se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween-20 (PBS-T, NaPO4 12 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Tween 20 al 0,05 %). A todos los pocillos se añadió anticuerpo antiflagelina policlonal de conejo diluido en ADB (100 μl/pocillo, 1:5.000) y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente o durante una noche a 4 °C, después se lavaron tres veces con PBS-T. Se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo marcado con HRP (Jackson Immunochemical) diluido en ADB (100 μl/pocillo, 1:5.000) y las
15 placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS-T. Después de añadir sustrato ultra TMB (Pierce) y monitorizar el revelado de color, se midió la A450 en un espectrofotómetro de microplaca Tecan Farcyte.
Ensayo de bioactividad de TLR5: las células HEK293 (ATCC, Cat#CRL-1573, Manassas, VA) expresan de manera constitutiva TLR5, y secretan diversos factores solubles, incluyendo IL-8, en respuesta a la señalización de TLR5. 20 Las células se sembraron en microplacas de 96 pocillos (50.000 células/pocillo), y se añadieron proteínas de ensayo recombinantes. Al día siguiente, se recogió el medio acondicionado, se transfirió a una microplaca transparente de 96 pocillos y se congeló a -20 °C. Después de descongelar, el medio acondicionado se ensayó para determinar la presencia de IL-8 en un ELISA de tipo sándwich usando un par de anticuerpos emparejados anti-IL-8 humana (Pierce; Rockford, IL, n.º M801E n.º M802B) siguiendo las instrucciones del fabricante. La densidad óptica se midió
25 usando un espectrofotómetro de microplaca.
Evaluación de la vacuna
Estudios con animales: se adquirieron ratones BALB/c (Charles River, Charles River, MA) de 6-8 semanas de vida en el Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se alojaron en el vivario de la Universidad de Yale (New Haven, CT) o en el de la Universidad de Princeton (Princeton, NJ). Todos los estudios se realizaron según la University 30 Institutional Animal Care y Use Committees (IACUC). Se prepararon proteínas recombinantes en uno de dos vehículos: PBS (solución salina tamponada con fosfato) o la fórmula F147 (L-histidina 10 mM, NaCl 150 mM, trehalosa al 5 %, polisorbato 80 al 0,02 %, EDTA 0,1 mM, etanol al 0,5 %, Tris 10 mM, pH 7,2). Los vehículos se usaron indistintamente sin impacto detectable sobre los resultados. Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea (s.c.) los días 0 y 14. Los días 13 (principal) y 21 (refuerzo), se extrajo la sangre de ratones individuales mediante
35 punción retroorbital. Se recogieron los sueros por coagulación y centrifugación de las muestras de sangre sin heparina.
Se realizaron estudios con conejos blancos de Nueva Zelanda, hembra y macho, en Covance Research Products (Denver, PA). Los conejos (6/grupo) se inmunizaron por vía intramuscular (i.m.) los días 0 y 21 con 5 o 15 μg de STF2.HA1-2. Los sueros se recogieron 3 semanas después del refuerzo y se evaluaron para determinar los títulos
40 de microneutralización específica de HA.
Evaluaciones de reactogenicidad: los conejos (6/grupo) se inmunizaron por vía intramuscular (i.m.) los días 0 y 21. Los sueros se recogieron 1 día después de la inmunización de sensibilización para mediciones de CRP (kit ELISA CRP, Immunology Consultants Laboratory, Newberg, Oregón). El consumo de alimentos se midió desde día 0 al día
1. La temperatura corporal se midió por vía rectal entre 2 y 10 horas después de las inmunizaciones.
45 Exposición de ratones al virus de la gripe: para evaluar la eficacia, los ratones inmunizados los días 0 y 14 se expusieron el día 35 por administración intranasal de 1 x DL90 (dosis letal al 90 % de los ratones; aproximadamente 1 x 103 DICT50) (DICT = dosis infecciosa de cultivo tisular) del aislado de gripe A, PR8. Los animales se monitorizaron diariamente durante 21 días después de la exposición para determinar la supervivencia y la pérdida de peso.
50 Resultados y análisis
Perfiles de reactogenicidad comparativos para las construcciones STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 460) y STF2R3.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 464) de H1N1: para determinar la reactogenicidad, la molécula de fusión C terminal STF2.HA1-2 PR-8 (SEQ ID NO: 460) se comparó con STF2R3.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 464) en el modelo de conejo, y para ensayar la eficacia, en un modelo de ratón. En el modelo de reactogenicidad, se inmunizaron seis 55 conejos por grupo por vía i.m. con 50, 15, 5, 1,5 y 0,5 μg de bien STF2.HA1-2 PR-8 (SEQ ID NO: 460) o bien STF2R3.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 464). La temperatura corporal se midió por vía rectal el día anterior a la inmunización, 10 horas y los días 1 a 3 después de la inmunización de sensibilización. El consumo de alimentos se midió durante 1 día después de la inmunización. Para determinar los niveles de CRP en suero se extrajo la sangre
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de los conejos el día antes y un día después de la inmunización usando un kit comercial (Immunology Consulting Laboratories, Newberg Oregón).
Como se muestra en las Figuras 11A-11C, aunque ambas construcciones demuestran efectos dependientes de la dosis sobre el consumo de alimento, la temperatura y los niveles de CRP, los resultados comparativos indican que la
5 construcción STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 460), que implica la fusión del antígeno con el extremo C de la flagelina de longitud completa, causa una respuesta reactogénica más fuerte que STF2R3.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 464). La inmunización con la fusión C terminal conduce a un mayor aumento en la temperatura corporal y CRP y causa una mayor pérdida de apetito en comparación con la dosis equivalente de STF2R3.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 464).
Para evaluar la eficacia comparativa de las construcciones STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 460) y STF2R3.HA1-2
10 (SEQ ID NO: 464), grupos de 10 ratones Balb/c se inmunizaron con 1, 0,1 o 0,01 μg de la proteína a un intervalo de dos semanas. Tres semanas después de la segunda dosis, los animales se expusieron a 1xDL90 del virus PR8. Se efectuó un seguimiento de las tasas de supervivencia durante 21 días después de la exposición. Coherente con los resultados de inmunogenicidad en el conejo, los resultados de la exposición del virus en ratones muestran que las formas de longitud completa y R3 de la flagelina son igualmente inmunogénicas y protectoras (Figura 12).
15 En resumen, los resultados de los estudios en conejo y en ratón muestran que para las construcciones de H5 pueden usarse los mismos principios de diseño que los que pueden usarse para generar una construcción de R3 con la cabeza globular de PR8 H1 como el antígeno de vacuna y que la construcción resultante (SEQ ID NO: 464) tiene un perfil de reactogenicidad reducido sin comprometer la inmunopotencia de la construcción.
Perfiles de reactogenicidad comparativos para las construcciones STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463) y STF2R3.HA1
20 2 SI (SEQ ID NO: 465) de H1N1: la construcción STF2.HA1-2 (SI) (SEQ ID NO: 463) comprende el dominio de la cabeza globular (HA1-2) de HA A/Islas Salomón /3/2006 fusionado el extremo C de la flagelina (tipo 2) de Salmonella typhimurium (STF2) (SEQ ID NO: 447). La construcción de fusión C terminal STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463) se comparó con STF2R3.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 465) en el modelo de conejo para evaluar la reactogenicidad relativa. En el modelo de reactogenicidad, se inmunizaron seis conejos por grupo por vía i.m. con
25 50, 15, 5, 1,5 μg de bien STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463) o bien STF2R3.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 465). Como control, se incluyó un grupo que solo recibió tampón de formulación, F147. Los conejos se monitorizaron para determinar las respuestas frente a la vacuna: la temperatura corporal se tomó 1 día antes de la inmunización, 6 horas después de la inmunización y 1, 2 y 3 días después de la inmunización. El consumo de alimentos se monitorizó a intervalos de 1 día desde 1 día antes a tres días después de la inmunización. Como se muestra en la
30 Figura 12, la temperatura corporal aumentó, 6 horas después de la inmunización, y el consumo de alimentos disminuyó el primer día de la vacunación de una manera dependiente de la dosis mediante STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463) con la dosis más alta, 150 μg, que tenía el efecto más grande. Sin embargo, la administración de STF2R3.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 465) tuvo un efecto más pequeño a la misma dosis; a 150 μg, los conejos experimentaron un aumento más moderado de temperatura y un efecto mucho menor sobre el consumo de
35 alimentos en comparación con STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463). A la dosis de 50 μg, la inyección i.m. de STF2R3.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 465) no afectó al consumo de alimentos con respecto al control que había recibido tampón (F147).
Conclusión
Estos datos muestran que la deleción del dominio D3 de la flagelina y el reemplazo con un antígeno de vacuna 40 pueden conducir regularmente a una reducción en el perfil de reactogenicidad de la vacuna de fusión de la flagelina.
EJEMPLO 3: LAS VACUNAS DE LA CABEZA GLOBULAR DE LA HA DE GRIPE B UTILIZANDO LAS FORMAS R3 Y R32X DE LA FLAGELINA PROPORCIONAN UN PERFIL DE REACTOGENICIDAD MEJORADO
Materiales y métodos
Clonación de genes de STF2R3.HA1-2 B FLA y STF2R32x.HA1-2 B FLA recombinantes: para la construcción del
45 gen de STF2R3.HA1-2 B FLA (SEQ ID NO: 466) se usó el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina (HA) de la gripe B/Florida/04/2006 para reemplazar el dominio D3 de fljB (flagelina fase 2) de Salmonella typhimurium (SEQ ID NO: 488). En primer lugar se creó un subfragmento del gen de HA que codifica B FLA HA1-2 (aa 52-291) (SEQ ID NO: 467) como un gen sintético optimizado por codones (DNA2.0 Inc., Menlo Park, CA) y se incorporó en STF2 mediante PCR en dos etapas. En la primera etapa, el AND de pET24a-STF2.HA1-2 FLA (SEQ ID NO: 483) se
50 usó como molde de ADN, y se emplearon cebadores para amplificar el extremo N y extremo C de STF2 respectivamente, y los cebadores se usaron para amplificar HA1-2 (FLA). En la segunda etapa, los fragmentos STF2 y HA1-2 (FLA) de la primera etapa de la PCR se purificaron en gel y se usaron como moldes de ADN junto con cebadores para la reacción de PCR solapante de la segunda etapa. El producto de la PCR final se digirió con Ndel y EcoRI, se purificó en gel y se ligó mediante extremos compatibles con pET24a para generar la construcción
55 STF2R3.HA1-2 (FLA) (SEQ ID NO: 466). Para generar el gen de STF2R3.2XHA1-2 (FLA), (SEQ ID NO: 469), el ADN de pET24a-STF2.HA1-2 FLA (SEQ ID NO: 483) se digirió con Ndel y Mfel. El fragmento de 6,6 kb purificado en gel sirvió como vector. El ADN de pET24a-STF2R3.HA1-2 FLA (SEQ ID NO: 466) se digirió con Ndel y Mfel. El fragmento de 1,4 kb purificado en gel sirve como inserto. El vector y el ADN inserto se ligaron para generar la construcción STF2R3.2xHA1-2 FLA. Todas las construcciones se verificaron mediante secuenciación de ADN y se usaron para transformar la cepa hospedadora de expresión, BLR3 (DE3) (Novagen, San Diego, CA; Cat n.º 69053). Los transformantes se seleccionaron en placas con contenían kanamicina (50 μg/ml), tetraciclina (5 μg/ml) y glucosa (0,5 %).
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5 Purificación de las proteínas: los clones STF2R3.HA1-2 B FLA (SEQ ID NO: 470) y STF2R3.2x.HA1-2 B FLA (SEQ ID NO: 471) se cultivaron durante una noche y el cultivo se usó para inocular medio LB reciente complementado con kanamicina 25 μg/ml, tetraciclina 12,5 μg/ml y glucosa al 0,5 %. A una DO600 = 0,6 la expresión de proteína se indujo con IPTG 1 mM durante 3 h a 37 °C. Las células se recogieron por centrifugación (8000 x g durante 7 minutos) y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato 2 x (PBS 2 x: KH2PO4  2HPO4, NaCl 274 mM,
10 KCl 5,4 mM), glicerol al 1 %, DNAsa, PMSF 1 mM, cóctel inhibidor de proteasa y lisozima 1 mg/ml. El sedimento se disolvió en urea 8 M, NaCl 25 mM y acetato 50 mM, pH 4,0 y se aplicó a una columna SP Sepharose Fast Flow de 30 ml (XK16, GE/Amersham) previamente equilibrada con acetato 50 mM, NaCl 25 mM y urea 8 M, pH 4,0. La fracción pico se concentró y el tampón se cambió a Tris 50 mM, NaCl 25 mM y urea 8 M, pH 8,0. El replegamiento de la proteína se realizó por dilución rápida (1:10) en tampón Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), y se cargó en una columna
15 Source Q de 45 ml (XK16, GE/Amersham).
La proteína unida se eluyó con un gradiente salino lineal de 0 a 1,0 M de NaCl en Tris-HCl 100 mM, pH 8,0. Para las preparaciones finales y retirada de endotoxina, las fracciones pico se agruparon y se cargaron directamente en una columna de filtración en gel Superdex 200 (10/300 GL, GE/Amersham) previamente equilibrada en Tris 100 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 1 % y desoxicolato sódico al 1 %. Las fracciones pico del volumen incluido de la columna
20 se agruparon, se dializaron frente 1 x PBS y se conservaron a -80 °C.
Caracterización de las proteínas: las proteínas se caracterizaron con respecto a la pureza, identidad, contenido de endotoxina y actividad biológica usando los siguientes ensayos.
SDS-PAGE: las proteínas (típicamente 5 μg) se diluyeron en un tampón de muestra SDS-PAGE (SDS al 1 %, Tris-HCl 30 mM, pH 6,8, glicerol al 4 %, azul de bromofenol 0,1 mg/ml) con y sin β-mercaptoetanol 5 mM. Las muestras
25 se hirvieron durante aproximadamente 5 minutos y se cargaron en un gel de poliacrilamida SDS 4-20 %. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con azul de Coomassie para visualizar las bandas de las proteínas.
Ensayo de endotoxina: la endotoxina residual se ensayó usando el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus cromogénico convencional (Cambrex, Walkersville, MD) siguiendo las indicaciones del fabricante.
Ensayo de proteínas: las concentraciones de las proteínas se determinaron con el kit de reactivo de ensayo de
30 proteína MicroBCA en un formato de 96 pocillos usando BSA como un patrón (Pierce Biotechnology), siguiendo las instrucciones del fabricante.
ELISA de flagelina: la integridad y concentración de las proteínas se examinaron mediante ELISA con anticuerpos específicos para la flagelina. Placas ELISA (96 pocillos) se recubrieron durante una noche a 4 °C con diluciones en serie de cada proteína diana, en PBS comenzando a aproximadamente 5 μg/ml. Las placas se bloquearon con 35 200 μl/pocillo de tampón diluyente de ensayo (ADB; BD Pharmingen) durante una hora a temperatura ambiente después se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween-20 (PBS-T, NaPO4 12 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Tween 20 al 0,05 %). A todos los pocillos se añadió anticuerpo antiflagelina policlonal de conejo diluido en ADB (100 μl/pocillo, 1:5.000) y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente o durante una noche a 4 °C, después se lavaron tres veces con PBS-T. Se añadió anticuerpo de cabra
40 anti-IgG de conejo marcado con HRP (Jackson Immunochemical) diluido en ADB (100 μl/pocillo, 1:5.000) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS-T. Después de añadir sustrato ultra TMB (Pierce) y monitorizar el revelado de color, se midió la A450 en un espectrofotómetro de microplaca Tecan Farcyte.
Ensayo de bioactividad de TLR5: las células HEK293 (ATCC, Cat#CRL-1573, Manassas, VA) expresan de manera
45 constitutiva TLR5, y secretan diversos factores solubles, incluyendo IL-8, en respuesta a la señalización de TLR5. Las células se sembraron en microplacas de 96 pocillos (50.000 células/pocillo), y se añadieron proteínas de ensayo recombinantes. Al día siguiente, se recogió el medio acondicionado, se transfirió a una microplaca de 96 pocillos transparente y se congeló a -20 °C. Después de la descongelación, el medio acondicionado se ensayó para detectar la presencia de IL-8 en un ELISA de tipo sándwich usando un par de anticuerpos emparejados anti IL-8
50 humana (Pierce; Rockford, IL, n.º M801E y n.º M802B) siguiendo las instrucciones del fabricante. La densidad óptica se midió usando un espectrofotómetro de microplaca.
Estudios de reactogenicidad e inmunogenicidad en conejos:
Animales: se realizaron estudios con conejos blancos de Nueva Zelanda, hembra y macho, en Covance Research Products (Denver, PA).
55 Evaluaciones de reactogenicidad: los conejos (6/grupo) se inmunizaron por vía intramuscular (i.m.) los días 0 y 21. Se recogieron los sueros 1 día después de la inmunización de sensibilización para mediciones CRP (kit ELISA CRP, Immunology Consultants Laboratory, Newberg, Oregón). El consumo de alimentos se midió desde el día 0 al día 1.
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ELISA de virus: la gripe B Florida/4/2006 se inactivó en embriones desarrollados usando beta propiolactona (BPL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). En resumen, el virus se mezcló con BPL a 0,05 % durante 4 horas a temperatura ambiente, seguido de 24 horas a 4 °C. La dilución de revestimiento óptima se determinó usando suero de referencia anti-B Florida de cabra de NIBSC (Hertfordshire, UK). Placas EIA Hi-bind Costar (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) se 5 recubrieron con virus B Florida inactivado en 1X PBS (EMD, Gibbstown, NJ) a 1:10 durante una noche a 4 °C. Una curva patrón de IgG de conejo (AbD Serotec, Raleigh, NC) también se recubrió durante una noche. Las placas se lavaron al día siguiente y se bloquearon con 300 μl de Superblock con T20 (Thermo, Hudson, NH) durante 2 horas a 25 °C. Las diluciones de los sueros se prepararon comenzando a una dilución de 1:25 veces y continuando en etapas de 5 veces por duplicado usando Superblock. Las placas bloqueadas se lavaron 3X con 1X PBS/ Tween al 0,05 % (Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ) y los sueros diluidos y los controles se añadieron a los pocillos recubiertos con el virus. Se añadió solo Superblock a los pocillos recubiertos con IgG de conejo. Después de 2 horas de incubación a 25 °C, las placas se lavaron de nuevo y se incubaron con 100 μl de una dilución 1:10.000 de anticuerpos anti-IgG de conejo conjugados con HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) durante 40 a 45 minutos. Las placas se lavaron 3 veces y se añadieron 100 μI de sustrato TMB previamente calentado (Thermo,
15 Hudson, NH) a los pocillos. El revelado del color se permitió durante 3,5 minutos después de los cuales se añadieron 100 μl de H2S04 1 M (Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ) para detener la reacción. La DO 450 nM se leyó al cabo de 40 minutos de detección de la reacción (Spectramax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). La concentración de los anticuerpos anti-IgG de Florida B se determinó usando una curva logística de 4 parámetros generada a partir de los patrones de IgG de conejo y sus DO resultantes.
Resultados y análisis
Perfiles de reactogenicidad e inmunogenicidad comparativos para las construcciones de la gripe B, STF2.HA1-2 B FLA (SEQ ID NO: 468) y STF2R3.HA1-2 B FLA (SEQ ID NO: 470): las construcciones STF2R3.HA1-2 B FLA (SEQ ID NO: 470) y STF2R3.2x.HA1-2 B FLA (SEQ ID NO: 471) se evaluaron en el modelo de conejo para determinar reactogenicidad. Seis conejos por grupo se inmunizaron i.m. con 150 o 15 μg de STF2R3.HA1-2 B FLA (SEQ ID NO:
25 470) o STF2R32x.HA1-2 B FLA (SEQ ID NO: 471). Un grupo que recibía solo el tampón de formulación, F147, se incluyó como un control negativo. El consumo de alimentos se midió durante 1 día, después de inmunización. Para la determinación de los niveles de CRP en suero, se extrajo la sangre de los conejos el día anterior y un día después de la inmunización, usando un kit comercial (Immunology Consulting Laboratories, Newberg Oregón). Los resultados se muestran en la Figura 14 A y B.
Como se muestra en la Figura 14 A y B, a la dosis de 15 μg, ninguna construcción condujo a una reducción significativa en el consumo de alimentos en comparación con el grupo de control que recibió solo tampón de formulación (F147). A la dosis de 150 μg, solamente se observó una moderada reducción para la construcción de R3 (SEQ ID NO: 470) mientras que no se observó reducción en el consumo de alimentos para el grupo tratado con R3.2x (SEQ ID NO: 471). Se observaron aumentos muy moderados en los niveles de CRP para la construcción de
35 R3 (SEQ ID NO: 470) a cualquier dosis (intervalo de 10-80 μg/ml en comparación con lo típico de 400 a 600 μg/ml observado para las construcciones de flagelina de longitud completa mostradas en las Figuras 9, 10 y 11) mientras que únicamente se observaron aumentos mínimos, esporádicos, en los niveles de CRP para la construcción de R3.2x (SEQ ID NO: 471).
En el mismo experimento, los conejos recibieron un refuerzo el día 21 con la misma construcción. El día 28 los sueros se recogieron y se evaluaron para determinar la IgG específica del virus de la gripe B /Florida/4/2006. Los resultados mostrados en la Figura 15, indican que ambas construcciones son inmunogénicas con solo una moderada reducción en los títulos de IgG para la construcción de R32x mínimamente reactogénica (SEQ ID NO: 471).
Conclusión
45 Estos datos indican que los principios del diseño desarrollado para generar las construcciones de R3 y R32x son generalizables. El perfil de reactogenicidad de la vacuna puede reducirse sustancialmente reemplazando el dominio 3 de la flagelina con el antígeno de vacuna. La adición de un segundo antígeno de vacuna a la construcción mejoró adicionalmente el perfil de reactogenicidad de la vacuna. Para los dos diseños de R3 y 2x.R3, la inmunogenicidad de la vacuna se conservó y en algunos casos mejoró. Por tanto, las formas R3 y 2xR3 de la flagelina proporcionan una mejora consistente en el perfil de reactogenicidad de la vacuna. Estas vacunas podrían tener utilidad en casos en los que los sujetos no se han expuesto previamente al antígeno de vacuna o cuando el antígeno de vacuna es un mal inmunógeno y se requiere una inmunopotencia máxima de la vacuna. Como un ejemplo de lo anterior podría incluirse la gripe pandémica, en donde la inmunidad limitada del hospedador es la base de la pandemia.
EJEMPLO 4: LAS VACUNAS QUE UTILIZAN LAS FORMAS D2D3L DE LA FLAGELINA PROPORCIONAN
55 PERFILES DE REACTOGENICIDAD MEJORADOS CON REDUCCIONES DE INMUNOGENICIDAD DE BAJAS A MODERADAS
Materiales y métodos
Diseño y formulación de las vacunas Clonación de genes recombinantes. Clonación de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 491): se sintetizaron cuatro copias en tándem de M2e correspondientes a la secuencia consenso del virus de la gripe A humana (H1N1, H2N1, H3N2) (DNA2.0, Menlo Park, CA) como un concatémero de ADN (SEQ ID NO: 484). En este gen sintético los ocho restos de cisteína (dos por copia de M2e) se modificaron por serina (SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDPSR; SEQ ID NO:
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5 507 para impedir la formación de enlaces disulfuro que podrían ser incompatibles con la expresión de E. coli. El ADN plasmídico sirvió como molde para generar el gen de fusión 4xM2e empleando el kit de clonación integral de Stratagene (LaJolla, CA).
El producto de la PCR se ligó con el extremo cebador 3 del gen de fljB de S. typhimurium (STF2) en un vector pET24A (Novagen, San Diego, CA) y la mezcla de ligamiento se usó para transformar células XL1-Blue MRF’, y los 10 clones positivos se identificaron mediante exploración con PCR usando cebadores específicos de pET24A y análisis de mapeo con enzimas de restricción. La construcción, pET/STF2.4xM2e se confirmó mediante secuenciación de ADN. El ADN plasmídico se usó para transformar células BLR(DE3)pLysS competentes y se escogieron diversos transformantes y crecieron durante una noche para la inducción con IPTG 1 mM. Aproximadamente dos horas después de la inducción las bacterias se recogieron y el lisado se analizó mediante SDS-PAGE. Una banda de 67 15 kDa, correspondiente a la proteína STF2.4xM2e, se visualizó fácilmente mediante tinción con azul de Coomassie e inmunotransferencia usando el anticuerpo monoclonal anti-M2, 14C2 (ABI Biosciences). Se seleccionó un clon. El gen de 4xM2e se generó por PCR usando pET/STF2.4xM2e como molde y empleando NdeF1 (5_GAATTCCATATGAGCTTGCTGACTGAGGTTGAGACCCCGATTCGCA; SEQ ID NO: 508 y BlpR (5_GACGTGGCTCAGCTTATTAATGGTGATGATGGTGATGTCTAGACGGGTCTGAGCTATCGTTAGAGCG; SEQ
20 ID NO: 509) como cebadores directo e inverso, respectivamente. El fragmento de 270 pb se digirió con las enzimas Ndel y Blpl y se insertó en el vector pET24A que previamente se había digerido con las mismas enzimas. La construcción pET/4xM2e, que contenía una etiqueta de polihistidina en el extremo C de la proteína M2e, se usó para transformar células BLR DE3 como se ha descrito anteriormente.
Clonación de STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 492): la flagelina de longitud completa de la fljb (flagelina de fase 2)
25 de Salmonella typhimurium o STF2 está codificada por un gen de 1,5 kb. Se generó una versión modificada de STF2, denominada STF2.D2D3L (SEQ ID NO: 486), delecionando la región hipervariable que abarca los aminoácidos 170 a 415. La región delecionada se reemplazó con un enlazador flexible corto (GAPVDPASPW; SEQ ID NO: 510) diseñado para retener interacciones de las regiones NH2 y COOH terminales necesarias para la señalización de TLR5. Un gen de 4xM2e sintético (SEQ ID NO: 484) se fusionó con el extremo C de STF2.D2D3L
30 (SEQ ID NO: 486) para generar pET/STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 492).
Expresión y purificación de proteínas de fusión: se elaboraron proteínas de fusión de flagelina utilizando un proceso de fermentación semidiscontinuo en E. coli. Después de acabarse por completo la glucosa disponible durante la fase en lotes, se bombearon cuatro litros de medio de alimentación sintético enriquecido a una velocidad controlada durante 10,5 h más (para un proceso total el tiempo fue de 30,3 h). Las expresiones de la proteína diana se
35 indujeron con IPTG 2,1 mM (concentración final). Las células se sedimentaron por centrifugación y la pasta celular se conservó a -20 °C. La pasta celular se descongeló y se diluyó a sólidos 15 % en Tris 50 mM, NaCl 25 mM (pH 8). La suspensión se homogeneizó tres veces con PSI 12 k. STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) se localizó tanto en elsobrenadante como en el sedimento. Únicamente se procesó el sobrenadante. La mayoría de la STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472) se encontró en el sedimento. Solamente se procesaron los cuerpos de inclusión.
40 Para el proceso del sobrenadante, las fracciones de proteína que contenían la proteína de fusión se precipitaron con polietilenglicol (PEG) al 10 % o con (NH4)2S04 4 M. Los sedimentos se disolvieron en urea 8 M a pH 4 para solubilizar la proteína diana. Las proteínas solubles se extrajeron en la fase de sobrenadante por centrifugación. Los sobrenadantes se unieron a una columna CEX (Tosoh SP650M) en urea 6 M, con poca sal. Las proteínas diana se eluyeron en condiciones de elución con una etapa de NaCl. Las proteínas recogidas se replegaron por dilución
45 rápida usando Tris 20 mM, urea 0,5 M, trehalosa 0,1 M, CaCl2  
50 cromatografía de exclusión por tamaño para aislar la forma monomérica purificada de las proteínas diana. Para el proceso de sedimentación, los cuerpos de inclusión se lavaron con Triton X-100 al 1 % y se solubilizaron con urea 8 M. La proteína se replegó por dilución rápida usando la misma condición. La purificación adicional sigue las mismas etapas que las del proceso de sobrenadante. La proteína final no procesada se conservó a -70 °C como partes alícuotas de 1 ml.
