CN111793591B - 一株高效刺激免疫反应的沙门菌突变株及构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株能够高效刺激宿主产生针对志贺氏菌福氏2a血清型O抗原多糖的免疫反应的沙门菌突变株及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的一株沙门菌突变菌株发生以下基因缺失突变ΔfliC、ΔfljB、ΔompA、ΔompC、ΔompD，并敲除利于异源O抗原多糖表达的基因rfbP，同时转入能够完整表达志贺氏菌O抗原多糖的表达质粒。其保藏号为CCTCC NO:M 2020142，保藏于中国典型培养物保藏中心。该突变菌株通过对沙门菌外膜结构的改造，使其更高效的作为多糖递呈载体来应用，同时将志贺氏菌的O抗原多糖表达至沙门菌外膜中，并纯化外膜囊泡，能够高效刺激宿主产生免疫反应并分泌外膜囊泡，从而递呈异源多糖抗原作为疫苗，能够高效用于志贺氏菌感染的防治。

Description

一株高效刺激免疫反应的沙门菌突变株及构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高效刺激宿主产生针对志贺氏 菌O抗原多糖免疫反应的沙门菌突变株及构建方法和应用。

背景技术

志贺氏菌属(Shigella spp.)细菌是一类具有高度传染性以及致病性，并且 会引起人类严重腹泻甚至死亡的革兰氏阴性菌，俗称痢疾杆菌，是人类细菌性痢 疾最为常见的病原菌。痢疾是一种全世界范围内高发的肠道传染病，据保守估计， 全世界每年的感染人数超过1.6亿，死亡人数超过110万人，痢疾尤其在发展中 国家存在多发现象。

志贺氏菌属细菌分为四个群体。A群：痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)，通 称志贺氏痢疾杆菌；B群：福氏志贺氏菌(Sh.flexneri)，通称福氏痢疾杆菌；C群： 鲍氏志贺氏菌(Sh.boydii)，通称鲍氏痢疾杆菌；D群：宋内氏志贺氏菌(Sh.sonnei)， 通称宋内氏痢疾杆菌。上述志贺氏菌属中各菌株都有强烈的内毒素，作用于肠壁， 使通透性增高，从而促使毒素的吸收，继而作用于中枢神经系统及心血管系统， 引起临床上一系列毒血症症状，如发热、神志障碍，甚至中毒休克。其毒素破坏 粘膜，形成炎症、溃疡，呈现典型的痢疾脓血便。毒素作用于肠壁植物神经，使 肠道功能紊乱，肠蠕动共济失调和痉挛，尤其直肠括约肌最明显，因而发生腹痛、 里急后重等症状。

志贺氏菌属的发现虽已有一百多年，且针对细菌性痢疾的疫苗研究从20世 纪40、50年代就已经开展，但是目前仍有问题需要解决。现有研究已经发现了 一些具有潜力的候选疫苗靶标，其中志贺氏菌的脂多糖(Lipopolysaccharide)能 够表现较好的保护力，有研究证明志贺氏菌脂多糖与蛋白的复合体能够激发小鼠 很高的血清抗体滴度，并且能够表现一定的保护力，临床实验表明，福氏2a (Shigellaflexneri 2a)的O抗原多糖能够引起特异的免疫保护，但脂多糖最关键 的问题在于进入宿主体内，不能有效的到达宿主免疫系统被免疫系统识别，从而 有一定概率导致免疫失败。这一缺陷极大的限制了志贺氏菌疫苗在实际临床中的 应用效果，因此开发新的疫苗迫在眉捷，如何开发新的疫苗能够保证高效刺激宿 主产生免疫反应，这一问题目前亟待解决。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一株能够高效刺激宿主 产生针对志贺氏菌福氏2a血清型O抗原多糖的免疫反应的沙门菌突变菌株及其 构建方法和应用。本发明的突变菌株是通过对沙门菌外膜结构的改造，使其更高 效的作为多糖递呈载体来应用，同时将志贺氏菌的O抗原多糖表达至沙门菌外 膜中，并纯化外膜囊泡，利用外膜囊泡能够高效刺激宿主产生免疫反应的特性， 从而递呈异源多糖抗原作为疫苗，用于防治志贺氏菌的感染。

本发明的目的之一是提供一株高效刺激宿主产生针对志贺氏菌O抗原多糖 的免疫反应的沙门菌突变株，该突变株发生以下基因缺失突变ΔfliC、ΔfljB、 ΔompA、ΔompC、ΔompD，并敲除利于志贺氏菌O抗原多糖表达的基因rfbP， 同时转入能够表达志贺氏菌O抗原的表达质粒。

本发明提供的上述突变菌株，采用基因工程改造的方法，通过对沙门菌外 膜结构的改造，使其更高效的作为多糖递呈载体来应用，通过缺失rfbP基因去 掉沙门菌自身O抗原；去掉干扰沙门菌外膜囊泡免疫反应的FliC和FljB鞭毛蛋 白；去掉沙门菌自身非必须的外膜蛋白OmpA、OmpC和OmpD，以排除自身外 膜蛋白对所递呈多糖的免疫干扰；利用表达质粒表达完整志贺氏菌福氏2a菌株 的O抗原多糖，通过沙门菌自身WaaL氨基转移酶连接至沙门菌外膜上。

本发明首次将志贺氏菌的O抗原多糖表达至沙门菌外膜中，并纯化突变株 的外膜囊泡，利用外膜囊泡能够高效刺激宿主产生免疫反应的特性，从而递呈异 源多糖抗原作为疫苗。此种疫苗设计策略在全球范围内均属首次，同时该技术策 略的成功构建也能够运用于其他重要革兰氏阴性肠道致病菌的多糖重组疫苗的 研发。

具体的，本发明上述突变菌株的命名为：Salmonella enterica serovarTyphimurium str.UK-1ΔfliCΔfljBΔompAΔompCΔompDΔrfbP，保藏号为CCTCC NO:M2020142，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：中国.武 汉.武汉大学，保藏时间为2020年5月25日。

具体的，编码所述fliC蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码 所述fljB蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

具体的，编码所述ompA蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，编 码所述ompC蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，编码所述ompD蛋白 的基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

具体的，所述引入rfbP的突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

具体的，所述编码志贺菌O抗原的基因簇序列如SEQ ID No.7所示。

本发明的目的之二是提供上述高效刺激宿主产生针对志贺氏菌O抗原多糖 的免疫反应的沙门菌突变株的构建方法，其包括以下步骤：

1)通过同源重组的方法，在鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株S100中敲除沙门菌 干扰外膜囊泡免疫反应的鞭毛蛋白FliC和FljB；

2)通过同源重组的方法，去掉沙门菌自身非必须的外膜蛋白OmpA、OmpC 和OmpD；

3)将截断志贺氏菌O抗原多糖表达的突变基因ΔrfbP引入步骤2)的突变 株中，构建得到沙门菌突变菌株。

所述步骤1)、2)和3)的同源重组的方法包括如下步骤：

1)构建同源重组质粒pRE112-FliC、pRE112-FljB、pRE112-OmpA、 pRE112-OmpC、pRE112-OmpD、pRE112-rfbP以及表达志贺氏菌O抗原的表达 质粒；

2)制备鼠伤寒沙门氏菌S100电转化感受态细胞χ7232；

3)将步骤1)所得同源重组质粒通过电转的方式转化入鼠伤寒沙门氏菌S100 电转化感受态细胞χ7232中，将电转杯移入电转仪，2500伏电击4毫秒；

4)将电击杯中的液体加入100μL预热的LB培养基，轻轻吹熄混匀后涂布 与含有氯霉素抗性(CmR)的平板上，37℃培养过夜，产生的单克隆即为电转 成功的菌；

5)通过PCR筛选得到不含FliC、FljB、OmpA、OmpC、OmpD和rfbP的 突变菌株。

所述鼠伤寒沙门氏菌S100电转化感受态细胞χ7232的制备方法包括如下步 骤：

1)挑取单菌落χ7232接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，取400 μL母液加入到100ml装有LB培养基的三角瓶中，37℃、180r/min振荡培养至 OD600＝0.8-1；

2)冰浴30min，4℃，4500r/min离心10min收集菌体，沉淀用冰浴预冷的 超纯水洗两遍，弃上清；

3)用预冷的10％甘油洗一遍，弃上清，菌体用60μL预冷的10％甘油重悬， 即制备好感受态备用

所述同源重组质粒pRE112-FliC、pRE112-FljB、pRE112-OmpA、 pRE112-OmpC、pRE112-OmpD、pRE112-rfbP的构建步骤为：

1)含有fliC基因上下游同源臂的同源重组质粒pRE112-fliC的构建：

根据GenBank上已发表沙门氏菌UK-1，全基因组序列，序列号为： GCF_000006945，设计fliC基因的左右同源臂，运用VecterNTI软件设计下述引 物：

fliC-1F：5’CGTTCTTTGTCAGGTCTGTC3’

fliC-2R：5’GATTAGCGGCCGCGATCTTTTCCTTATCAATTA3’

fliC-2F：5’AAGATCGCGGCCGCTAATCCGGCGATTGATTCAC3’

fliC-2R：5’TGTACCCGGCACAGACGGTC3’

提取处于对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株S100的基因组DNA作 为模板，分别扩增对应的上下游同源臂片段，得到其左右同源臂的扩增产物，扩 增产物利用1F和2R引物进行重叠PCR扩增，用重叠PCR方法连接前后臂片段； 再用Ahd I酶切自杀质粒载体pYA4278，酶切产物与预先PCR扩增的融合片段 进行连接并转入鼠伤寒沙门氏菌S100电转化感受态细胞χ7232中，得到重组质 粒pRE112-fliC。

2)含有fljB基因上下游同源臂的同源重组质粒pRE112-fljB的构建：

根据GenBank上已发表沙门氏菌UK-1，全基因组序列，序列号为： GCF_000006945，设计fliC基因的左右同源臂，运用VecterNTI软件设计下述引 物：

fljB-1F：5’AGTGAGCTCCACGTTCATGT3’

fljB-1R：5’AATTAGCGGCCGCAAAATTTTCCTTTTGGAAGG3’

fljB-2F：5’ATTTTGCGGCCGCTAATTTATTTCGTTTTATTC3’

fljB-2R：5’GTCATTACCTGATAATTCTTC3’

提取处于对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株S100的基因组DNA作 为模板，分别扩增对应的上下游同源臂片段，得到其左右同源臂的扩增产物，扩 增产物利用1F和2R引物进行重叠PCR扩增，用重叠PCR方法连接前后臂片段； 再用Ahd I酶切自杀质粒载体pYA4278，酶切产物与预先PCR扩增的融合片段 进行连接并转入鼠伤寒沙门氏菌S100电转化感受态细胞χ7232中，得到重组质 粒pRE112-fljB。

3)含有OmpA基因上下游同源臂的同源重组质粒pRE112-OmpA的构建：

根据GenBank上已发表沙门氏菌UK-1，全基因组序列，序列号为： GCF_000006945，设计OmpA基因的左右同源臂，运用VecterNTI软件设计下 述引物：

ompA-1F：5’CATCCTCTCACACAACGAGAC3’

ompA-1R：

5’CTGCAGGAATGCGGCCGCCGGGGGATCTGCTCAATATT3’

ompA-2F：

5’CGGCCGCATTCCTGCAGGTAAGTTATCGTCTGGTAGAAAAAC3’

ompA-2R：5’CATATGAATCCGGAACTGGTC3’

提取处于对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株S100的基因组DNA作 为模板，分别扩增对应的上下游同源臂片段，得到其左右同源臂的扩增产物，扩 增产物利用1F和2R引物进行重叠PCR扩增，用重叠PCR方法连接前后臂片段； 再用Ahd I酶切自杀质粒载体pYA4278，酶切产物与预先PCR扩增的融合片段 进行连接并转入鼠伤寒沙门氏菌S100电转化感受态细胞χ7232中，得到重组质 粒pRE112-OmpA。

4)含有OmpC基因上下游同源臂的同源重组质粒pRE112-OmpC的构建：

根据GenBank上已发表沙门氏菌UK-1，全基因组序列，序列号为： GCF_000006945，设计OmpC基因的左右同源臂，运用VecterNTI软件设计下述 引物：

ompC-1F：5’GCCAATACGCAGCGCCGAGGTCACG3’

ompC-1R：

5’ACCTGCAGGATGCGGCCGCGGTCAGCAAAAGATG3’

ompC-2F：

5’CCGCGGCCGCATCCTGCAGGTGTTATTAACCCTCTG3’

ompC-2R：5’ATAGGGGTAAACAGACATTCAGAAG3’

