CN116333957A - 一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明将枯草芽孢杆菌编码锚定蛋白cotG基因与编码前噬菌体裂解酶Lys0859基因融合，在枯草芽孢杆菌中进行外源表达，获得表面展示前噬菌体裂解酶Lys0859的重组枯草芽孢杆菌。所述重组枯草芽孢杆菌产生的芽孢可耐受高温、强酸强碱、胃肠道的环境，同时对猪链球菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、产气荚膜梭菌等革兰氏阳性菌具有抑菌效果，可作为新型的替抗制剂。重组芽孢在应用于猪链球菌感染时，可通过口服接种，同时在储存和运输方面有极大便利，还具有节约生产成本的特点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌及其构建方法和应用。
背景技术
我国饲料“禁抗令”已全面实施，饲料行业进入禁止使用抗生素的新时代，寻找更多、更好、更有效的抗生素替代品成为当务之急。噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体感染后期在宿主体内合成的细胞壁水解酶，通过穿孔素蛋白，裂解酶到达宿主细胞肽聚糖层从而发挥裂解功能，最终宿主细胞裂解释放子代噬菌体。噬菌体裂解酶因其不易产生耐药性、作用专一、高效且特异性杀菌等优点成为研究的热点。现有技术中报道的猪链球菌前噬菌体裂解酶Lys0859具有CHAP的催化结构域(EAD)和SH3b的细胞壁结合结构域(CBD)。该裂解酶是半胱氨酸、组氨酸依赖性的酰胺水解酶。但是该裂解酶耐受胃肠道的环境能力极差，不稳定易降解，增加储存和运输成本。注射的给药途径给猪只带来较大的应激，不仅影响仔猪生产性能，而且操作不便，增加工作量和饲养成本。另一方面，噬菌体裂解酶的制备过程如纯化、破碎成本高。因此，亟需寻求制备噬菌体裂解酶的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌，不仅可耐受高温、强酸强碱、胃肠道的环境而且具有良好的特异杀菌活性，为预防猪链球菌感染，提供新型替抗制剂。
本发明提供了一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌，在芽孢杆菌的锚定蛋白表面展示前噬菌体裂解酶Lys0859。
优选的，所述芽孢杆菌锚定蛋白为cotG蛋白；
所述cotG蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述前噬菌体裂解酶Lys0859的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选的，所述锚定蛋白和前噬菌体裂解酶Lys0859形成的融合蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO：3所示。
优选的，所述重组芽孢杆菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌168标准菌株。
本发明提供了一种所述重组芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
制备芽孢杆菌锚定蛋白和前噬菌体裂解酶Lys0859形成的融合基因；
将所述融合基因克隆至穿梭质粒中，得到重组质粒；
将所述重组质粒转化芽孢杆菌宿主菌中，得到展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌。
优选的，所述制备芽孢杆菌锚定蛋白和前噬菌体裂解酶Lys0859形成的融合基因的方法包括分别扩增芽孢杆菌锚定蛋白的编码基因和前噬菌体裂解酶Lys0859的编码基因，通过重叠PCR扩增，得到融合基因cotG-0859。
优选的，扩增芽孢杆菌锚定蛋白的编码基因的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的反向引物；
扩增前噬菌体裂解酶Lys0859的编码基因的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的反向引物；
重叠PCR扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的反向引物。
优选的，所述融合基因整合至枯草芽孢杆菌宿主菌基因组中的淀粉酶基因中。
本发明还提供了所述重组芽孢杆菌产生的重组芽孢。
本发明提供了所述重组芽孢杆菌、所述构建方法得到的重组芽孢杆菌或所述重组芽孢在制备抗菌剂或饲料中的应用，所述抗菌剂优选包括以下至少一种：猪链球菌抑菌剂、金黄色葡萄球菌抑菌剂、李斯特菌抑菌剂和产气荚膜梭菌抑菌剂。
本发明提供了一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌，在芽孢杆菌的锚定蛋白表面展示前噬菌体裂解酶Lys0859。所述重组芽孢杆菌在内生芽孢形成时前噬菌体裂解酶Lys0859基因随着锚定蛋白的表达从而得以成功地展示在芽孢表面。本发明利用SDS-PAGE、Western-blot、荧光免疫分析鉴定证明，前噬菌体裂解酶成功固定在芽孢表面。为了验证外源蛋白是否影响芽孢的功能，本发明测定野生型菌株和重组菌株的产酶定性实验、生长曲线、产芽孢率，结果表明，融合蛋白的表达不会影响芽孢杆菌的产芽孢功能。此外通过高温、强酸强碱、乙醇、人工胃液、人工肠液、胆盐、金属离子、EDTA处理重组芽孢，测定芽孢的稳定性，结果表明重组芽孢对上述环境具有较强的耐受性。同时，所述重组芽孢杆菌由于表面展示表达前噬菌体裂解酶，对猪链球菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、产气荚膜梭菌等革兰氏阳性菌具有良好的抑菌作用。可见，本发明提供的重组芽孢杆菌产生的重组芽孢不仅具有稳定的环境适应性而且保持良好的特异性杀菌性能，为开发预防猪链球菌感染提供抗菌剂，同时在口服接种和储存以及运输方面均具有独特的优势。