55 Se ensayó la endotoxina residual usando el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus cromogénico estándar (Cambrex, Walkersville, MD) siguiendo las indicaciones del fabricante. Para las proteínas producidas por baculovirus marcadas con 6xHis, se empleó la columna de quelante metálica. La proteína se cargó en una columna de Ni-NTA equilibrada en Tris 20 mM, pH 8, NaCl 0,5 M y se eluyó en un gradiente de imidazol 0-0,5 M. La proteína diana se purificó adicionalmente mediante una columna de exclusión por tamaño (10/300 GL, GE/Amersham). Las fracciones
60 pico se agruparon, se concentraron y dializaron frente 1 x PBS. La solución de proteína dividida en alícuotas se conservó a -80 °C.
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Caracterización de las proteínas: las proteínas se caracterizaron con respecto a la pureza, identidad, contenido de endotoxina y actividad biológica usando los siguientes ensayos.
SDS-PAGE: las proteínas (típicamente 5 μg) se diluyeron en tampón de muestra SDS-PAGE (SDS al 1 %, Tris-HCl 30 mM, pH 6,8, glicerol al 4 %, azul de bromofenol 0,1 mg/ml) con y sin β-mercaptoetanol 5 mM. Las muestras se 5 hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel de poliacrilamida SDS al 4-20 %. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con azul de coomassie para visualizar las bandas de proteína.
Ensayo con endotoxina: los niveles de endotoxina se midieron usando el kit de ensayo LAL cromogénico cuantitativo QCL-1000 (BioWhittaker n.º 50-648U), siguiendo las instrucciones del fabricante para el método de microplaca.
Ensayo de proteína: las concentraciones de las proteínas se determinaron con el kit de reactivo de ensayo de
10 proteína MicroBCA en un formato de 96 pocillos usando BSA como un patrón (Pierce Biotechnology), siguiendo las instrucciones del fabricante.
ELISA de flagelina: la integridad y la concentración de las proteínas se examinó mediante ELISA con anticuerpos específicos de flagelina. Las placas ELISA (96 pocillos) se recubrieron durante una noche a aproximadamente 4 °C con diluciones en serie de cada proteína diana, en PBS comenzando a 5 μg/ml. Las placas se bloquearon con 15 aproximadamente 200 μl/pocillo de tampón diluyente de ensayo (ADB; BD Pharmingen) durante una hora a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween-20 (PBS-T, NaPO4 12 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Tween 20 al 0,05 %). Se añadió anticuerpo antiflagelina policlonal de conejo diluido en ADB (100 μl/pocillo, 1:5.000) a todos los pocillos y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente o durante una noche a 4 °C, después se lavó tres veces con PBS
20 T. Se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo marcado con HRP (Jackson Immunochemical) diluido en ADB (100 μl/pocillo, 1:5.000) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS-T. Después de añadir sustrato Ultra TMB (Pierce) y de controlar el revelado de color, la A450 se midió en un espectrofotómetro de microplaca Tecan Farcyte.
Bioensayo de TLR5: la bioactividad de las proteínas recombinantes purificadas se ensayó usando un ensayo in vitro
25 basado en células. En resumen, se obtuvieron células RAW264.7 de la ATCC (Rockville, MD). Esta línea celular expresa TLR2 y TLR4, pero no TLR5. Las células RAW264.7 se transfectaron con un plásmido que codificaba el TLR5 (Invivogen, San Diego, CA) humano para generar células RAW/h5. La actividad específica de TLR5 de las proteínas de fusión se evaluó midiendo la inducción de la producción de TNF. Las células RAW/h5 se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos (Costar) a una densidad de siembra de (3-5) x 104 células en 100 μl/pocillo
30 en medio DMEM complementado con FCS a 10 % y antibióticos. Al día siguiente, las células se trataron durante 5 h con diluciones en serie de proteínas de ensayo comenzando a 5 μg/ml. Al finalizar el ensayo, se recogieron los sobrenadantes y la expresión de TNF se evaluó mediante ELISA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se evaluó la absorbancia y la luminiscencia usando un espectrofotómetro de microplaca TECAN que ejecuta el software Magellan (Amersham).
35 Estudios de reactogenicidad e inmunogenicidad en conejos:
Animales: se realizaron estudios con conejos blancos de Nueva Zelanda, hembra y macho, en Covance Research Products (Denver, PA).
Evaluaciones de reactogenicidad: se inmunizaron conejos (6/grupo) por vía intramuscular (i.m.) los días 0 y 21. Los sueros se recogieron 1 día después de la inmunización de sensibilización para mediciones de CRP (kit ELISA CRP,
40 Immunology Consultants Laboratory, Newberg, Oregón). El consumo de alimentos se midió del día 0 al día 1.
ELISA: placas de ELISA se recubrieron con péptido M2e o con proteína HA SI en PBS durante una noche a 4 °C, se bloquearon con 200-300 μl/pocillo de tampón diluyente de ensayo (ADB; BD Pharmingen, San Diego, CA) durante 23 horas a 23-27 °C. Después de la incubación con los anticuerpos de detección indicados, se añadió anticuerpo antiratón de cabra marcado con HRP (Jackson Immunochemical, West Grove, PA) diluido en ADB y las placas se
45 incubaron a 23-27 °C durante 1-2 horas. Todos los lavados entre las etapas de adición de reactivo se realizaron 3 veces con 1X PBS/Tween-20 al 0,05 %. Después de añadir sustrato Ultra TMB (Pierce, Rockford, IL) y de monitorizar el revelado del color, la reacción se detuvo con H SO4 y se midió la DO450 en un espectrofotómetro de microplaca.
Estudios de inmunogenicidad y eficacia de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) y STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472)
50 en ratones: se adquirieron ratones BALB/c de 6-8 semanas de vida del Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Las proteínas recombinantes STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) y STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472) se prepararon como se ha descrito anteriormente y se formularon en una de dos formulaciones, PBS (solución salina taponada con fosfato) o fórmula F105 (histidina 10 mM, NaCl 75 mM, sacarosa al 5 %, polisorbato 80 al 0,02 %, EDTA al 0.1 mM, etanol al 0,5 %, Tris 10 mM, pH 7,2). Las formulaciones se usaron indistintamente sin impacto detectable sobre los
55 resultados. Para evaluar la eficacia, los ratones inmunizados los días 0 y 14 como se ha descrito anteriormente, se expusieron el día 28 mediante administración intranasal de una DL90 (dosis letal para al 90 % de ratones; 8 X 103 DIE) de aislado PR8 de gripe A. Después de la exposición se efectuó un seguimiento de las tasas de supervivencia de los animales durante 21 días.
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Resultados y análisis
Actividad relativa de TLR5 de fusiones con formas de flagelina de longitud completa y D2D3L: las proteínas de fusión purificadas STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472) STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463) y STF2D2D3L.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 473) se evaluaron para detectar la bioactividad específica de TLR5 5 usando la línea celular RAW/h5. Diversas diluciones de las proteínas se incubaron con las células RAW/h5 durante una noche. Los sobrenadantes RAW se ensayaron con respecto a los niveles de TNF. Tanto el antígeno M2e (4xM2e; SEQ ID NO: 485) como el antígeno HA1-2 SI (SEQ ID NO: 499) fusionados con la forma D2D3L de la flagelina (también indicado como “STF2Δ” o “STF2 delta”) exhibieron una fuerte actividad estimuladora específica de TLR5 que fue comparable con la del mismo antígeno fusionado con la construcción de flagelina de longitud completa
10 (Figura 16A y B). Las proteínas de fusión resultantes son (SEQ ID NO: 472) (STF2Δ.4xM2e) y (SEQ ID NO: 473) (STF2Δ.HA1-2(SI)).
Reactogenicidad comparativa de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) y STF2D2D3L.4xM2e (SEO ID NO: 472): la reactogenicidad de las proteínas STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) y STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472) se examinó en el modelo de conejo. Grupos de seis conejos se inmunizaron con dosis que variaban de 0,15 a 50 μg.
15 Se midió el consumo de alimentos durante 24 horas después de la inmunización. Se extrajo la sangre de los conejos el día antes y 1 día después de la inmunización para la determinación de los niveles en suero de CRP usando un kit comercial (Immunology Consulting Laboratories, Newberg Oregón).
Como se muestra en las Figuras 17A y 17B ambas construcciones demuestran efectos dependientes de la dosis sobre el consumo de alimentos y sobre los niveles de CRP. Sin embargo, resultados comparativos indican que la
20 construcción STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457), que implica la fusión del antígeno con el extremo C de la flagelina de longitud completa, causa una respuesta reactogénica más fuerte que la de STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472). La inmunización con la fusión C terminal causa una mayor pérdida de apetito y conduce a un aumento más alto en los niveles de CRP en comparación con la dosis equivalente de STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472).
Inmunogenicidad y eficacia comparativa de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) y STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO:
25 472): la inmunogenicidad de las proteínas STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) y STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472) se examinó en ratones BALB/c (10/grupo) inmunizados s.c. el día 0 y 14 con PBS, STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) (3 μg) o STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472) (3 o 0,3 μg). El día 21 se extrajo la sangre de los ratones y se examinaron las respuestas de IgG específicas de M2e examinado por ELISA. Los resultados de la Figura 18A y B demuestran que la inmunización con 3 o 0,3 μg de STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472) induce respuestas de IgG
30 específicas de M2e, demostrando la dosis más alta respuestas comparables a las inducidas por la misma dosis de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457). El día 28, los ratones de este estudio se expusieron con una DL90 de PR/8 (8 x 103 DIE (dosis infecciosas de embrión)) para evaluar la eficacia in vivo. Como se muestra en las Figuras 18A y 18B, los ratones inmunizados solo con PBS exhibieron una supervivencia de 10 % mientras que los ratones inmunizados con la PROTEÍNA STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) demostraron una supervivencia de 80 %. Los ratones inmunizados
35 con 3 o 0,3 μg de STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472) demostraron una supervivencia de 90 y 80 %, respectivamente, que fue comparable con la observada en los animales que recibieron STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457). Por tanto, parece que la deleción de los dominios D2 y D3 de la flagelina no afecta negativamente en la inmunogeneicidad del antígeno 4xM2e fusionado o en la eficacia de la construcción de la vacuna.
Perfiles de reactogenicidad e inmunogeneicidad comparativos para las construcciones STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO:
40 463) y STF2D2D3L.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 473) de H1N1: para determinar la reactogenicidad, la molécula de fusión C terminal STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463) se comparó con STF2D2D3L.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 473) en el modelo de conejo. Se inmunizaron seis conejos por grupo, por vía i.m. con 50, 15, 5, 1,5 y 0,5 μg de bien STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 463) o bien STF2D2D3L.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 473). El consumo de alimentos se midió durante 24 horas después de la inmunización. Para la determinación de los niveles en suero de CRP, se extrajo sangre de los
45 conejos el día anterior y 1 día después de la inmunización usando un kit comercial (Immunology Consulting Laboratories, Newberg Oregón).
Como se observa en la Figura 19A y B, aunque las dos construcciones demuestran efectos dependientes de la dosis sobre el consumo de alimentos, la temperatura y los niveles de CRP, los resultados comparativos indican que la construcción STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 460), que implica la fusión del antígeno con el extremo C de la flagelina
50 de longitud completa, causa una respuesta reactogénica más fuerte que la de STF2R3.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 464). La inmunización con la fusión C terminal conduce a un mayor aumento en la temperatura corporal y en los niveles de CRP y causa una mayor pérdida de apetito que la dosis equivalente de STF2R3.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 464).
El día 21 del mismo estudio se recogieron los sueros de los conejos y se ensayaron para determinar las respuestas
55 de IgG específicas de SI. Los resultados de la Figura 20 demuestran que la inmunización con STF2D2D3.HA1-2 SI (SEQ ID NO: 473) induce respuestas de IgG específicas de SI HA más bajas, que variaban de aproximadamente 10 veces menos a la dosis más baja y de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 veces a las dosis más altas.
EJEMPLO 5: LAS VACUNAS DE CABEZA GLOBULAR DE HA H1 QUE UTILIZAN LAS FORMAS R0 DE LA FLAGELINA PROPORCIONAN REACTOGENEICIDAD LIMITADA E INMUNOGENEICIDAD DE BAJA A MODERADA
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Materiales y métodos
Diseño y formulación de la vacuna
Clonación de genes de HA recombinantes: para la construcción del gen de STF2R0.HA1-2 (PR8) (SEQ ID NO: 493)
5 se usó una reacción PCR de dos etapas para delecionar el dominio D0 de STF2. HA1-2 (PR8). En la primera etapa, se usó ADN de pET24a-STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 458) como un molde de ADN, y se usaron cebadores para amplificar STF2 sin el dominio 0 y HA1-2 (PR8) respectivamente. En la segunda etapa, los dos fragmentos de la PCR de la primera etapa se purificaron en gel y se usaron como moldes de ADN y se usaron cebadores para esta 2ª etapa de reacción PCR solapante. El producto de la PCR final se digirió con Ndel y EcoRI, se purificó en gel y se ligó
10 mediante extremos compatibles a pET24a para generar la construcción STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 493).
Expresión y purificación de las proteínas de fusión flagelina-cabeza globular de HA: se elaboraron proteínas de fusión de flagelina utilizando un proceso de fermentación semidiscontinuo en E. coli. Después de acabarse por completo la glucosa disponible durante la fase en lotes, se bombearon cuatro litros de medio de alimentación sintético enriquecido a una velocidad controlada durante 10,5 h más (para un proceso total el tiempo fue de 30,3 h). 15 Las expresiones de la proteína diana se indujeron con IPTG 2,1 mM (concentración final). Las células se sedimentaron por centrifugación y la pasta celular se conservó a -20 °C. La pasta celular se descongeló y se diluyó a sólidos 15 % en Tris 50 mM, NaCl 25 mM (pH 8). La suspensión se homogeneizó tres veces con PSI 12 k. STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457) se localizó tanto en el sobrenadante como en el sedimento. Únicamente se procesó el sobrenadante. La mayoría de la STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO: 472) se encontró en el sedimento. Solamente 20 se procesaron los cuerpos de inclusión. Los sedimentos se disolvieron urea 8 M a pH 4 para solubilizar la proteína diana. Las proteínas solubles se extrajeron en la fase sobrenadante por centrifugación. Los sobrenadantes se unieron a una columna CEX (Tosoh SP650M) en urea 6 M, con poca sal. Las proteínas diana se eluyeron en condiciones de elución en la etapa de NaCl. Las proteínas recogidas se replegaron mediante dilución rápida usando Tris 20 mM, urea 0,5 M, trehalosa 0,1 M, CaCl2 2 mM, cisteína 3 mM, cistina 0,3 mM, EDTA 1 mM, PS-80 al 0,1 %, 25 pH 8,0 con agitación constante durante una noche. Las proteínas replegadas se concentraron a 1 litro y el tampón se cambió usando Tris 50 mM, PS80 al 0,05 %, trehalosa 0,1 M (pH 8). Se realizó cromatografía de intercambio aniónico Q para retirar las impurezas restantes. Se seleccionaron fracciones pico de eluato Q que contenían alto contenido en proteínas para procesamiento posterior. Se realizó cromatografía de exclusión por tamaño como una etapa de purificación final para aislar la forma monomérica purificada de las proteínas diana. Para los procesos de 30 sedimentación, los cuerpos de inclusión se lavaron con Triton X-100 al 1 % y se solubilizaron con urea 8 M. La proteína se replegó por dilución rápida usando la misma condición. La purificación adicional sigue las mismas etapas que las del proceso de sobrenadante. La proteína final sin procesar se conservó a -70 °C como partes alícuotas de 1 ml. Se ensayó la endotoxina residual usando el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus cromogénico convencional (Cambrex, Walkersville, MD) siguiendo las indicaciones del fabricante. La solución de proteínas
35 dividida en alícuotas se conservó a -80 °C.
Caracterización de las proteínas: las proteínas se caracterizaron con respecto a la pureza, identidad, contenido de endotoxina y actividad biológica usando los siguientes ensayos.
SDS-PAGE: las proteínas (típicamente 5 μg) se diluyeron en tampón de muestra SDS-PAGE (SDS al 1 %, Tris-HCl 30 mM, pH 6,8, glicerol al 4 %, azul de bromofenol 0,1 mg/ml) con y sin β-mercaptoetanol 5 mM. Las muestras se
40 hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel de poliacrilamida SDS al 4-20 %. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con azul de Coomassie para visualizar las bandas de proteína.
Ensayo de endotoxina: la endotoxina residual se ensayó usando el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus cromogénico convencional (Cambrex, Walkersville, MD) siguiendo las indicaciones del fabricante.
Ensayo de proteína: las concentraciones de las proteínas se determinaron con el kit de reactivo de ensayo de
45 proteína MicroBCA en un formato de 96 pocillos usando BSA como un patrón (Pierce Biotechnology), siguiendo las instrucciones del fabricante.
ELISA de flagelina: la integridad y la concentración de las proteínas se examinó mediante ELISA con anticuerpos específicos de flagelina. Se recubrieron placas ELISA (96 pocillos) durante una noche a 4 °C con diluciones en serie de cada proteína diana, en PBS comenzando a 5 μg/ml. Las placas se bloquearon con 200 μl/pocillo de tampón 50 diluyente de ensayo (ADB; BD Pharmingen) durante una hora a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween-20 (PBS-T, NaPO4 12 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Tween 20 al 0,05 %). Se añadió anticuerpo antiflagelina policlonal de conejo diluido en ADB (100 μl/pocillo, 1:5.000) a todos los pocillos y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente o durante una noche a 4 °C, después se lavó tres veces con PBS-T. Se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo marcado con HRP
55 (Jackson Immunochemical) diluido en ADB (100 μl/pocillo, 1:5.000) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces con PBS-T. Después de añadir sustrato Ultra TMB (Pierce) y de controlar el revelado de color, la A450 se midió en un espectrofotómetro de microplaca Tecan Farcyte.
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Ensayo de bioactividad de TLR5: las células HEK293 (ATCC, Cat#CRL-1573, Manassas, VA) expresan de manera constitutiva TLR5, y secretan diversos factores solubles, incluyendo IL-8, en respuesta a la señalización de TLR5. Las células se sembraron en microplacas de 96 pocillos (50.000 células/pocillo), y se añadieron proteínas de ensayo recombinantes. Al día siguiente, se recogió el medio acondicionado, se transfirió a una microplaca transparente de
5 96 pocillos y se congeló a -20 °C. Después de descongelar, el medio acondicionado se ensayó para determinar la presencia de IL-8 en un ELISA de tipo sándwich usando un par de anticuerpos emparejados anti-IL-8 humana (Pierce; Rockford, IL, n.º M801E n.º M802B) siguiendo las instrucciones del fabricante. La densidad óptica se midió usando un espectrofotómetro de microplaca.
Evaluación de la vacuna
10 Estudios de inmunogeneicidad y eficacia en ratones: se adquirieron ratones BALB/c de 6-8 semanas de vida en el Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se alojaron en el vivario de Princeton University (Princeton, NJ). Todos los estudios se realizaron según la University Institutional Animal Care y Use Committees (IACUC). Las proteínas recombinantes se prepararon en la fórmula F147 (L-histidina 10 mM, NaCl 150 mM, trehalosa al 5 %, polisorbato 80 al 0,02 %, EDTA 0,1 mM, etanol al 0,5 %, Tris 10 mM, pH 7,2). Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea (s.c.)
15 los días 0 y 14. Los días 13 (principal) y 21 (refuerzo), se extrajo la sangre de ratones individuales mediante punción retroorbital. Los sueros se recogieron por coagulación y centrifugación de muestras de sangre sin heparina. Para evaluar la eficacia, los ratones inmunizados los días 0 y 14 como se describe anteriormente se expusieron el día 35 a administración intranasal de 1 x DL90 (dosis letal al 90 % de los ratones; 1 x 103 DICT50 del aislado PR8 de gripe
A. Los animales se monitorizaron diariamente durante 21 días después la exposición para determinar la 20 supervivencia y pérdida de peso.
Estudios de reactogenicidad e inmunogeneicidad en conejos: se realizaron estudios con conejos blancos de Nueva Zelanda hembra y macho en Covance Research Products (Denver, PA). Los conejos (6/grupo) se inmunizaron por vía intramuscular (i.n.) los días 0 y 21. Los sueros se recogieron 1 día después de la inmunización de sensibilización para mediciones de CRP y 3 semanas después de la dosis de refuerzo para mediciones de IgG específicas de HA.
25 Resultados y análisis
Los datos descritos en la presente memoria, muestran que la flagelina de tipo 2 de Salmonella typhimurium (STF2) está asociada con la reactogenicidad dependiente de la dosis en seres humanos y en conejos. Esto se observa como un aumento en la temperatura corporal y en los niveles de proteína C reactiva (CRP) en ambas especies, náuseas en seres humanos y consumo de alimentos reducido en conejos. Probablemente, esto apenas está 30 relacionado con la actividad TLR5 de STF2, que puede medirse en un ensayo de liberación de citocina in vitro. La inmunogenicidad, medida como IgG específica para el antígeno de vacuna fusionado, también se ha descubierto que es dependiente de la dosis, de tal manera que el grupo significa que la reactogenicidad e inmunogenicidad pueden modelarse en una correlación generalmente lineal. En nuestro intento inicial de mejorar la inmunopotencia de una vacuna de cabeza globular de HA H5 (Ejemplo 1) se crearon deleciones y reemplazos de dominios
35 seleccionados de flagelina a través de manipulaciones de la secuencia génica recombinante. Se descubrió que, la molécula STF2R0.HA1-2 VN (SEQ ID NO: 453), en donde el dominio D0 se reemplazó por la cabeza globular de HA de la gripe H5N1 VN04, era escasamente inmunogénica y eficaz en un modelo de exposición letal de ratón (Ejemplo 1, Figuras 5, 6A y 6B). La escasa inmunogeneicidad/eficacia en ratones es probablemente la consecuencia de la actividad estimuladora de TLR5 enormemente disminuida, asociada con esta construcción (Ejemplo 1, Tabla 7).
40 En un conjunto de estudios distintos, se crearon deleciones y reemplazos de los dominios D0 y D3 de STF2 a través de manipulaciones de la secuencia génica para el gen de la cabeza globular de H1N1 PR8/34 fusionado a flagelina (SEQ ID NO: 460). Las construcciones se expresaron, se purificó la proteína y después se evaluó en el ensayo TLR5 y en el modelo de conejo establecido para la reactogenicidad e inmunogenicidad. La molécula STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474), en donde el dominio D0 se reemplazó con la cabeza globular de la HA de la gripe H1N1
45 PR8/34, produjo un resultado inesperado. Coherente con los resultados de VN04 R0 la PR8/34 R0 tuvo una actividad estimuladora TLR5 baja. También se descubrió que la reactogenicidad era baja; pero sorprendentemente, la inmunogenicidad a dosis medias y altas fue equivalente a la de la STF2 nativa relacionada con PR8 HA (STF2.HA1-2 PR8) (SEQ ID NO: 460) en este modelo de conejo. Esto puede permitir un suministro seguro de dosis más altas de una vacuna basada en flagelina en seres humanos.
50 Análisis in vitro de la actividad estimuladora de TLR5 de STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474): células 293 HEK (ATCC) se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos (Costar) a una densidad de siembra de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 x 104 células en 100 μl/pocillo en medio DMEM complementado con FCS al 10 % y antibióticos. Al día siguiente, las células se trataron durante 5 horas con diluciones en serie de proteínas de ensayo. La STF2.R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474) se comparó con la proteína de referencia STF2.HA1-2 SI,
55 que es la cabeza globular HA de las Islas Salomón fusionada con la flagelina de longitud completa (SEQ ID NO: 461). Al final del ensayo, se recogieron los sobrenadantes y la expresión de IL-8 se evaluó por ELISA (Invitrogen, Carlsbad, CA). La DO450 se midió en un espectrofotómetro de microplaca (Molecular Devices-MDS, Sunnyvale, CA). Los resultados mostrados en la Figura 21 muestran que en relación con la construcción de fusión de flagelina de longitud completa, la proteína STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474) tiene baja actividad estimuladora TLR5.
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Ensayo de inmunogenicidad y reactogenicidad de STF2R0.HA1-2 PR8: la inmunogenicidad y reactogenicidad relativa de STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474) se comparó con la de STF2.HA1-2 PR8 usando el modelo de reactogenicidad en el conejo. Dosis de 150, 15 y 1,5 μg de STF2.HA1-2 PR8 se compararon con las dosis ajustadas por masa equivalente de 132,1, 13,2 y 1,32 μg de STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474). También se incluyó un 5 control de formulación. La inmunización se realizó i.m. los días 0 y 21. El consumo de alimentos se midió desde los días del estudio -1 a +3. La temperatura corporal también se midió por vía rectal los días -1 a +3. El día 0, la temperatura se midió 6 horas después de la inmunización. Se recogió sangre y suero preparado los días -1 (presangrado), +1, 21, 22, 28 y 42. Se determinó la proteína C reactiva (CRP) usando un ELISA comercial (Immunological Consultants Laboratories, Oregón). La IgG específica de PR8 HA se determinó usando un ELISA
10 para virus. Las placas se recubrieron con virus PR8 (205 HAU/ml) junto con una curva patrón de IgG policlonal (Serotec, Raleigh, NC). Después del lavado y bloqueo, las diluciones de suero se unieron a los virus que recubrían la placa. Después de un lavado adicional, se detectó la IgG específica usando anti IgG de conejo de cabra-HRP, TMB y H2SO4. Las placas se leyeron a 450 nm y se calculó la IgG en μg/ml usando la curva patrón ajustada con una ecuación logística de 4 parámetros (Softmax 5,2, Molecular Devices, California).
15 Las medidas de consumo de alimentos, temperatura corporal y CRP se consideran conjuntamente en un perfil de reactogenicidad. La flagelina de tipo silvestre hallada en STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 460) administrada a conejos a dosis iguales a o mayores de 50 μg reduce la alimentación y aumenta la temperatura y secreción de CRP, una proteína de fase aguda hecha en el hígado. Estos resultados son coherentes con observaciones en un ensayo clínico de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 457), que contiene la misma secuencia de flagelina. Como se muestra en las
20 Figuras 22A a C, el reemplazo del dominio 0 de STF2 con HA1-2 (SEQ ID NO: 474) reduce significativamente el perfil de reactogenicidad a dosis equivalentes. Más notablemente, el consumo de alimentos está en gran medida inalterado incluso por 132,1 μg de STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474) que es el equivalente molar de 150 μg de STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 460).
A pesar de la reactogenicidad reducida de la construcción de R0 (SEQ ID NO: 474), se descubrió que IgG específica
25 de virus era igual que la inducida por STF2.HA1-2 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 460) a las dosis equivalentes a 150 y 15 μg, como se muestra en la Figura 23. A la dosis equivalente de 1,5 μg de STF2.HA1-2 PR8 nativo (SEQ ID NO: 460) produce un título de anti PR8 mayor que STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474).
Como se muestra en las Figuras 24A a C, la representación de IgG específica de PR8 en comparación con cada una de las medidas de reactogenicidad proporciona una representación visual única de las diferencias entre las 30 moléculas de tipo silvestre y R0. En particular, las pendientes de R0 de las líneas de mejor ajuste en cada una de las representaciones son diferentes que STF2. Esto no se ha observado con ninguna de las otras variantes de STF2 evaluadas en las que las medidas de reactogenicidad e IgG se han movido en paralelo de modo que las pendientes permanecen similares. Dado el perfil de reactogenicidad superior de R0, parece que pueden tolerarse dosis mayores de STF2R0.HA1-2 (SEQ ID NO: 474) en seres humanos en cuyo caso podrían conseguirse títulos equivalentes o
35 incluso mayores sin efectos secundarios.
Eficacia de STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474) en ratones: la eficacia protectora de STF2.HA1-2 PR8 y STF2R0.HA1-2 PR8 se comparó en un modelo de exposición letal de ratón. Se inmunizaron ratones BALB/c con los dos antígenos a tres dosis diferentes en un intervalo de 2 semanas, y se expusieron a A/PR8/34. Como se muestra en la Figura 25, las inmunizaciones con 0,03, 0,1 y 1 μg de STF2.HA1-2 PR8 dieron como resultado 20 %, 80 % y
40 100 % de supervivencia. Por el contrario, solamente 20 % de ratones inmunizados con la dosis mayor (1 μg) de STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO: 474) sobrevivieron a la exposición vírica letal.