提取处于对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株S100的基因组DNA作 为模板，分别扩增对应的上下游同源臂片段，得到其左右同源臂的扩增产物，扩 增产物利用1F和2R引物进行重叠PCR扩增，用重叠PCR方法连接前后臂片段； 再用Ahd I酶切自杀质粒载体pYA4278，酶切产物与预先PCR扩增的融合片段 进行连接并转入鼠伤寒沙门氏菌S100电转化感受态细胞χ7232中，得到重组质 粒pRE112-OmpC。

5)含有OmpD基因上下游同源臂的同源重组质粒pRE112-OmpD的构建：

根据GenBank上已发表沙门氏菌UK-1，全基因组序列，序列号为： GCF_000006945，设计OmpD基因的左右同源臂，运用VecterNTI软件设计下 述引物：

ompD-1F:5’AAAGTTAATGATGATAGCGG3’

ompD-1R:5’CTGCAGGAATGCGGCCGCGTTATTAACCCTCTGTTATA3’

ompD-2F:5’CGGCCGCATTCCTGCAGGTAATCTCGATGGATATCGAAC3’

ompD-2R:5’CGTTAAAGCGCATCAGCGCG3’

提取处于对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株S100的基因组DNA作 为模板，分别扩增对应的上下游同源臂片段，得到其左右同源臂的扩增产物，扩 增产物利用1F和2R引物进行重叠PCR扩增，用重叠PCR方法连接前后臂片段； 再用Ahd I酶切自杀质粒载体pYA4278，酶切产物与预先PCR扩增的融合片段 进行连接并转入鼠伤寒沙门氏菌S100电转化感受态细胞χ7232中，得到重组质 粒pRE112-OmpD。

6)含有rfbP基因上下游同源臂的同源重组质粒pRE112-rfbP的构建：

根据GenBank上已发表沙门氏菌UK-1，全基因组序列，序列号为： GCF_000006945，设计rfbP基因的左右同源臂，运用VecterNTI软件设计下述 引物：

rfbP-1F：5’CAACTGATAAAAGTCAATCC3’

rfbP-1R：

5’GTAAGCTTACCTGCAGGTTAATCCTCACCCTCTGA3’

rfbP-2F：

5’GATTAACCTGCAGGTAAGCTTACCGAGAAGTACTGA3’

rfbP-2R：5’ATACGACGAGGCGTTTCGAG3’

提取处于对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株S100的基因组DNA作 为模板，分别扩增对应的上下游同源臂片段，得到其左右同源臂的扩增产物，扩 增产物利用1F和2R引物进行重叠PCR扩增，用重叠PCR方法连接前后臂片段； 再用Ahd I酶切自杀质粒载体pYA4278，酶切产物与预先PCR扩增的融合片段 进行连接并转入鼠伤寒沙门氏菌S100电转化感受态细胞χ7232中，得到重组质 粒pRE112-rfbP。

同源重组质粒由于不能在沙门氏菌中不能复制存活，将含有同源片段的同源 重组质粒通过电转化的方式转入大肠杆菌Δasd缺失株χ7213中，通过同源片段的 同源重组作用，能够使左右同源臂中缺失目的基因的全片段与基因组中的目的基 因上、下游的同源臂发生替换从而将基因敲除。最后利用PCR的方法鉴定得到 沙门氏菌突变体ΔfliCfljBΔompAΔompCΔompDΔrfbP。

7)志贺氏菌O抗原表达载体的构建：

根据GenBank上已发表志贺氏菌福氏2a，全基因组序列，序列号为： GCF_002950215.1，设计O抗原基因的左右同源臂，运用VecterNTI软件设计 下述引物：

2a-F-vector： 5’CGCCTGCATATAGCCCATTTCAGAATGGCCGGCCGCAGTC3’

2a-R-vector： 5’GAAAGTCGTGGTTATACCGCTCATGAGACAATAACCCTG3’

2a-1F：5’CCGCCATTCTGAAATGGGCTATATGCAGGCGTTTGTGAA3’

2a-1R：5’AATGCATTTCTTACTCGATAATAAC3’

2a-2F：5’CTGTGGGATTAACATACCAATTCAC3’

2a-2R：5’ATTGTCTCATGAGCGGTATAACCACGACTTTCGATGTTG3’

提取处于对数生长期的福氏2a志贺氏菌的基因组DNA作为模板，分别扩增 对应的上下游同源臂片段，得到其左右同源臂的扩增产物。以其基因组为模板， 用LAtaq聚合酶进行扩增，通过两对引物2a-1F/2a-1R和2a-2F/2a-2R来扩增完 整的O抗原基因簇，大小分别约为8000bp，并以载体pSC101为模板扩增载体 片段，大小约为6000bp，用浓度为0.8％的结晶紫琼脂糖凝胶回收片段，用Gibson 组装试剂盒(GibsonAssembly Master Mix,NEB)，通过在设计引物时在片段中 加入overlap片段，从而片段能够通过重叠片段，并通过gibson组装酶连接成一 个完整的质粒。加好体系后在50摄氏度作用1小时，取2微升用电转化的方法 将连接物转化入TOP10感受态细胞内，涂布于Kan平板上，放置与37℃待菌落 长出后挑菌用相应引物进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的菌落再次进行对其表 达O抗原的后续鉴定。

本发明的目的之三是提供上述高效刺激宿主产生志贺氏菌O抗原多糖免疫 反应的沙门菌突变株的应用，是将该突变菌株纯化其自发产生的外膜囊泡用于制 备成疫苗用于防治志贺氏菌的感染。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1)本发明首次将志贺氏菌的O抗原多糖表达至沙门菌外膜上，通过纯化其 外膜囊泡，利用外膜囊泡能够高效刺激宿主产生免疫反应的特性，从而递呈异源 多糖抗原作为疫苗。

2)本发明通过对沙门菌外膜结构的改造，使其更高效的作为多糖递呈载体 来应用，包括：缺失rfbP基因去掉沙门菌自身O抗原；去掉干扰沙门菌外膜囊 泡免疫反应的FliC和FljB鞭毛蛋白；去掉沙门菌自身非必须的外膜蛋白OmpA、 OmpC和OmpD，以排除自身外膜蛋白对所递呈多糖的免疫干扰；利用表达质粒 表达完整志贺氏菌福氏2a菌株的O抗原多糖，通过沙门菌自身WaaL氨基转移 酶连接至沙门菌外膜上。

附图说明

图1为构建得到的表达LPS、S.flexneri 2a O-抗原基因簇的质粒。

图2为利用cryo-EM鉴定所纯化得到的能够表达志贺氏菌O抗原多糖的沙门菌 突变株的外膜囊泡外观形态。

图3为采用银染法对表达志贺氏菌O抗原多糖的鼠伤寒沙门氏菌抗原递呈疫苗 的外膜囊泡脂多糖图谱的鉴定结果。

图4为采用免疫印迹法对表达志贺氏菌O抗原多糖的鼠伤寒沙门氏菌抗原递呈 疫苗的外膜囊泡的鉴定结果。

图5为验证突变菌株外膜囊泡介导志贺菌O抗原多糖诱导免疫应答的测试结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对 本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释 和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些 非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

突变菌株的构建方法：

以鼠伤寒沙门菌UK-1菌株为模板，对基因进行敲除，构建突变株QS001 (ΔfliCΔfljBΔompAΔompCΔompD)。纯化其外膜囊泡，通过SDS-PAGE验证 外膜囊泡中不含鞭毛蛋白以及OmpACD。验证构建成功后，再将截断脂多糖O 抗原链的突变(ΔrfbP)引入突变株QS001中，构建O抗原突变株，并通过PCR 以及银染(Sliver staining)观察其脂多糖图谱的方法鉴定所构建的突变株。

实验例1

构建表达LPS、S.flexneri 2a O-抗原基因簇的质粒：

1、ΔfilC引物设计和PCR扩增

根据已报到的沙门氏菌S100菌株序列，(参照GenBank序列号为 GCF_000006945)设计两对融合PCR引物分别扩增filC基因的上游同源臂以及 下游同源臂，扩增片段大小分别为300bp，上述引物均由北京华大基因公司合成， 引物序列如下：

fliC-1F：CGTTCTTTGTCAGGTCTGTC

fliC-1R：GATTAGCGGCCGCGATCTTTTCCTTATCAATTA

fliC-2F：AAGATCGCGGCCGCTAATCCGGCGATTGATTCAC

fliC-2R：TGTACCCGGCACAGACGGTC

2、沙门氏菌filC基因的上、下游同源臂的扩增

煮沸裂解法制备鼠伤寒沙门氏菌S100的基因组DNA模板：挑取鼠伤寒沙 门氏菌S100单菌落于LB培养基37℃过夜培养，第二天取0.5ml菌液12000 r/min离心3min，弃上清，收集菌体用超纯水洗一次，并重悬。放于沸水中煮 10min，冷却过后12000r/min离心3min，以上清作为模板备用。

PCR的扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系如下：10×PCR buffer (Mg2+)2.5μL，dNTP(10mM)1.5μL，Primer 1(50mM)0.25μL，Primer 2(50mM) 0.25μL，DNA模板2μL，超纯水17μL，Taq DNA高保真酶0.5μL。

扩增条件为：98℃变性3min后进入循环；循环参数为98℃解链10sec， 55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后，72℃保温10min，最终4℃ 保存。扩增的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为 300bp，与预期大小相当。回收产物过后，利用1F和2R引物进行重叠PCR扩 增，用重叠PCR方法连接前后臂片段，回收纯化连接产物为ΔfliC片段。

3、pRE112-filC同源重组质粒的构建

用Ahd I酶切自杀质粒载体pRE112，由于酶切之后载体会出现一个 T-terminal，切胶回收该片段，将得到的载体酶切产物在T4连接酶的作用下与预 先PCR扩增已+A的ΔfliC融合片段进行连接，连接体系为：pRE112载体片段5 μL，ΔfliC融合片段5μL，T4连接酶Buffer，2.5μL，T4连接酶1μL，16℃水 浴过夜，将连接产物电转化入感受态细胞χ7232，得到重组质粒pRE112-filC。

首先制备电转感受态细胞χ7232，挑取单菌落χ7232接种于LB液体培养基中， 37℃振荡培养过夜。取400μL母液加入到100ml装有LB培养基的三角瓶中， 37℃、180r/min振荡培养至OD600＝0.8-1，冰浴30min，4℃，4500r/min离心 10min收集菌体，沉淀用冰浴预冷的超纯水洗两遍，最后一步用预冷的10％甘 油洗一遍，最终用60μL预冷的10％甘油重悬备用。将连接产物加入到感受态细 胞中充分混匀，加入到直径为2mm的电击杯中，冰浴使电击杯冷却，在电压2.5 KV的参数下进行电击，随即在电击杯中加入100μL预热的LB培养基，轻轻吹 熄混匀后涂布与含有氯霉素抗性(CmR)的平板上，37℃培养过夜，待菌落长 出后用PCR进行筛选鉴定，鉴定结果证明pRE112-fliC质粒构建成功。

4、filC基因缺失突变株的构建与鉴定

利用重组自杀质粒pRE112-fliC在大肠杆菌Δasd缺失株χ7213中可以复制， 但在沙门氏菌中不能复制存活的特点，将在χ7232菌株中构建得到的自杀质粒进 行提取质粒，将其电转入感受态χ7213中，该菌缺失了asd基因，所以其需要DAP 才能够生长，将自杀质粒转入χ7213之后，培养含有质粒pRE112-fliC的χ7213 菌以及鼠伤寒沙门氏菌S100，待其培养至OD值约为0.8左右时进行结合转移， 待结合培养24小时过后，挑取菌苔划线于氯霉素平板上，同源片段与载体片段 导入沙门氏菌基因组的细菌能够在抗性平板上生长，随机挑取能够在抗性平板上 生长的细菌进行第二次同源重组，将单菌落挑取至LB液体培养基培养，置于 37℃振荡培养2-3个小时，待菌OD600值达到0.6时，将菌进行1：100稀释后 取100μL涂布含有5％的蔗糖平板进行第二次筛选，插入有SacB敏感基因的菌 株在蔗糖平板上不生长，无抗性的突变菌株与回复突变菌株能够在蔗糖平板上生 长，最后将得到对抗生素敏感而对蔗糖抗性的克隆，进行PCR鉴定，PCR鉴定 大小结果显示，突变株成功缺失了大小约为900bp的fliC基因，即得到 pRE112ΔfilC突变菌株。

PCR鉴定：提取fliC突变菌株pRE112ΔfilC基因组DNA，用引物filC-1F 和filC-2R扩增上下游同源臂片段，看能否扩增出大小为800bp左右的缺失了fliC 基因的上下游同源臂片段，如果能扩增出相应片段，则表明结果与预期相符，可 初步鉴定突变株构建成功(命名为S.Typhimurium S100ΔfliC)。

实施例2

1、ΔfljB引物设计和PCR扩增

根据已报到的沙门氏菌S100菌株序列，(参照GenBank序列号为 GCF_000006945)设计两对融合PCR引物分别扩增fljB基因的上游同源臂以及 下游同源臂，扩增片段大小分别为300bp，上述引物均由北京华大基因公司合成， 引物序列如下：

fljB-1F:AGTGAGCTCCACGTTCATGT

fljB-1R:AATTAGCGGCCGCAAAATTTTCCTTTTGGAAGG

fljB-2F：ATTTTGCGGCCGCTAATTTATTTCGTTTTATTC

fljB-2R：GTCATTACCTGATAATTCTTC

2、沙门氏菌fljB基因的上、下游同源臂的扩增

煮沸裂解法制备鼠伤寒沙门氏菌S100的基因组DNA模板：挑取鼠伤寒沙 门氏菌S100单菌落于LB培养基37℃过夜培养，第二天取0.5ml菌液12000 r/min离心3min，弃上清，收集菌体用超纯水洗一次，并重悬。放于沸水中煮 10min，冷却过后12000r/min离心3min，以上清作为模板备用。

PCR的扩增反应在25μL的体系中进行，反应体系如下：10×PCR buffer (Mg2+)2.5μL，dNTP(10mM)1.5μL，Primer 1(50mM)0.25μL，Primer 2(50mM) 0.25μL，DNA模板2μL，超纯水17μL，Taq DNA高保真酶0.5μL。

扩增条件为：98℃变性3min后进入循环；循环参数为98℃解链10sec，55℃ 退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后，72℃保温10min，最终4℃保存。 扩增的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为300bp， 与预期大小相当。回收产物过后，利用1F和2R引物进行重叠PCR扩增，用重 叠PCR方法连接前后臂片段，回收纯化连接产物为ΔfljB片段。

3、pRE112-fljB同源重组质粒的构建

用Ahd I酶切自杀质粒载体pRE112，由于酶切之后载体会出现一个 T-terminal，切胶回收该片段，将得到的载体酶切产物在T4连接酶的作用下与预 先PCR扩增已+A的ΔfljB融合片段进行连接，连接体系为：pRE112载体片段5 μL，ΔfliC融合片段5μL，T4连接酶Buffer，2.5μL，T4连接酶1μL，16℃水 浴过夜，将连接产物电转化入感受态细胞χ7232，得到重组质粒pRE112-fljB。

首先制备电转感受态细胞χ7232，挑取单菌落χ7232接种于LB液体培养基中， 37℃振荡培养过夜。取400μL母液加入到100ml装有LB培养基的三角瓶中， 37℃、180r/min振荡培养至OD600＝0.8-1，冰浴30min，4℃，4500r/min离心 10min收集菌体，沉淀用冰浴预冷的超纯水洗两遍，最后一步用预冷的10％甘 油洗一遍，最终用60μL预冷的10％甘油重悬备用。将连接产物加入到感受态细 胞中充分混匀，加入到直径为2mm的电击杯中，冰浴使电击杯冷却，在电压2.5 KV的参数下进行电击，随即在电击杯中加入100μL预热的LB培养基，轻轻吹 熄混匀后涂布与含有氯霉素抗性(CmR)的平板上，37℃培养过夜，待菌落长 出后用PCR进行筛选鉴定，鉴定结果证明pRE112-fljB质粒构建成功。

4、沙门氏菌ΔfliCΔfljB缺失株的突变与鉴定

利用重组自杀质粒pRE112-fljB在大肠杆菌Δasd缺失株χ7213中可以复制， 但在沙门氏菌中不能复制存活的特点，将在χ7232菌株中构建得到的自杀质粒进 行提取质粒，将其电转入感受态χ7213中，该菌缺失了asd基因，所以其需要DAP 才能够生长，将自杀质粒转入χ7213之后，培养含有质粒pRE112-fljB的χ7213 菌以及鼠伤寒沙门氏菌ΔfliC突变缺失株(命名为S.Typhimurium S100ΔfljB), 待其培养至OD值约为0.8左右时进行结合转移，待结合培养24小时过后，挑 取菌苔划线于氯霉素平板上，同源片段与载体片段导入沙门氏菌基因组的细菌能 够在抗性平板上生长，随机挑取能够在抗性平板上生长的细菌进行第二次同源重 组，将单菌落挑取至LB液体培养基培养，置于37℃振荡培养2-3个小时，待菌 OD600值达到0.6时，将菌进行1：100稀释后取100μL涂布含有5％的蔗糖平 板进行第二次筛选，插入有SacB敏感基因的菌株在蔗糖平板上不生长，无抗性 的突变菌株与回复突变菌株能够在蔗糖平板上生长，最后将得到对抗生素敏感而 对蔗糖抗性的克隆，进行PCR鉴定，PCR鉴定大小结果显示，突变株成功缺失 了大小约为800bp的fljB基因，即得到pRE112ΔfilCΔfljB突变菌株。

PCR鉴定：提取ΔfljB突变菌株pRE112ΔfilCΔfljB基因组DNA，用引物fljB-1F和fljB-2R扩增上下游同源臂片段，看能否扩增出大小为800bp左右的缺失了fljB 基因的上下游同源臂片段，如果能扩增出相应片段，则表明结果与预期相符，可 初步鉴定突变株构建成功(命名为S.Typhimurium S100ΔfliCΔfljB)。

实施例3

1、ΔompA引物设计和PCR扩增

根据已报到的沙门氏菌S100菌株序列，(参照GenBank序列号为 GCF_000006945)设计两对融合PCR引物分别扩增ompA基因的上游同源臂以 及下游同源臂，扩增片段大小分别为400bp，上述引物均由北京华大基因公司合 成，引物序列如下：

ompA-1F：5’CATCCTCTCACACAACGAGAC3’

ompA-1R：

5’CTGCAGGAATGCGGCCGCCGGGGGATCTGCTCAATATT3’

ompA-2F：

5’CGGCCGCATTCCTGCAGGTAAGTTATCGTCTGGTAGAAAAAC3’

ompA-2R：5’CATATGAATCCGGAACTGGTC3’

2、沙门氏菌ompA基因的上、下游同源臂的扩增

煮沸裂解法制备鼠伤寒沙门氏菌S100的基因组DNA模板：挑取鼠伤寒沙 门氏菌S100单菌落于LB培养基37℃过夜培养，第二天取0.5ml菌液12000 r/min离心3min，弃上清，收集菌体用超纯水洗一次，并重悬。放于沸水中煮 10min，冷却过后12000r/min离心3min，以上清作为模板备用。

PCR的扩增反应在25μL的体系中进行，反应体系如下：10×PCR buffer (Mg2+)2.5μL，dNTP(10mM)1.5μL，Primer 1(50mM)0.25μL，Primer 2(50mM) 0.25μL，DNA模板2μL，超纯水17μL，Taq DNA高保真酶0.5μL。

扩增条件为：98℃变性3min后进入循环；循环参数为98℃解链10sec，55℃ 退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后，72℃保温10min，最终4℃保存。 扩增的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为400bp， 与预期大小相当。回收产物过后，利用1F和2R引物进行重叠PCR扩增，用重 叠PCR方法连接前后臂片段，回收纯化连接产物为ΔompA片段。

3、pRE112-ompA同源重组质粒的构建

用Ahd I酶切自杀质粒载体pYA4278，由于酶切之后载体会出现一个 T-terminal，切胶回收该片段，将得到的载体酶切产物在T4连接酶的作用下与预 先PCR扩增已+A的ΔompA融合片段进行连接，连接体系为：pRE112载体片段 5μL，ΔompA融合片段5μL，T4连接酶Buffer，2.5μL，T4连接酶1μL，16℃ 水浴过夜，将连接产物电转化入感受态细胞χ7232，得到重组质粒pRE112-ompA。

首先制备电转感受态细胞χ7232，挑取单菌落χ7232接种于LB液体培养基中， 37℃振荡培养过夜。取400μL母液加入到100ml装有LB培养基的三角瓶中， 37℃、180r/min振荡培养至OD600＝0.8-1，冰浴30min，4℃，4500r/min离心 10min收集菌体，沉淀用冰浴预冷的超纯水洗两遍，最后一步用预冷的10％甘 油洗一遍，最终用60μL预冷的10％甘油重悬备用。将连接产物加入到感受态细 胞中充分混匀，加入到直径为2mm的电击杯中，冰浴使电击杯冷却，在电压2.5 KV的参数下进行电击，随即在电击杯中加入100μL预热的LB培养基，轻轻吹 熄混匀后涂布与含有氯霉素抗性(CmR)的平板上，37℃培养过夜，待菌落长 出后用PCR进行筛选鉴定，鉴定结果证明pRE112-ompA质粒构建成功。

4、沙门氏菌ΔfliCΔfljBΔompA缺失株的突变与鉴定

利用重组自杀质粒pRE112-ompA在大肠杆菌Δasd缺失株χ7213中可以复 制，但在沙门氏菌中不能复制存活的特点，将在χ7232菌株中构建得到的自杀质 粒进行提取质粒，将其电转入感受态χ7213中，该菌缺失了asd基因，所以其需 要DAP才能够生长，将自杀质粒转入χ7213之后，培养含有质粒pRE112-ompA 的χ7213菌以及鼠伤寒沙门氏菌ΔfliCΔfljB突变缺失株(命名为S.Typhimurium S100ΔfliCΔfljB),待其培养至OD值约为0.8左右时进行结合转移，待结合培养 24小时过后，挑取菌苔划线于氯霉素平板上，同源片段与载体片段导入沙门氏 菌基因组的细菌能够在抗性平板上生长，随机挑取能够在抗性平板上生长的细菌 进行第二次同源重组，将单菌落挑取至LB液体培养基培养，置于37℃振荡培养2-3个小时，待菌OD600值达到0.6时，将菌进行1：100稀释后取100μL涂布 含有5％的蔗糖平板进行第二次筛选，插入有SacB敏感基因的菌株在蔗糖平板 上不生长，无抗性的突变菌株与回复突变菌株能够在蔗糖平板上生长，最后将得 到对抗生素敏感而对蔗糖抗性的克隆，进行PCR鉴定，PCR鉴定大小结果显示， 突变株成功缺失了大小约为900bp的ompA基因，即得到 pRE112ΔfilCΔfljBΔompA突变菌株。

PCR鉴定：提取ΔompA突变菌株pRE112ΔfilCΔfljBΔompA基因组DNA，用引物ompA-1F和ompA-2R扩增上下游同源臂片段，看能否扩增出大小为900bp左右 的缺失了ompA基因的上下游同源臂片段，如果能扩增出相应片段，则表明结果 与预期相符，可初步鉴定突变株构建成功(命名为S.Typhimurium S100ΔfliC ΔfljBΔompA)。

实施例4

1、ΔompC引物设计和PCR扩增

根据已报到的沙门氏菌S100菌株序列，(参照GenBank序列号为 GCF_000006945)设计两对融合PCR引物分别扩增ompC基因的上游同源臂以 及下游同源臂，扩增片段大小分别为400bp，上述引物均由北京华大基因公司合 成，引物序列如下：

ompC-1F:5’GCCAATACGCAGCGCCGAGGTCACG3’

ompC-1R:5’ACCTGCAGGATGCGGCCGCGGTCAGCAAAAGATG3’

ompC-2F:5’CCGCGGCCGCATCCTGCAGGTGTTATTAACCCTCTG3’

ompC-2R:5’ATAGGGGTAAACAGACATTCAGAAG3’

2、沙门氏菌ompC基因的上、下游同源臂的扩增

煮沸裂解法制备鼠伤寒沙门氏菌S100的基因组DNA模板：挑取鼠伤寒沙 门氏菌S100单菌落于LB培养基37℃过夜培养，第二天取0.5ml菌液12000 r/min离心3min，弃上清，收集菌体用超纯水洗一次，并重悬。放于沸水中煮 10min，冷却过后12000r/min离心3min，以上清作为模板备用。

PCR的扩增反应在25μL的体系中进行，反应体系如下：10×PCR buffer (Mg2+)2.5μL，dNTP(10mM)1.5μL，Primer 1(50mM)0.25μL，Primer 2(50mM) 0.25μL，DNA模板2μL，超纯水17μL，Taq DNA高保真酶0.5μL。

扩增条件为：98℃变性3min后进入循环；循环参数为98℃解链10sec，55℃ 退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后，72℃保温10min，最终4℃保存。 扩增的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为400bp， 与预期大小相当。回收产物过后，利用1F和2R引物进行重叠PCR扩增，用重 叠PCR方法连接前后臂片段，回收纯化连接产物为ΔompC片段。