Estos resultados confirman que, a diferencia de los conejos, en ratones la construcción R0 (SEQ ID NO: 474) es escasamente inmunogénica, pero puede ser útil en composiciones para prevenir o aliviar infección en donde un sujeto no está tratado previamente de forma inmunológica.
45 Conclusión
Aunque la construcción de R0 (SEQ ID NO: 474) es escasamente inmunogénica y eficaz en ratones, en el modelo de conejo la construcción es inmunogénica observándose solamente reducciones modestas de inmunopotencia a las dosis menores ensayadas. Debido a que el modelo de conejo ha predicho con éxito la ventana terapéutica para dos vacunas separadas evaluadas en la clínica, es probable que el modelo de conejo pueda proporcionar una 50 predicción precisa de lo que podría observarse en la situación clínica. El modelo de conejo puede proporcionar una evaluación de la ventana terapéutica (por ejemplo, un intervalo de dosis que maximiza la respuesta inmunológica minimizando la reactogenicidad) para uso en seres humanos para ciertas construcciones de flagelos. Las construcciones de vacuna con la señalización de TLR5 mínima requerida para estimulación de una respuesta inmunitaria podrían tener utilidad real en la situación clínica. Dicha vacuna sería útil en casos en los que los sujetos
55 tengan inmunidad preexistente al antígeno de vacuna, tal como con gripe de temporada o cuando es necesario combinar múltiples antígenos de vacuna para formar una vacuna multivalente, de nuevo como sucede con gripe de temporada.
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EJEMPLO 6: ADSORCIÓN DE UNA FLAGELINA EN LA SUPERFICIE DE PLGA
La inmunogenicidad de las composiciones, agonistas de receptor de tipo Toll 5 y proteínas de fusión de la invención, puede mejorarse por asociación con partículas, tales como coloidales (por ejemplo, nanopartículas). Un agonista de receptor de tipo Toll 5, tal como flagelina, y un antígeno puede unirse a la superficie de una partícula.
5 Métodos:
El polímero biodegradable poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) se disolvió en acetona a diferentes concentraciones que variaban de 1,25 mg a 10,0 mg/ml. Después se incubó la solución de polímero orgánico con flagelina (SEQ ID NO: 447) a diferentes pH (pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 10). El pH óptimo de adsorción de la flagelina en PLGA se determinó siguiendo la cantidad de proteína flagelina en la solución inicial y después en la
10 solución final después de incubar con el PLGA:
Resultados:
Los resultados en la Tabla 9 muestran que las partículas no pudieron recuperarse a una concentración de PLGA de 10 mg/ml. A una concentración de PLGA de 2,5 o 1,25 mg/ml, las partículas de PLGA se prepararon con éxito con valores de polidispersión bajos. El control del tamaño de partícula y polidispersión se vio influido por el ajuste de la
15 concentración de PLGA en la dispersión. Se descubrió que la adsorción de flagelina en la superficie de las partículas era dependiente del pH y era máxima cuando el pH del medio era diferente del pI de flagelina, más específicamente cuando el pH estaba por debajo del pI de flagelina (pI = 5). (Tabla 9). Se produjo adsorción óptima y formación de nanopartículas a pH 4.
Conclusiones:
20 Se puede adsorber flagelina en la superficie de partículas, tales como sistemas coloidales (por ejemplo, nanopartículas). Las partículas adsorbidas con flagelina pueden ser útiles en combinación con un antígeno que se coadsorbe en la superficie, se encapsula o se une covalentemente en la superficie del agonista de TLR 5 que contiene partículas, que pueden tener presentación superior del antígeno a las células inmunitarias y, por lo tanto, generar una respuesta inmunitaria potenciada en comparación con el antígeno solo.
25 Tabla 9: efecto del pH sobre la adsorción del agonista TLR 5
Concentración PLGA
de Flagelina fljb Tamaño partícula de Concentración de Flagelina (% p/p de PLGA)
10 mg/ml
4,0 N/D N/D
10 mg/ml
7,0 N/D N/D
10 mg/ml
10,0 N/D N/D
2.5 mg/ml
4,0 210 nm 2,5 %
2.5 mg/ml
7,0 150 nm 2,1 %
2.5 mg/ml
10,0 110 nm 1,7 %
1.25 mg/ml
4,0 150 nm 3,2 %
1.25 mg/ml
7,0 115 nm 3,4 %
1.25 mg/ml
10,0 120 nm 2,2 %
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SEQ ID NO: 447 STF2 (S. typhimurium fljB)
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Ejemplo 7: datos de reactogenicidad e inmunogenicidad preclínicos de ratones y conejos inyectados con STF2.HA1 (SI)
5 Introducción
El componente activo de la vacuna VAX125 incluye STF2.HA1 (SI) (SEQ ID NO: 660), que incluye el dominio de cabeza globular de la proteína HA de las Islas Solomon fusionada con una flagelina (STF2; SEQ ID NO: 661). Es un antígeno específico de cepa A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1) la que coactiva las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas acoplando un ligando para un TLR5 (flagelina), que desencadena la fase inicial, innata, de una
10 respuesta inmunitaria, al antígeno de vacuna (HA), que induce una respuesta adaptativa inmunitaria específica de antígeno. Se expresan receptores de tipo Toll (TLR) en diversos tipos celulares, más notablemente células presentadoras de antígenos profesionales (CPA), donde actúan como sensores primarios de productos microbianos y activan rutas de señalización que conducen a la inducción de genes inmunitarios e inflamatorios.
La proteína de fusión STF2.HA1 (SI) en tampón de F147 (Tris 10 mM, L-histidina 10 mM, trehalosa 5 % (p/p), NaCl
15 150 mM, polisorbato 80 0,02 % (p/p), EDTA 0,1 mM, etanol 0,41 % (p/p) a pH 7,0) es una composición denominada en la presente memoria “VAX125”. En experimentos preclínicos, los ratones se inmunizaron por vía subcutánea con VAX125 que incluía STF2.HA1-2 (SI) en dosis que variaban de 0,1 μg a 10 μg. Se desarrollaron inhibición de hemaglutinación (IHA) protectora y títulos de anticuerpos neutralizantes después de una sensibilización y un refuerzo con tan poco como 0,1 μg de la proteína de fusión.
20 Se proporcionó a los conejos dosis intramusculares de la proteína de fusión en un intervalo de 0,5 μg a 300 μg. La mayoría de los conejos desarrollaron respuestas de IgG contundentes después de una única dosis y todos desarrollaron respuestas de IgG después de dos dosis. Dosis tan bajas como 5 μg condujeron a la inducción de niveles protectores de anticuerpos neutralizantes. Tanto en ratones como en conejos, anticuerpos dirigidos a flagelina (bien preexistentes o bien los inducidos por una inmunización de sensibilización) no interfirieron con
25 respuestas inmunitarias a la vacuna en inmunización posterior.
Materiales y métodos
Bioensayo de TLR5.
Se evaluó la actividad específica de TLR5 de proteínas de fusión midiendo la inducción de producción de IL-8 por células HEK 293 (ATCC, Manassas, VA). Las células se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos 30 (Costar, ThermoFisher, Hudson, NH) a una densidad de siembra de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 x 104 células en 100 μl/pocillo en medio DMEM complementado con FCS 10 % y antibióticos (Invitrogen, Carlsbad, CA). Al día siguiente, las células se trataron durante aproximadamente 5 horas con diluciones en serie de proteínas de ensayo comenzando a 5 μg/ml. Al completar el ensayo, se recogieron sobrenadantes y se evaluó la expresión de IL8 por ELISA (BD, Franklin Lakes, NJ). Se midió la DO450 en un espectrofotómetro de microplacas (Molecular
35 Devices-MDS, Sunnyvale, CA).
Estudios in vivo: ratón y conejo
Se obtuvieron ratones BALB/c a las 5-6 semanas de edad de Charles River Labs (Wilmington, MA) y se alojaron en condiciones de SPF. Después de una semana de aclimatación, se inmunizaron s.c. en la nuca (volúmenes de 0,1 ml) o en el flanco (0,25 ml en cada flanco para un total de 0,5 ml) con la proteína de fusión. Los ratones se
40 inmunizaron típicamente los días de estudio 0 y 14.
Se realizaron sangrados de ratón no terminales en región retroorbital y se realizaron sangrados terminales bien en región retroorbital (Princeton) o mediante punción cardiaca. Se recogió sangre en tubos separadores de suero BD (Franklin Lakes, NJ) y se centrifugaron a 3000 RPM durante 20 minutos para generar suero.
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Se obtuvieron conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW) de Covance o Charles River. Los conejos eran de entre 12 y 17 semanas de edad al llegar y se aclimataron durante una semana antes de la inmunización. Los conejos se inmunizaron i.m. con VAX125 que incluía diversas dosis de STF2.HA1-2 (SI) como se describe en la presente memoria en un volumen total de 0,5 ml. Se administraron inyecciones de sensibilización y refuerzo a músculos del
5 muslo alternantes.
Se realizó sangrado por vena de la oreja en todos los puntos temporales. Se realizó consumo de alimentos pesando el aporte de alimento y los residuos a intervalos de 24 horas. Se tomó la temperatura corporal por vía rectal excepto para el estudio en la Figura 33 que se tomó por microplaca subcutánea.
Potencia de ratón: IgG específica de HA por ELISA
10 Para el ELISA que evalúa la inmunopotencia, se usaron placas (ThermoFisher, Hudson, NH) revestidas con el antígeno HA1-1 (SI) (Vaxlnnate, Cranbury, NJ) a 1-3 μg/ml para evaluar la actividad específica de HA de suero de ratón. Las muestras de suero se diluyeron en Superblock T20 (ThermoFisher, Hudson, NH) y se transfirieron a la placa recubierta y bloqueada. Se realizaron dos diluciones independientes para cada muestra de suero. Después de incubación y lavado (IX PBS, Tween 20 0,05 %, Mallinkrodt-Baker, Phillipsburg, NJ), las placas se desarrollaron
15 usando un IgG de cabra anti ratón (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) conjugado directamente con peroxidasa de rábano rusticano seguido de TMB/H2SO4, (ThermoFisher, Hudson, NH y Mallinkrodt-Baker, Phillipsburg, NJ). Las placas se leyeron a 450 nm (SpectraMax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se revistió una parte de cada placa con una serie de diluciones de IgG de ratón purificado (AbD Serotech, Oxford, Reino Unido) para generar una curva patrón, que se ajustó usando una ecuación logística de 4 parámetros (Softmax Pro 5.2,
20 Molecular Devices). Esta curva permite el cálculo de IgG específico de HA en μg/ml.
Potencia de ratón: microneutralización
En el ensayo de microneutralización, las muestras de suero se trataron con enzima destructora de receptor (EDR, 1 parte de suero más 3 partes de EDR, DENKA SEIKEN, obtenida a través de Accurate Chemicals, Westbury, NY) a 37 ºC durante una noche, se inactivaron por calor (56 ºC, 30 min), se cocultivaron con 100 DICT50 de gripe 25 A/Solomon Islands/ 3/2006 (CDC, Atlanta, GA) durante 1 hora en placas de microtitulación de 96 pocillos. Después se añadieron células MDCK (4 x 104/pocillo) en medio DMEM (DMEM complementado con BSA 1 %, HEPES 20 mM y penicilina 100 UI/ml y estreptomicina 100 μg/ml, Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de incubación durante una noche (3 ºC durante 20 h), se aspiró el medio. Las células se lavaron después una vez con PBS (Invitrogen), se fijaron en acetona 80 % (Mallinkrodt-Baker, Phillipsburg, NJ), se secaron al aire y se sometieron a ensayo de ELISA
30 con anticuerpo monoclonal anti NP (BEI Resources, Manassas, VA) como el anticuerpo de detección (1:2000) e IgG:HRP de cabra específico anti Fcγ de ratón (1:5000, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) como el anticuerpo secundario. También se incluyeron controles de la titulación de virus para asegurar que se usaba la dosis de virus apropiada.
Potencia de ratón: ensayo de inhibición de hemaglutinina (IHA)
35 En el ensayo de IHA, las muestras de suero se trataron con EDR (DENKA SEIKEN, obtenido a través de Accurate Chemicals, Westbury, NY) durante 18-20 horas a 37 ºC y se inactivaron por calor (56 ºC, 30 min). Se añadieron veinticinco microlitros de las muestras de suero tratadas a placas de 96 pocillos de fondo en V (ThermoFisher, Hudson, NH) por duplicado, y se diluyeron en serie (dos veces). Se añadió virus de Gripe A/Solomon Islands/3/2006 (4 UHA en 25 μl) a las muestras de suero y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadieron
40 cincuenta microlitros de glóbulos rojos de pollo al 0,5 % (CRBC, Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA) a la mezcla de suero de virus. También se incluye suero de referencia positivo (hurón anti-A/Solomon Islands/03/2006, CDC, Atlanta, GA) y un control de CRBC. Después de ~2 horas de incubación a temperatura ambiente, se leyeron los patrones de hemaglutinación de las muestras. Los títulos de IHA se definieron como las diluciones recíprocas que provocan inhibición completa de hemaglutinación específica de virus.
45 ELISA de proteína C reactiva
Se realizó determinación de los niveles de CRP de suero de conejo usando un kit de ELISA de tipo sándwich comercial (Immunology Consultants Fab, Inc., Newberg, OR). Los kits se procesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y con reactivos proporcionados. El kit incluye una curva patrón que se ajustó usando una ecuación logística de 4 parámetros (Softmax Pro 5.2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se procesaron muestras
50 de suero a dilución 1:1000 o 1:5000. Solamente se usaron valores de DO en el intervalo de la curva patrón.
Potencia de conejo: IgG específico de HA y STF2 por ELISA
Para los ELISA que evalúan IgG específicos de HA y STF2, se usaron placas (ThermoFisher, Hudson, NH) recubiertas con la proteína HA1-1 (SI) a 3 μg/ml o STF2 a 1 μg/ml para evaluar la actividad específica de suero de conejo. Brevemente, se diluyeron muestras de suero en Superblock T20 (ThermoFisher, Hudson, NH), y se 55 transfirieron a la placa recubierta y bloqueada. Se realizaron dos diluciones independientes para cada muestra de suero. Después de incubación y lavado (PBS IX, Tween 20 0,05 %, Mallinkrodt-Baker, Phillipsburg, NJ), las placas se desarrollaron usando un IgG de cabra anti conejo (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) directamente
imagen127
conjugado con peroxidasa de rábano rusticano seguido de TMB/H2SO4, (ThermoFisher, Hudson, NH y Mallinkrodt-Baker, Phillipsburg, NJ). Las placas se leyeron a 450 nm (SpectraMax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se recubrió una parte de cada placa con una serie de diluciones de IgG de conejo purificado (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) para generar una curva patrón, que se ajustó usando una ecuación logística de 4 parámetros
5 (Softmax Pro 5.2, Molecular Devices). Esta curva permite el cálculo de IgG específico de HA y STF2 en μg/ml.
Potencia de conejo: microneutralización
El ensayo de microneutralización mide los niveles de anticuerpos (Ab) neutralizantes específicos de virus en muestras de suero cuantificando la reducción en proteína NP de la gripe en células MDCK infectadas por virus como resultado de coincubación de anticuerpo-virus. Para retirar los inhibidores no específicos, las muestras de suero se 10 trataron con EDR II (1 parte de suero + 3 partes de EDR II, DENKA SEIKEN, obtenido a través de Accurate Chemicals, Westbury, NY) a 37 ºC durante 18-20 horas y 56 ºC durante 30 minutos. A continuación, los sueros tratados se diluyeron en serie por duplicado en placas de cultivo tisular de 96 pocillos y se coincubaron con 100 DICT50 de gripe A/Solomon Islands/03/2006 (CDC, Atlanta, GA) durante 1-1,5 horas a 37 ºC. Esto se siguió de adición de 4 x 104/pocillo de células MDCK/pocillo (ATCC, Manassas, YA). Después de 18-22 horas de incubación, 15 se realizó cuantificación de proteína NP usando un protocolo de ELISA convencional usando MAb anti-NP (BEI, NR4282, 1:2.000) como el anticuerpo primario e IgG de cabra anti conejo como el anticuerpo secundario (JacksonlmmunoResearch, West Grove, PA, 1:5.000). Se incluyó suero de oveja anti A/Solomon Islands/03/2006 (NIBSC, Herfordshire, Reino Unido) como un suero de referencia en cada placa para supervisar la variabilidad. Se han descrito anteriormente lavado de placas, sustrato TMB y solución de terminación, y lectura de DO45. Los títulos
20 de anticuerpos neutralizantes se definen como las diluciones recíprocas que están por debajo de la señal específica calculada a partir de los valores DO de controles negativos y positivos.
Resultados
Secreción de IL-8
Se presenta la bioactividad de diferentes lotes de proteínas como una relación de la IL-8 producida en respuesta a
25 una concentración seleccionada del artículo de ensayo (aproximadamente 278 ng/ml) en relación con la de la misma concentración del patrón de referencia. Una relación de menos de 1,00 indica bioactividad reducida en comparación con la referencia. La Tabla 10 muestra que dos lotes diferentes de STF2.HA1-2 (SI) indujeron cantidades similares de IL-8 a partir de células HEK-293.
Tabla 10: STF2.HA1 (SI) estimula la secreción de IL-8 a través de TLR5 Inmunopotencia de conejo y ratón
imagen128
Referencia
n.º de pocillo Resultado (ng/nl) medio Media de todos los pocillos Relación T/C
STF2.HA1-2(SI) lote 1 (2,19 mg/ml)
1 635,470 1105,669 N/D
2
797,188
3
1073,319
4
1227,599
5
1362,383
6
1538,054
STF2.HA1-2(SI) lote 2 (4,0 mg/ml)
1 1464,454 1407,564 1,3
2
1594,904
3
1608,427
4
1304,132
5
1379,742
6
1093,725
imagen129
En un experimento, se inmunizaron grupos de 15 ratones BALB/c s.c. dos veces con dosis de 10 μg, 1 μg y 0,1 μg de STF2.HA1 (SI) en un intervalo de 2 semanas. Se prepararon muestras de suero 7 días después del refuerzo, como se describe en Métodos. Los títulos de anticuerpos neutralizantes se definieron como las diluciones recíprocas
5 que están por debajo de la señal específica calculada a partir de los valores DO de controles negativos y positivos. Los resultados de microneutralización se muestran en la Figura 26. Los resultados indicaron que dos inmunizaciones de ratones con STF2.HA1 a 1 μg y 10 μg de dosis inducían niveles significativos de anticuerpos neutralizantes a A/Solomon Islands/03/2006 (p <0,05, en ensayo de ANOVA/Tukey).
En un segundo estudio de inmunogenicidad comparativo, se inmunizaron grupos de 15 ratones BALB/c s.c. dos
10 veces con 3 μg, 1 μg, 0,3 μg o 0,1 μg de STF2.HA1 (SI) o Fluvirin® (Novartis) en un intervalo de 2 semanas. Las muestras de suero se recogieron 7 días después del refuerzo, y se prepararon como se ha descrito anteriormente para el ensayo de microneutralización. Los resultados, mostrados en la Figura 27, indican que tanto STF2.HA1 (SI) como Fluvirin® inducen anticuerpos neutralizantes específicos de virus de una manera dependiente de dosis. La inmunización con STF2.HA1 (SI) a una dosis tan baja como 0,3 μg dio como resultado un aumento significativo en
15 los anticuerpos neutralizantes específicos de virus. Los títulos de anticuerpos neutralizantes inducidos en ratones por 3 μg o 1 μg de Fluvirin® en comparación con 1 μg o 0,3 μg de STF2.HA1 (SI) son similares como se determina por ensayo de ANOVA/Tukey.
También se realizó un estudio de variación de dosis del producto STF2.HA1 (SI) en conejos. Los conejos recibieron 300 μg, 150 μg, 45 μg, 15 μg y 5 μg suministrado i.m. los días 0 y 21. Se observó lagrimeo relacionado con dosis en
20 los conejos aproximadamente 24 horas después de la inmunización de sensibilización. Esto se autorresolvió a las 48-72 horas. Resulta interesante que la frecuencia de esta observación fue mayor a 150 μg (6 de 6 animales) y sustancialmente inferior a 300 μg (1 de 6 animales). Como se muestra en la Figura 28A, se observa IgG específico de HA significativo 21 días después de la inmunización de sensibilización a todos los niveles de dosis. Esta respuesta se reforzó en todos los grupos como se muestra en la Figura 28B.
25 Se realizaron ensayos de microneutralización en el suero de conejo usando el método descrito anteriormente para suero de ratón. Un único refuerzo con STF2.HA1 (SI) condujo a aumentos contundentes en los títulos de anticuerpo en comparación con los de sueros normales (4-64 veces, Tabla 11). Aunque los niveles de anticuerpos neutralizantes en las muestras de suero de grupos de dosis de 45 μg y 150 μg parecen ser mayores que los de los grupos de dosis menores, no hubo ninguna diferencia estadística entre los diferentes grupos de dosis de acuerdo
30 con el ensayo de ANOVA/Tukey. Por lo tanto, STF2.HA1 (SI) es altamente inmunogénico en conejos conduciendo dosis tan bajas como 5 μg a la inducción de niveles protectores de anticuerpos neutralizantes.
Tabla 11: neutralización de gripe A/Solomon Islands/3/2006 por anti STF2.HA (SI) de conejo
Grupos
Dosis (μg/animal) Animales por grupo (n) MGTa IC al 95 %b Significaciónc
F147
6 10 10-10
SID.008
5 6 411 302-560 ***
SID.008
15 6 544 314-940 ***
SID.008
50 6 565 179-1786 ***
SID.008
150 6 685 274-1713 ***
atítulos de medias geométricas;
bintervalos de confianza al 95 %;
cSignificativo en Ensayo de ANOVA/Tukey (frente a F147), ***, p< 0,001.
En una ampliación de los experimentos de inmunogenicidad comparativos descritos anteriormente para ratones, se
inmunizaron grupos de 6 conejos blancos de Nueva Zelanda i.m. dos veces con 45, 15 o 5 μg de STF2.HA1 (SI) o 35 Fluvirin® en un intervalo de 3 semanas. Se prepararon muestras de suero 7 días después del refuerzo, como se ha
descrito anteriormente para el ensayo de microneutralización. Los resultados, mostrados en la Figura 29, indican
que dosis bajas de ambas vacunas inducen títulos de neutralización contundentes en el conejo. Ciertas
comparaciones entre grupos por ANOVA (45 μg de Fluvirin® en comparación con 15 μg de STF2.HA1 (SI)) indican
que STF2.HA1 (SI) es menos potente que Fluvirin®, aunque otras comparaciones entre grupos (15 μg de Fluvirin® 40 en comparación con 5 μg de STF2.HA1 (SI) por ensayo de ANOVA/Tukey no muestran ninguna diferencia
estadística significativa entre Fluvirin® y STF2.HA1 (SI).
imagen130
Resultados no clínicos de VAX 125
En los estudios de diversas dosis de VAX125 en conejos, descritos anteriormente, se observó lagrimeo relacionado con la dosis 24 horas después de la inmunización de sensibilización. Se evaluó la reactogenicidad sistémica de VAX 125 en conejos para incluir medidas relacionadas con la dosis de temperatura, consumo de alimentos y CRP.
5 Se inmunizaron grupos de conejos con dosis de STF2.HA1 (SI) en VAX125 que variaban de 150 μg a 0,5 μg. Se evaluaron los niveles de consumo de alimentos y CRP después de la inmunización de sensibilización. El intervalo de dosis completo para STF2.HA1 (SI) se evaluó en un único experimento. Los datos se representan en las Figuras 30
32. La administración de STF2.HA1 (SI) suprime el apetito en conejos de una manera dependiente de dosis. El consumo de alimentos para los grupos de dosis de 50 y 15 μg se acerca a la línea basal. CRP aumentó de una
10 manera dependiente de dosis después de la administración de STF2.HA1 (SI) (Figura 31). Coherentemente con estas observaciones, la temperatura se elevó a las 2 horas después de la vacunación con STF2.HA1 (SI) a dosis de 50 μg y 150 μg (Figura 32).
La cinética de elevación de temperatura después de inyección con STF2.HA1 (SI) también se determinó. Los resultados de este estudio indican que la temperatura se eleva durante al menos 10 horas después de inmunización
15 mientras que vuelve a la normalidad a las 24 horas (Figura 33). Se realizó por lo tanto un estudio de variación de dosis de STF2.HA1 (SI) que mide la temperatura a las 6 horas después de la inmunización. Las dosis de 15 a 0,5 μg se compararon con el tampón F147 solamente. Coherentemente con los resultados a las 2 horas, la elevación de temperatura dependió de la dosis (Figura 34) y comenzó a aumentar significativamente a dosis ≥ 15 μg.
Se evaluó suero del estudio de conejos en el ensayo de microneutralización. Como se muestra en la Figura 35,
20 dosis de STF2.HA1 (SI) tan bajas como 1,5 μg generan títulos de anticuerpos neutralizantes sustanciales, con tasas de seroconversión que varían de 67 a 100 %. Una dosis de 0,5 μg también induce anticuerpos neutralizantes en el 33 % de los conejos.
Conclusión
Se produjo un enlace molecular de flagelina de Salmonella typhimurium y una cabeza globular de HA de gripe A en
25 E. coli y cuando se proporcionó a conejos y ratones, dio como resultado anticuerpos neutralizantes de virus. La función de estímulo inmunitario innata del STF2 se conservó claramente como se indica por la secreción de IL-8 de células HEK-293, y por reducciones en el consumo de alimentos, y aumentos en la temperatura corporal y CRP de suero observados a dosis mayores de la vacuna. A dosis menores, sin embargo, las medidas de reactogenicidad en el conejo fueron similares al control de tampón mientras que se detectaron títulos de anticuerpos neutralizantes
30 significativos, así como IgG específico de HA.
Estos títulos son similares en magnitud a los inducidos por Fluvirin®, una vacuna usada en seres humanos. En ratones, 1 μg de STF2.HA1 (SI) produce mayores títulos de anticuerpos neutralizantes que 3 μg de Fluvirin®, que tiene aproximadamente la misma cantidad de proteína SI HA. Por lo tanto, las composiciones que incluyen antígenos en combinación con agonistas de receptor de tipo Toll 5, tales como STF2.HA1-2 (SI), pueden tener una
35 ventaja significativa frente a vacunas de gripe tradicionales, debido a que dichas composiciones pueden prepararse en E. coli, que tiene un mayor rendimiento de proteínas por metro cuadrado de capacidad de fabricación en relación con la fabricación basada en huevo fertilizado. Además, la respuesta inmunogénica potente y baja reactogenicidad a bajas dosis en comparación con las vacunas usadas en la actualidad, era inesperada.
Ejemplo 8: estudio de variación de dosis creciente para evaluar la seguridad e inmunogenicidad de la VAX125 en 40 seres humanos
Para evaluar la seguridad y eficacia de la proteína de fusión STF2.HA1-2 (SI) (SEQ ID NO: 660; también denominada en la presente memoria “STF2.HA1 (SI)”) en F147 (Tris 10 mM, L-histidina 10 mM, trehalosa 5 % (p/p), NaCl 150 mM, polisorbato-80 0,02 % (p/p), EDTA 0,1 mM, etanol 0,41 % (p/p) a pH 7,0), se realizaron ensayos clínicos de Fase I. La proteína de fusión STF2.HA1-2 (SI) en combinación con el tampón F147 se denomina
45 “VAX125”. Se evaluó la seguridad y eficacia de la composición de VAX 125. Las composiciones de VAX125 se administraron i.m., en un régimen de una única dosis en adultos sanos de 18 a 49 años de edad. Se completaron tarjetas diarias de síntomas y se realizaron evaluaciones físicas en todos los sujetos. Además, se cuantificaron los niveles de citocinas en suero y proteína C reactiva (CRP) antes y después de la administración de la composición.