3、pRE112-ompC同源重组质粒的构建

用Ahd I酶切自杀质粒载体pYA4278，由于酶切之后载体会出现一个 T-terminal，切胶回收该片段，将得到的载体酶切产物在T4连接酶的作用下与预 先PCR扩增已+A的ΔompC融合片段进行连接，连接体系为：pRE112载体片段 5μL，ΔompC融合片段5μL，T4连接酶Buffer，2.5μL，T4连接酶1μL，16℃ 水浴过夜，将连接产物电转化入感受态细胞χ7232，得到重组质粒pRE112-ompC。

首先制备电转感受态细胞χ7232，挑取单菌落χ7232接种于LB液体培养基中， 37℃振荡培养过夜。取400μL母液加入到100ml装有LB培养基的三角瓶中，37℃、180r/min振荡培养至OD600＝0.8-1，冰浴30min，4℃，4500r/min离心 10min收集菌体，沉淀用冰浴预冷的超纯水洗两遍，最后一步用预冷的10％甘 油洗一遍，最终用60μL预冷的10％甘油重悬备用。将连接产物加入到感受态细 胞中充分混匀，加入到直径为2mm的电击杯中，冰浴使电击杯冷却，在电压2.5 KV的参数下进行电击，随即在电击杯中加入100μL预热的LB培养基，轻轻吹 熄混匀后涂布与含有氯霉素抗性(CmR)的平板上，37℃培养过夜，待菌落长 出后用PCR进行筛选鉴定，鉴定结果证明pRE112-ompC质粒构建成功。

4、沙门氏菌ΔfliCΔfljBΔompAΔompC缺失株的突变与鉴定

利用重组自杀质粒pRE112-ompC在大肠杆菌Δasd缺失株χ7213中可以复 制，但在沙门氏菌中不能复制存活的特点，将在χ7232菌株中构建得到的自杀质 粒进行提取质粒，将其电转入感受态χ7213中，该菌缺失了asd基因，所以其需 要DAP才能够生长，将自杀质粒转入χ7213之后，培养含有质粒pRE112-ompC 的χ7213菌以及鼠伤寒沙门氏菌ΔfliCΔfljBΔompA突变缺失株(命名为S. Typhimurium S100ΔfliCΔfljBΔompA),待其培养至OD值约为0.8左右时进行结 合转移，待结合培养24小时过后，挑取菌苔划线于氯霉素平板上，同源片段与 载体片段导入沙门氏菌基因组的细菌能够在抗性平板上生长，随机挑取能够在抗 性平板上生长的细菌进行第二次同源重组，将单菌落挑取至LB液体培养基培养， 置于37℃振荡培养2-3个小时，待菌OD600值达到0.6时，将菌进行1：100稀 释后取100μL涂布含有5％的蔗糖平板进行第二次筛选，插入有SacB敏感基因 的菌株在蔗糖平板上不生长，无抗性的突变菌株与回复突变菌株能够在蔗糖平板 上生长，最后将得到对抗生素敏感而对蔗糖抗性的克隆，进行PCR鉴定，PCR 鉴定大小结果显示，突变株成功缺失了大小约为900bp的ompC基因，即得到 pRE112ΔfilCΔfljBΔompAΔompC突变菌株。

PCR鉴定：提取ΔompC突变菌株pRE112ΔfilCΔfljBΔompAΔompC基因组DNA， 用引物ompC-1F和ompC-2R扩增上下游同源臂片段，看能否扩增出大小为900bp 左右的缺失了ompC基因的上下游同源臂片段，如果能扩增出相应片段，则表明 结果与预期相符，可初步鉴定突变株构建成功(命名为S.Typhimurium S100ΔfliC ΔfljBΔompAΔompC)。

实施例5

1、ΔompD引物设计和PCR扩增

根据已报到的沙门氏菌S100菌株序列，(参照GenBank序列号为 GCF_000006945)设计两对融合PCR引物分别扩增ompD基因的上游同源臂以 及下游同源臂，扩增片段大小分别为400bp，上述引物均由北京华大基因公司合 成，引物序列如下：

ompD-1F:AAAGTTAATGATGATAGCGG

ompD-1R:CTGCAGGAATGCGGCCGCGTTATTAACCCTCTGTTATA

ompD-2F:CGGCCGCATTCCTGCAGGTAATCTCGATGGATATCGAAC

ompD-2R:CGTTAAAGCGCATCAGCGCG

2、沙门氏菌ompD基因的上、下游同源臂的扩增

煮沸裂解法制备鼠伤寒沙门氏菌S100的基因组DNA模板：挑取鼠伤寒沙 门氏菌S100单菌落于LB培养基37℃过夜培养，第二天取0.5ml菌液12000 r/min离心3min，弃上清，收集菌体用超纯水洗一次，并重悬。放于沸水中煮 10min，冷却过后12000r/min离心3min，以上清作为模板备用。

PCR的扩增反应在25μL的体系中进行，反应体系如下：10×PCR buffer (Mg2+)2.5μL，dNTP(10mM)1.5μL，Primer 1(50mM)0.25μL，Primer 2(50mM) 0.25μL，DNA模板2μL，超纯水17μL，Taq DNA高保真酶0.5μL。

扩增条件为：98℃变性3min后进入循环；循环参数为98℃解链10sec，55℃ 退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后，72℃保温10min，最终4℃保存。 扩增的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为400bp， 与预期大小相当。回收产物过后，利用1F和2R引物进行重叠PCR扩增，用重 叠PCR方法连接前后臂片段，回收纯化连接产物为ΔompD片段。

3、pRE112-ompD同源重组质粒的构建

用Ahd I酶切自杀质粒载体pYA4278，由于酶切之后载体会出现一个 T-terminal，切胶回收该片段，将得到的载体酶切产物在T4连接酶的作用下与预 先PCR扩增已+A的ΔompA融合片段进行连接，连接体系为：pRE112载体片段 5μL，ΔompD融合片段5μL，T4连接酶Buffer，2.5μL，T4连接酶1μL，16℃ 水浴过夜，将连接产物电转化入感受态细胞χ7232，得到重组质粒pRE112-ompD。

首先制备电转感受态细胞χ7232，挑取单菌落χ7232接种于LB液体培养基中， 37℃振荡培养过夜。取400μL母液加入到100ml装有LB培养基的三角瓶中， 37℃、180r/min振荡培养至OD600＝0.8-1，冰浴30min，4℃，4500r/min离心 10min收集菌体，沉淀用冰浴预冷的超纯水洗两遍，最后一步用预冷的10％甘 油洗一遍，最终用60μL预冷的10％甘油重悬备用。将连接产物加入到感受态细 胞中充分混匀，加入到直径为2mm的电击杯中，冰浴使电击杯冷却，在电压2.5 KV的参数下进行电击，随即在电击杯中加入100μL预热的LB培养基，轻轻吹 熄混匀后涂布与含有氯霉素抗性(CmR)的平板上，37℃培养过夜，待菌落长 出后用PCR进行筛选鉴定，鉴定结果证明pRE112-ompD质粒构建成功。

4、沙门氏菌ΔfliCΔfljBΔompAΔompCΔompD缺失株的突变与鉴定

利用重组自杀质粒pRE112-ompD在大肠杆菌Δasd缺失株χ7213中可以复 制，但在沙门氏菌中不能复制存活的特点，将在χ7232菌株中构建得到的自杀质 粒进行提取质粒，将其电转入感受态χ7213中，该菌缺失了asd基因，所以其需 要DAP才能够生长，将自杀质粒转入χ7213之后，培养含有质粒pRE112-ompD 的χ7213菌以及鼠伤寒沙门氏菌ΔfliCΔfljBΔompAΔompC突变缺失株,待其培养至 OD值约为0.8左右时进行结合转移，待结合培养24小时过后，挑取菌苔划线于 氯霉素平板上，同源片段与载体片段导入沙门氏菌基因组的细菌能够在抗性平板 上生长，随机挑取能够在抗性平板上生长的细菌进行第二次同源重组，将单菌落 挑取至LB液体培养基培养，置于37℃振荡培养2-3个小时，待菌OD600值达 到0.6时，将菌进行1：100稀释后取100μL涂布含有5％的蔗糖平板进行第二 次筛选，插入有SacB敏感基因的菌株在蔗糖平板上不生长，无抗性的突变菌株 与回复突变菌株能够在蔗糖平板上生长，最后将得到对抗生素敏感而对蔗糖抗性 的克隆，进行PCR鉴定，PCR鉴定大小结果显示，突变株成功缺失了大小约为 900bp的ompD基因，即得到pRE112ΔfilCΔfljBΔompAΔompCΔompD突变菌株。

PCR鉴定：提取ΔompD突变菌株pRE112ΔfilCΔfljBΔompAΔompCΔompD基 因组DNA，用引物ompD-1F和ompD-2R扩增上下游同源臂片段，看能否扩增 出大小为900bp左右的缺失了ompD基因的上下游同源臂片段，如果能扩增出相 应片段，则表明结果与预期相符，可初步鉴定突变株构建成功(命名为S. Typhimurium S100ΔfliCΔfljBΔompAΔompCΔompD)。

实施例6：

1、ΔrfbP引物设计和PCR扩增

根据已报到的沙门氏菌S100菌株序列，(参照GenBank序列号为 GCF_000006945)设计两对融合PCR引物分别扩增rfbP基因的上游同源臂以及 下游同源臂，扩增片段大小分别为400bp，上述引物均由北京华大基因公司合成， 引物序列如下：

rfbP-1F:5’CAACTGATAAAAGTCAATCC3’

rfbP-1R:5’GTAAGCTTACCTGCAGGTTAATCCTCACCCTCTGA3’

rfbP-2F:5’GATTAACCTGCAGGTAAGCTTACCGAGAAGTACTGA3’

rfbP-2R:5’ATACGACGAGGCGTTTCGAG3’

2、沙门氏菌rfbP基因的上、下游同源臂的扩增

煮沸裂解法制备鼠伤寒沙门氏菌S100的基因组DNA模板：挑取鼠伤寒沙 门氏菌S100单菌落于LB培养基37℃过夜培养，第二天取0.5ml菌液12000 r/min离心3min，弃上清，收集菌体用超纯水洗一次，并重悬。放于沸水中煮 10min，冷却过后12000r/min离心3min，以上清作为模板备用。

PCR的扩增反应在25μL的体系中进行，反应体系如下：10×PCR buffer (Mg2+)2.5μL，dNTP(10mM)1.5μL，Primer 1(50mM)0.25μL，Primer 2(50mM) 0.25μL，DNA模板2μL，超纯水17μL，Taq DNA高保真酶0.5μL。

扩增条件为：98℃变性3min后进入循环；循环参数为98℃解链10sec，55℃ 退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后，72℃保温10min，最终4℃保存。 扩增的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为400bp， 与预期大小相当。回收产物过后，利用1F和2R引物进行重叠PCR扩增，用重 叠PCR方法连接前后臂片段，回收纯化连接产物为ΔrfbP片段。

3、pRE112-rfbP同源重组质粒的构建

用Ahd I酶切自杀质粒载体pYA4278，由于酶切之后载体会出现一个 T-terminal，切胶回收该片段，将得到的载体酶切产物在T4连接酶的作用下与预 先PCR扩增已+A的ΔrfbP融合片段进行连接，连接体系为：pRE112载体片段5 μL，ΔrfbP融合片段5μL，T4连接酶Buffer，2.5μL，T4连接酶1μL，16℃水 浴过夜，将连接产物电转化入感受态细胞χ7232，得到重组质粒pRE112-rfbP。

首先制备电转感受态细胞χ7232，挑取单菌落χ7232接种于LB液体培养基中， 37℃振荡培养过夜。取400μL母液加入到100ml装有LB培养基的三角瓶中， 37℃、180r/min振荡培养至OD600＝0.8-1，冰浴30min，4℃，4500r/min离心 10min收集菌体，沉淀用冰浴预冷的超纯水洗两遍，最后一步用预冷的10％甘 油洗一遍，最终用60μL预冷的10％甘油重悬备用。将连接产物加入到感受态细 胞中充分混匀，加入到直径为2mm的电击杯中，冰浴使电击杯冷却，在电压2.5 KV的参数下进行电击，随即在电击杯中加入100μL预热的LB培养基，轻轻吹 熄混匀后涂布与含有氯霉素抗性(CmR)的平板上，37℃培养过夜，待菌落长 出后用PCR进行筛选鉴定，鉴定结果证明pRE112-rfbP质粒构建成功。

4、沙门氏菌ΔfliCΔfljBΔompAΔompCΔompDΔrfbP缺失株的突变与鉴定

利用重组自杀质粒pRE112-rfbP在大肠杆菌Δasd缺失株χ7213中可以复制， 但在沙门氏菌中不能复制存活的特点，将在χ7232菌株中构建得到的自杀质粒进 行提取质粒，将其电转入感受态χ7213中，该菌缺失了asd基因，所以其需要DAP 才能够生长，将自杀质粒转入χ7213之后，培养含有质粒pRE112-rfbP的χ7213 菌以及鼠伤寒沙门氏菌ΔfliCΔfljBΔompAΔompCΔompD突变缺失株,待其培养至 OD值约为0.8左右时进行结合转移，待结合培养24小时过后，挑取菌苔划线于 氯霉素平板上，同源片段与载体片段导入沙门氏菌基因组的细菌能够在抗性平板 上生长，随机挑取能够在抗性平板上生长的细菌进行第二次同源重组，将单菌落 挑取至LB液体培养基培养，置于37℃振荡培养2-3个小时，待菌OD600值达 到0.6时，将菌进行1：100稀释后取100μL涂布含有5％的蔗糖平板进行第二 次筛选，插入有SacB敏感基因的菌株在蔗糖平板上不生长，无抗性的突变菌株 与回复突变菌株能够在蔗糖平板上生长，最后将得到对抗生素敏感而对蔗糖抗性 的克隆，进行PCR鉴定，PCR鉴定大小结果显示，突变株成功缺失了大小约为 900bp的rfbP基因，即得到pRE112ΔfilCΔfljBΔompAΔompCΔompDΔrfbP突变菌 株。

PCR鉴定：提取ΔrfbP突变菌株pRE112ΔfilCΔfljBΔompAΔompCΔompDΔrfbP基因组DNA，用引物rfbP-1F和rfbP-2R扩增上下游同源臂片段，看能否扩增出 大小为900bp左右的缺失了rfbP基因的上下游同源臂片段，如果能扩增出相应 片段，则表明结果与预期相符，可初步鉴定突变株构建成功(命名为S. Typhimurium S100ΔfliCΔfljBΔompAΔompCΔompDΔrfbP)。

实施例6

1、O抗原基因簇引物设计和PCR扩增

根据已报到的志贺氏菌福氏2a菌株序列，(参照GenBank序列号为 GCF_002950215.1)设计两对PCR引物来扩增完整的O抗原基因簇，大小分别 约为8000bp，引物序列如下：

2a-F-vector：

CGCCTGCATATAGCCCATTTCAGAATGGCCGGCCGCAGTC

2a-R-vector：

GAAAGTCGTGGTTATACCGCTCATGAGACAATAACCCTG

2a-1F：

5’CCGCCATTCTGAAATGGGCTATATGCAGGCGTTTGTGAA3’

2a-1R：5’AATGCATTTCTTACTCGATAATAAC3’

2a-2F：5’CTGTGGGATTAACATACCAATTCAC3’

2a-2R：

5’ATTGTCTCATGAGCGGTATAACCACGACTTTCGATGTTG3’

2、志贺氏菌福氏2a O抗原基因簇的扩增：

煮沸裂解法制备志贺氏菌福氏2a的基因组DNA模板，挑取单菌落37℃过 夜培养。取0.5ml菌液12000r/min离心3min，弃上清，收集菌体用超纯水洗 一次，并重悬。放于沸水中煮10min，冷却过后12000r/min离心3min，以上清 作为模板备用。

PCR的扩增反应在25μL的体系中进行，反应体系如下：10×PCR buffer (Mg2+)2.5μL，dNTP(10mM)3μL，Primer 1(50mM)0.25μL，Primer 2(50mM) 0.25μL，DNA模板2μL，超纯水17μL，LATaq DNA聚合酶0.5μL。

扩增条件为：95℃预变性3min后进入循环，循环参数为98℃10sec，55℃ 30sec，68℃8min。30个循环后，72℃保温10min，最终4℃保存。扩增的PCR 产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增的两个片段大小分别为8000bp，与预 期大小相当。

3、质粒构建

质粒构建需要用到Gibson组装试剂盒(GibsonAssembly Master Mix,NEB)， 通过在设计引物时在片段中加入overlap片段，从而片段能够通过重叠片段，并 通过gibson组装酶连接成一个完整的质粒。将片段按照相同摩尔数比控制总体 积在20微升加好反应体系：组装片段(2-3个)XμL，总量为0.02-0.5pmols， Gibson组装酶10μL，超纯水10-XμL，加好体系后在50摄氏度作用1小时， 取2微升用电转化的方法将连接物转化入TOP10感受态细胞内，涂布于Kan平 板上，放置与37℃待菌落长出后挑菌用相应引物进行PCR鉴定。鉴定结果证实 构建质粒正确。

4、TOP10电转化感受态细胞制作流程如下：

挑取对数生长期的单菌落大肠杆菌TOP10接种于LB液体培养基中，37℃ 振荡培养过夜。取400μL母液加入到100ml装有LB培养基的三角瓶中，37℃、 180r/min振荡培养至OD600＝0.8-1，冰浴30min，4℃，低转速4500r/min离心 10min收集菌体，重复洗涤三次，最终用60μL预冷的10％甘油重悬，即制备好 感受态备用。

如图1所示，为构建得到的表达LPS、S.flexneri 2a O-抗原基因簇的质粒所 包含的基因实验例2

验证表达O抗原突变株构建成功：

1、志贺氏菌O抗原表达质粒的鉴定

LPS图谱鉴定：过夜培养5ml PCR鉴定为阳性的包含有质粒的大肠杆菌 TOP10菌株，离心收集菌体，取200μl缓冲液A(组份为：0.5M Tris-Cl pH 6.8, 10％glycerol,10％SDS以及5％Beta-mercaptoethanol)重悬菌体，样品充分混匀 后在沸水中煮10分钟，待样品冷却后离心15分钟以除去未溶解的杂质，离心完 成后，将上清按照1：10(10μl加至90μl)的比例加入缓冲液B(组份为：0.5 M Tris-Cl pH 6.8,10％glycerol,0.05％Bromophenolblue)中，并加入1μl浓度为 20mg/ml的蛋白酶K。充分混匀后将样品放置于37℃。一小时过后，将样品取 15μl在15％浓度的SDS-PAGE胶进行电泳，待胶跑完后，将胶进行银氨染色，若表达志贺氏菌O抗原，则能够看到有条带，若不表达，则TOP10的脂多糖结 构表现为rough型。

2、染色步骤简要如下：

1)固定：将胶放入固定液中固定过夜，之后用超纯水漂洗三次，每次10min；

2)敏化：向染色盘中加入敏化液，轻摇10min，之后用超纯水洗三次，每次10 min；

3)上银：向染色盘中加入银染液，轻摇10min，之后用超纯水洗三次，每次10 min；

4)显色：向染色盘中加入显色液，轻轻振荡，待显出条带后，立即换超纯水， 将胶漂洗至不变色为止，进行照相保存分析。

3、Westernblot鉴定：

将处理好的脂多糖样品通过SDS-PAGE胶分离，待电泳完成后，将LPS条 带通过转印仪转印至硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)上。待转膜完成， 用含有5％脱脂牛奶的Tris缓冲液封闭2小时，随即加入特异性针对志贺氏菌福 氏2a O抗原的兔抗血清(1：100稀释)放置于室温孵育2小时。孵育完成后， 用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG二抗以1：10000倍稀释进行孵育，两小时后用 TBS缓冲液洗三遍。免疫印记条带通过加入BCIP显色液进行显色。反应终止则 通过将膜放入超纯水中清洗，则终止反应。其中亲本志贺氏菌福氏2a菌株为阳 性对照，未转入质粒的TOP10菌株为阴性对照。

如图2所示利用cryo-EM鉴定所纯化得到的能够表达志贺氏菌O抗原多糖的沙 门菌突变株的外膜囊泡外观形态。

如图3所示采用银染法对表达志贺氏菌O抗原多糖的鼠伤寒沙门氏菌抗原递呈 疫苗的外膜囊泡脂多糖图谱的鉴定结果。

如图4所示采用免疫印迹法对表达志贺氏菌O抗原多糖的鼠伤寒沙门氏菌抗原 递呈疫苗的外膜囊泡的鉴定结果。

实验例3

验证突变菌株OMV介导志贺菌O抗原诱导免疫应答的能力：

免疫：本研究采用4-6周龄(16-22g)的雌性BALB/c小鼠，购买于成都 达硕生物技术有限公司，并采用两种免疫途径，包括滴鼻(intranasal)与腹腔注 射(intraperitoneal)来评估沙门氏菌外膜囊泡引起机体产生的免疫效力与保护野 生毒株攻击的能力。将新购进的小鼠饲养一周以适应新环境，将小鼠按照每组8 只分为若干组，从第一次免疫算起，0天和第30天分别作为首免和加强免疫(二 免)。免疫计量分别为：滴鼻免疫组为20μg/10μl DPBS浓度的外膜囊泡；腹 腔免疫组为5μg/100μl DPBS浓度的外膜囊泡。对照组则免疫相应体积的DPBS 缓冲液作为阴性对照。血清样品采集：采用眼眶窦静脉从穿刺采血，于一免后4 周以及二免后4周采集，将采集到的血液静置于37℃一小时后放于4℃过夜，待 血清析出后，采集血清放置于-80℃冰箱备用。阴道分泌物样品的采集：取150μlPBS缓冲液在阴道口来回冲洗，并收集阴道分泌物放于-80℃冰箱备用。

攻毒保护效力评价：我们利用志贺氏菌小鼠肺部病理模型来评估沙门氏菌多糖抗原递呈疫苗对野生型志贺氏菌的攻击保护效力，具体实施如下：

(1)于二免后第五周进行攻毒，用致死计量10⁹CFU/10μl DPBS的志贺氏菌通 过滴鼻的方式进行攻毒，攻毒完24小时后，分别于免疫组以及对照组取3只小 鼠解剖，取其肺脏进行病理切片制作，将组织依次在乙醇和二甲苯中浸泡，然后 用石蜡进行包埋，并使组织脱水，脱水完成后将石蜡包埋样品切成5mm的切片， 进行苏木精-伊红染色。染色完成的结果在电子显微镜下进行照相观察分析，通 过病理切片以及病理损伤分数的统计来反应疫苗的保护效力。

(2)将攻毒完后24小时的部分小鼠取其肺脏灌洗液进行细胞因子的测定，肺脏 灌洗液采集步骤简要如下：将小鼠处死过后，对颈部进行解刨，暴露气管，利用 穿刺针或者4.5号针头进行插管，用预冷的PBS缓冲液0.8ml进行灌洗，灌洗 3-5次即可，收集的灌洗液放置于-80℃备用。最终检测其肺泡灌洗液中IgA、 TNF-α、IFN-γ和IL-6的含量，检测方法利用ELISA检测试剂盒(R&D System) 进行，所有的操作步骤严格按照试剂盒说明书严格进行。

(3)剩余小鼠则继续观察其体重变化以及是否死亡，记录其每天死亡小鼠的数量，观察持续到攻毒后14天，最终统计结果进行保护效力分析。

抗体含量测定：间接酶联免疫吸附实验(ELISA)被用于抗体含量的测定， 针对志贺氏菌脂多糖(LPS)的抗体含量被测定，具体步骤如下：

(1)我们采用绘制不同抗体特异性的标准曲线的方法，来定量不同个体中所含 有的抗体含量，所以需要将纯化的鼠Ig亚型标准品从0.5μg/μl，按照2倍的倍 数进行倍比稀释，按照同样的方法进行包被，同时待测样品则以1μg每孔的脂 多糖稀释于100μl包被缓冲液中加至96孔ELISA板中，放置于4℃过夜孵育。

(2)孵育过夜后，将ELISA板用PBST(PBS包含0.1％Tween 20)洗三遍， 随即用2％BSA缓冲液进行封闭，于室温静置2小时。

(3)将不同的血清样品与阴道分泌物样品以一定的稀释比例加100μl入孔中， 每个样品进行三个重复，加好样品后放置于室温1小时。

(4)待PBST洗三遍结束之后，分别在不同板子里加入不同的生物素标记的羊 抗鼠IgG、IgG1、IgG2a和IgA，测定不同的Ig亚型含量，同上仍在室温放置2 小时。

(5)PBST洗三遍过后，加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素作用1小时。

(6)最终用pNpp(p-nitrophenylphosphate substrate)进行显色。颜色反应(吸光度)测定其在波长为405nm时的吸光度。数值大于PBS对照的被认为是阳性。

(7)标准曲线的绘制使用curve expert软件进行，利用log-log regressioncurve 曲线函数得到标准曲线，将测得的样品数值带入，即可得到样品中抗体含量，最 终的Ig抗体含量需要换算样品的稀释倍数，得到最终的抗体含量。

统计分析：所有数据均已MEAN±SD表示，采用软件Graph Prim 6对数据 进行绘图分析，用软件SPSS Statistics 17.0对数据进行单因素方差分析。当P< 0.05被认为是微显著差异，当P<0.01被认为是显著差异，当P<0.001被认为 是极显著差异。