La inmunogenicidad de la composición VAX 125 en sujetos humanos se evaluó. El criterio de valoración primario fue
50 el anticuerpo de inhibición de la hemaglutinación en suero (IHA) frente a A/Solomon Islands/06 cultivado en huevo que se evaluó los días 0, 14 y 28. (Belshe, R. B., et. al., The J. of Infectious Diseases 181: 1133-1137 (2000)). Además, se evaluó el suero en un ensayo de microneutralización usando virus de las Islas Solomon cultivado en huevo, y en un ELISA usando HA recombinante como se ha descrito previamente (Katz, J.M. et. al., TheJ. of Infectious Diseases 750: 1763-1770 (1999)).
55 Materiales y métodos
Diseño del estudio VAX125-01 Fase 1, Parte 1: este estudio fue un diseño de estudio abierto, prospectivo, de aumento de dosis, en sujetos sanos, no previamente vacunados. El estudio consistió en 7 grupos que variaban de 0,1 a 8 μg de VAX125 (proteína total): 0,1 μg, 0,3 μg, 1 μg, 2 μg, 3 μg, 5 μg o 8 μg. Hubo 8 sujetos por grupo, 56 sujetos en total. La inmunogenicidad se evaluó el día 0, 7, 14 y 28. El día 0 es el día en que se administró la composición.
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5 VAX125-01 Fase 1, Parte 2: este estudio fue un estudio aleatorio, controlado por placebo, con ocultación en adultos sanos. El fin de este estudio fue desarrollar datos de seguridad e inmunogenicidad adicionales a dosis bien toleradas que podría actuar como la base de una formulación trivalente a 1 μg o 2 μg.
Participantes en el estudio:
Antes de participar en procedimientos de estudio, cada voluntario proporcionó un consentimiento informado por
10 escrito, voluntario. Los sujetos tenían 18-49 años de edad y eran sanos como se determinó por el historial médico, examen físico de exploración y análisis de laboratorio de exploración. Los criterios de exclusión principales incluyeron historial de afección médica activa o presencia de resultados de laboratorio de exploración anómalos, respuesta inmunitaria alterada por cualquier razón, infección por gripe documentada durante los 6 meses previos, recepción reciente de vacuna no del estudio o alergia a los componentes de la vacuna.
15 Procedimientos
En el primer estudio, los participantes se asignaron aleatoriamente para recibir 1 administración de dosis crecientes de VAX 125 para aumentar la concentración de la proteína de fusión STF2.HA1-2 (SI): 0,1 μg, 0,3 μg, 1 μg, 2 μg, 3 μg, 5 u 8 μg. Los participantes en el estudio recibieron la vacuna por inyección intramuscular (i.m.) en el músculo deltoides del brazo no dominante. Los participantes mantuvieron un diario después de la dosis de VAX 125 y durante
20 6 días en lo sucesivo, donde registraron reacciones locales y sistémicas solicitadas clasificadas como ninguna, leve, moderada o grave. Las reacciones adversas se evaluaron por los participantes en el estudio usando una escala de 4 puntos (0-3). Las reacciones locales solicitadas fueron rojez, hinchazón o induración, dolor y equimosis. Las reacciones sistémicas solicitadas fueron fiebre, cefalea, dolor de las articulaciones, fatiga, dolores musculares, escalofríos y aumento de la sudoración.
25 Los sujetos volvieron a la clínica para observaciones de seguridad los días 1 y 7 después de la administración de VAX125 para un examen físico breve, revisión del diario y evaluación de laboratorio. Se realizaron evaluaciones de laboratorio de seguridad adicionales los días 14 y 28. Los análisis de laboratorio incluyeron CBC, BUN, Creatinina, análisis de orina y ensayos de la función hepática. Se realizaron ensayos de proteína C reactiva (CRP, Latex Enhanced Immunoturbidimetric, Bayer, Pittsburg, PA) el día 0 (preadministración de la VAX125) y 1. Se realizaron
30 ensayos de IHA, microneutralización y respuestas de IgG a HA y flagelina en sueros recogidos los días 0, 7, 14 y 28 después de la administración de VAX 125.
Procedimientos de aumento de dosis (Estudio 1)
Dentro de cada grupo de dosis, tras completar la visita clínica del Día 1, se revisaron datos de llamada telefónica del Día 3 y laboratorios de seguridad el Día 1 por el comité de supervisión de seguridad.
35 Tras completar la parte de aumento de dosis del estudio inicial, el protocolo permitió la inclusión de 48 sujetos adicionales asignados aleatoriamente para recibir uno de dos niveles de dosis que se determinó que tenían seguridad e inmunogenicidad óptimas o placebo.
Proteína de fusión STF2.HA 1 -2 (SI)
La proteína de fusión STF2.HA1-2 (SI) se purificó en condiciones de GMP usando métodos convencionales de
40 cromatografía (WCBF, Madison, WI). La proteína de fusión se formuló en tampón F147, se colocó en viales y se administró a seres humanos.
Ensayos clínicos
Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (IHA)
El ensayo de IHA clínico se realizó usando glóbulos rojos de pavo (RBC, TCC Farms, Federalsburg, MD) y placas de
45 microtitulación de fondo en V de 96 pocillos (VWR, West Chester. PA). Los RBC se lavaron tres veces en PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Las células se resuspendieron a una concentración final de 0,75 % de RBC en PBS. El suero objeto se trató con enzima destructora de receptor (EDR, Denka Sieken, Accurate Chemical, Westbury, NY) para retirar inhibidores no específicos (dilución 1:4). Se preparó gripe A/Solomon Islands/3/2006 a 4 UHA/25 μl L en PBS. El suero se diluyó en
50 serie 1:2 dejando 25 μl L en cada fila. Después se añadió virus en un volumen de 25 μl L, la placa se mezcló suavemente y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después se añadieron cincuenta microlitros de RBC 0,75 % a cada pocillo, las placas se mezclaron suavemente y se permitió que sedimentaran a 4 ºC hasta que las células formaron un sedimento bien definido.
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Los pocillos de control incluyeron los que contenían solamente RBC (sin virus o suero); RBC + virus (sin suero) y RBC, virus y suero de control (suero humano agrupado). El título de IHA en suero se determinó como la dilución mayor en donde se formó un sedimento o “botón” bien definido.
Microneutralización
5 Se realizó un ensayo de microneutralización con el uso del protocolo modificado a partir del desarrollado por (Katz,
J. M., et .al., The J. of Infectious Diseases 180: 1763-1770 (1999)). Las muestras de suero se diluyeron en serie por duplicado, comenzando a 1:20, se cocultivaron con 100 dosis infecciosas de células de cultivo tisular (DICT 100) que provocaron 50 % de lisis (DICT50) de gripe A/Solomon Islands/3/2006 durante 1,5 horas en placas de microtitulación de 96 pocillos. Después se añadieron células MDCK (ATCC, Manassas, VA, 4 x 104/pocillo) en medio DMEM 10 (DMEM complementado con BSA 1 %, HEPES 20 mM y penicilina 100 UI/ml y estreptomicina 100 μg/ml (Invitrogen, Carlsbad, CA)). Después de una incubación de 20 horas a 37 ºC, se aspiró el medio. Las células se lavaron después una vez con PBS (Invitrogen, Carlsbad, CA), se fijaron en acetona 80 % (Sigma, St. Louis, MO), se secaron al aire y se sometieron a ensayo de ELISA con nucleoproteína anti gripe A monoclonal (1:2000, clones A1 y A3, ATCC/BEI resources, Manassas, VA) como el anticuerpo de detección e IgG de cabra específico anti Fcgamma de ratón:HRP
15 (1:5000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) como el anticuerpo secundario.
Después del desarrollo en sustrato de TMB-ELISA Ultra de 1 etapa (Thermo, Hudson, NH) y terminación de la reacción en H2SO4 1 M (Mallinckrodt Baker, Phiilipsburg, NJ) se leyó la DO450 (Spectramax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se incluyeron la retrotitulación del virus, el control de suero positivo, controles de virus (CV) y controles celulares (CC). El criterio de valoración del anticuerpo neutralizante del virus para cada suero se determinó
20 usando la ecuación: 50 % de señal específica = [(promedio de DO de pocillos CV) -(promedio de DO de pocillos CC)]/2 + promedio de DO de pocillos CC. Los valores por debajo de este valor se consideran positivos para actividad neutralizante.
ELISA
Se recubrieron placas 4HBX Immulon (Thermoelectron Corp., Milford, MA) con HA1-1 (SI) (SEQ ID NO: 662)
25 (aminoácidos de proteína recombinante 53-324 de HA de virus de las Islas Solomon; SEQ ID NO: 665 preparada en células de insecto), o STF2.his6 recombinante (preparado en E. coli), a 1 μg/ml durante 15,5 a 17,5 horas a 4 ºC. Se diluyó IgG humana purificada (ABD Serotec, Raleigh, NC) 8 veces usando PBS 1X (EMD, Gibbstown NJ, 4 veces cada vez) comenzando a una concentración de 0,9 μg/ml y también se recubrió durante una noche.
Las placas se lavaron al día siguiente y se bloquearon con 300 μl de Superblock con T20 (Thermo, Hudson, NH)
30 durante 2 horas a 23-27 ºC. Se prepararon diluciones de sueros comenzando a una dilución 1:500 veces y terminando a una dilución 1:15.807 veces (diluciones 3,162 veces cada vez) por triplicado usando Superblock. Se diluyeron suero de control positivo y negativo 2500 veces usando Superblock. Las placas bloqueadas se lavaron 3X con PBS 1X/Tween 0,05 % (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) y se añadieron los sueros diluidos y controles a los pocillos recubiertos con HA1-1. Se añadió Superblock solo a pocillos recubiertos con IgG humana. Después de 2 horas de
35 incubación a 23-27 ºC, las placas se lavaron de nuevo y se incubaron con 100 μl de una dilución 1:5000 de anticuerpos anti IgG humano conjugados con HRP (Jackson Immuno Research Labs Inc., West Grove, PA) durante 40 a 45 minutos.
Las placas se lavaron tres veces y se añadieron 100 μl de sustrato TMB precalentado (Thermo, Hudson, NH) a los pocillos. Se permitió el desarrollo de color durante 4 minutos después de lo cual se añadieron 100 μl de H2SO4 1 M 40 (Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ) para detener la reacción. La DO a 450 nm se leyó a los 40 minutos de detener la reacción (SpectraMax 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). La concentración de anticuerpos IgG anti HA se determinó usando una curva logística de 4 parámetros (SoftMax Pro 5.2, Molecular Devices, Sunnyvale CA) generada a partir de los patrones de IgG humanos y sus DO resultantes. Los sueros que estaban altamente concentrados y fuera del rango de la curva patrón se repitieron en un ELISA alternativo usando diluciones que
45 variaban de 31.250 a 3.906.250.
Resultados
La Tabla 12 proporciona las características demográficas de los sujetos que participaron en la Parte 1 del estudio. Los grupos están bien equilibrados con respecto a edad, sexo y raza-etnia.
Tabla 12: características demográficas La Tabla 13 describe el perfil de seguridad para cada grupo de dosis de Parte 1. Los síntomas se dividen en síntomas locales que son síntomas en el sitio de inyección, tales como dolor, enrojecimiento o hinchazón y síntomas sistémicos, tales como cefalea, fatiga, dolor de las articulaciones, dolores musculares, escalofríos y sudores. La proteína de fusión se toleró bien por casi todos los sujetos. Los sujetos en el grupo de 5 μg y 8 μg tuvieron un aumento en el dolor moderado de los brazos. Hubo dos sujetos que tuvieron síntomas sistémicos graves, uno en el grupo de 2 μg, que parecían no relacionados con VAX 125 y uno en el grupo de 3 μg que comenzaron 2 horas después de la vacunación de VAX125 y duraron aproximadamente 2-3 horas.
Grupo
Dosis n.º de sujetos Edad media Intervalo de edad Hombres Mujeres
1
0,1 8 34,5 23-45 2 6
2
0,3 8 33 22-46 3 5
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Grupo
Dosis n.º de sujetos Edad media Intervalo de edad Hombres Mujeres
3
1 8 30 19-46 4 4
4
2 8 37,4 22-49 3 5
5
3 8 37 25-43 3
5
6
5 8 32,4 19-45 4 4
7
8 8 37,6 25-48 1
7
Tabla 13: reactogenicidad local y sistémica presentada después de administración de VAX125
Dosis (μg)
n.º de sujetos n.º de sujetos con dolor de los brazos n.º de sujetos con síntomas sistémicos
Ninguno
Suave Moderado Ninguno Suave Moderado Grave
0,1
8 6 2 0 8 0 0 0
0,3
8 5 3 0 7 1 0 0
1
8 4 3 1 8 0 0 0
2
8 2 5 1 6 1 0 1a
3
8 5 3 0 7 0 0 1b
5
8 1 2 5 7 1 0 0
8
8
1 2 5 6 2 0 0
10
a.
Fatiga grave presentada el día 7 no relacionada con la administración de VAX125.
b.
Aparición de síndrome sistémico grave 2 horas después de la administración de VAX125 con fiebre (38,61 ºC), escalofríos graves, mialgias, malestar, náusea leve sin vómitos. Los síntomas duraron aproximadamente 2-3 horas.
Se muestra en la Tabla 14 un compendio de los títulos de medias geométricas de IHA por dosis y factor de aumento
15 en la Parte 1 del estudio. Se observaron títulos de IHA significativos el día 0, que reflejan más probablemente una población de reclutamiento, muchos de los cuales se pueden haber vacunado contra gripe en años recientes. Todos los participantes con VAX125 mostraron un aumento en la media geométrica del título de inhibición de la hemaglutinación (IHA MGT) los días 14 y 28, aunque el factor de aumento fue menor de 4 para los niveles de dosis de 0,1 μg y 0,3 μg.
20 Tabla 14: media geométrica de títulos y factor de aumento medio para cada grupo de dosis
IHA MGT Factor de aumento
Dosis (μg) Día 0 Día 14 Día 28 D14/d0 D28/d0 0,1 87 123 174 1,4 2,0 0,3 113 293 381 2,6 3,4 1 160 698 905 4,4 5,7
imagen134
IHA MGT Factor de aumento
Dosis (μg) Día 0 Día 14 Día 28 D14/d0 D28/d0 2 95 587 587 6,2 6,2 3 174 987 640 5,7 3,7 5 62 1.522 1.174 24,7 19,0 8 40 320 349 8,0 8,7
En la Tabla 15, los 7 grupos de dosis de la Parte 1 se combinaron en 3 que representaban grupos de dosis baja, media y alta. La proteína C reactiva (CRP) se mide 1 día después de la administración de la proteína de fusión y es indicativa de respuesta de citocina (IL-6). Debido a la variación en la preadministración de títulos de IHA de VAX 125 5 el factor de aumento puede ser más útil como una medida de la respuesta inmunitaria. La seroconversión se definió como un aumento cuádruple del título y la seroprotección se define como el título postadministración mínimo de 40. Usando este método de análisis, los grupos de dosis baja tienen un aumento de CRP bajo y un aumento bajo de seroconversión. Debido a los títulos de IHA preadministración, sin embargo, hubo 100 % de seroprotección. En la dosis tanto medias como altas, los niveles de CRP aumentan así como los MGT de IHA. En el grupo de nivel medio,
10 la seroconversión aumentó al 50 %, y en el grupo de dosis alta la tasa de seroconversión fue del 75 %. Las tasas de seroprotección fueron de 100 y 94 % en los grupos de dosis media y alta, respectivamente.
Tabla 15: títulos de MGT de IHA y factor de aumento y tasas de seroconversión (SC) y seroprotección después de la administración de VAX 125
Dosis baja (0,10,3 μg)
Dosis media (1-3 μg) Dosis alta (5-8 μg)
n=16
n=24
n=16
Proteína C reactiva
1,8 5,2 10,2
IHA-pre MGT
99 138 50
IHA-post MGT
258 698 640
Factor de aumento de IHA
2,6 5 13
Seroconversión (n, %)
4 (31 %) 12 (50 %) 12 (75 %)
Seroprotección (n, %)
16 (100 %) 24 (100 %) 15 (94 %)
15 Los resultados de la Parte 2 del estudio se resumen en la Tabla 16. En este caso, la serorrespuesta se define como un aumento al menos cuádruple con una postadministración mínima del título de proteína de fusión de 40. Como se esperaba, no se vio ningún aumento en los títulos de IHA en el grupo de placebo mientras que los grupos de 1 y 2 μg tuvieron aumentos apreciables tanto en serorrespuesta (50 y 81 % respectivamente) como en seroprotección (75 y 100 %, respectivamente).
20 Tabla 16: VAX125-01: Fase I, Parte 2
MGT, tasas de serorrespuesta (SR) y seroprotección (SP) *Serorrespuesta: aumento del título de anticuerpo de IHA al menos cuádruple con un título postadministración mínimo de 40
Punto
Control 1 μg 2 μg
temporal
n=16 n=16 n=16
Día 0
91 108 62
MGT
Día 14 87 494 795
Día 28
84 473 761
MGT
día 14 1 4,6 12,9
imagen135
Punto
Control 1 μg 2 μg
temporal
n=16 n=16 n=16
MFR
día 28 1 4,4 12,3
SR* (%)
0 8 (50) 13 (81)
SP** (%)
0 de 2 3 de 4 (75) 5 de 5 (100)
**Seroprotección: consecución de un título de IHA postadministración mínimo de 40 entre sujetos con títulos preadministración de <40
5 Además del ensayo de IHA, se realizaron ensayos de microneutralización y ELISA. Como se muestra en la Figura 36 para sujetos de Parte 1, los resultados del ensayo de microneutralización son comparables con los resultados de IHA: se observaron títulos preadministración significativos (D0) pero las dosis de VAX125 de 0,3 μg a 8 μg provocaron aumentos en los títulos de microneutralización el día 28 (D28). Como se muestra en las Figuras 37A y B, para sujetos de la Parte 2, IgG específico anti HA, que era medible antes de la administración de la proteína de
10 fusión, aumentó de los días 0 a 7, y alcanzó un nivel estable el día 14. IgG anti flagelina comenzó a una concentración menor pero aumentó con cinética similar a la respuesta anti HA.
Conclusiones
VAX 125 fue altamente inmunogénico después de una única dosis intramuscular a dosis que variaron de 0,1 μg a 8 μg. Las dosis en el intervalo de 1 μg a 3 μg produjeron respuestas inmunitarias comparables a o mejores que el
15 antígeno convencional proporcionado a dosis de 15 μg. Estos datos muestran que la proteína de cabeza globular de HA de la gripe puede expresarse en E. coli y cuando se fusiona con flagelina es altamente inmunogénica. Una persona en el grupo de 3 μg tuvo un efecto secundario sistémico indicativo de liberación de citocina, que puede ser una consecuencia de la estimulación de TLR5 del sistema inmunitario innato.
Se vieron aumentos apreciables en el título de IHA, microneutralización e IgG específico de HA a todas las dosis a o
20 por encima de 1 μg. También se vieron aumentos a 0,1 μg y 0,3 μg pero aunque los títulos preadministración medibles podrían tener la tasa de seroconversión reducida, el 100 % de los sujetos estaban seroprotegidos a estas dosis.
SEQ ID NO: 660 Secuencia de aminoácidos de STF2.HA1 (SI) SEQ ID NO: 661 STF2
imagen136
imagen137
imagen138
E
SEQ ID NO: 663 secuencia de aminoácidos de STF2.his6
imagen139
SEQ ID NO: 662 secuencia de aminoácidos de HA1-1 (SI)
imagen140
SEQ ID NO: 665 secuencia de aminoácidos de HA (SI)
imagen141
EJEMPLO 9: ADMINISTRACIÓN DE STF2.4XM2E EN SERES HUMANOS -INTERVALO DE DOSIS Y VÍAS DE ADMINISTRACIÓN.
Para determinar la seguridad de inmunogenicidad de STF2.4xM2e (SEQ ID NO: 664) en tampón F105 (Tris 10 mM,
5 L-histidina 10 mM, sacarosa 5 % (p/p), NaCl 75 mM, polisorbato 80 0,02 % (p/p), EDTA 0,1 mM, etanol 0,41 % (p/p) a pH 7,2) se realizaron ensayos clínicos de Fase I. La proteína de fusión STF2.4xM2e en tampón F105 es una composición denominada en la presente memoria “VAX1022”. Se admitieron ciento cincuenta y seis (156) sujetos de 18-49 años de edad en ensayos multicentro, con doble ocultación, aleatorios, controlados por placebo, para evaluar dosis de VAX102 que variaban de 0,03 a 10 μg.
10 Se administró VAX102 y placebo por vía intramuscular (i.m.), por vía subcutánea (s.c.) o por vía intradérmica (i.d.) a los 0 y 28 días. Tuvieron lugar evaluaciones de seguridad clínica y de laboratorio 1 y 7 días después de la inmunización. Se evaluaron las respuestas inmunitarias a M2e y flagelina por ELISA a los 7, 14 y 28, 35, 42, 60, 120 y 180 días después de cada dosis. La seroconversión se definió como un valor de anticuerpo IgG anti M2e en suero mayor de o igual a 0,174 μg/ml y un aumento cuádruple en el título.
15 Materiales y métodos
Diseño del estudio
Se realizaron tres estudios para evaluar la seguridad, tolerabilidad e inmunogenicidad de VAX102. El primer estudio clínico de Fase I (denominado en la presente memoria “VAX102-01”) se realizó con dosis de 0,3 μg, 1,0 μg, 3,0 μg y 10 μg administradas i.m. El segundo estudio clínico de Fase I (denominado en la presente memoria “VAX102-02”)
20 se realizó con dosis de 0,03 μg y 0,1 μg bien i.m. o bien i.d. Un tercer estudio clínico de Fase I (denominado en la presente memoria “VAX102-03”) se realizó con dosis de 0,3 μg (i.m., s.c. o i.d.), 1 μg (i.m., s.c. o i.d.) y 2 μg (i.m. o s.c.). Los ensayos se registraron con el número de ClinicalTrials.gov NCT00603811.
Participantes en el estudio
Los sujetos fueron de 18-49 años de edad y estaban sanos como se determinó por historial médico, examen físico
25 exploratorio y análisis de laboratorio exploratorio. Los principales criterios de exclusión incluyeron historial de afección médica activa o presencia de resultados de laboratorio exploratorios anómalos, respuesta inmunitaria alterada por cualquier razón, infección de gripe documentada en los 6 meses previos, recepción reciente de vacuna no del estudio, o alergia a los componentes de la composición.
Procedimientos
30 En el primer estudio, los participantes se asignaron aleatoriamente para recibir 2 dosis de VAX102 o placebo en una relación de 3 receptores de VAX102 frente a 1 receptor de placebo. Se prepararon materiales del estudio por farmacéuticos sin ocultación y se proporcionaron a personal clínico con ocultación. Los participantes en el estudio recibieron el VAX102/placebo de apariencia idéntica por inyección intramuscular en el músculo deltoides del brazo no dominante. Los participantes mantuvieron un diario después de cada dosis de VAX102, y durante 6 días a
35 continuación, en donde registraron reacciones locales y sistémicas solicitadas clasificadas como ninguna, leve, moderada o grave. Las reacciones adversas se evaluaron por los participantes en el estudio usando una escala de 4 puntos (0-3). Las reacciones locales solicitadas fueron rojez, hinchazón o induración, dolor y equimosis. Las reacciones sistémicas solicitadas fueron fiebre, cefalea, dolor de las articulaciones, fatiga, dolores musculares, escalofríos y aumento de la sudoración.
40 Los sujetos volvieron a la clínica para observaciones de seguridad los días 1 y 7 después de cada administración de VAX102 para un examen físico breve, revisión del diario y evaluación de laboratorio. Se realizaron evaluaciones de laboratorio de seguridad adicionales los días 14, 28, 42, 60, 120 y 180. Los análisis de laboratorio incluyeron CBC, BUN, Creatinina, análisis de orina y ensayos de la función hepática. Se realizaron ensayos de proteína C reactiva (CRP) el día 0 (antes de la vacunación y 4 horas después de la vacunación) y 1,28 (antes de la vacunación y 4 horas después de la vacunación) y 29 días para todos los individuos del estudio con la excepción de los del grupo de dosis de 10 μg. El día 0 es el día en que se administró la composición de VAX102 o placebo. Se realizaron ensayos de respuestas de IgG a M2e y flagelina en sueros recogidos los días 0, 7, 14, 28, 35, 42, 60, 120 y 180 después de
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5 la vacunación.
Procedimientos de aumento de dosis (Estudio 1)
Al final de cada cohorte de dosis el comité de supervisión de seguridad revisó los datos de seguridad proporcionados por el equipo de control de datos (Veristat, Inc, MA). El protocolo se diseñó inicialmente con la dosis de 10 μg como la primera dosis. Se encontraron altos niveles de reactogenicidad en varios sujetos después de la 10 primera dosis de VAX102 a este nivel y el estudio se detuvo hasta que estuvieron disponibles los resultados de inmunogenicidad. Se realizaron ensayos de CRP el día 1 después de VAX102 cuando fue posible una vez que se identificó la reactogenicidad. Respuestas inmunitarias favorables condujeron al rediseño del protocolo para examinar dosis menores que variaron de 0,3 a 3 μg. El protocolo revisado se modificó para proporcionar un periodo de observación en el sitio de 4 horas después de la primera dosis de VAX102 y seguimiento en la clínica el día 1 y día
15 29 para evaluación de seguridad y CRP. Los datos con respecto a reactogenicidad y el rediseño del protocolo se revisaron y se aprobaron por un comité de supervisión de Datos y Seguridad independiente y los comités de revisión institucionales respectivos.
Dentro de cada grupo de dosis, tras completar los diarios de 7 días y los laboratorios de seguridad los días 1, 7 y 14, los datos se revisaron por el comité de supervisión de seguridad. Este comité estaba comprendido por
20 investigadores principales de cada sitio, el oficial médico del patrocinador y un monitor de seguridad independiente. Todas las decisiones con respecto al aumento de dosis se determinaron por acuerdo de los miembros de este comité.
Tras completar la parte de aumento de dosis del estudio inicial, el protocolo permitió la inclusión de 16 sujetos adicionales a la dosis que se determinó que tenía seguridad e inmunogenicidad óptimas.
25 Estudio 2
Después de las visitas del día 60 en el estudio 1, se admitieron dos grupos de 8 sujetos en un segundo estudio y se les administraron dosis de 0,03 y 0,1 μg proporcionadas por vía intramuscular o por vía intradérmica. Las actividades de estudio adicionales fueron similares a las del Estudio 1, con la excepción de que no hubo ocultación y ningún individuo recibió placebo.
30 Estudio 3
Se admitieron ocho grupos de 8 sujetos en un tercer estudio en donde se administraron dosis de 0,3, 1 y 2 μg por vía intramuscular, por vía subcutánea o por vía intradérmica. Los procedimientos de estudio en este tercer estudio fueron como se ha perfilado anteriormente con respecto a criterios de inclusión y exclusión. Otras actividades de estudio fueron similares a las de los Estudios 1 y 2, con la excepción de que no hubo ninguna ocultación y ningún
35 individuo recibió placebo.
La composición administrada a seres humanos
STF2.4xM2e (Hu) (SEQ ID NO: 664) consiste en cuatro repeticiones en tándem del ectodominio de la proteína de matriz del virus de la gripe A M2 (M2e) fusionado con el extremo C terminal de la secuencia de longitud completa de fljB de Salmonella typhimurium (un ligando de TLR5). El gen de STF2.4xM2e (Hu) (SEQ ID NO: A) codifica un resto 40 de metionina N terminal que se escindió proteolíticamente tras la expresión en E. coli. STF2.4xM2e (Hu) intacto, como se purificó a partir de E. coli, contiene 610 restos de aminoácidos con una masa molecular de 64.077 Dalton. La secuencia de aminoácidos de STF2.4xM2e (Hu) se muestra en SEQ ID NO: A). Se usó un plásmido que codificaba este producto (PET/STF2.4xM2e) bajo control del operón lac para transformar la cepa de E. coli BLR (DE3) (Novagen-EMD, San Diego, CA). Se cultivaron bacterias recombinantes en un medio sintético y proteína
45 inducida usando IPTG. El material se purificó en condiciones de GMP usando métodos convencionales de cromatografía (Avecia, Billingham, Reino Unido). Este material se formuló en tampón F105 (Tris 10 mM, L-histidina 10 mM, sacarosa 5 % (p/p), NaCl 75 mM, polisorbato 80 0,02 % (p/p), EDTA 0,1 mM, etanol 0,41 % (p/p) a pH 7,2) y se administró a sujetos humanos en una serie de ensayos clínicos.