注：动物实验是按照动物福利法案和有关动物实验的规定进行的。本研究 严格遵循实验动物的使用和关爱原则。所有对实验动物的不利影响在不影响实验 结果的情况下都控制在最小范围。

如图5所示：验证突变菌株外膜囊泡介导志贺菌O抗原多糖诱导免疫应答 的测试结果。

序列表

<110> 南昌大学

<120> 一株高效刺激免疫反应的沙门菌突变株及构建方法和应用

<141> 2020-06-22

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> Salmonella enterica

<400> 1

atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa 60

tcccagtccg ctctgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ccggtctgcg tatcaacagc 120

gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt 180

ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc 240

gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct 300

aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg 360

aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag 420

gacaacaccc tgaccatcca ggttggtgcc aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg 480

aagcagatca actctcagac cctgggtctg gatacgctga atgtgcaaca aaaatataag 540

gtcagcgata cggctgcaac tgttacagga tatgccgata ctacgattgc tttagacaat 600

agtactttta aagcctcggc tactggtctt ggtggtactg accagaaaat tgatggcgat 660

ttaaaatttg atgatacgac tggaaaatat tacgccaaag ttaccgttac ggggggaact 720

ggtaaagatg gctattatga agtttccgtt gataagacga acggtgaggt gactcttgct 780

ggcggtgcga cttccccgct tacaggtgga ctacctgcga cagcaactga ggatgtgaaa 840

aatgtacaag ttgcaaatgc tgatttgaca gaggctaaag ccgcattgac agcagcaggt 900

gttaccggca cagcatctgt tgttaagatg tcttatactg ataataacgg taaaactatt 960

gatggtggtt tagcagttaa ggtaggcgat gattactatt ctgcaactca aaataaagat 1020

ggttccataa gtattaatac tacgaaatac actgcagatg acggtacatc caaaactgca 1080

ctaaacaaac tgggtggcgc agacggcaaa accgaagttg tttctattgg tggtaaaact 1140

tacgctgcaa gtaaagccga aggtcacaac tttaaagcac agcctgatct ggcggaagcg 1200

gctgctacaa ccaccgaaaa cccgctgcag aaaattgatg ctgctttggc acaggttgac 1260

acgttacgtt ctgacctggg tgcggtacag aaccgtttca actccgctat taccaacctg 1320

ggcaacaccg taaacaacct gacttctgcc cgtagccgta tcgaagattc cgactacgcg 1380

accgaagttt ccaacatgtc tcgcgcgcag attctgcagc aggccggtac ctccgttctg 1440

gcgcaggcga accaggttcc gcaaaacgtc ctctctttac tgcgttaa 1488

<210> 2

<211> 1520

<212> DNA

<213> Salmonella enterica

<400> 2

atggcacaag taatcaacac taacagtctg tcgctgctga cccagaataa cctgaacaaa 60

tcccagtccg cactgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ctggtctgcg tatcaacagc 120

gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt tcaccgcgaa catcaaaggt 180

ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc 240

gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct 300

aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg 360

aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag 420

gacaacaccc tgaccatcca ggttggcgcc aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg 480

aagcagatca actctcagac cctgggtctg gactcactga acgtgcagaa agcgtatgat 540

gtgaaagata cagcagtaac aacgaaagct tatgccaata atggtactac actggatgta 600

tcgggtcttg atgatgcagc tattaaagcg gctacgggtg gtacgaatgg tacggcttct 660

gtaaccggtg gtgcggttaa atttgacgca gataataaca agtactttgt tatattggtg 720

gctttactgg tgctgatgcc gccaaaaatg gcgattatga agttaacgtt gctactgacg 780

gtacagtaac ccttgcggct ggcgcaacta aaaccacaat gcctgctggt gcgacaacta 840

aaacagaagt acaggagtta aaagatacac cggcagttgt ttcagcagat gctaaaaatg 900

ccttaattgc tggcggcgtt gacgctaccg atgctaatgg cgctgagttg gtcaaaatgt 960

cttataccga taaaaatggt aagacaattg aaggcggtta tgcgcttaaa gctggcgata 1020

agtattacgc cgcagattac gatgaagcga caggagcaat taaagctaaa actacaagtt 1080

atactgctgc tgacggcact accaaaacag cggctaacca actgggtggc gtagacggta 1140

aaaccgaagt cgttactatc gacggtaaaa cctacaatgc cagcaaagcc gctggtcatg 1200

atttcaaagc acaaccagag ctggcggaag cagccgctaa aaccaccgaa aacccgctgc 1260

agaaaattga tgccgcgctg gcgcaggtgg atgcgctgcg ctctgatctg ggtgcggtac 1320

aaaaccgttt caactctgct atcaccaacc tgggcaatac cgtaaacaat ctgtctgaag 1380

cgcgtagccg tatcgaagat tccgactacg cgaccgaagt ttccaacatg tctcgcgcgc 1440

agattctgca gcaggccggt acttccgttc tggcgcaggc taaccaggtc ccgcagaacg 1500

tgctgtctct gttacgttaa 1520

<210> 3

<211> 1053

<212> DNA

<213> Salmonella enterica

<400> 3

atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60

gccgctccga aagataacac ctggtacgct ggtgctaaac tgggctggtc tcagtaccat 120

gacaccggct tcattcacaa tgatggcccg actcatgaaa accaactggg cgcaggtgct 180

tttggtggtt accaggttaa cccgtatgtt ggctttgaaa tgggctacga ctggttaggc 240

cgtatgccgt acaaaggcga caacatcaat ggcgcttata aagctcaggg cgttcagttg 300

accgctaaac tgggttatcc aatcactgac gatctggacg tttatacccg tctgggtggt 360

atggtatggc gtgcagacac caagtctaac gtccctggcg gcccgtctac taaagaccac 420

gacaccggcg tttccccggt attcgcgggc ggtatcgagt atgctatcac ccctgaaatc 480

gcaacccgtc tggaatacca gtggactaac aacatcggtg atgccaacac catcggcacc 540

cgtccggaca acggcctgct gagcgtaggt gtttcctacc gtttcggcca gcaagaagct 600

gctccggtag tagctccggc accagctccg gctccggaag tacagaccaa gcacttcact 660

ctgaagtctg acgtactgtt caacttcaac aaatctaccc tgaagccgga aggccagcag 720

gctctggatc agctgtacag ccagctgagc aacctggatc cgaaagacgg ttccgttgtc 780

gttctgggct tcactgaccg tatcggttct gacgcttaca accagggtct gtccgagaaa 840

cgtgctcagt ctgttgttga ttacctgatc tccaaaggta ttccgtctga caaaatctcc 900

gcacgtggta tgggcgaatc taacccggtt accggcaaca cctgtgacaa cgtgaaacct 960

cgcgctgccc tgatcgattg cctggctccg gatcgtcgcg tagagatcga agttaaaggc 1020

gttaaagacg tggtaactca gccgcaggct taa 1053

<210> 4

<211> 908

<212> DNA

<213> Salmonella enterica

<400> 4

atgaaagtta aagtactgtc cctcctggta ccagctctgc tggtggcggg cgcagcgaat 60

gcggctgaaa tttataataa agacggcaac aaattagacc tgtttggtaa agttgatggc 120

ctgcactact tctctgacga caaaggcagc gatggcgacc agacctacat gcgtatcggc 180

ttcaaaggcg aaacgcaggt taacgatcag ctgaccggtt atggccagtg ggaatatcag 240

attcagggca accagactga aggcagcaac gactcctgga cgcgtgtggc gtttgcgggt 300

ctgaaattcg ctgatgcagg ttccttcgat tatggtcgta actacggcgt aacctatgac 360

gtgacctcct ggaccgacgt tctgccggag ttcggcggcg acacctacgg cgctgacaac 420

tttatgcagc agcgtggtaa cggctatgct acctaccgta acaccgactt cttcggcctg 480

gtggatggtc tggacttcgc gttacagtat cagggcaaaa acggcagcgt gagcggtgaa 540

aacaccaacg gtcgcagcct gctgaaccag aacggcgacg gttacggcgg atcgctgact 600

tatgcaatcg gcgaaggctt ctctgtcggt ggcgctatca ccacgtctaa acgtactgcc 660

gatcagaaca acaccgctaa cgctcgcctg tatggtaacg gcgatcgcgc cacggtttac 720

accggcggcc tgaaatacga tgcgaacaac atctatctgg cagcgcagta ttctcagacc 780

tataacgcaa cccgttttgg tacctctaac ggtagcaacc cgtccacctc ttacggtttt 840

gccaacaaag cgcagaactt tgaagtggtt gctcagtacc agttcgactt tggtctgcgt 900

ccgtctgt 908

<210> 5

<211> 1089

<212> DNA

<213> Salmonella enterica

<400> 5

atgaaactta agttagtggc agtggcagtg acttccctgt tggcagcagg cgtggtaaac 60

gcagccgagg tatataacaa agacggtaat aaactggatc tgtacggcaa agttcatgct 120

cagcattatt tctctgatga taacggaagt gatggcgaca aaacttacgc gcgactgggt 180

tttaaaggcg aaacgcagat caacgaccaa ctgaccggtt ttggtcagtg ggaatatgaa 240

ttcaaaggca accgtactga aagccagggt tctgacaaag ataaaactcg tctggcattt 300

gctggcctga aattcgctga ctacggttct ttcgactatg gccgtaacta cggcgttgct 360

tacgacatcg gcgcatggac cgacgttctg ccggaattcg gcggcgacac ctggactcag 420

gctgatgtct tcatgactgg ccgtactact ggcgttgcaa cctaccgtaa cactgacttc 480

ttcggtctgg ttgatgggct gaattttgcc gcacagtatc agggcaaaaa cgaccgtgcc 540

aatgcttatg agtctaacgg cgacggtttc ggtttgtccg caacgtatga atacgaaggc 600

tttggcgtag gtgcggccta tgcgaaatct gaccgtacta acaaccaggt taaagctgca 660

agcaatctga acgccgcagg taaaaatgct gaagtctggg ctgctggcct gaaatatgat 720

gcgaacaaca tctacctggc gacgacctac tccgaaacgc tgaacatgac caacttcggt 780

gaagatgccg taggtaacgc gtttatcgca aacaaaaccc agaactttga agcggttgct 840

cagtaccagt ttgacttcgg tctgcgtcca tctatcgctt acctgaaatc caaaggtaaa 900

aacctcggta ctttcggtga ccaggatctg gttgagtaca tcgatctcgg cgcaacctac 960

tacttcaaca aaaacatgtc taccttcgtt gattacaaaa tcaacctgct ggacgacagc 1020

aacttcacca aagcagctaa agtgtctacc gacaacatcg ttgctgttgg tctgaactat 1080

cagttctaa 1089

<210> 6

<211> 1431

<212> DNA

<213> Salmonella enterica

<400> 6

atggataata ttgataataa gtataatcca cagctatgta aaattttttt ggctatatcg 60

gatttgattt tttttaattt agccttatgg ttttcattag gatgtgtcta ttttattttt 120

gatcaagtac agcgatttat tcctcaagac caattagata caagagttat tacgcatttt 180

attttgtcag tagtatgtgt cggttggttt tggattcgtt tgcgacatta tacataccgc 240

aagccatttt ggtatgagtt aaaagaaatt tttcgtacga tcgttatttt tgctatattt 300

gatttggctc tgatagcgtt tacaaaatgg cagttttcac gctatgtctg ggtgttttgt 360

tggacttttg ccctaatcct ggtgcctttt tttcgcgcac ttacaaagca tttattgaac 420

aagctaggta tctggaagaa aaaaactatc atcctgggga gcggacagaa tgctcgtggt 480

gcatattctg cgctgcaaag tgaggagatg atggggtttg atgttatcgc tttttttgat 540

acggatgcgt cagatgctga aataaatatg ttgccggtga taaaggatac tgagattatt 600

tgggatttaa atcgtacagg tgatgtccat tatatccttg cttatgaata caccgagttg 660

gagaaaacac atttttggct acgtgaactt tcaaaacatc attgtcgttc tgttactgta 720

gtcccctcgt ttagaggatt gccattatat aatactgata tgtcttttat ctttagccat 780

gaagttatgt tattaaggat acaaaataac ttggctaaaa ggtcgtcccg ttttctcaaa 840

cggacatttg atattgtttg ttcaataatg attcttataa ttgcatcacc acttatgatt 900

tatctgtggt ataaagttac tcgagatggt ggtccggcta tttatggtca ccagcgagta 960

ggtcggcatg gaaaactttt tccatgctac aaatttcgtt ctatggttat gaattctcaa 1020

gaggtactaa aagaactttt ggctaacgat cctattgcca gggctgaatg ggagaaagat 1080

tttaaactga aaaatgatcc tcgaatcaca gctgtaggtc gatttatacg taaaactagc 1140

cttgatgagt tgccacaact ttttaatgta ctaaaaggtg atatgagcct ggttggacca 1200

cgacctatcg tttcggatga actggagcgt tattgtgatg atgttgatta ttatttgatg 1260

gcaaagccgg gcatgacagg tctatggcaa gtgagtgggc gtaatgatgt tgattatgac 1320

actcgtgttt attttgattc ctggtatgtt aaaaactgga cgctttggaa tgatattgcc 1380

attctgttta aaacagcgaa agttgttttg cggcgagatg gtgcgtatta a 1431

<210> 7

<211> 7583

<212> DNA

<213> Salmonella enterica

<400> 7

tgaagatact tgttactggt ggcgcaggat ttattggttc tgctgtagtt cgtcacatta 60

taaataatac gcaggatagt gttgttaatg tcgataaatt aacgtacgcc ggaaacctgg 120

agtcacttgc tgatgtttct gactctaaac gctatgtttt tgaacatgcg gatatttgcg 180

atgctgctgc aatggcgcgg atttttgctc agcatcagcc ggatgcagtg atgcacctgg 240

ctgctgaaag ccatgtggat cgttcaatta caggccctgc ggcatttatt gaaaccaata 300

ttgttggtac ttatgtcctt ttggaagcgg ctcgcaatta ctggtctgct cttgatggcg 360

acaagaaaaa tagcttccgt tttcatcata tttctactga cgaagtctat ggtgatttgc 420

ctcatcctga cgaagtaaat aataaagaac aattacccct ctttactgag acgacagctt 480

acgcgcctag tagtccttat tccgcatcaa aagcatccag cgatcattta gtccgtgcgt 540

ggaaacgtac ctatggttta ccgaccattg tgactaactg ttcgaataac tacggtcctt 600

atcactttcc ggaaaaattg attccactag taattcttaa tgctctggaa ggtaaggcat 660

tacctattta tggcaaaggg gatcaaattc gtgactggct gtatgttgaa gatcatgcgc 720

gtgcgttata tatcgtcgta accgaaggta aagcgggtga aacttataac attggtggac 780

acaacgaaaa gaaaaacatc gatgtagtgc tcactatttg tgatttgttg gatgagattg 840

taccgaaaga gaaatcttac cgcgagcaaa ttacttatgt tgccgatcgc ccgggacacg 900

atcgccgtta tgcgattgat gcagagaaga ttagccgcga attgggctgg aaaccgcagg 960

aaacgtttga gagcgggatt cgtaaaacgg tgggatggta cctctccaat acaaaatggg 1020

ttgataatgt aaaaagtggt gcctatcaat cgtggattga acagaactat gagggccgcc 1080

agtaatgaat atcctccttt tcggcaaaac agggcaggta ggttgggaac tacagcgtgc 1140

tctggcacct ctgggtaatt tgattgctct tgatgttcac tccactgatt actgtggtga 1200

ttttagtaat cctgaaggtg tagctgaaac cgtaagaagc attcggcctg atattattgt 1260

caacgcagcc gctcacaccg cagtagacaa agcagaatca gaaccggagt ttgcacaatt 1320

acttaacgcg acgagtgtcg aagcgatcgc gaaagcagcc aatgaagtcg gcgcctgggt 1380

tattcactac tctactgact acgtatttcc ggggaccggt gaaataccat ggcaggaggc 1440

ggatgcaacc gcaccgctaa atgtttacgg tgaaaccaag ttagctggag aaaaagcatt 1500

acaagagcat tgtgcgaagc acctaatttt ccgtacaagc tgggtctatg caggtaaagg 1560

aaataacttc gccaaaacga tgttgcgtct gggaaaagag cgtgaagaat tagccgttat 1620

taatgatcag tttggtgcgc caacaggtgc tgaactgctg gctgattgta cggcacatgc 1680

aattcgtgtg gcactgaata aaccagaagt cgcaggcttg taccatctgg tagccactgg 1740

taccacaacc tggcacgatt atgctgcgct ggtttttgaa gaggcacgaa aagcaggtat 1800

tccccttgca ctcaacaagc tcaacgcagt accaacaaca gcttatccta caccagctcg 1860

tcgtccacat aactctcgcc ttaatacaga aaaatttcag caaaattttg cgcttgtttt 1920

gcctgactgg caggttggcg tgaaacgaat gctcaacgaa ttatttacga ctacagcaat 1980

ttaatagttt ttgcatcttg ttcgtgatga tggagcaaga tgaattaaaa ggaatgatgt 2040

aatgaaaacg cgtaaaggta ttattttagc gggtggctct ggtactcgtc tttatcctgt 2100

gactatggct gtcagtaaac agctattacc tatttatgat aagccgatga tctattaccc 2160

gctctctaca ctgatgttgg cgggtattcg cgatattctg attattagta cgccacagga 2220

tactcctcgt tttcaacaac tcctgggtga tggtagccag tgggggttaa atcttcagta 2280

caaagtgcaa ccgagtccag atggtcttgc gcaggcattt atcatcggtg aagagtttat 2340

cggtggtgat gattgtgctc tggttctcgg tgataatatc ttctacggtc atgatctgcc 2400

gaagttaatg gatgtcgctg tcaacaaaga aagtggtgca acggtatttg cctatcacgt 2460

taatgatcct gaacgctacg gtgttgttga gtttgataaa aacggtacgg caatcagcct 2520

ggaagaaaaa ccgctacaac caaaaagtaa ttatgcggta accgggcttt atttctatga 2580

taacgacgtt gtcgaaatgg cgaaaaacct taagccttct gcccgtggtg aactggaaat 2640

taccgatatt aaccgtattt atatggagca ggggcgttta tccgttgcca tgatgggacg 2700

tggttatgca tggctggaca cggggacaca tcaaagtctt attgaagcaa gcaacttcat 2760

tgcaacaatt gaagagcgcc aagggttaaa ggtatcttgc ctggaagaga ttgcttatcg 2820

taaaggcttt attgacgcag agcaggttaa tgtattagcc gaaccgctaa agaaaaatgc 2880

ttatggtcag tatctgttga aaatgattaa aggttattaa aaatgaatgt aattaaaact 2940

gaaattccag atgtattaat tttcgagccg aaagtttttg gtgatgaacg tggttttttt 3000

atggaaagct ttaaccagaa agttttcgaa gaggctgtag ggcggaaggt tgaatttgtt 3060

caggataacc attctaaatc aactaagggt gtgttacgcg gactgcacta tcagttggaa 3120

ccttatgctc aaggtaaatt agttcgttgt gttgtcggtg aagtttttga tgtagcagtt 3180

gatattcgta aatcgtcacc tacatttggg aaatggattg gggtgaattt gtctgctgag 3240

aataagcgtc agttgtggat acctgaagga tttgcgcatg gatttttggt gctgagtgaa 3300

acggctgagt ttgtttataa aacaacaaac tattacaatc caagttttga aaaaagtatt 3360

tcatactcag atcctaccat taaaattcag tggcccaatt tacaggatat gcattttaaa 3420

ttatcaaata aggatttgaa tgctaagaac ttttttaata acaatagttt aatgcaatga 3480

agaaaaatat attgctcttg ttcttagtac atggggcaaa ttatttgttc ccgtttatag 3540

ttcttccata tcaaactcga atattaagca tcgagacatt cgcagatgta gcaaaaattc 3600

aagccgctgt gatgctttta tctttaatcg taaattatgg atataactta tcaagtacaa 3660

gagctatagc tagggccgta tctcaagcag aaataaataa gatctatagt gagactctta 3720

ttgtaaaatt attattggca accatttgtc ttgcacttgg ttgcgtacat ttgatgtatg 3780

tcaaagagta ctcattgata tatcctttta taatcagttc gatatatctt tatggtagtg 3840

cattatttgc tacttggtta ttccaaggac ttgagaaaat gaaagcggtc gttatagcaa 3900

caacaatcgc taaactgact ggtgtgatac ttacttttat tttagttaag tctccaaatg 3960

atatagttgc agctcttttt acacaaaaca ttgggatgtt tataagtggt ataatatcta 4020

tttatttggt aaggaaaaac aaatatgcaa ccgtaatatg ttttcgactt aaaaatatta 4080

ttgtaagctt aaaagaagcg tggccgtttt ttttatcatt agctgcaaca agtgtatata 4140

catattttaa tgtgatttta ttatcttttt atgctggcga ctatgttgtg gcaaatttta 4200

atgctgctga taaattaaga atggctgctc aagggttact tattccaata ggacaggctg 4260

ttttcccacg attatctaaa ctagagggct atgaatatag ttctaaactt aaaatttatg 4320

caataaggta tgctattttt ggtgtttgca ttagtgcggg acttgtattt ttaggtccca 4380

tgttaactac tatttattta ggcaaagaat attcgttgtc aggagaatat cttcaaagta 4440

tgtttttact acctgccact atttcaatat cgactatact gagtcaatgg atgttgatac 4500

ctcaaggcaa agaaaaaata ttaagcagaa tctatattct aggcgccatt gtccatttat 4560

tatatgcatt tcctttagtt tactattatg gggcttgggg catggtaata tcaattttat 4620

ttactgaagt cttaattgta ttatttatgc ttaaggctgt gaaatgactt actttactgg 4680

ttttatttta atattgtttg ctattataat taaaagatta actccaagtc aaagcaagaa 4740

aaatattgtc ttaatagcta atgcgttttg gggaatattg ttggtaggtt atgctttcaa 4800

tgaacaatat ttcgtaccat taagtgcaac aaccttgttt tttatacttg cattcttatt 4860

tttctttagt atgacttata ttttaattgc taggagtgga agggttgttt tttctttcgg 4920

tactggtttt atagaaagca aatatattta ctggtttgct gggatgatta atattattag 4980

tatctgcttt ggcattatcc ttttatataa taatcatttt tctttaaaag taatgagaga 5040

aggaatttta gatggttcta ttagtgggtt tggattgggg ataagtttgc cactttcctt 5100

ctgctgtatg tatttagcaa gacatgagaa taaaaaaaat tatttctatt gttttacact 5160

actttcattc ttgcttgcgg tgttatcaac ttcaaagatc ttcttaatat tattccttgt 5220

atatattgtt ggaataaata gttatgtaag caaaaagaaa ttgcttattt atggagtgtt 5280

tgtatttgga ctgttcgctt tatcaagtat tatcttgggt aagttctctt cagaccctga 5340

aggcaagatt atttcagcaa tatttgatac gttaagggtt tatcttttct cgggattggc 5400

agcctttaat ctttatgttg aaaagaatgc cacgctcccc gaaaatttac ttttgtatcc 5460

atttaaggag gtttggggga cgacaaaaga tattcccaaa actgatattt tgccttggat 5520

caacattggt gtatgggaca cgaatgtata tacagctttt gcaccatggt atcagtcatt 5580

gggattatat gcagctataa ttattggtat tctcttaggg ttttattacg ggatatggtt 5640

tagctttcgt caaaatttag ctgtgggttt ttatcaaaca tttttgtgtt ttcctctttt 5700

aatgttgttt ttccaggagc attatttgtt gtcatggaaa atgcatttta tttatttttt 5760

atgtgcaatt ttattagcga tgagaaaagc attagagtat gaataaatat tgtatcttag 5820

tactatttaa tccagatata agtgttttta ttgataatgt caaaaagatt ttatctttgg 5880

atgtaagttt atttgtatat gacaattcag caaataaaca tgcattcctt gctctatcct 5940

cacaagagca aacaaagata aattactttt cgatatgtga aaatatcgga ttgtcgaaag 6000

cttataatga gacactaagg catattcttg aatttaataa gaatgtgaaa aataaaagca 6060

ttaatgatag tgtgcttttt ctcgaccaag actctgaagt tgatttaaat tccatcaata 6120

ttttgtttga aactatatca gcagcagagt ctaatgtgat gatagtcgcg gggaatccca 6180

taaggagaga tggactaccg tatatagatt acccccacac tgtaaacaat gtaaaatttg 6240

taattagtag ttatgctgtg tatcgcttag acgcatttag aaacatcggc ttgtttcaag 6300

aagatttttt tatagatcat atcgatagtg atttttgttc aaggctgata aaaagcaatt 6360

accaaattct ccttagaaaa gatgcctttt tttatcaacc aataggaata aaaccattca 6420

atctctgtgg tagatattta ttccctatcc catcacaaca ccgaacatat tttcaaatta 6480

gaaatgcttt tttaagttac aggcgcaatg gtgttacatt taatttttta tttagggaaa 6540

ttgtaaatag attgattatg agtatattct caggccttaa cgagaaagac ttattgaaac 6600

gattgcattt atatttaaaa ggaataaaag atggtcttaa aatgtaattc ttggctagaa 6660

gtgggggcgt tgtgattaaa aaaaaagtgg cggcgataat tataacatat aatccagatc 6720

taacaattct gcgagaaagt tatacgagtc tatataagca agtcgataaa ataattctta 6780

ttgataacaa ctctacaaac tatcaagaac ttaagaagtt attcgaaaaa aaagaaaaaa 6840

taaaaatagt gcccttgagt gataatatag gactagcagc agctcaaaat ttaggtttga 6900

acttagctat taaaaataac tatacttatg ctattttatt cgatcaggat agcgtcttac 6960

aagacaatgg aattaacagt ttcttttttg aatttgagaa attagttagt gaagaaaaat 7020

taaatatagt tgccattggg ccaagttttt ttgacgaaaa gacaggaaga cgctttcggc 7080

ctacaaaatt tatcggtccc tttttatatc cctttcgtaa aataaccaca aaaaatcctc 7140

taacagaagt tgacttcttg attgcttctg gttgtttcat aaaattggag tgtattaaat 7200

cagccggaat gatgactgaa tcgttattca tcgattatat tgatgttgaa tggtcatatc 7260

gtatgcgttc gtatggctat aagctatata ttcataatga tattcacatg agtcatttag 7320

tgggagaatc tcgagttaat ttaggattga aaactatttc tttacatggg ccgctaagac 7380

gatattactt atttaggaat tatatttcaa ttttaaaagt gagatatata ccgttaggat 7440

ataaaatacg tgagggtttt tttaatatcg gaagattttt ggtaagtatg attataacta 7500

aaaatagaaa aactttaatt ttatacacta taaaagcaat taaggacgga ataaataatg 7560

aaatggggaa atataaaggc taa 7583

Claims (13)