ELISA clínico de M2e
50 Para la realización del ELISA clínico de M2e, se comparó la unión de muestras de suero humano a placas recubiertas con M2e con una curva patrón de IgG policlonal humano. La curva se ajustó usando una ecuación logística de 4 parámetros en Softmax Pro 5.2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se procesaron sueros de control positivos y negativos agrupados en cada placa. Los resultados de suero objeto y de control se convirtieron de valores de DO a IgG específico de M2e usando la curva patrón y ajustando con respecto a dilución. Los criterios de
55 aprobado/suspenso para cada ensayo se establecieron basándose tanto en el rendimiento de curva patrón como en los resultados ajustados del suero positivo y negativo.
imagen143
El IgG humano (ABD Serotec, Oxford, Reino Unido) se unió a placas (Immunlon 4 HBX Extra high binding, Thermo, Hudson, NH) a diluciones cuádruples comenzando a 3,6 μg/ml. El péptido M2e fue idéntico a la secuencia usada en el VAX102 STF2.4xM2e (SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDP; SEQ ID NO: 666, Princeton Biomolecules, Langhome, PA). Este péptido se usó para recubrir la placa a 2 μg/ml.
5 Después de incubación durante una noche a 2-8 ºC, las placas se lavaron y se bloquearon (Pierce Superblock con Tween 20, Thermo, Hudson, NH). Se prepararon diluciones de suero objeto en una placa separada y se transfirieron a placas recubiertas con M2e. Después de incubación y lavado, las placas se desarrollaron con anti IgG humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP-Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), sustrato de TMB (Pierce One Step, Thermo, Hudson, NH) y solución de interrupción de H2SO4 (Mallinckrodt Baker,
10 Phillipsburg, NJ). Las placas se leyeron a 450 nm. Los resultados ajustados se calcularon para cada sujeto y fecha de sangrado. Una muestra se consideró positiva si su resultado ajustado fue > 0,174 μg/ml.
ELISA clínico de STF2
Para el rendimiento del ELISA clínico de STF2, se comparó la unión de muestras de suero humano a placas recubiertas con STF2 con una curva patrón de IgG policlonal humano. La curva se ajustó usando una ecuación
15 logística de 4 parámetros en Softmax Pro 5.2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se procesaron sueros de control positivos agrupados en cada placa. Los resultados de suero objeto y de control se convirtieron de valores de DO a IgG específico de STF2 usando la curva patrón y ajustando con respecto a dilución. Los criterios de aprobado/suspenso para cada ensayo se establecieron basándose tanto en el rendimiento de curva patrón como en los resultados ajustados del suero positivo.
20 El IgG humano (ABD Serotec, Oxford, Reino Unido) se unió a placas (Immunlon 4 HBX Extra high binding, Thermo, Hudson, NH) a diluciones cuádruples comenzando a 3,6 μg/ml. La proteína STF2 fue idéntica a la secuencia usada en el VAX102 STF2.4xM2e (STF2.4xM2e). Esta proteína se usó para recubrir la placa a 1 μg/ml.
Después de incubación de una noche a 2-8 ºC, las placas se lavaron y bloquearon (Pierce Superblock con Tween 20, Thermo, Hudson, NH). Se prepararon diluciones de suero objeto en una placa separada y se transfirieron a
25 placas recubiertas con STF2. Después de incubación y lavado, las placas se desarrollaron con anti IgG humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP-Jackson ImmunResearch, West Grove, PA), sustrato de TMB (Pierce One Step, Thermo, Hudson, NH) y solución de interrupción de H2SO4 (Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ). Las placas se leyeron a 450 nm. Los resultados ajustados se calcularon para cada sujeto y fecha de sangrado.
Se realizaron análisis estadísticos al nivel de significación de dos lados de α = 0,05 a no ser que se indique de otro
30 modo. Se agruparon sujetos tratados placebo de todos los grupos de dosis y sujetos con VAX102 que recibieron la misma dosis para efectuar compendios y análisis. No se realizó ningún ajuste para ensayos estadísticos múltiples. Todos los programas para emisión de datos y análisis se escribieron en SAS® versión 9.1 (SAS Institute, Cary, NC).
Los análisis de seguridad y tolerabilidad incluyeron todos los sujetos de ambos estudios e incluyeron estadística descriptiva. Se usaron ensayos de chi cuadrado para datos categóricos y análisis de varianza para datos continuos
35 para determinar las diferencias en las características de línea basal. La frecuencia de anomalías en el sitio de vacunación; incidencia de AA locales y sistémicos y su relación con el fármaco del estudio; y los cambios en los resultados de laboratorio clínico, señales vitales y hallazgos de examen físico fueron las principales medidas de seguridad. Se compararon las tasas de reacciones usando métodos exactos de Fisher y de Cochran Mantal-Haenszel.
40 Serología: se establecieron curvas de valoración de anticuerpos IgG específicos de M2e en cada punto temporal. Se usaron análisis de medias de mínimos cuadráticos para distinguir diferencias significativas en los títulos de anticuerpo. Todos los análisis se basaron en una cohorte según el protocolo con análisis adicionales realizados para la cohorte de intención de tratar (ITT). La cohorte según protocolo se definió como todos los voluntarios que completaron 2 inmunizaciones. La población de inmunogenicidad primaria consistió en todos los sujetos que
45 recibieron ambas dosis de tratamiento de estudio y que tuvieron títulos de anticuerpos anti M2e en suero de línea basal y día 60 para el estudio 1 y día 42 para el estudio 2. La seroconversión se definió como un valor de M2e mayor de o igual a 0,174 y un aumento cuádruple en el título. Se determinaron las medias geométricas para cada dosis y punto temporal. Se evaluaron las tasas de seroconversión usando un modelo de regresión logística.
Resultados
50 Se admitió un total de 156 individuos en estudios clínicos de Fase I 1, 2 y 3. En el estudio 1, se seleccionaron aleatoriamente 60 sujetos para recibir VAX102 a dosis de 0,3, 1,0, 3 y 10 μg (n = 44) o placebo (n = 16), por inyección i.m. En el estudio 2, se incluyeron 32 sujetos para recibir 0,03 o 0,1 μg de VAX102 proporcionado i.m. o
i.d. En el estudio 3, se incluyeron 64 sujetos para recibir 0,3, 1 o 2 μg de VAX102 i.m. o s.c. y 0,3 o 1 μg i.d. Dieciséis
(16) individuos en el estudio 1 no recibieron la dosis de refuerzo de VAX102, debido al cambio en el diseño de
55 protocolo después de AA a la dosis de 10 μg. Las características de línea basal de los sujetos en los Estudios 1 y 2 se muestran en la Tabla 17. La edad media fue de 31,7 años, las mujeres representaron el 59 % de los sujetos y la raza blanca representó el 78 % de los sujetos. En el estudio 1 los sujetos se admitieron en dos sitios clínicos, el sitio en Kansas admitió al 68 % de los sujetos. Todos los sujetos se admitieron en el sitio clínico en Kansas en los estudios 2 y 3.
imagen144
Tabla 17: características de línea basal de sujetos de estudio en VAX102-01/102-02 por grupo de dosis, expresado como número (%)
Placebo
0,03 μg 0,1 μg 0,3 μg 1 μg 3 μg 10 μg Total
(n=16)
(n=8) (n=8) (n=6) (n=18) (n=6) (n=14) 76
Edad 1 (media)
32,8 35,4 35,0 28,7 32 32,7 26,8 30,7
Hombres 2
5 (31) 4 (50) 3 (37,5) 2 (33) 8 (44) 4 (67) 5 (36) 31 (41)
Mujeres
11 (69) 4 (50) 5 (62,5) 4 (67) 10 (56) 2 (33) 9 (64) 45 (59)
Blancos 2
12 (75) 7 (87,5) 6 (75) 4 (67) 15 (83) 5 (83) 11 (79) 60 (79)
Negros
3 (19) 1 (12,5) 1 (12,5) 2 (33) 1 (6) 1 (27) 3 (21) 12 (16)
Otros
1 (6) 0 1 (12,5) 0 2 (11) 0 0 4 (5)
1 NS basado en análisis de varianza
2 NS basado en ensayo de chi cuadrado
5 Seguridad de VAX102
VAX102 a dosis de 0,03 μg, 0,1 μg, 0,3 μg y 1 μg se toleró bien en todos los sujetos cuando se proporcionó i.m., s.c.
o i.d. Adicionalmente, dosis de 2 μg de VAX102 se toleraron bien cuando se proporcionaron s.c. Como se muestra en la Tabla 18A para sujetos a los que se proporcionaron dosis i.m. en los Estudios 1 y 2, VAX102 a dosis mayores se asoció con niveles mayores de reactogenicidad que eran estadísticamente significativas (p <0,05) después de la
10 primera dosis. No se vio reactogenicidad significativa después del refuerzo (Tabla 18B). No hubo ningún acontecimiento adverso grave durante el periodo de estudio en ningún individuo a ninguna dosis.
Tabla 18A: síntomas locales y sistémicos después de la primera dosis de VAX102-01/102-02 o placebo 1 Local: dolor en el sitio de inyección, rojez, magulladura o induración 2 Sistémico: cefalea, fatiga, dolor de las articulaciones, dolores musculares, escalofríos y sudores
Dosis
Placebo 0,03 μg 0,1 μg 0,3 μg 1 μg 3 μg 10 μg
n=16
n=8 n=8 n=6 n=18 n=6 n=14
Local1
Ninguno
11 (69) 2(25) 2(25) 1(17) 3(17) 0 0
Leve
5(31) 3 (37,5) 3 (37,5) 2(33) 10 (56) 3 (50) 5 (36)
Moderado
0 3 (37,5) 3 (37,5) 3 (50) 5(28) 3 (50) 8(57)
Grave
0 0 0 0 0 0 1(7)
Sistémico2
Ninguno
9(56) 6(75) 4(50) 4(67) 6(33) 2(33) 0
Leve
4(25) 2(25) 4(50) 2(33) 9(50) 0 2(14)
imagen145
Dosis Placebo 0,03 μg 0,1 μg 0,3 μg 1 μg n=16 n=8 n=8 n=6 n=18
3 μg n=6 10 μg n=14
Moderado 2(13) 0 0 0 3(17) Grave 1(6) 0 0 0 0
4(67) 0 6(43) 6(43)
Tabla 18B: síntomas locales y sistémicos después de la segunda dosis de VAX102-01/102-02 o placebo
Dosis
Placebo 0,03 μg 0,1 μg 0,3 μg 1 μg 3 μg 10 μg
n=11
n=8 N=8 n=6 n=18 n=6 n=3
Local
Ninguno
10 (91) 2 (25) 5 (37,5) 5 (83) 13 (72) 4 (67) 1 (33)
Leve
1 (9) 6 (75) 2 (25) 1 (17) 5 (28) 2 (33) 2 (67)
Moderado
0 0 1 (12,5) 0 0 0 0
Grave
0 0 0 0 0 0 0
Sistémico
Ninguno
11 (100) 7 (87,5) 6 5 (83) 14 (78) 5 (83) 2 (67)
Leve
0 0 1 (12,5) 0 4 (22) 1 (17) 1 (33)
Moderado
0 1 (12,5) 0 1 (17) 0 0 0
Grave
0 0 1 (12,5) 0 0 0 0
Formulaciones de dosis de 0,03, 0,1, 0,3 y 1 μg
5 Las tasas y gravedades de reacciones locales y sistémicas presentadas por los sujetos del estudio a los que se administraron dosis i.m. en los Estudios 1 y 2 se muestran en las Tablas 18A para la primera dosis y Tabla 18B para la segunda dosis. Las Tablas 18A y 18B representan el mayor nivel de gravedad del síntoma en cada categoría presentado por un sujeto. Después de la primera dosis, los síntomas locales se clasificaron predominantemente como leves a moderados durante el periodo de observación de 7 días después de la vacunación. Los síntomas
10 locales se resolvieron en 1 o 2 días después de la vacunación. Cefalea leve, fatiga o dolores musculares fueron los síntomas sistémicos más comunes y fueron similares en frecuencia a los presentados en el grupo de placebo durante el periodo de observación de 7 días después de la vacunación. Todos los síntomas sistémicos se resolvieron en un periodo de 12-18 horas después de VAX102. Se presentaron síntomas locales y sistémicos más frecuentemente después de la primera dosis que la segunda proporcionada en el mismo brazo 28 días después
15 (Tablas 18A y 18B). Se vieron perfiles de reactogenicidad similares después de la primera dosis por administración intradérmica en el Estudio 3 como se muestra en la Tabla 18C.
imagen146
Tabla 18C: síntomas locales y sistémicos después de inyección intradérmica de VAX102
Dosis 1, 0,3 μg Gravedad del síntoma
Dosis 1, 1,0 μg Gravedad del síntoma
Ninguno Leve Moderado
Ninguno Leve Moderado
Temperatura > 37,78 ºC
8 0 0 8 0 0
Rojez
5 3 (38) 0 2 6 (75) 0
Hinchazón
8 0 0 4 4 (50) 0
Magulladura
8 0 0 8 0 0
Dolor en el brazo
1 6 (75) 1 (13) 1 6 (75) 1 (13)
Cefalea
7 1 (13) 0 4 2 (25) 2 (25)
Fatiga
5 3 0 3 3 2 (25)
Dolor de las articulaciones
7 1 (13) 0 7 1 (13) 0
Dolores musculares
6 2 (25) 0 7 0 1 (13)
Escalofríos
8 0 0 8 0 0
Sudoración
8 0 0 8 0 0
Formulaciones de dosis de 3 y 10 μg
La vacunación con dosis a 3 y 10 μg se asoció con mayores niveles de síntomas locales y sistémicos después de la
5 primera dosis. Un sujeto en el grupo de 10 μg indicó reacción local grave y más de la mitad de cada grupo de dosis indicó reacciones locales moderadas (Tabla 18A). Cuatro de 6 sujetos en el grupo de 3 μg presentó síntomas sistémicos moderados con una aparición de 6 a 8 horas después de la inoculación y se resolvieron en un periodo de 12-18 horas. En el grupo de 10 μg, aparecieron síntomas sistémicos, consistentes en cefalea, dolores musculares, fatiga y escalofríos, aproximadamente 2 horas después de la inyección y disminuyeron en 4 a 5 horas, describiendo
10 6 de los 14 sujetos los síntomas como graves (Tabla 18A). Por el contrario, la segunda dosis se toleró bien en los 6 sujetos que recibieron la dosis de 3 μg y 3 sujetos que recibieron la dosis de 10 μg.
Estudios de seguridad de laboratorio
Los niveles de CRP demostraron una elevación relacionada con la dosis el día 1 (datos de Estudios 1 y 2 i.m. mostrados en la Tabla 19). En el grupo de 3 μg, la CRP promedio fue de 2,7 mg/dl (intervalo de 0,5 a 5,8). En el 15 grupo de 10 μg no se obtuvieron CRP de forma rutinaria el día después de la inyección, sin embargo se obtuvieron CRP de 6 sujetos como parte de una evaluación de reactogenicidad sistémica de moderada a grave el día 1. En este grupo, la CRP media fue de 6,4 (intervalo de 3,9 a 12,5 mg/dl). Tres sujetos en el grupo de 10 μg tuvieron recuentos de glóbulos blancos elevados con desplazamiento a la izquierda y uno tuvo ensayos de función hepática elevada después de la primera dosis (datos no mostrados). A las dosis menores de 0,03 μg y 0,1 μg proporcionadas i.d.,
20 solamente se vieron niveles de línea basal de CRP (Tabla 19B). Se indujeron niveles de CRP similares por inyecciones i.m. o s.c. de 0,3 μg, 1 μg y 2 μg o inyección i.d. de 0,3 μg o 1 μg de VAX102 en el Estudio 3 (Tabla 21).
Tabla 19A: proteína C reactiva (valor medio en mg/dl) antes y después de vacunación i.m. con VAX102-01/102-02
Dosis
Número de Primera dosis Segunda dosis
(μg)
sujetos
Día 0 Día 1
Día 28 Día 29
Placebo
10 0,3 0,3 0,3 0,3
0,03
8 0,2 0,2 0,2 0,2
imagen147
Dosis
Número de Primera dosis Segunda dosis
(μg)
sujetos
Día 0 Día 1
Día 28 Día 29
0,1
8 0,2 0,3 0,3 0,3
0,3
6 0,2 0,6 0,2 0,2
1
18 0,3 1,2 0,6 0,6
3
6 0,2 2,7 0,2 0,3
Tabla 19B: proteína C reactiva (valor medio en mg/dl) antes y después de vacunación i.d. con VAX102-01/102-02
Dosis (μg)
Número de sujetos Primera dosis Día 0 Día 1 Segunda dosis Día 28 Día 29
0,03
8 0,2 0,3 0,3 0,3
0,1
8 0,3 0,3 0,3 0,3
Respuesta inmunitaria
5 La media geométrica relacionada con la dosis de respuestas de anticuerpos de suero IgG a vacunación i.m. para M2e y flagelina en los Estudios 1 y 2 se resumen en la Tabla 20A. El día 0 el título del anticuerpo de M2e era apenas detectable. Todos los sujetos vacunados mostraron algún grado de respuesta de anticuerpo M2e, con un aumento más que cuádruple observado en todos los grupos a los 14 días después de la segunda dosis de VAX102. Como se muestra en las Figuras 28A y 28B, se vieron respuestas de IgG a M2e rápidas en muchos sujetos de 7 a 14 días
10 después de la sensibilización con dosis de 0,3 μg y 1 μg. Particularmente a la dosis menor, la respuesta a dosis a la primera dosis fue más variable que la segunda. Los sujetos que recibieron una dosis de VAX102 de 1 μg mostraron una respuesta de refuerzo a la dosis administrada el día 28 (Figura 28B).
Tabla 20A: tasas de seroconversión de M2e* después de las primera y segunda dosis y media geométrica de las concentraciones de anticuerpo de M2e y flagelina (μg/ml) en la línea basal, los días 14 y 42 por grupo de dosis, i.m.
15 VAX102-01/102-02
Dosis (μg)
n.º de sujetos Tasas de seroconversión 1ª dosis 2ª dosis n (%) n (%)
Placebo 0,03 0,1 0,3
16 8 8 6 0(0) 0(0) 1(13) 3 (38) 5 (63) 6 (75) 5 (83) 5 (83)
1 3 10
18 6 14 13 (72) 18 (100) 5 (83) 6 (100) 12 (86) 3 (100)
imagen148
Dosis (μg)
n.º de sujetos Media geométrica de la concentración de anticuerpo IgG en suero anti M2e IgG en suero anti flagelina Día 0 Día 14 Día 42 Día 0 Día 14 Día 42
Placebo 0,03 0,1 0,3 1 3 10
16 8 8 6 18 6 14 0,01 0,01 0,02 0,3 0,4 0,2 0,04 0,08 0,18 0,9 4,4 4,4 0,02 0,18 0,36 0,4 9,4 8,9 0,02 0,99 1,1 0,2 24,7 12,5 0,01 0,36 1,7 0,1 16,9 16,9 0,01 0,48 2,8 0,1 38,2 28,8 0,03 0,66 2,8 0,5 40,8 60,8
* definido como un nivel ≥0,174 μg/ml y un aumento cuádruple en la concentración de anticuerpo
La respuesta de anticuerpo después de la dosis de refuerzo mostró una respuesta de anticuerpos IgG a M2e relacionada con dosis uniforme (Tabla 20A y Figura 29). La diferencia en la media geométrica entre todos los grupos 5 fue estadísticamente significativa después del día 28 (p <0,05). Las comparaciones por pares con el grupo de placebo mostraron que todos los títulos para todas las dosis fueron mayores que el placebo el día 42 (p <0,0001). Como se muestra en la Figura 30, se observó un nivel estable en la curva de anticuerpo a las dos dosis mayores (3 y 10 μg). Los niveles de anticuerpos de M2e alcanzaron un máximo el día 42 (14 días después de la segunda dosis). Los niveles de anticuerpo de M2e aún estaban presentes el día 120 y día 180 a niveles que variaban de 0,1 a 0,2
10 μg/ml o aproximadamente 10 veces la concentración de anticuerpo en la línea basal (Figura 30). Como se ve en la Tabla 21 y las Figuras 31A-31C, IgG específico de M2e se eleva por encima de la línea basal después de inmunización con 0,3 μg o 1 μg por vías i.d., i.m. o s.c., así como inmunización i.m. y s.c. a 2 μg. Se ve un efecto de refuerzo significativo después del día 28.
Los niveles de anticuerpo de línea basal para flagelina estaban elevados en muchos sujetos en la línea basal y la
15 vacunación indujo una fuerte respuesta de anticuerpos relacionada con la dosis después de la primera dosis de VAX102 (Tablas 20A y 20B). La respuesta de IgG anti flagelina a la segunda dosis de VAX102 fue menos pronunciada que la observada para la respuesta de IgG a M2e.
Las tasas de seroconversión para administración i.m. se muestran en la Tabla 20A. La probabilidad de seroconversión aumentó con la dosis el día 42 (p <0,0001). De forma similar a los MGT, una respuesta a dosis se
20 observa a dosis ≥0,3 μg cuando el 80 % de los sujetos (35/44) demostraron seroconversión por esta definición después de la primera dosis y 97 % (32/33) se seroconvirtieron después de la segunda dosis. Se observaron tasas de seroconversión idénticas a 0,03 μg y 0,1 μg de dosis de refuerzo proporcionadas i.d. (Tabla 20B). Se observaron respuestas ligeramente mayores a refuerzo i.d. frente a i.m.
Tabla 20B: tasas de seroconversión de M2e* después de las primera y segunda dosis y media geométrica de las
25 concentraciones de anticuerpo de M2e y flagelina (μg/ml) a línea basal, los días 14 y 42 por el grupo de dosis i.d. VAX102-01/102-02
Tasas de seroconversión
Dosis
n.º de 1ª dosis 2ª dosis
(μg)
sujetos n (%) n (%)
0,03
8 1 (13) 6 (75)
0,1
8 5 (63) 8 (100)
imagen149
Dosis (μg)
n.º de sujetos Media geométrica de la concentración de anticuerpo IgG en suero anti M2e IgG en suero anti flagelina Día 0 Día 14 Día 42 Día 0 Día 14 Día 42
0,03 0,1
8 8 0,02 0,07 0,28 0,4 3,8 6,3 0,02 0,28 0,70 0,3 4,1 7,4
*definido como un nivel ≥0,174 μg/ml y un aumento cuádruple en la concentración de anticuerpo Tabla 21: anticuerpo de M2e y CRP
n.º de
Dosis GM CRP CRP
sujetos
Vía
(μg)
M2e (media) (veces)
8
IM 0,3 0,5 0,8 1,8
8
IM 1 1,3 0,8 3,1
6
IM 2 2,3 1,4 5,9
8
SC 0,3 0,7 0,4 1,8
8
SC 1 0,8 0,6 2,1
8
SC 2 1,9 0,8 3,2
8
ID 0,3 0,4 0,4 1,3
8
ID 1 1,8 0,7 2
Análisis
5 Una composición que incluye una proteína de fusión de flagelina y 4 copias de un ectodominio de M2 humano (SEQ ID NO: 664) induce una fuerte respuesta inmunitaria en seres humanos al ectodominio M2 de virus de la gripe A. El VAX102 fue seguro y se toleró bien a dosis menores de 3 μg. Los síntomas locales fueron habitualmente suaves. La frecuencia y gravedad de los síntomas sistémicos fueron comparables al placebo a dosis menores de 3 μg. A dosis de 3 y 10 μg, se observó un complejo de síntomas coherente con una respuesta de citocinas que se correlacionó
10 bien con la elevación de CRP y se resolvió completamente en un periodo de 24 horas. La flagelina, como otros agonistas de TLR, activa una respuesta de citocinas que se considera que es importante en la organización de respuestas inmunitarias adaptativas. La interleucina 6 (IL-6) es una de las primeras citocinas liberadas después de la estimulación del receptor TLR5 por flagelina. CRP es un reactivo de fase aguda que a su vez se estimula por la liberación de IL-6. El componente de flagelina de VAX102 indujo una respuesta de citocinas fuerte, pero corta, que
15 provocó los síntomas observados a las dosis de 3 y 10 μg. Debido a este perfil, se usaron dosis menores que estas para evaluación adicional. Como se esperaba, aunque M2e es un componente de virus de la gripe A en circulación, todos los sujetos mostraron títulos insignificantes de anticuerpo de M2e antes de la vacunación. Se demostró seroconversión en todos los sujetos vacunados después de la segunda vacunación a dosis de 1 μg y mayores.
La mayoría de las vacunas para uso en seres humanos son composiciones de virus o bacterias atenuados o
20 muertos. En general, las vacunas que incluyen proteínas purificadas, tales como una vacuna de la gripe, contienen proteínas HA purificadas de aproximadamente 45 μg por dosis (15 μg de cada una de tres cepas, por ejemplo la formulación de 2008-09 de Fluvirin® contiene 15 mg de cada uno de HA de A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Uruguay/716/2007 (H3N2), una cepa de tipo A/Brisbane/10/2007 y B/Florida/4/2006, Prospecto de producto Fluvirin®, enero 2008-2009.
25 Las vacunas de proteínas recombinantes por lo general no han tenido éxito, debido a la escasa inmunogenicidad de las proteínas aisladas en las composiciones. Existen en la actualidad dos enfermedades para las que existen vacunas proteicas recombinantes en los Estados Unidos, Hepatitis B (HBV) y papilomavirus humano (HPV). Ambas preparaciones forman partículas de tipo vírico y se suministran absorbidas en alumbre, que actúa como un adyuvante. Por ejemplo, la vacuna Engerix® se proporciona como una dosis de 10 μg de antígeno de superficie de
30 HBV adsorbido en 0,25 μg de alumbre (Prospecto de producto de Engerix® enero de 2007). Además, la vacuna de HPV Gardasil® que contiene 20 μg de proteína L1 de HPV 6, 40 μg de proteína L1 de HPV 11, 40 μg de proteína L1 de HPV 16 y 20 μg de proteína L1 de HPV 18 adsorbida en 0,225 mg de alumbre (prospecto del producto de Gardasil®, septiembre de 2008). Por lo tanto, es inesperado que STF2.4xM2e, que es una proteína recombinante altamente purificada, suministrada sin un adyuvante, induzca respuestas de anticuerpos específicos para M2e significativas a dosis iguales a o menores de aproximadamente 1 μg.
imagen150
Secuencia de aminoácidos de STF2.4xM2e (Hu) intacto (SEQ ID NO: 664)
imagen151
5 EJEMPLO 10.
Clonación de ADN y expresión de proteínas -métodos
Clonación de ADN y expresión de proteínas en E. coli: se optimizaron los codones de genes sintéticos que codificaban los aminoácidos 66-298 y 130-230 de la glucoproteína (G) (SEQ ID NO: 544) y los aminoácidos 1-194 de la matriz 2 (M2) (SEQ ID NO: 551) de la cepa de RSV A2 para expresión en E. coli y se sintetizaron por un
10 proveedor comercial (DNA 2.0; Menlo Park, CA). Los genes se diseñaron para incorporar sitios BlpI flanqueantes en los extremos tanto 5’ como 3’. Los fragmentos génicos se escindieron de los plásmidos respectivos con BlpI y se clonaron por extremos compatibles en el casete de vector STF2ΔA.blp para generar secuencias quiméricas uniendo la secuencia de antígeno de RSV en fusión con STF2Δ (SEQ ID NO: 619) una flagelina que carece de al menos una porción de una región bisagra.
15 En cada caso, los plásmidos construidos se usaron para transformar células E. coli TOP 10 competentes y se identificaron recombinantes potenciales por exploración de PCR y análisis de mapeo de restricción. La integridad de los construcciones se verificó mediante secuenciación de ADN y se usó ADN plasmídico que codificaba estas construcciones para transformar el hospedador de expresión, BLR (DE3) (Novagen, San Diego, CA; Cat n.º 69053). Se seleccionaron transformantes en placas que contenían kanamicina (50 μg/ml), tetraciclina (5 μg/ml) y glucosa
20 (0,5 %). Las colonias se seleccionaron e inocularon en 2 ml de medio LB complementado con kanamicina 25 μg/ml, tetraciclina 12,5 μg/ml y glucosa 0,5 % y se cultivaron durante una noche. Se usaron alícuotas de estos cultivos para inocular cultivos nuevos en la misma formulación de medio, que se cultivaron hasta que se alcanzó una densidad óptica (DO600nm) = 0,6, momento en el cual se indujo expresión de proteínas por la adición de IPTG 1 mM y se cultivó durante 3 horas a 37 ºC. Después las células se recogieron y analizaron con respecto a expresión de proteínas.