1.一株高效刺激免疫反应的沙门菌突变株，其特征在于，所述突变株发生以下基因缺失突变∆fliC、∆fljB、∆ompA、∆ompC、∆ompD，并敲除利于异源O抗原多糖表达的基因rfbP，同时转入能够完整表达志贺氏菌O抗原多糖的表达质粒。

2.根据权利要求1所述的高效刺激免疫反应的沙门菌突变株，其特征在于，所述突变株的命名为：Salmonella enterica serovar Typhimurium str. UK-1 ∆fliC∆fljB∆ompA∆ompC∆ompD∆rfbP，保藏号为CCTCC NO: M 2020142，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年6月9日。

3.根据权利要求1所述的高效刺激免疫反应的沙门菌突变株，其特征在于，基因fliC的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，基因fljB的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，基因ompA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，基因ompC的基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，基因ompD的基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，基因rfbP的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，志贺氏菌O抗原的基因序列如SEQ ID No.7所示。

4.一株高效刺激免疫反应的沙门菌突变株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

（1）构建同源重组质粒pRE112-FliC、pRE112-FljB、pRE112-OmpA、pRE112-OmpC、pRE112-OmpD、pRE112-rfbP、表达志贺氏菌O抗原多糖的表达质粒；

（2）制备鼠伤寒沙门氏菌S100电转化感受态细胞χ7232；

（3）将步骤（1）所得同源重组质粒通过电转的方式转化入鼠伤寒沙门氏菌S100电转化感受态细胞χ7232中，将电转杯移入电转仪，2500伏电击4毫秒；

（4）将电击杯中的液体加入100 μL预热的LB培养基，轻轻吹熄混匀后涂布于含有氯霉素抗性CmR的平板上，37℃培养过夜，产生的单克隆即为电转成功的菌；

（5）通过PCR筛选得到不含FliC、FljB、OmpA、OmpC、OmpD 和rfbP基因，以及能够表达志贺氏菌O抗原多糖的突变菌株。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中电转化感受态细胞χ7232的制备方法包括如下步骤：

1）挑取单菌落χ7232接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，取400 μL母液加入到100 ml 装有LB培养基的三角瓶中，37℃、180 r/min振荡培养至OD₆₀₀=0.8-1；

2）冰浴30 min，4℃，4500 r/min离心10 min收集菌体，沉淀用冰浴预冷的超纯水洗两遍，弃上清；

3）用预冷的10%甘油洗一遍，弃上清，菌体用60 μL预冷的10%甘油重悬，即制备好感受态备用。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组质粒pRE112-fliC的构建步骤为：

1）引物设计：

fliC-1F：5’CGTTCTTTGTCAGGTCTGTC3’

fliC-2R：5’GATTAGCGGCCGCGATCTTTTCCTTATCAATTA3’

fliC-2F：

5’AAGATCGCGGCCGCTAATCCGGCGATTGATTCAC3’

fliC-2R：5’TGTACCCGGCACAGACGGTC3’；

2) 煮沸裂解法制备鼠伤寒沙门氏菌S100的基因组DNA模板，挑取单菌落37℃过夜培养，根据GenBank上已发表沙门氏菌S100基因组序列设计针对fliC上下游同源臂的扩增引物，分别扩增fliC对应的上下游同源臂片段，用重叠PCR方法连接前后臂片段，回收纯化连接产物为ΔfliC片段；

3）用Ahd I酶切自杀质粒载体pRE112，与预先PCR扩增已+A的ΔfliC融合片段进行连接，将连接产物放置于16℃过夜后，转入电转化感受态细胞χ7232中，得到重组质粒pRE112-fliC。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组质粒pRE112- FljB的构建步骤为：

1）引物设计：

fljB-1F：5’AGTGAGCTCCACGTTCATGT3’

fljB-1R：5’AATTAGCGGCCGCAAAATTTTCCTTTTGGAAGG3’

fljB-2F：5’ATTTTGCGGCCGCTAATTTATTTCGTTTTATTC3’

fljB-2R：5’GTCATTACCTGATAATTCTTC3’；

2）煮沸裂解法制备鼠伤寒沙门氏菌S100的基因组DNA模板，挑取单菌落37℃过夜培养，根据GenBank上已发表沙门氏菌S100基因组序列设计针对fljB上下游同源臂的扩增引物，分别扩增fljB对应的上下游同源臂片段，用重叠PCR方法连接前后臂片段，回收纯化连接产物为ΔfljB片段；

3）用Ahd I酶切自杀质粒载体pRE112，与预先PCR扩增已+A的ΔfljB融合片段进行连接，将连接产物放置于16℃过夜后，转入电转化感受态细胞χ7232中，得到重组质粒pRE112-fljB。

8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组质粒pRE112- ompA的构建步骤为：

1）引物设计：

ompA-1F：5’CATCCTCTCACACAACGAGAC3’

ompA-1R：

5’CTGCAGGAATGCGGCCGCCGGGGGATCTGCTCAATATT3’

ompA-2F：

5’CGGCCGCATTCCTGCAGGTAAGTTATCGTCTGGTAGAAA AAC3’

ompA-2R：5’CATATGAATCCGGAACTGGTC3’；

2）煮沸裂解法制备鼠伤寒沙门氏菌S100的基因组DNA模板，挑取单菌落37℃过夜培养，根据GenBank上已发表沙门氏菌S100基因组序列设计针对ompA上下游同源臂的扩增引物，分别扩增ompA对应的上下游同源臂片段，用重叠PCR方法连接前后臂片段，回收纯化连接产物为ΔompA片段；

3）用Ahd I酶切自杀质粒载体pRE112，与预先PCR扩增已+A的ΔompA融合片段进行连接，将连接产物放置于16℃过夜后，转入电转化感受态细胞χ7232中，得到重组质粒pRE112-ompA。

9.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组质粒pRE112- ompC的构建步骤为：

1）、引物设计：

ompC-1F：5’GCCAATACGCAGCGCCGAGGTCACG3’

ompC-1R：

5’ACCTGCAGGATGCGGCCGCGGTCAGCAAAAGATG3’

ompC-2F：

5’CCGCGGCCGCATCCTGCAGGTGTTATTAACCCTCTG3’

ompC-2R：5’ATAGGGGTAAACAGACATTCAGAAG3’；

2）煮沸裂解法制备鼠伤寒沙门氏菌S100的基因组DNA模板，挑取单菌落37℃过夜培养，根据GenBank上已发表沙门氏菌S100基因组序列设计针对ompC上下游同源臂的扩增引物，分别扩增ompC对应的上下游同源臂片段，用重叠PCR方法连接前后臂片段，回收纯化连接产物为ΔompC片段；

3) 用Ahd I酶切自杀质粒载体pRE112，与预先PCR扩增已+A的ΔompC融合片段进行连接，将连接产物放置于16℃过夜后，转入电转感受态细胞χ7232中，得到重组质粒pRE112-ompC。

10.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组质粒pRE112- ompD的构建步骤为：

1) 引物设计：

ompD-1F: 5’AAAGTTAATGATGATAGCGG3’

ompD-1R: 5’CTGCAGGAATGCGGCCGCGTTATTAACCCTCTGTTATA3’

ompD-2F: 5’CGGCCGCATTCCTGCAGGTAATCTCGATGGATATCGAAC3’

ompD-2R: 5’CGTTAAAGCGCATCAGCGCG3’；

2) 煮沸裂解法制备鼠伤寒沙门氏菌S100的基因组DNA模板，挑取单菌落37℃过夜培养，根据GenBank上已发表沙门氏菌S100基因组序列设计针对ompD上下游同源臂的扩增引物，分别扩增ompD对应的上下游同源臂片段，用重叠PCR方法连接前后臂片段，回收纯化连接产物为ΔompD片段；

3）用Ahd I酶切自杀质粒载体pRE112，与预先PCR扩增已+A的ΔompD融合片段进行连接，将连接产物放置于16℃过夜后，转入电转感受态细胞χ7232中，得到重组质粒pRE112-ompD。

11.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组质粒pRE112- rfbP的构建步骤为：

1）引物设计：

rfbP-1F：5’CAACTGATAAAAGTCAATCC3’

rfbP-1R：5’GTAAGCTTACCTGCAGGTTAATCCTCACCCTCTGA3’

rfbP-2F：5’GATTAACCTGCAGGTAAGCTTACCGAGAAGTACTGA3’

rfbP-2R：5’ATACGACGAGGCGTTTCGAG3’；

2) 煮沸裂解法制备鼠伤寒沙门氏菌S100的基因组DNA模板，挑取单菌落37℃过夜培养，根据GenBank上已发表沙门氏菌S100基因组序列设计针对rfbP上下游同源臂的扩增引物，分别扩增rfbP对应的上下游同源臂片段，用重叠PCR方法连接前后臂片段，回收纯化连接产物为ΔrfbP片段；

3）用Ahd I酶切自杀质粒载体pRE112，与预先PCR扩增已+A的ΔrfbP融合片段进行连接，将连接产物放置于16℃过夜后，转入电转感受态细胞χ7232中，得到重组质粒pRE112-rfbP。

12.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述表达志贺氏菌O抗原多糖的表达质粒的构建步骤为：

1）引物设计：

2a-F-vector：5’CGCCTGCATATAGCCCATTTCAGAATGGCCGGCCGCAGTC3’

2a-R-vector：5’GAAAGTCGTGGTTATACCGCTCATGAGACAATAACCCTG3’

2a-1F：5’CCGCCATTCTGAAATGGGCTATATGCAGGCGTTTGTGAA3’

2a-1R：5’AATGCATTTCTTACTCGATAATAAC3’

2a-2F：5’CTGTGGGATTAACATACCAATTCAC3’

2a-2R：5’ATTGTCTCATGAGCGGTATAACCACGACTTTCGATGTTG3’；

2）煮沸裂解法制备福氏志贺菌2a的基因组DNA模板，挑取单菌落37℃过夜培养，根据GenBank上已发表的福氏志贺菌2a基因组序列设计针对rfbP上下游同源臂的扩增引物，以其基因组为模板，用LA taq聚合酶进行扩增，通过两对引物2a-1F/2a-1R和2a-2F/2a-2R来扩增完整的O抗原基因簇，并以载体pSC101为模板扩增载体片段；

3）使用Gibson组装试剂盒，通过在设计引物时在片段中加入overlap片段，从而片段能够通过重叠片段，病通过gibson组装酶连接成一个完整的质粒，用电转化的方法将连接物转化入TOP10感受态细胞内，得到表达志贺氏菌O抗原多糖的表达质粒。

13.一种如权利要求1-3任一项所述的高效刺激免疫反应的沙门菌突变株或由权利要求4-12任一项所述方法制备得到的高效刺激免疫反应的沙门菌突变株的应用，其特征在于，所述应用包括将其所产生的外膜囊泡进行纯化，制备成用于防治志贺氏菌感染的疫苗。

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