25 Clonación de ADN y expresión de proteínas en baculovirus: se optimizaron los codones de un gen sintético que codificaba los aminoácidos 26-524 de la proteína de fusión (F) de la cepa de RSV A2 (SEQ ID NO: 524) para expresión en baculovirus y se sintetizó por un proveedor comercial (DNA 2,0; Menlo Park, CA). Esta secuencia incluyó mutaciones específicas diseñadas para prevenir el procesamiento endoproteolítico de la proteína F que normalmente escinde la proteína F de tipo silvestre (SEQ ID NO: 522) en dos polipéptidos separados durante la
30 secreción. Los genes se diseñaron para incorporar sitios BlpI flanqueantes en los extremos tanto 5’ como 3’. El fragmento génico se escindió del plásmido con BlpI y se clonó por extremos compatibles en el plásmido vector pFastBac (Invitrogen; Carlsbad, CA) 3’ de una señal de secreción de abeja melífera para dirigir la secreción de la proteína recombinante al medio. Se clonó STF2ng (SEQ ID NO: 613), una flagelina mutada para prevenir la Nglucosilación (designación “ng” para no glucosilación), 3’ de las secuencias F para producir RSVF.STF2ngHis6 (SEQ
35 ID NO: 615) una fusión quimérica que une la secuencia de proteína F con el extremo N terminal de STF2ng. El marcador de His6 C terminal deriva de la secuencia de vector. La misma secuencia de RSVF también se clonó en el plásmido vector pFastBac (Invitrogen; Carlsbad, CA) 3’ de una señal de secreción de abeja melífera sin fusión con
imagen152
STF2ng para producir RSVFHis6 (SEQ ID NO: 617).
Después de transformación en células E. coli TOP 10 competentes, se identificaron recombinantes potenciales por exploración de PCR y análisis de mapeo de restricción. La integridad de las construcciones se verificó mediante secuenciación de ADN, y el ADN, y se usó ADN plasmídico de pFastBac recombinante para transformar el 5 hospedador de recombinación de genoma de baculovirus, DH10Bac (Invitrogen; Carlsbad, CA). Se seleccionaron transformantes de bácmidos recombinantes mediante exploración de azul-blanco en placas que contenían X-gal. Se seleccionaron colonias y se confirmó la recombinación por exploración de PCR. Se obtuvo ADN de bácmido recombinante mediante midi-prep y se usó para transfectar células de insecto Sf9 (Invitrogen; Carlsbad, CA). Después de la determinación de título por ensayos de placas, se amplificaron baculovirus recombinantes
10 reinfectando células Sf9 y los títulos se determinaron por ensayo en placa.
Para expresión en baculovirus de proteínas DEN, se cultivaron células Hi-5 (Invitrogen; Carlsbad, CA) hasta una densidad de 1 x 106 células/ml y se infectaron con baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Después de 24 horas de infección, se recogió medio acondicionado por centrifugación. Se purificó proteína secretada de medio acondicionado por cromatografía de Ni-NTA.
15 SDS-PAGE y transferencia de Western: se determinaron la expresión e identidad de proteínas mediante electroforesis en gel y análisis de inmunotransferencia. Las células se recogieron mediante centrifugación y se lisaron en tampón de Laemmli. Se diluyó una alícuota de 10 μl de cada lisado en tampón de muestra de SDS-PAGE con o sin ditiotreitol (DTT) 100 mM como un reductor. Las muestras se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel de poliacrilamida de SDS 10 % y se sometieron a electroforesis por SDS-PAGE. El gel se tiñó con Coomassie
20 R-250 (Bio-Rad; Hercules, CA) para visualizar las bandas proteicas. Para transferencia de Western, se sometieron a electroforesis 0,5 ml/carril de lisado celular y se electrotransfirió a una membrana de PVDF y se bloqueó con leche en polvo 5 % (p/v).
Para proteínas de fusión de flagelina expresadas en E. coli, la membrana se exploró con anticuerpo anti flagelina (Inotek; Beverly, MA). Después de decorar con anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (Pierce;
25 Rockland, IL), se visualizaron bandas proteicas con un sustrato cromogénico de fosfatasa alcalina (Promega, Madison, WI).
Se seleccionaron clones bacterianos que produjeron bandas de proteína del peso molecular correcto y reactivas con los anticuerpos apropiados para producción de proteína para su uso en ensayos biológicos y experimentos de inmunogenicidad animal. Para construcciones de proteína F de RSV expresadas en baculovirus, la membrana se
30 exploró con anticuerpos anti His6 (C terminal) unido a fosfatasa alcalina (Invitrogen; Carlsbad, CA) y/o anticuerpo monoclonal anti proteína F.
Se enumeran construcciones de ADN y proteínas que incorporan antígenos de RSV en la Tabla 22.
Tabla 22: construcciones de ADN de proteína de fusión del antígeno de RSV para expresión en E. coli y baculovirus:
Aminoácidos SEQ ID NO:
Nucleótidos SEQ ID NO: Nombre de la construcción Peso molecular predicho de la proteína (Da)
625
626 STF2Δ.RSVM2 51.463
621
622 STF2Δ.RSVG( 13 0-230) 40.821
623
624 STF2Δ.RSVG(66-298) 54.805
615
616 RSVF.STF2His6 108.465
617
618 RSVF.His6 56.065
35 Clonación de ADN -resultados
Como se ensaya por tinción con azul de Coomassie del gel de SDS-PAGE, los clones de expresión de E. coli presentaron una banda que migró al peso molecular esperado. La ausencia de esta banda en el cultivo de control (sin IPTG) indicó que se induce específicamente por IPTG. La transferencia de Western con anticuerpos específicos para flagelina confirmó que esta especie inducida es la proteína de fusión de antígeno de RSV-flagelina e indicó que
40 ambas partes de la proteína de fusión se expresaban intactas. Los baculovirus recombinantes indujeron expresión de una banda proteica en medio de células Hi-5 acondicionado que reaccionó con anticuerpo de His6, anticuerpo monoclonal anti RSV y anticuerpo anti flagelina al peso molecular esperado para la construcción de proteína F de RSV elegida.
imagen153
Purificación de proteínas -métodos
Cultivo bacteriano y lisis celular: se produjeron proteínas STF2Δ.RSVM2 (SEQ ID NO: 626), STF2Δ.RSVG130-230 (SEQ ID NO: 622) y STF2Δ.RSVG66-298 (SEQ ID NO: 624) en la cepa hospedadora de E. coli BLR (DE3). Se cultivaron células E. coli y se recogieron como se ha descrito anteriormente. La cepa individual se recuperó de una 5 reserva de glicerol y se cultivó en matraces de agitación hasta un volumen final de 12 litros. Las células se cultivaron en medio LB que contenía kanamicina 50 μg/ml, tetraciclina E 12,5 μg/ml, dextrosa 0,5 % hasta DO600 = 0,6 y se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM durante 3 horas a 37 ºC. Las células se recogieron por centrifugación
(7.000 rpm x 7 minutos en una centrífuga Sorvall RC5C) y se resuspendió en PBS 1x, glicerol 1 %, DNAsa I 1 μg/ml, PMSF 1 mM, cóctel de inhibidor de proteasa y lisozima 1 mg/ml. Las células se lisaron después por dos pases a
10 través de un microfluidizador a 103,39 MPa. El lisado se centrifugó después a 45.000xg durante una hora para separar fracciones solubles e insolubles.
Purificación de proteínas de E. coli recombinante. Después de la lisis y centrifugación, la fracción insoluble (sedimento) que contenía proteínas de fusión se resuspendió y homogeneizó en Tris 50 mM, pH 8,0, seguido de Tris 50 mM, pH 8,0 más Triton X-100 0,5 % (p/v) usando un homogeneizador Dounce. El homogeneizado se centrifugó 15 después (19.000 rpm x 10 min). La fracción de sedimento resultante se homogeneizó después en Tris 50 mM, pH 8,0, más Triton X-100 0,5 % (p/v) + NaCl 0,1 M y se centrifugó. Este material se lavó después con Tris 50 mM, pH 8,0 + NaCl 0,1 M. La fracción de cuerpo de inclusión (sedimento) se disolvió después en tampón A (Acetato Na 50 mM, pH 4,0, más urea 8,0 M) y se centrifugó (19.000 rpm x 10 minutos) para retirar el residuo insoluble. El sobrenadante resultante se fraccionó en una columna Source S (GE Healthcare; Piscataway, NJ) equilibrada en 20 Tampón A y se eluyó en un gradiente lineal con tampón B (Acetato Na 50 mM, pH 4,0, NaCl 1,0 M). La proteína se replegó después por dilución décupla en tampón Tris-HCl 100 mM, pH 8,0. La proteína replegada se fraccionó después en una columna de Q Sepharose HP (GE Healthcare; Piscataway, NJ) equilibrada en Tampón C (Tris 100 mM, pH 8,0) y se eluyó en un gradiente lineal de 0 a aproximadamente 60 % con tampón D (tampón C + NaCl 1 M). El eluato de Q HP se fraccionó después en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (CET) 10/30
25 Superdex 200 (GE/Amersham Biosciences) equilibrada con solución salina tamponada con Tris 1X, pH 8,0, para separar la proteína de fusión monomérica de la proteína agregada. Las fracciones monoméricas después se agruparon, se separaron en alícuotas y se almacenaron a -80 ºC.
Expresión y purificación de proteínas de baculovirus recombinantes: para expresión en baculovirus de proteínas de RSV, se cultivaron células Hi-5 (Invitrogen; Carlsbad, CA) hasta una densidad de aproximadamente 1 x 106 30 células/ml y se infectaron con baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de aproximadamente
2. Después de aproximadamente 24 horas de infección, el medio acondicionado se recogió por centrifugación. Se purificaron proteínas RSVF.His6 (SEQ ID NO: 617) y RSVF.STF2ngHis6 (SEQ ID NO: 615) secretadas de medio acondicionado por cromatografía de afinidad de Ni-NTA. El medio acondicionado se complementó con Tris 20 mM, pH 8 + NaCl 0,5 M y se aplicó a una columna de Ni-NTA de 250 ml (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO). Después de lavar 35 con tampón de equilibrado (Tris 20 mM, pH 8 + NaCl 0,5 M), la proteína unida se eluyó con un gradiente de 5 volúmenes de columna de tampón de elución 0 -100 % (Tampón de equilibrado + imidazol 0,5 M). Las fracciones pico que contenían proteína RSV-F se agruparon, se dializaron frente a tampón de equilibrado y se aplicaron a una columna de Ni-NTA de 25 ml (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO). Después de eluir en un gradiente de tampón de elución de 0 -100 %, se agruparon fracciones pico (como se determinó por SDS-PAGE y transferencia de Western), se
40 dializaron frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS), se separaron en alícuotas y se almacenaron.
SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western: se determinaron la identidad de proteínas y pureza de construcciones de antígenos de proteínas de RSV mediante SDS-PAGE. Se diluyó una alícuota de aproximadamente 5 μg de cada muestra en tampón de muestra de SDS-PAGE con o sin DTT 100 mM como un reductor. Las muestras se hirvieron durante 5 minutos, se cargaron en un gel de poliacrilamida al 10 % (LifeGels; 45 French’s Forest, Nueva Gales del Sur, Australia) y se sometieron a electroforesis. El gel se tiñó con Coomassie R250 (Bio-Rad; Hercules, CA) para visualizar bandas proteicas. Para transferencia de Western, se sometieron 0,5 μg/carril de proteína total a electroforesis como se ha descrito anteriormente y los geles se electrotransfirieron después a una membrana de PVDF y se bloquearon con leche en polvo desnatada 5 % (p/v) antes de explorar con anticuerpo anti-flagelina (Inotek; Beverly, MA). Después de explorar con anticuerpos secundarios conjugados con
50 fosfatasa alcalina (Pierce; Rockland, IL), se visualizaron bandas proteicas con un sustrato cromogénico de fosfatasa alcalina (Promega; Madison, WI).
Ensayo de proteína: se determinó la concentración de proteínas total para todas las proteínas usando el ensayo de Micro BCA (ácido bicincónico) (Pierce; Rockland, IL) en el formato de microplaca, usando albúmina de suero bovino como un patrón, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
55 Ensayo de endotoxina: se determinaron los niveles de endotoxina para todas las proteínas usando el kit de ensayo de LAL cromogénico cuantitativo QCL-1000 (Cambrex; E. Rutherford, NJ), siguiendo las instrucciones del fabricante para el método de microplacas.
Ensayo de bioactividad de TLR: las células HEK293 expresan de forma constitutiva TLR5 y secretan varios factores solubles, incluyendo IL-8, en respuesta a señalización de TLR5. Las células se sembraron en microplacas de 96 60 pocillos (50.000 células/pocillo) y se añadió STF2Δ.RSVM2 (SEQ ID NO: 625), STF2Δ.RSVG130-230 (SEQ ID NO:
imagen154
621), STF2Δ.RSVG66-298 (SEQ ID NO: 623) o RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 615), y se incubó durante una noche. Al día siguiente, el medio acondicionado se recogió, se transfirió a una microplaca de 96 pocillos limpia y se congeló a -20 ºC. Después de descongelar, el medio acondicionado se ensayó con respecto a la presencia de IL-8 en un ELISA de tipo sándwich usando un par de anticuerpos coincidentes anti IL-8 humana (Pierce; Rockland, IL) n.º M801E y M802B) siguiendo las instrucciones del fabricante. La densidad óptica se midió usando un espectrofotómetro de microplacas (FARCyte, GE Healthcare; Piscataway, NJ).
Purificación de proteínas -resultados
Reducción y pureza de proteínas: STF2Δ.RSVM2 (SEQ ID NO: 625), STF2Δ.RSVG130-230 (SEQ ID NO: 621) y STF2Δ.RSVG66-298 (SEQ ID NO: 623) se produjeron en alto rendimiento de cultivo de células E. coli. Los rendimientos totales después de purificación variaron de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 mg, la pureza de las tres proteínas superaron aproximadamente el 90 % por SDS-PAGE, y los valores de endotoxina para cada proteína fueron menores de 0,05 UE/μg. Las tres proteínas de fusión STF2Δ.RSV producidas en proteínas de fusión de E. coli mostraron bioactividad de TLR5 in vitro.
RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 615) y RSVF.His6 (SEQ ID NO: 617) se expresaron por baculovirus recombinante en medio acondicionado de células Hi-5 y se purificaron parcialmente en rendimientos totales que variaron de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mg. RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 615) tuvo actividad TLR5 in vitro positiva y ambas proteínas tuvieron niveles indetectables de endotoxina.
Ensayos de inmunogenicidad -métodos
Estudios con animales: se usaron ratones hembra Balb/c (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) de 6-8 semanas de vida. Se formularon proteínas de ensayo en aproximadamente 100 μl de solución salina tamponada con fosfato por inyección. Los ratones se dividieron en grupos de 10 y recibieron inmunizaciones subcutáneas (s.c.) inguinales de la siguiente manera:
Estudio de inmunogenicidad n.º 1:
Inmunización primaria: día 0; Refuerzo: día 28
grupo
1. PBS (solución salina tamponada con fosfato; control negativo)
2. 3 μg de STF2Δ.RSVM2 (SEQ ID NO: 625) Se sacrificaron dos (2) ratones/grupo por inhalación de CO2 7 días después de la sensibilización y 7 días después
del refuerzo. Se recogieron células del bazo y se analizaron con respecto a respuestas de linfocitos T específicas de RSVM2 por ensayo de ELISPOT, como se describe posteriormente. Estudio de inmunogenicidad n.º 2: Inmunización primaria: día 0; Refuerzo: día 14
grupo
1.
PBS (solución salina tamponada con fosfato; control negativo)
2.
3 μg de STF2Δ.RSVG130-230 (SEQ ID NO: 621)
3.
3 μg de STF2Δ.RSVG66-298 (SEQ ID NO: 623)
Se tomó sangre de ratones por punción retroorbital el día 21. Los sueros se recogieron mediante coagulación y centrifugación de las muestras de sangre sin heparina, y se ensayaron mediante ELISA con respecto a respuestas de anticuerpos de IgG específicas de RSV como se describe posteriormente.
Estudio de inmunogenicidad n.º 3: Inmunización primaria: día 0; Refuerzo: día 21
grupo
1.
PBS (solución salina tamponada con fosfato; control negativo)
2.
100 μl de RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 615)
3.
10 μl de RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 615)
imagen155
Se tomó sangre de ratones por punción retroorbital el día 28. Se recogieron sueros mediante coagulación y centrifugación de las muestras de sangre sin heparina, y se ensayaron mediante ELISA con respecto a respuestas 5 de anticuerpos específicas de RSV como se describe posteriormente.
Determinación de anticuerpos en suero de RSV: se determinaron los niveles de IgG específico de proteína F y G de RSV mediante ELISA. Se recubrieron placas de ELISA (96 pocillos) durante una noche a 4 ºC con 100 ml/pocillo de péptido RSVG NH2 -HPEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRI -COOH (SEQ ID NO: 627), proteína RSVF.His6 (SEQ ID NO: 617) o virus RSV A2 en PBS a una concentración de 2 μg/ml. Las placas se bloquearon con 200 μl/pocillo de 10 tampón de diluyente de ensayo (ADB; BD Pharmingen, San Diego, CA) durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3x en PBS-T. Se añadieron diluciones de los sueros en ADB (100 μl/pocillo) y las placas se incubaron durante una noche a 4 ºC. Las placas se lavaron después 3x con PBS-T. Se añadió anticuerpo anti ratón de cabra marcado con HRP (Jackson Immunochemical; West Grove, PA) diluido en ADB (100 μl/pocillo) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron 3x con PBS-T. Después de añadir
15 sustrato de TMB (3, 3’, 5, 5’-tetrametilbencidina) Ultra (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) y supervisar el desarrollo del color, se midió la absorbancia a 450 nm (A450) en un microespectrofotómetro Tecan Farcyte.
Ensayos de ELISPOT específicos de antígeno de RSVM2: se añadieron células del bazo (106 células/pocillo) de animales 7 días después de inmunización primaria o 7 días después de la inmunización de refuerzo con STF2Δ.RSVM2 (SEQ ID NO: 625) a placas Multiscreen-IP de 96 pocillos (Millipore; Billerica, MA) recubiertas con 20 anticuerpo anti IFNγ o IL-5 de captura (eBioscience; San Diego, CA) diluido en PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se estimularon después linfocitos T durante una noche con células presentadoras de antígenos (CPA) no tratadas previamente (106 células/pocillo) en ausencia o presencia de un grupo de péptidos de 15 unidades solapantes que abarcan la proteína M2 de RSV M2 (AnaSpec; San Jose, CA). Se usó anti CD3 (BD Pharmingen; San Jose, CA) como un control positivo a una concentración final de 0,25 μg/ml. Las placas se 25 incubaron durante una noche a 37 ºC/CO2 5 %, después se lavaron y se incubaron con anticuerpo de detección biotinilado diluido en PBS/suero bovino fetal al 10 % (FBS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las placas se desarrollaron usando el Módulo de Desarrollo de Color Azul ELISPOT de acuerdo con el protocolo del fabricante (R & D Systems, Minneapolis, MN). Se ensayaron respuestas específicas de antígeno por duplicado de animales individuales y se cuantificaron usando un lector de ELISPOT automático (Cellular Technology Ltd.;
30 Cleveland, OH). Los datos se representan como el número de respuestas específicas de antígeno/106 CPA.
Cultivo de cepa de virus RSV A2: se produjo virus RS para su uso en ensayo de ELISA directo para determinar la reactividad de suero inmunitaria con el virión nativo. Se infectaron monocapas de HEp-2 con RSV A2. Cuando aproximadamente el 75 % de las células demostraron efectos citopáticos (CPE), las monocapas se rasparon, se sedimentaron y se lavaron una vez en PBS. Los sedimentos se resuspendieron después en NP-40 0,5 % en agua, 1
35 ml por cada placa de 100 mm y después se incubaron en hielo durante aproximadamente 10 minutos. Los lisados celulares se centrifugaron a 10.000 rpm a 4 ºC para sedimentar los núcleos celulares. Los sobrenadantes se agruparon, se separaron en alícuotas y se almacenaron a -20 ºC. El lisado se usó para recubrir placas de ELISA que posteriormente se exploraron con sueros inmunitarios de ratón.
ELISA de células completas de RSV: se cultivaron células Vero (ATCC; Manassas, VA) hasta casi la confluencia en
40 placas de cultivo transparentes de 96 pocillos. La mitad de cada placa se infectó durante una noche con virus RSV A2. Las monocapas se fijaron con formalina y después se bloquearon con diluyente de ensayo (BD Biosciences). Se añadieron valoraciones de sueros individuales a las monocapas fijas y se incubaron durante una noche. Al día siguiente, se añadió IgG de cabra anti ratón con HRP para detectar anticuerpos unidos. Las placas se desarrollaron usando sustrato TMB Ultra (Pierce; Rockland, IL) y se midió la Abs a 450 nm (A450). La absorbancia de fondo de
45 pocillos no infectados se restó de la absorbancia de pocillos infectados correspondientes y se representó.
Ensayo de neutralización de suero de RSV: se pipetearon aproximadamente 1000 ufp/pocillo de la cepa de RSV A2 en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Se añadieron diluciones en serie de sueros inmunitarios de ratón. Después de una incubación de aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 37 ºC, se añadieron células Vero y las placas se cultivaron durante 7 días. La infectividad y neutralización se evaluaron mediante el ensayo de
50 citotoxicidad celular Cytotox One™ (Promega; Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se representaron como porcentaje de neutralización.
Ensayo de inmunogenicidad -resultados
Respuestas de anticuerpos específicos de RSVG y RSVF: como se muestra en las Figuras 42A-42C, la inmunización de ratones con proteína STF2Δ.RSVG130-230 (SEQ ID NO: 621) o STF2Δ.RSVG66-298 (SEQ ID NO: 55 624) indujo la producción de IgG de suero específico que reaccionó con el péptido de RSVG altamente conservado, NH2 -HPEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRI -COOH (SEQ ID NO: 627), mientras que los sueros de control no. Los sueros inmunitarios también reconocieron específicamente células Vero infectadas por RSV A2 en el ensayo de ELISA de células completas (Figuras 43A y 43B), lo que demuestra que la inmunización con cualquiera de estas construcciones de vacuna induce anticuerpos que reconocen el virus RS nativo. La inmunización con RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 616) también indujo anticuerpos específicos para RSV. Como se muestra en la Figura 44A, los sueros inmunitarios de ratones inmunizados con 10 μl o 100 μl de RSVFng.STF2His6 reaccionaron específicamente con proteína RSVF.His6 recombinante. Notablemente, como se muestra en la Figura 44B, estos sueros también reconocieron el virus RS A2 en el formato de ELISA de virus completo, lo que demuestra que la 5 inmunización con RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 616) induce anticuerpos que reconocen el virus nativo. La administración de la proteína RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 615) formulada en TiterMax™, un adyuvante potente que no es aceptable para uso humano, no potenció significativamente la respuesta de anticuerpo específico de RSV.
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Cualquier vacuna eficaz para el virus sincitial respiratorio (RSV) debe inducir una respuesta de anticuerpo neutralizante. Los anticuerpos producidos por inmunización con RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 615) son capaces de 10 neutralizar la infectividad de virus RS in vitro. Como se muestra en la Figura 45 la neutralización por sueros inmunitarios de proteína de Grupo 2 (aproximadamente una dosis de 100 μl, que se estima que es menor de aproximadamente 1 μg de RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 615), es semimáxima a una dilución en suero de aproximadamente 1:500. Un décimo de esta dosis (Grupo 3) también induce actividad de neutralización detectable en el suero inmunitario. Finalmente, como con la respuesta de IgG específica de RSV (descrita anteriormente), la
15 administración de aproximadamente 50 μl de proteína RSVF.STF2His6 (SEQ ID NO: 615) formulada en el adyuvante potente TiterMax Gold™ induce una respuesta de neutralización muy similar en magnitud a la dosis de 100 ml formulada solamente en tampón fisiológico.
Respuestas de linfocitos T específicas de RSVM2: los resultados del ensayo de ELISPOT mostrado en las Figuras 46A y 46B indican que los ratones desarrollaron respuestas de linfocitos T específicas de antígeno después de una 20 única inmunización con STF2.RSVM2 (SEQ ID NO: 625) y que los ratones inmunizados con simulación no. Tras la estimulación con células presentadoras de antígenos (CPA) sensibilizadas con el grupo de péptidos de RSVM2, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 células/106 esplenocitos secretaron IFN-γ en comparación con ninguna en el grupo inmunizado con simulación. Más células de animales inmunizados con STF2.RSVM2 (SEQ ID NO: 625), secretaron IL-5, variando de aproximadamente 75 a aproximadamente 200 células/106 esplenocitos. Las CPA sin
25 tratamiento previo sensibilizadas con simulación con tampón no estimularon la producción de IFN-γ o IL-5 en ninguno de los grupos.
Los ensayos de ELISPOT realizados en células del bazo recogidas 7 días después de la inmunización de refuerzo con STF2.RSVM2 (SEQ ID NO: 625) mostraron un aumento significativo en los linfocitos T específicos de antígeno de RSVM2 que secretaban IFN-γ en comparación con células recogidas después de la inmunización primaria. Tras 30 la estimulación con células presentadoras de antígenos (CPA) sensibilizadas con el grupo de péptido RSVM2, entre aproximadamente 150 y aproximadamente 300 células/106 esplenocitos secretaron IFN-γ. El número de células que secretaban IL-5 después del refuerzo fue de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 células/106 esplenocitos. El aumento relativo en la producción de IFN-γ entre la sensibilización y el refuerzo es indicativo de desplazamiento de una respuesta inmunitaria dominada por Th2 a una respuesta dominada por Th-1 y sugiere la inducción de una
35 respuesta de linfocitos T efectora contra el antígeno diana.
Ejemplo 11
Clonación de ADN y expresión de proteínas -métodos
Clonación de ADN y expresión de proteínas en E. coli:
Se optimizaron los codones de genes sintéticos que codificaban 112 aminoácidos que abarcaban el dominio III (EIII),
40 e incluían aminoácidos del dominio I (El), de la proteína de la envoltura (E) de virus Dengue serotipos Den1, Den2, Den3 y Den4 (SEQ ID NO: 652; SEQ ID NO: 654; SEQ ID NO: 656; SEQ ID NO: 658, respectivamente) para expresión en E. coli y se sintetizaron por un proveedor comercial (DNA 2.0; Menlo Park, CA). Los genes se diseñaron para incorporar sitios BlpI flanqueantes en los extremos tanto 5’ como 3’. Los fragmentos génicos se escindieron de los plásmidos respectivos con BlpI y se clonaron por extremos compatibles en el casete de vector
45 STF2Δ.blp con un enlazador de 12 aminoácidos entre los dominios EIII y STF2Δ. Las construcciones de ADN se designaron STF2Δ.DEN1EIII+ (SEQ ID NO: 629), STF2Δ.DEN2EIII+ (SEQ ID NO: 631), STF2Δ.DEN3EIII+ (SEQ ID NO: 633) y STF2Δ.DEN4EIII+ (SEQ ID NO: 635).
Los plásmidos construidos se usaron para transformar células E. coli TOP 10 competentes y se identificaron recombinantes potenciales por exploración de PCR y análisis de mapeo de restricción. La integridad de las 50 construcciones se verificó mediante secuenciación de ADN, se usaron construcciones para transformar el hospedador de expresión, BLR (DE3) (Novagen, San Diego, CA; Cat n.º 69053). Se seleccionaron transformantes en placas que contenían kanamicina (50 μg/ml), tetraciclina (5 μg/ml) y glucosa (0,5 %). Se seleccionaron colonias y se inocularon en 2 ml de medio LB complementado con kanamicina 25 μg/ml, tetraciclina 12,5 μg/ml y glucosa 0,5 % y se cultivaron durante una noche. Se usaron alícuotas de estos cultivos para inocular cultivos nuevos en la misma
55 formulación de medio, que se cultivaron hasta que se alcanzó una densidad óptica (DO600nm) = 0,6, momento en el cual se indujo expresión de proteínas mediante la adición de IPTG 1 mM y se cultivó durante 3 horas a 37 ºC. Después las células se recogieron y se analizaron para expresión de proteínas.
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Clonación de ADN y expresión de proteínas en baculovirus: la proteína de envoltura de longitud completa (E) de cada virus Dengue Den1, Den2, Den3 y Den4 consiste en un polipéptido de 495 aminoácidos e incluye una porción C terminal de aproximadamente 50 aminoácidos que contiene dos (2) secuencias transmembrana (véase SEQ ID NO: 652, 653, 654, 655, 656, 657 y 658). Para producir proteínas E recombinantes, solubles, para su uso como 5 reactivos de ensayo ELISA, los 400 aminoácidos N terminales de la proteína de envoltura (E) de cada virus Dengue 1-4 (Den1, Den2, Den3 y Den4) se clonó y se expresó en baculovirus para su uso como reactivos de ensayo ELISA. La expresión “80%E”, como se usa en la presente memoria en referencia a la secuencia proteica de Dengue descrita en la presente memoria, significa que la secuencia carece de los dos (2) dominios transmembrana C terminales y aproximadamente 45 aminoácidos del ectodominio. Se optimizaron los codones de genes sintéticos que codificaban
10 las secuencias de 80 %E de las proteínas E de Dengue descritas en la presente memoria para expresión en baculovirus y se sintetizaron por un proveedor comercial (DNA 2.0; Menlo Park, CA) para producir SEQ ID NO: 637; SEQ ID NO: 639; SEQ ID NO: 641 y SEQ ID NO: 643. Los genes de 80%E se diseñaron para incluir un marcador 6xHis en el extremo 5’ y sitios BlpI flanqueantes en los extremos tanto 5’ como 3’.
Los fragmentos génicos se escindieron de los plásmidos respectivos con BlpI y se clonaron por extremos
15 compatibles en el plásmido vector pFastBac (Invitrogen; Carlsbad, CA) 3’ de una señal de secreción de melitina de abeja melífera para dirigir la secreción de la proteína recombinante al medio. Las construcciones de expresión de ADN de baculovirus que incorporan el gen de DEN 80%E se designaron DEN1EHisBv (SEQ ID NO: 637), DEN2EHisBv (SEQ ID NO: 639), DEN3EHisBv (SEQ ID NO: 641) y DEN4EHisBv (SEQ ID NO: 643).
Los plásmidos construidos se usaron para transformar células E. coli TOP 10 competentes y se identificaron
20 recombinantes potenciales por exploración de PCR y análisis de mapeo de restricción. La integridad de las construcciones se verificó por secuenciación de ADN, y se usó ADN plasmídico para transformar el hospedador de recombinación de baculovirus, DH10Bac (Invitrogen; Carlsbad, CA). Se seleccionaron transformantes de bácmidos recombinantes por exploración de azul-blanco en placas que contenían X-gal. Se seleccionaron colonias y se confirmó la recombinación por exploración de PCR. Se obtuvo ADN de bácmido recombinante por midi-prep y se
25 usó para transfectar células de insecto Sf9 (Invitrogen; Carlsbad, CA). Después de la determinación del título por ensayos en placa, se amplificaron baculovirus recombinantes reinfectando células Sf9 y los títulos se determinaron por ensayo en placa.
Para expresión de baculovirus de proteínas DEN, se cultivaron células Hi-5 (Invitrogen; Carlsbad, CA) hasta una densidad de 1 x 106 células/ml y se infectaron con baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección (MOI)
30 de 2. Después de 24 horas de infección, el medio acondicionado se recogió por centrifugación. Se purificó proteína DEN 80%E secretada de medio acondicionado por cromatografía Ni-NTA.
SDS-PAGE y transferencia de Western: se determinaron la expresión de proteínas y el tipo de virus Dengue mediante electroforesis en gel y análisis de inmunotransferencia. Se recogieron células por centrifugación y se lisaron en un tampón de Laemmli. Se diluyó una alícuota de 10 μl de cada lisado en tampón de muestra de SDS
35 PAGE con o sin ditiotreitol (DTT) 100 mM como un reductor. Las muestras se hirvieron durante aproximadamente 5 minutos y se cargaron en un gel de poliacrilamida SDS 10 % y se sometieron a electroforesis por SDS-PAGE. El gel se tiñó con Coomassie R-250 (Bio-Rad; Hercules, CA) para visualizar bandas proteicas. Para transferencia de Western, se sometieron a electroforesis 0,5 ml/carril de lisado celular y se electrotransfirieron a una membrana de PVDF y se bloquearon con leche en polvo 5 % (p/v).
40 Para proteínas de fusión de flagelina expresadas en E. coli, la membrana se exploró con anticuerpo anti flagelina (Inotek; Beverly, MA). Después de explorar con anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (Pierce; Rockland, IF), se visualizaron las bandas proteicas con un sustrato cromogénico de fosfatasa alcalina (Promega, Madison, WI). Se seleccionaron clones bacterianos que producían bandas proteicas del peso molecular correcto y reactivas a los anticuerpos apropiados para producción de proteínas para su uso en ensayos biológicos y
45 experimentos de inmunogenicidad de animales. Para proteínas DEN 80%E expresadas en baculovirus, la membrana se exploró con anticuerpo anti His6 (C terminal) unido a fosfatasa alcalina (Invitrogen; Carlsbad, CA).
Se enumeran construcciones de ADN y proteínas que enlazan flagelina con antígenos de Dengue en la Tabla 23.
Tabla 23: construcciones de ADN de antígeno de Dengue-flagelina para expresión en E. coli y baculovirus Clonación de ADN -resultados
Aminoácidos SEQ ID NO
Nucleótidos SEQ ID NO: Nombre de la construcción Peso molecular predicho de la proteína (Da)
628
629 STF2Δ.DEN1EIII+ 43.223
630
631 STF2Δ.DEN2EIII+ 43.549
632
633 STF2Δ.DEN3EIII+ 43.349
634
635 STF2Δ.DEN4EIII+ 43.274
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Aminoácidos SEQ ID NO
Nucleótidos SEQ ID NO: Nombre de la construcción Peso molecular predicho de la proteína (Da)
636
637 DEN1 80%EHis6Bv 44.581
638
639 DEN2 80%EHis6Bv 45.172
640
641 DEN3 80%EHis6Bv 44.477
642
643 DEN4 80%EHis6Bv 44.603
Como se ensaya por tinción con azul de Coomassie del gel de SDS-PAGE, todos los clones de expresión de E. coli presentaron una banda que migraba al peso molecular esperado. La ausencia de esta banda en el cultivo de control
5 (sin IPTG) indicó que se induce específicamente por IPTG. La transferencia de Western con anticuerpos específicos para flagelina confirmó que esta especie inducida es la proteína de fusión de antígeno de HPV-flagelina y sugirió que ambas porciones de la proteína de fusión se expresaban intactas. Todos los baculovirus recombinantes indujeron expresión de una banda proteica en medio de células Hi-5 acondicionado que reaccionó con anticuerpo de His6 al peso molecular esperado para la proteína DEN 80%EHis6Bv elegida.
10 Purificación de proteínas -métodos
Cultivo bacteriano y lisis celular: las proteínas STF2Δ.DEN1EIII + (SEQ ID NO: 628), STF2Δ.DEN2EIII + (SEQ ID NO: 630), STF2Δ.DEN3EIII + (SEQ ID NO: 632) y STF2Δ.DEN4EIII + (SEQ ID NO: 634) se produjeron en la cepa de
E. coli BLR (DE3). Se cultivaron células E. coli y se recogieron como se ha descrito anteriormente. La cepa individual se recuperó de una reserva de glicerol y se cultivó en matraces de agitación hasta un volumen final de 12 litros. Las 15 células se cultivaron en medio LB que contenía kanamicina 50 μg/ml/tetraciclina 12,5 μg/ml/dextrosa 0,5 % hasta DO600 = 0,6 y se indujo por la adición de IPTG 1 mM durante 3 horas a 37 ºC. Las células se recogieron por centrifugación (aproximadamente 7000 rpm x aproximadamente 7 minutos en una centrífuga Sorvall RC5C) y se resuspendieron en PBS 1x, glicerol 1 %, DNAsa I 1 μg/ml, PMSF 1 mM, cóctel inhibidor de proteasa y lisozima 1 mg/ml. Las células se lisaron después por dos pases a través de un microfluidizador a 103,39 MPa. El lisado se
20 centrifugó después a 45.000xg durante una hora para separar fracciones solubles e insolubles.
Purificación de proteínas:
Después de la centrifugación, las fracciones insolubles (cuerpos de inclusión) se resuspendieron en Tampón A (solución salina tamponada con Tris 1x, pH 8,0 + Triton X-100 1 % (p/v)) y se resuspendieron usando un homogeneizador Dounce de bola de vidrio. La proteína resuspendida se centrifugó después de nuevo como 25 anteriormente y se recuperó el material insoluble. El proceso de lavado se repitió 3 veces. Después se desnaturalizó la proteína insoluble en Tampón B (urea 8 M, ácido cítrico 20 mM, pH 3,5). La proteína desnaturalizada se aplicó después a una columna Source SP (GE Healthcare; Piscataway, NJ) equilibrada en Tampón B (urea 8 M, citrato 20 mM, pH 3,5) y se eluyó proteína de la resina con un gradiente de 5 volúmenes de columna de Tampón C 0 -100 % (Tampón B + NaCl 1 M). El material eluido se dializó exhaustivamente frente a Tampón D (urea 8 M, Tris-HCl 50
30 mM, pH 8,0) y después se replegó por dilución en un volumen décuplo de Tampón E (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0). El material replegado se aplicó después a una columna Source Q (GE Healthcare; Piscataway, NJ) equilibrada en Tampón F (Tris 20 mM, pH 8,0) y la proteína monomérica, unida, se eluyó con un gradiente salino lineal de 5 volúmenes de columna de Tampón G 0 -100 % (Tampón F + NaCl 1 M). Las fracciones pico se agruparon y dializaron frente a TBS 1x, pH 8,0 y se esterilizaron por filtración.
35 Análisis de SDS-PAGE y transferencia de Western: se determinaron la identidad y pureza proteicas de proteínas STF2Δ.DENEIII+ (SEQ ID NO: 628, 630, 632, 634) mediante SDS-PAGE. Se diluyo una alícuota de 5 μg de cada muestra en tampón de muestra de SDS-PAGE con o sin DTT 100 mM como reductor. Las muestras se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel de poliacrilamida 10 % (LifeGels; French’s Forest, Nueva Gales del Sur, Australia) y se sometieron a electroforesis. El gel se tiñó con Coomassie R250 (Bio-Rad; Hercules, CA) para
40 visualizar bandas proteicas. Para transferencia de Western, se sometieron a electroforesis 0,5 μg/carril de proteína total como se ha descrito anteriormente y los geles se electrotransfirieron después a una membrana de PVDF y se bloquearon con leche en polvo desnatada 5 % (p/v) antes de explorar con anticuerpo anti flagelina (Inotek; Beverly, MA). Después de explorar con anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina (Pierce; Rockland, IL), se visualizaron bandas proteicas con un sustrato cromogénico de fosfatasa alcalina (Promega; Madison, WI).
45 Ensayo de proteínas: se determinó la concentración de proteínas total para todas las proteínas usando el ensayo de Micro BCA (ácido bicincónico) (Pierce; Rockland, IL) en el formato de microplacas, usando albúmina de suero bovino como patrón, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
imagen159
Ensayo de endotoxinas: se determinaron los niveles de endotoxina para todas las proteínas usando el kit de ensayo de LAL cromogénico cuantitativo QCL-1000 (Cambrex; E. Rutherford, NJ), siguiendo las instrucciones del fabricante para el método de microplacas.
Ensayo de bioactividad de TLR: las células HEK293 expresan de forma constitutiva TLR5 y secretan varios factores
5 solubles, incluyendo IL-8, en respuesta a señalización de TLR5. Las células se sembraron en microplacas de 96 pocillos (50.000 células/pocillo) y se añadieron proteínas STF2Δ.DEN1-4EIII+ individuales (SEQ ID NO: 628, 630, 632, 634) y se incubaron durante una noche. Al día siguiente, se recogió el medio acondicionado, se transfirió a una microplaca de 96 pocillos limpia y se congeló a -20 ºC. Después de descongelar, el medio acondicionado se ensayó con respecto a la presencia de IL-8 en un ELISA de tipo sándwich usando un par de anticuerpos coincidentes anti IL
10 8 humana (Pierce; Rockland, IL) n.º M801E y M802B) siguiendo las instrucciones del fabricante. La densidad óptica se midió usando un espectrofotómetro de microplacas (FARCyte, GE Healthcare; Piscataway, NJ).
Purificación de proteínas -resultados
Rendimiento y pureza de proteínas: se produjeron las cuatro proteínas STF2Δ.DENEIII+ (SEQ ID Nº: 628, 630, 632, 634) con alto rendimiento a partir de cultivo celular de E. coli. Los rendimientos totales después de la purificación
15 variaron de 25 a 50 mg, la pureza de las cuatro proteínas superó 95 % por SDS-PAGE y los valores de endotoxina para cada proteína fueron menores de 0,05 UE/μg. Las cuatro proteínas de fusión STF2Δ.DENEIII+ (SEQ ID NO: 628, 630, 632, 634) tuvieron bioactividad de TLR5 in vitro. Las cuatro proteínas DEN 80%EHis6Bv (SEQ ID NO: 636, 638, 640, 642) se expresaron en medio acondicionado de células Hi-5 y se purificaron a partir de cultivos de 12L en rendimientos totales que variaron de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg.
20 Ensayo de inmunogenicidad -métodos
Estudio en animales n.º 1: se usaron ratones hembra C57B/6 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) de 6-8 semanas de vida. Se formularon proteínas de ensayo en 100 μl de solución salina tamponada con fosfato. Los ratones se dividieron en grupos de 10 y recibieron inmunizaciones subcutáneas (s.c.) inguinales los días 0, 14 y 28 de la siguiente manera. La formulación tetravalente incluyó cuatro proteínas de fusión que incluían cada una cuatro
25 antígenos Dengue diferentes (DEN1EIII+, DEN2EIII+, DEN3EIII+, DEN4EIII+ SEQ ID Nº: 628, 630, 632 y 634, respectivamente).
grupo
3.
PBS (solución salina tamponada con fosfato)
4.
3 μg de STF2Δ.DEN1EIII + (SEQ ID NO: 628)
30 5. 3 μg de STF2Δ.DEN2EIII + (SEQ ID NO: 630)
6.
3 μg de STF2Δ.DEN3EIII + (SEQ ID NO: 632)
7.
3 μg de STF2Δ.DEN4EIII + (SEQ ID NO: 634)
8.
Formulación Tetravalente:
3 μg de STF2Δ.DEN1EIII + (SEQ ID NO: 628)
35 3 μg de STF2Δ.DEN2EIII + (SEQ ID NO: 630)
3 μg de STF2Δ.DEN3EIII + (SEQ ID NO: 632)
3 μg de STF2Δ.DEN4EIII + (SEQ ID NO: 634)
Se tomó sangre de los ratones por punción retroorbital los días 21 y 35. Los sueros se recogieron por coagulación y centrifugación de las muestras de sangre sin heparina, y se ensayaron mediante ELISA con respecto a reactividad
40 con proteínas DEN E.
Estudio con animales animal n.º 2:
Se usaron ratones hembra Balb/C (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) de 6-8 semanas de vida. Las proteínas de ensayo se formularon en 100 μl de solución salina tamponada con fosfato. Los ratones se dividieron en grupos de 10 y recibieron inmunizaciones subcutáneas (s.c.) inguinales los días 0, 14 y 28 de la siguiente manera:
45 grupo
1.
PBS (solución salina tamponada con fosfato)
2.
3 μg de STF2Δ.DEN1EIII + (SEQ ID NO: 628)
imagen160
4.
3 μg de STF2Δ.DEN2EIII + (SEQ ID NO: 630)
5.
30 μg de STF2Δ.DEN2EIII + (SEQ ID NO: 630)
6.
3 μg de STF2Δ.DEN3EIII + (SEQ ID NO: 632)
5 7. 30 μg de STF2Δ.DEN3EIII + (SEQ ID NO: 632)
8.
3 μg de STF2Δ.DEN4EIII + (SEQ ID NO: 634)
9.
30 μg de STF2Δ.DEN4EIII + (SEQ ID NO: 634)
Se extrajo sangre de los ratones por punción retroorbital los días 21 y 35. Los sueros se recogieron por coagulación y centrifugación de las muestras de sangre sin heparina, y se ensayaron por ELISA con respecto a reactividad con
10 proteínas DEN E.
Determinación de anticuerpos de suero de DEN: se determinaron los niveles de IgG específico de proteína de la envoltura de DEN mediante ELISA. Se recubrieron placas de ELISA (96 pocillos) durante una noche a 4 ºC con 100 ml/pocillo de la proteína DEN 80%E seleccionada (SEQ ID NO: 636; SEQ ID NO: 638; SEQ ID NO: 640, o SEQ ID NO: 642) en PBS a una concentración de 2 μg/ml. Las placas se bloquearon con 200 μl/pocillos del Tampón 15 Diluyente de Ensayo (ADB; BD Pharmingen, San Diego, CA) durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3x en PBS-T. Se añadieron diluciones de los sueros en ADB (100 μl/pocillo) y las placas se incubaron durante una noche a 4 ºC. Las placas se lavaron después 3x con PBS-T. Se añadieron anticuerpos de cabra anti IgG de ratón marcados con HRP (Jackson Immunochemical; West Grove, PA) diluidos en ADB (100 μl/pocillo) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron 3x con PBS-T. Después de
20 añadir sustrato TMB (3, 3’, 5, 5’-tetrametilbencidina) Ultra (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) y supervisar el desarrollo del color, se midió la absorbancia a 450 nm (A450) en un microespectrofotómetro Tecan Farcyte.
Ensayos de ENRP50: se determinó la capacidad de sueros inmunitarios de ratón para neutralizar la infectividad de virus DEN in vitro mediante el ensayo de neutralización de reducción de placas (ENRP). Se ensayaron muestras de suero del día 35 de ratones inmunizados con respecto a su capacidad para bloquear infección por virus DEN en 25 células Vero cultivadas. Brevemente, se termoinactivaron muestras de suero de ratones individuales y se diluyeron en serie dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) + gelatina 0,5 %. Se incubaron diluciones partiendo de 1:10 con 100 ufp de virus Dengue 2. La mezcla de virus/suero se incubó a 37 ºC durante 1 hora y después se inoculó en monocapas confluentes de células Vero (ATCC, catálogo n.º CCL-81; Manassas, VA) en pocillos por duplicado de placas de cultivo tisular de 6 pocillos. Se permitió que el virus se adsorbiera en la
30 monocapa celular antes de añadir una superposición de agarosa al 1 %. Se incubaron cultivos de células infectadas durante 4 días a 37 ºC seguido de una segunda superposición de agarosa que contenía rojo neutro al 4 %. Se contaron las placas de virus 12 horas después. Se registraron los títulos de suero que indujeron una reducción del 50 % en el número de placas víricas (ENRP50).
Ensayos de inmunogenicidad -resultados
35 Respuestas de anticuerpos específicos de DEN E: como se muestra en las Figuras 47A a 47D, la inmunización de ratones C57B/6 con cualquiera de las cuatro proteínas individuales STF2Δ.DENEIII+ (SEQ ID NO: 628; SEQ ID NO: 630; SEQ ID NO: 632; SEQ ID NO: 634) indujo altos niveles de IgG en suero que reaccionó con la proteína DEN 80%EHis6Bv del serotipo de virus Dengue homólogo. Por el contrario, la inmunización con simulación (PBS) no indujo ningún anticuerpo reactivo a DEN 80%EHis6Bv.
40 Se ensayaron sueros inmunitarios de cada uno de los cuatro grupos de ratones inmunizados individualmente con respecto a reactividad cruzada con proteínas DEN 80%EHis6Bv de los otros tres serotipos de Dengue heterólogos. Como se muestra en las Figuras 48A a 48D la inmunización con las cuatro proteínas STF2Δ.DENEIII+ individuales (SEQ ID NO: 628; SEQ ID NO: 630; SEQ ID NO: 632, o SEQ ID NO: 634) indujo anticuerpos más específicos para la proteína DEN E homóloga que para la proteína DEN E heteróloga. En el caso de DEN2, el título de anticuerpo
45 homólogo superó el título heterólogo más alto en aproximadamente 3 veces log10 (103). Para DEN1 y DEN4, el título de anticuerpo homólogo superó el título heterólogo mayor en aproximadamente 2 veces log10 (103). Para DEN3, hubo algo de reactividad cruzada con DEN1, superando la respuesta homóloga la respuesta de DEN1 heteróloga en aproximadamente 2 veces, y superando la respuesta heteróloga contra DEN2 y DEN4 1 vez log10.
Estos datos muestran que los antígenos de DENEIII+ fusionados con STF2Δ inducen respuestas de anticuerpos
50 potentes que son altamente específicas para el serotipo de Dengue homólogo y tienen reactividad cruzada mínima con serotipos heterólogos.
Además de las administraciones monovalentes, las cuatro proteínas STF2Δ.DENEIII+ (SEQ ID NO: 628; SEQ ID NO: 630; SEQ ID NO: 632, o SEQ ID NO: 634) se administraron juntas como una mezcla tetravalente. Las Figuras 49A, 49B, 50A y 50B muestran las respuestas de anticuerpos homólogas y heterólogas inducidas por las formulaciones monovalentes y tetravalentes. Como se muestra en las Figuras 49A y 49B, la inmunización con la mezcla tetravalente induce respuestas de anticuerpos anti DEN 1 E y anti DEN2 E que son muy similares a las inducidas por las formulaciones monovalentes para estos dos serotipos. Como se muestra en las Figuras 50A y 50B, la respuesta de anticuerpo al componente DEN3 en la mezcla tetravalente STF2Δ.DEN3EIII+ (SEQ ID NO: 632)
imagen161
5 desciende significativamente en comparación con la administración monovalente de esta construcción de vacuna. Esta respuesta disminuida a DEN3 en la mezcla tetravalente puede corregirse aumentando la cantidad de proteína STF2Δ.DEN3EIII+ (SEQ ID NO: 632) en la mezcla tetravalente el triple con respecto a los otros 3 serotipos de DEN. La respuesta de anticuerpo al componente DEN4 en la mezcla tetravalente, STF2Δ.DEN4EIII+ (SEQ ID NO: 634), también disminuye ligeramente en comparación con la administración monovalente de DEN4.
10 Estos datos muestran que una formulación tetravalente de componentes de vacuna DEN, que consisten en STF2Δ.DEN1EIII+ (SEQ ID NO: 628), STF2Δ.DEN2EIII+ (SEQ ID NO: 630), STF2Δ.DEN3EIII+ (SEQ ID NO: 632) y STF2Δ.DEN4EIII+ (SEQ ID NO: 634) puede inducir respuestas de anticuerpos potentes y específicas contra los cuatro serotipos de proteína E de Dengue, y que las respuestas disminuidas provocadas por interferencia inmunitaria entre los componentes individuales pueden corregirse ajustando las relaciones de los componentes en la
15 formulación tetravalente.
Estudio con animales n.º 1
Neutralización in vitro de infectividad del virus del Dengue: la capacidad para inducir anticuerpos neutralizantes del virus del Dengue es esencial para la eficacia de la vacuna. Se ensayaron sueros inmunitarios individuales de ratones inmunizados con STF2Δ.DEN2EIII+ (SEQ ID NO: 630) para neutralización de virus en un ensayo de neutralización 20 de reducción de placas (ENRP). Los resultados de este ensayo se muestran en la Figura 51. La mayoría de ratones (9/10 = 90 %) inmunizados con STF2Δ.DEN2EIII+ (SEQ ID NO: 630) se seroconvirtieron, definido como tener un título de ENRP50≥20-1, mientras que ningún ratón en el grupo de control (PBS) desarrolló anticuerpos neutralizantes. El título de ENRP50 en el grupo inmunizado varió de 1:20 a 1:160. Estos resultados demuestran que la inmunización con STF2Δ.DEN2EIII+ (SEQ ID NO: 630) induce anticuerpos neutralizantes, potentes. Ninguno de los sueros de
25 ratones C57B/6 inmunizados con STF2Δ.DEN1EIII+ (SEQ ID NO: 628), STF2Δ.DEN3EIII+ (SEQ ID NO: 632) y STF2Δ.DEN4EIII+ (SEQ ID NO: 634) se seroconvirtió con título de ENRP50≥20-1 .
Estudio con animales n.º 2: como con los ratones C57B/6 en el Estudio n.º 1, los ratones Balb/C inmunizados con STF2Δ.DEN1EIII+ (SEQ ID NO: 628), STF2Δ.DEN2EIII+ (SEQ ID NO: 630), STF2Δ.DEN3EIII+ (SEQ ID NO: 632) o STF2Δ.DEN4EIII+ (SEQ ID NO: 634) desarrollaron altos niveles de IgG de suero reactivo con DEN 80%E homólogo
30 en ensayos de ELISA.
Se ensayaron sueros inmunitarios individuales de ratones Balb/C inmunizados con STF2Δ.DEN1EIII+ (SEQ ID NO: 628), STF2Δ.DEN2EIII+ (SEQ ID NO: 630), STF2Δ.DEN3EIII+ (SEQ ID NO: 632) o STF2Δ.DEN4EIII+ (SEQ ID NO: 634) para neutralización de virus en un ensayo de neutralización de reducción de placas (ENRP). Los resultados de estos ensayos se muestran en las Tablas 25A y 25B.
35 Todos los ratones inmunizados con STF2Δ.DEN1EIII+ (SEQ ID NO: 628) y STF2Δ.DEN2EIII+ (SEQ ID NO: 630) se seroconvirtieron, lo que representa un título de ENRP50 de aproximadamente ≥20-1, mientras que ningún ratón en el grupo de control (PBS) desarrolló anticuerpos neutralizantes. La media geométrica de títulos de ENRP50 en los grupos inmunizados con 3 μg fuer de aproximadamente 439-1 y aproximadamente 1365-1 para DEN1 y DEN2, respectivamente. La mayoría de ratones (9/10 o el 90 %) inmunizados con 3 μg de STF2Δ.DEN3EIII+ (SEQ ID NO:
40 632) se seroconvirtieron, con una media geométrica del título de aproximadamente 19-1, mientras que 4 de 10 ratones inmunizados con 30 μg de STF2Δ.DEN3EIII+ (SEQ ID NO: 632) se seroconvirtieron, con una media geométrica de título de aproximadamente 12-1. No se seroconvirtió ningún ratón inmunizado con STF2Δ.DEN4EIII+ (SEQ ID NO: 634).
Los títulos de neutralización de suero de ratones Balb/C inmunizados con STF2Δ.DEN1EIII+ (SEQ ID NO: 628),
45 STF2Δ.DEN2EIII+ (SEQ ID NO: 630), STF2Δ.DEN3EIII+ (SEQ ID NO: 632) son mejores que los de ratones C57B/6, tanto con respecto a potencia como con respecto a amplitud de respuesta a los diversos serotipos Dengue, lo que muestra que las proteínas de fusión DEN1, 2 y 3 pueden inducir anticuerpos neutralizantes de virus. Esta diferencia con animales en el estudio n.º 1 (ratones C57B/6) puede deberse, en parte, a diferencias en la respuesta inmunitaria al componente de flagelina de la vacuna entre estas dos cepas de ratón genéticamente distintas. La magnitud de la
50 respuesta inmunitaria puede variar entre cepas de ratón, siendo la cepa C57B/6 hiposensible con respecto a Balb/C.
La incapacidad de detectar anticuerpos neutralizantes para el componente DEN4 de la proteína de fusión, STF2Δ.DEN4EIII+ (SEQ ID NO: 634) para inducir anticuerpos neutralizantes en cepas de ratón tanto C57B/6 como Balb/C puede deberse a uno o una combinación de diferentes factores. Por ejemplo, el dominio DEN4 EIII+ de la proteína de fusión puede no haberse replegado en el proceso de purificación a una conformación que presenta de
55 forma apropiada epítopos neutralizantes críticos al sistema inmunitario. Otra posibilidad es que las interacciones físicas entre los dominios de flagelina y antígeno bloqueen la presentación de epítopos críticos para el sistema inmunitario, un fenómeno visto con otras fusiones de flagelina-antígeno. Es posible que construcciones adicionales que incluyen construcciones de flagelina alternativas con antígenos víricos Dengue 4 puedan dar como resultado neutralización.
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Tabla 25A
Inmunógeno
STF2Δ.DEN1EII I+ (SEQ ID NO: 628) STF2 A.DEN 1EIII + (SEQ ID NO: 628) STF2Δ.DEN2EII I+ (SEQ ID NO: 630) STF2Δ.DEN2EII I+ (SEQ ID NO: 630)
Dosis
3 μg 30 μg 3 μg 30 μg
Media geométrica del título
493 331 1365 517
intervalo
120 -5120 60 -1600 480 -5120 160 -1920
seroconversión
10/10 10/10 10/10 10/10
Tabla 25B
Inmunógeno
STF2Δ.DEN3EIII + (SEQ ID NO: 632) STF2Δ.DEN3EIII + (SEQ ID NO: 632) STF2Δ.DEN4EII I+ (SEQ ID NO: 634) STF2Δ.DEN4EII I+ (SEQ ID NO: 634)
Dosis
3 μg 30 μg 3 μg 30 μg
Media geométrica del título
19 12 5 5
intervalo
5-40 5 -80 5 -5 5-5
seroconversión
9/10 4/10 0/10 0/10
5 Ejemplo 12. Clonación, producción y ensayo de inmunogenicidad de proteínas de fusión de antígeno de HPVflagelina recombinantes en E. coli.
Métodos
Clonación de ADN: se optimizaron los codones de genes sintéticos que codificaban las proteínas E6, E7 y L2 de la cepa del virus de papiloma humano 16 (HPV 16) para expresión en E. coli y se sintetizaron por un proveedor 10 comercial (DNA 2.0; Menlo Park, CA). Los genes se diseñaron para incorporar sitios BlpI flanqueantes en los extremos tanto 5’ como 3’. Los fragmentos génicos se escindieron de los plásmidos respectivos con BlpI y se clonaron mediante extremos compatibles en el casete de vector STF2.blp o STF2Δ.blp. Las construcciones de fusión que incorporaban el gen de flagelina de longitud completa se designaron STF2.E6 (SEQ ID NO: 667), STF2.E7 (SEQ ID NO: 668) y STF2.L2. (SEQ ID NO: 669). Las construcciones análogas para el gen de flagelina que carecían
15 de una región bisagra (también denominada en la presente memoria “flagelina truncada” se designaron STF2Δ.E6 (SEQ ID NO: 670), STF2Δ.E7 (SEQ ID NO: 671) y STF2Δ.L2 (SEQ ID NO: 672). Además, un gen sintético que combinaba E6 y E7 se fusionó con STF2 y STF2Δ para crear STF2.E6E7 (SEQ ID NO: 673) y STF2Δ.E6E7 (SEQ ID NO: 674), respectivamente.
En cada caso, los plásmidos construidos se usaron para transformar células E. coli TOP 10 competentes y se
20 identificaron recombinantes potenciales por exploración por PCR y análisis de mapeo de restricción. La integridad de las construcciones se verificó mediante secuenciación de ADN, se usaron construcciones para transformar el hospedador de expresión, BLR (DE3) (Novagen, San Diego, CA; Cat n.º 69053). Se seleccionaron transformantes en placas que contenían kanamicina (50 μg/ml), tetraciclina (5 μg/ml) y glucosa (0,5 %). Se seleccionaron colonias y se inocularon en 2 ml de medio LB complementado con kanamicina 25 μg/ml, tetraciclina 12,5 μg/ml y glucosa 0,5 %
25 y se cultivaron durante una noche. Se usaron alícuotas de estos cultivos para inocular cultivos nuevos en la misma formulación de medio, que se cultivaron hasta que se alcanzó una densidad óptica (DO600nm) = 0,6, momento en el cual se indujo expresión proteica mediante la adición de IPTG 1 mM y se cultivó durante 3 horas a 37 ºC. Después las células se recogieron y analizaron para expresión de proteínas.
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SDS-PAGE y transferencia de Western: se determinaron la expresión e identidad de proteínas mediante electroforesis en gel y análisis de inmunotransferencia. Se recogieron células por centrifugación y se lisaron en tampón de Laemmli. Se diluyó una alícuota de 10 μl de cada lisado en tampón de muestras de SDS-PAGE con o sin
5 ditiotreitol (DTT) 100 mM como un reductor. Las muestras se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel de poliacrilamida SDS 10 % y se sometieron a electroforesis mediante SDS-PAGE. El gel se tiñó con Coomassie R-250 (Bio-Rad; Hercules, CA) para visualizar bandas proteicas. Para Transferencia de Western, se sometieron a electroforesis 0,5 ml/carril de lisado celular y se electrotransfirieron a una membrana de PVDF y se bloquearon con leche en polvo 5 % (p/v).
10 Después la membrana se exploró con anticuerpo anti flagelina (Inotek; Beverly, MA). Después de explorar con anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (Pierce; Rockland, IL), se visualizaron bandas proteicas con un sustrato cromogénico de fosfatasa alcalina (Promega, Madison, WI). Se seleccionaron clones bacterianos que producían bandas proteicas del peso molecular correcto y reactivas con los anticuerpos apropiados para producción de proteína para su uso en ensayos biológicos y experimentos de inmunogenicidad animal.
15 Se enumeran en la Tabla 24 construcciones de ADN que enlazan flagelina con antígenos de HPV 16
Tabla 24: construcciones de ADN de antígeno de HPV 16-flagelina para expresión en E. coli
SEQ ID NO:
Construcción Peso molecular predicho (Da)
667
STF2.E6 71.489
668
STF2.E7 63.323
673
STF2.E6E7 82.362
670
STF2Δ.E6 48.495
671
STF2Δ.E7 40.330
674
STF2Δ.E6E7 59.369
669
STF2.L2 103.009
672
STF2Δ.L2 80.016
675
STF2.E6. CTLHis6 55.402
676
STF2.4xE6CTLHis6 61.394
677
STF2.E7.CTLHis6 55.600
678
STF2.4xE7CTLHis6 62.187
115
HPV 16E6His6 20.010
117
HPV 16E7His6 11.845
119
HPV 16E6E7His6 30.833
121
HPV16L2His6 51.531
Resultados
Como se ensaya mediante tinción con azul de Coomassie del gel de SDS-PAGE, todos los clones presentaron una 20 banda que migraba al peso molecular esperado. La ausencia de esta banda en el cultivo de control (sin IPTG) indica
imagen164
que se induce específicamente por IPTG. La transferencia de Western con anticuerpos específicos para flagelina confirmó que esta especie inducida es la proteína de fusión de antígeno de HPV-flagelina y sugirió que ambas partes de la proteína de fusión se expresaban intactas.
Purificación de STF2.HPV16 E6 (SEQ ID Nº: 679)
5 Métodos
Cultivo bacteriano y lisis celular: STF2.HPV16E6 (SEQ ID NO: 679) se expresó en la cepa hospedadora de E. coli BLR (DE3). Se cultivaron células E. coli y se recogieron como se ha descrito anteriormente. La cepa individual se recuperó de una reserva de glicerol y se cultivó en matraces de agitación hasta un volumen final de 12 litros. Las células se cultivaron en medio LB que contenía kanamicina 50 μg/ml/tetraciclina 12,5 μg/ml/dextrosa 0,5 % hasta
10 DO600 = 0,6 y se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM durante 3 horas a 37 ºC. Las células se recogieron por centrifugación (7000 rpm x 7 minutos en una centrífuga Sorvall RC5C) y se resuspendieron en PBS 1x, glicerol 1 % DNAsa I 1 μg/ml, PMSF 1 mM, cóctel de inhibidor de proteasa y lisozima 1 mg/ml. Las células se lisaron después mediante dos pases a través de un microfluidizador a 103,39 MPa. El lisado se centrifugó después a 45.000xg durante una hora para separar fracciones solubles e insolubles.
15 Purificación de STF2.HPV16E6 (SEQ ID NO: 679) de E. coli: después de lisis celular y centrifugación (véase anteriormente) la fracción de sobrenadante (soluble) se recogió y complementó con Tris 50 mM, pH 8. La solución se aplicó después a una columna de intercambio aniónico Source Q (GE Healthcare: Piscataway, NJ) equilibrada en tampón A (Tris 50 mM, pH 8,0 + EDTA 5 mM). Se ensayaron fracciones de flujo continuo y eluato mediante SDS-PAGE seguido de tinción con azul de Coomassie y transferencia de Western.
20 La proteína de fusión de flagelina-E6 no se unió con la columna y se encontró en la fracción de flujo continuo. La fracción de flujo continuo se dializó durante una noche para Tampón B (ácido cítrico 20 mM, pH 3,5/urea 8 M/EDTA 5 mM/beta-mercaptoetanol 1 mM) y se aplicó a una columna de intercambio catiónico Source S equilibrada en Tampón B. Después de eluir con un gradiente lineal de 5 volúmenes de columna de NaCl 0 -1 M en tampón B, se ensayaron fracciones de eluato mediante SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie y transferencia de
25 Western. La proteína de flagelina-E6 no se unió con esta columna y se recuperó de nuevo en la fracción de flujo continuo. La fracción de flujo continuo se dializó durante una noche para Tampón C (Tris 50 mM, pH 8,0/EDTA 5 mM/urea 8 M) y se aplicó a una columna de intercambio aniónico Source Q (GE Healthcare; Piscataway, NJ) equilibrada en Tampón C. Después de eluir con un gradiente lineal de 5 columnas de NaCl 0-1 M en tampón C, se ensayaron las fracciones de flujo continuo y eluato mediante SDS-PAGE seguido de tinción con azul de Coomassie
30 y transferencia de Western. La proteína de flagelina-E6 no se unió con esta columna y se encontró de nuevo en la fracción de flujo continuo. La proteína de flagelina-E6 se replegó mediante dilución décupla en Tampón D (Tris 20 mM, pH 8,0/NaCl 0,15 M/EGTA 2 mM/ZnCl2 2 μM) y se aplicó a una columna de exclusión por tamaño Superdex 200 (GE Healthcare; Piscataway, NJ) equilibrada en Tampón D. Se ensayaron fracciones de eluato mediante SDS-PAGE seguido de tinción con azul de Coomassie y transferencia de Western. Las fracciones pico se agruparon, se
35 esterilizaron por filtración y se almacenaron a -80 ºC.
Análisis de SDS-PAGE y transferencia de Western: se determinaron la identidad y pureza de proteínas de STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) mediante SDS-PAGE. Se diluyo una alícuota de 5 μg de cada muestra en tampón de muestra de SDS-PAGE con o sin DTT 100 mM como reductor. Las muestras se hirvieron durante 5 minutos y se cargaron en un gel de poliacrilamida al 10 % (LifeGels; French’s Forest, Nueva Gales del Sur, 40 Australia) y se sometieron a electroforesis. El gel se tiñó con Coomassie R250 (Bio-Rad; Hercules, CA) para visualizar bandas proteicas. Para transferencia de Western, se sometieron a electroforesis 0,5 μg/carril de proteína total como se ha descrito anteriormente y después los geles se electrotransfirieron a una membrana de PVDF y se bloquearon con leche en polvo desnatada 5 % (p/v) antes de explorar con anticuerpo anti flagelina (Inotek; Beverly, MA). Después de explorar con anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina (Pierce; Rockland, IL), se
45 visualizaron bandas proteicas con un sustrato cromogénico de fosfatasa alcalina (Promega; Madison, WI).
Ensayo de proteínas: se determinó la concentración de proteína total para todas las proteínas usando el ensayo de Micro BCA (ácido bicincónico) (Pierce; Rockland, IL) en el formato de microplaca, usando albúmina de suero bovino como un patrón, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ensayo de endotoxina: se determinaron los niveles de endotoxina para todas las proteínas usando el kit de ensayo
50 cuantitativo cromogénico LAL QCL-1000 (Cambrex; E. Rutherford, NJ), siguiendo las instrucciones del fabricante para el método de microplaca.
Ensayo de bioactividad de TLR: las células HEK293 expresan de forma constitutiva TLR5 y secretan varios factores solubles, incluyendo IL-8, en respuesta a señalización de TLR5. Se sembraron células en microplacas de 96 pocillos
(50.000 células/pocillo) y se añadió STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) y se incubó durante una noche. Al día
55 siguiente, se recogió el medio acondicionado, se transfirió a una microplaca de 96 pocillos limpia, y se congeló a -20 ºC. Después de descongelar, el medio acondicionado se ensayó con respecto a la presencia de IL-8 en un ELISA de tipo sándwich usando un par de anticuerpos coincidentes anti IL-8 humana (Pierce; Rockland, IL) n.º M801E y M802B) siguiendo las instrucciones del fabricante. La densidad óptica se midió usando un espectrofotómetro de microplaca (FARCyte, GE Healthcare; Piscataway, NJ).
imagen165
Estudios con animales: se usaron ratones hembra C57B/6 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) de 6-8 semanas de vida. Los ratones se dividieron en grupos de 6 y recibieron inmunizaciones subcutáneas (s.c.) inguinales los días 0 y 14 de la siguiente manera:
5 9. PBS (solución salina tamponada con fosfato)
10.
3 μg de STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) en PBS
11.
30 μg de STF2.HPV16E6 (SEQ ID NO: 679) en PBS
12.
3 μg de STF2.HPV16E6 (SEQ ID NO: 679) formulado en adyuvante TiterMax Gold (CytRx; Norcross, GA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
10 13. 30 μg de STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) formulada en adyuvante TiterMax Gold.
Siete (7) días después de la inmunización primaria y siete (7) días después de la inmunización de refuerzo, se sacrificaron 2 animales de cada grupo, se retiraron los bazos y se usaron los esplenocitos en ensayos de ELISPOT para analizar las respuestas inmunitarias específicas de antígeno.
Ensayos de ELISPOT específicos de antígeno: se añadieron células del bazo (106 células/pocillo) de animales 7 días
15 después de la inmunización primaria o 7 días después de la inmunización de refuerzo con STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO 679) a placas Multiscreen-IP de 96 pocillos (Millipore; Billerica, MA) recubiertas con anticuerpo de captura anti IFNγ o IL-5 (eBioscience; San Diego, CA) diluido en PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después se estimularon linfocitos T durante una noche con células presentadoras de antígeno (CPA) sin tratamiento previo (106 células/pocillo) en ausencia o presencia de un péptido antigénico específico de HPV E6, NH3 -EVYDFAFRDL
20 COOH (AnaSpec; San Jose, CA) (SEQ ID NO: 680). Se usó anti CD3 (BD Pharmingen; San Jose, CA) como un control positivo a una concentración final de 0,25 μg/ml. Las placas se incubaron durante una noche a 37 ºC/CO2 5 %, después se lavaron y se incubaron con anticuerpo de detección biotinilado diluido en PBS/suero bovino fetal al 10 % (FBS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las placas se desarrollaron usando el Módulo de Desarrollo de Color Azul ELISPOT de acuerdo con el protocolo del fabricante (R & D Systems, Minneapolis, MN). Se
25 ensayaron respuestas específicas de antígeno por duplicado a partir de animales individuales y se cuantificaron usando un lector ELISPOT automático (Cellular Technology Ltd.; Cleveland, OH). Los datos se representan como el número de respuestas específicas de antígeno/106 CPA.
Resultados y análisis
Rendimiento y pureza de proteínas: se produjo STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) en alto rendimiento a partir de
30 cultivo celular de E. coli. Después de purificación el rendimiento fue de aproximadamente 5,7 mg de proteína total, se estimó que la pureza era mayor de aproximadamente 85 % mediante SDS-PAGE, con un nivel de endotoxina de aproximadamente 0,97 UE/μg. Sin embargo, la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño final (CET) en la purificación mostró que la proteína STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) eluía en el volumen vacío (datos no mostrados). Este resultado sugiere que la proteína no es monomérico y es probable que esté agregada. La proteína
35 de fusión STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) mostró bioactividad de TLR5 in vitro positiva, aunque menor que la vista habitualmente para proteínas de fusión antígeno-flagelina monoméricas.
Inmunogenicidad de STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679): los resultados del ensayo de ELISPOT indican que los ratones desarrollaron respuestas de linfocitos T específicas de antígeno después de una única inmunización con STF2.HPV E6 (SEQ ID NO: 679) y que los ratones inmunizados con simulación no. Tras la estimulación con células 40 presentadoras de antígenos (CPA) sensibilizadas con el péptido E6 de HPV16 (SEQ ID NO: 680), aproximadamente 10 células/106 esplenocitos secretaron IFN-γ, frente a ninguno en el grupo inmunizado con simulación. Un número similar de células de animales inmunizados con STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) secretaron IL-5 frente a aproximadamente 3 en el grupo de simulación. Las CPA sin tratamiento previo sensibilizadas con simulación con tampón no estimularon la producción de IFN-γ o IL-5 en ninguno de los grupos. Como control positivo, la mitad de
45 los grupos de ratones se inmunizaron con proteína STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) formulada en adyuvante TiterMax Gold (CytRx; Norcross, GA). No resulta sorprendente que este adyuvante potente (que no es aceptable para uso humano) reforzara significativamente el número de células secretoras de IFN-γ e IL-5.
Los ensayos de ELISPOT realizados en células del bazo recogidas 7 días después de la inmunización de refuerzo con STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) mostraron un aumento significativo en las respuestas de linfocitos T 50 específicas de antígeno E6 frente a células recogidas después de la inmunización primaria. Tras la estimulación con células presentadoras de antígenos (CPA) sensibilizadas con el péptido HPV16 E6 (SEQ ID NO: 680), > 150 células/106 esplenocitos en el grupo de 3 μg y > 50 células/106 esplenocitos en el grupo de 30 μg secretaron IFN-γ. > 40 células/106 esplenocitos en el grupo de 3 μg y > 20 células/106 esplenocitos en el grupo de 30 μg secretaron IL
5. Menos de 10 células/106 esplenocitos en el grupo inmunizado con simulación secretaron IFN-γ o IL-5. Por lo tanto,
55 en ambos grupos de dosis después de refuerzo la respuesta de IFN-γ predominó frente a la respuesta de IL-5, mientras que estas respuestas eran aproximadamente equivalentes cuando se ensayaron después de la inmunización primaria. Como se ha visto con ratones que recibieron solamente una inmunización, los ratones inmunizados dos veces con proteína STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) formulada en adyuvante TiterMax Gold (CytRx; Norcross, GA) mostraron una respuesta de linfocitos T potenciada en comparación con ratones inmunizados dos veces con proteína STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) formulada solamente en PBS.
imagen166
5 Un factor que puede influir en la respuesta inmunitaria inducida por STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) en este experimento es el estado agregado de la proteína de fusión STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 209), que puede obstaculizar la señalización apropiada del dominio de flagelina a través de TLR5. La proteína de fusión monomérica STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO: 679) puede inducir respuestas de linfocitos T específicas de antígeno más fuertes. La mutación de uno o más restos de cisteína en la proteína E6 con otro aminoácido puede dar como resultado una
10 proteína de fusión de flagelina-E6 que es monomérica o menos agregada que la proteína de fusión de flagelina-E6 de tipo silvestre eliminando o reduciendo la posibilidad de enlaces disulfuro inapropiados.
Equivalentes
Aunque la presente invención se ha mostrado en particular y se ha descrito con referencia a realizaciones ejemplares de la misma, se entenderá por los expertos en la materia que pueden realizarse diversos cambios de
15 forma y detalles en la misma sin alejarse del alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (13)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80,0% de identidad con la secuencia de aminoácidos contigua
    como se expone en SEQ ID NO: 29 (R3), en donde la secuencia de aminoácidos aislada activa un receptor de tipo 5 Toll 5.
  2. 2.
    La secuencia de aminoácidos de la reivindicación 1, en donde al menos un resto de aminoácido de SEQ ID NO: 29 seleccionado del grupo que consiste en 84, 91, 95, 322 y 326 se sustituye por un resto de alanina.
  3. 3.
    Una proteína de fusión que comprende:
    a) al menos una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 29 (construcción de R3) y al menos
    10 una porción de al menos un antígeno vírico, en donde el antígeno vírico está entre los restos de aminoácidos 190 y 191 de SEQ ID NO: 29, y en donde la proteína de fusión activa un receptor de tipo Toll 5; o b) al menos una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 29 (construcción R3-2xAg) y al menos una porción de al menos dos antígenos víricos, en donde al menos un antígeno vírico está entre los restos de aminoácidos 190 y 191 de SEQ ID NO: 29 y al menos otro antígeno vírico está fusionado con el resto
    15 de aminoácido 405 de SEQ ID NO: 29 y en donde la proteína de fusión activa un receptor de tipo Toll 5.
  4. 4. La proteína de fusión de la reivindicación 3b), en donde los antígenos víricos son antígenos distintos o antígenos similares.
  5. 5. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a), 3 b) o 4 para su uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria en un ser humano en donde la proteína de fusión se administra al ser humano en al 20 menos una dosis seleccionada del grupo que consiste en una dosis de aproximadamente 10,0 μg, una dosis de aproximadamente 5,0 μg, una dosis de aproximadamente 3,0 μg, una dosis de aproximadamente 2,5 μg, una dosis de aproximadamente 1,0 μg, una dosis de aproximadamente 0,5 μg, una dosis de aproximadamente 0,3 μg, una dosis de aproximadamente 0,25 μg, una dosis de aproximadamente 0,1 μg, una dosis de aproximadamente 0,05 μg, una dosis de aproximadamente de 0,025 μg y una dosis de aproximadamente 0,01 μg; y opcionalmente en donde la
    25 administración de la composición al ser humano proporciona inmunidad protectora contra una infección consecuente del contacto del ser humano con una fuente del antígeno vírico.
  6. 6. Una proteína de fusión que incluye una porción de una proteína flagelina de origen natural, en donde
    la porción incluye, en secuencia, un dominio amino 0, un dominio amino 1, un dominio amino 2, un antígeno vírico, un dominio carboxilo 2, un dominio carboxilo 1 y un dominio carboxilo 0.
    30 7. La proteína de fusión de la reivindicación 6 que incluye además al menos una porción de al menos un antígeno vírico adicional fusionado con el dominio carboxilo 0 de la porción de la proteína flagelina de origen natural (R32XAg); y en cuyo caso en donde opcionalmente además el antígeno vírico y el antígeno vírico adicional son similares o distintos.
  7. 8. Un método para preparar una proteína de fusión que activa un receptor de tipo Toll 5, que comprende las etapas 35 de:
    a) separar una porción de una proteína de una flagelina de origen natural para formar de este modo una porción de proteína, en donde la porción de proteína incluye, en secuencia, un dominio amino 0, un dominio amino 1, un dominio amino 2, un dominio carboxilo 2, un dominio carboxilo 1 y un dominio carboxilo 0. b) unir operativamente una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno vírico con una
    40 secuencia de ácido nucleico que codifica la porción proteica, la secuencia de ácido nucleico del antígeno vírico unida operativamente entre la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio amino 2 y el dominio carboxilo 2 de la porción proteica para generar de este modo una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión; c) transformar la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión en una célula hospedadora; y
    45 d) cultivar la célula hospedadora para preparar de este modo una proteína de fusión que activa un receptor de tipo Toll 5.
  8. 9. El método de la reivindicación 8, en donde:
    i) la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota o una célula hospedadora eucariota; ii) incluye además las etapas de:
    50 unir operativamente una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno vírico adicional con el extremo 3’ de la secuencia de ácido nucleico que codifica la porción proteica (R3-2xAg); en cuyo caso opcionalmente además en donde el antígeno vírico adicional codificado por la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno vírico adicional es similar al antígeno vírico codificado por la secuencia de ácido nucleico unida operativamente entre la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio amino 2 y el dominio
    55 carboxilo 2 de la porción proteica, o distinto del antígeno vírico codificado por la secuencia de ácido nucleico unida operativamente entre la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio amino 2 y el dominio carboxilo
    139
    imagen2
    2 de la porción proteica; o iii) en donde el antígeno vírico o el antígeno vírico adicional es un antígeno de gripe, y en cuyo caso opcionalmente en donde el antígeno de gripe es un antígeno vírico de gripe de hemaglutinina o un antígeno vírico de gripe de matriz 2.
    5 10. La secuencia de aminoácidos de las reivindicaciones 1 o 2, la proteína de fusión de las reivindicaciones 3, 4, 6 o 7, el uso de la reivindicación 5 o el método de las reivindicaciones 8 o 9, que incluye además al menos una nanopartícula asociada con la secuencia de aminoácidos o, la proteína de fusión y una relación molar del antígeno con respecto a la flagelina en la proteína de fusión no es mayor de aproximadamente 1,
    en donde:
    10 i) el diámetro promedio de la nanopartícula es al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 20 nanómetros, aproximadamente 25 nanómetros, aproximadamente 30 nanómetros, aproximadamente 40 nanómetros, aproximadamente 50 nanómetros, aproximadamente 75 nanómetros, aproximadamente 100 nanómetros, aproximadamente 125 nanómetros , alrededor de 150 nanómetros, aproximadamente 175 nanómetros y aproximadamente 200 nanómetros; o
    15 ii) la nanopartícula incluye al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en poli(d,l-lactida-coglicólido) y bisaciloxipropilcisteína; o iii) la asociación de la secuencia de aminoácidos, o la proteína de fusión con la nanopartícula es un enlace covalente; y en cuyo caso opcionalmente en donde el enlace covalente es un enlace no polar o un enlace polar; o
    20 iv) la asociación de la secuencia de aminoácidos, o la proteína de fusión con la nanopartícula es un enlace no covalente; y en cuyo caso opcionalmente en donde el enlace no covalente es al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un enlace de hidrógeno, una interacción de van der Waals, un enlace iónico, una interacción hidrófoba y una interacción dipolo-dipolo; o v) la nanopartícula es biodegradable; o
    25 vi) la relación molar del antígeno vírico con respecto a la secuencia de aminoácidos de porción de flagelina se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,1, aproximadamente 0,05, aproximadamente 0,01, aproximadamente 0,005, aproximadamente 0,001, aproximadamente 0,0005, aproximadamente 0,0001, aproximadamente 0,00005 y aproximadamente 0,00001; o vii) la secuencia de aminoácidos o la proteína de fusión se asocia con una superficie externa de la nanopartícula;
    30 o viii) el antígeno vírico se asocia con una superficie interna de la nanopartícula.
  9. 11.
    La secuencia de aminoácidos de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde al menos una porción de al menos un antígeno vírico está fusionada con la secuencia de aminoácidos.
  10. 12.
    La proteína de fusión de las reivindicaciones 3, 4, 6 o 7, el uso de la reivindicación 5 o el método de las
    35 reivindicaciones 8 o 9 en donde el antígeno vírico es un antígeno proteico; y en cuyo caso opcionalmente además en donde el antígeno proteico vírico es al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un antígeno proteico vírico de la gripe, un antígeno proteico vírico sincitial respiratorio y un antígeno proteico de flavivirus; en cuyo caso opcionalmente además en donde el antígeno proteico vírico es el antígeno proteico vírico de la gripe; en cuyo caso opcionalmente además en donde el antígeno de gripe incluye al menos un antígeno proteico de
    40 membrana integral; en cuyo caso opcionalmente además en donde el antígeno proteico de membrana integral incluye al menos una porción de al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una proteína hemaglutinina, una proteína neuraminidasa y una proteína de matriz 2 y opcionalmente además una proteína de ectodominio de matriz 2.
  11. 13. La proteína de fusión, la secuencia de aminoácidos, el uso o método de la reivindicación 12, en donde el
    45 antígeno vírico es un antígeno vírico de la gripe y opcionalmente al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en una cepa H1, H2, H3, H4, H5, H7, H9 y H13 de gripe.
  12. 14. La proteína de fusión o la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 13, en donde el antígeno vírico de gripe es un antígeno vírico de hemaglutinina.
  13. 15. La proteína de fusión o la secuencia de aminoácidos de la reivindicación 14, en donde el antígeno vírico de 50 hemaglutinina incluye al menos una porción de una cabeza globular.
    140
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