附图说明
图1为基因片段扩增电泳图；(a)cotG、0859基因扩增电泳图(b)融合基因片段cotG-0859扩增电泳图(c)泳道2是质粒pDG364-cotG-0859经过HindIII、EcoRI双酶切电泳图(d)重组子cotG-0859/DH5α菌落PCR电泳图；
图2为重组枯草芽孢杆菌rBScoG-0859淀粉酶活性鉴定结果；
图3为重组枯草芽孢杆菌rBScoG-0859菌液PCR鉴定结果；
图4为重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859基因组PCR鉴定结果；M：Marker，W：菌株168，N2：rBScotG-0859；
图5为重组枯草芽孢杆菌的抑菌效果；
图6为野生型枯草芽孢杆菌168和重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859的一步生长曲线；
图7中(a)为野生型枯草芽孢杆菌168和重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859的细菌总数图；图7中(b)为野生型枯草芽孢杆菌168和重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859的产芽孢图；
图8为SDS-PAGE分析结果，M：Marker 1：pCold-0859，2：pCold-cotG-0859，3：rBScotG-0859；
图9为抗0859多抗抗体Westem-blotting分析结果，M：Marker，1：rBScotG-0859，2：pCold-cotG-0859，3：pCold-0859，4：菌株168；
图10免疫荧光分析图；
图11为本发明提供的展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌构建方法的技术路线。
具体实施方式
本发明提供了一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌，在芽孢杆菌锚定蛋白表面展示表达前噬菌体裂解酶Lys0859。
在本发明中，所述芽孢杆菌锚定蛋白优选包括cotG蛋白。所述cotG蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO：1(MLGHYSHSDIEEAVKSAKKEGLKDYLYQEPHGKKRSHKKSHRTHKKSRSHKKSYCSHKKSRSHKKSFCSHKKSRSHKKSYCSHKKSRSHKKSYRSHKKSRSYKKSYRSYKKSRSYKKSCRSYKKSRSYKKSYCSHKKKSRSYKKSCRTHKKSYRSHKKYYKKPHHHCDDYKRHDDYDSKKEYWKDGNCWVVKKKYK)所示。所述前噬菌体裂解酶Lys0859的氨基酸序列优选如SEQ ID NO：2(GGSSGSMTTVFEVVNFAKDLANRGQGVDYDGWYGNQCVDLPNWISGKFFGKALWGNAIDLIKSAKQHGFEVHYMPTSERPRPGAIFVKNYWANDGGNYGHTGLIIGVSGNTVQTIEQNLVGNLSVGGPAQYSSQQISNLVGWFYPPYSDSTAVATQSSSGNLGKVKDEQGTMTVKVSLLNVRDKPGLDGKVVATYTNSEQFNYDSVYIADGYIWVSYVSRSGVRRYVAAGEESNRRNVVPYGIFKHHHHHH)所示。本发明实施例中，所述融合蛋白为芽孢杆菌锚定蛋白-前噬菌体裂解酶Lys0859的连接顺序，对应的氨基酸序列优选如SEQ ID NO：3(MLGHYSHSDIEEAVKSAKKEGLKDYLYQEPHGKKRSHKKSHRTHKKSRSHKKSYCSHKKSRSHKKSFCSHKKSRSHKKSYCSHKKSRSHKKSYRSHKKSRSYKKSYRSYKKSRSYKKSCRSYKKSRSYKKSYCSHKKKSRSYKKSCRTHKKSYRSHKKYYKKPHHHCDDYKRHDDYDSKKEYWKDGNCWVVKKKYKGGSSGSMTTVFEVVNFAKDLANRGQGVDYDGWYGNQCVDLPNWISGKFFGKALWGNAIDLIKSAKQHGFEVHYMPTSERPRPGAIFVKNYWANDGGNYGHTGLIIGVSGNTVQTIEQNLVGNLSVGGPAQYSSQQISNLVGWFYPPYSDSTAVATQSSSGNLGKVKDEQGTMTVKVSLLNVRDKPGLDGKVVATYTNSEQFNYDSVYIADGYIWVSYVSRSGVRRYVAAGEESNRRNVVPYGIFKHHHHHH)所示。所述前噬菌体裂解酶Lys0859通过锚定蛋白成功展示在重组芽孢杆菌表面。
本发明对所述芽孢杆菌的宿主菌种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的宿主菌即可，例如枯草芽孢杆菌168菌株。所述cotG蛋白优选来源于枯草芽孢杆菌168菌株。
本发明提供了一种所述重组芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：
制备芽孢杆菌锚定蛋白和前噬菌体裂解酶Lys0859形成的融合基因；
将所述融合基因克隆至穿梭质粒中，得到重组质粒；
将所述重组质粒转化芽孢杆菌宿主菌中，得到展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌。
本发明首先制备芽孢杆菌锚定蛋白和前噬菌体裂解酶Lys0859形成的融合基因。
在本发明中，所述制备芽孢杆菌锚定蛋白和前噬菌体裂解酶Lys0859形成的融合基因的方法优选包括分别扩增芽孢杆菌锚定蛋白的编码基因和前噬菌体裂解酶Lys0859的编码基因，通过重叠PCR扩增，得到融合基因cotG-0859。
在本发明中，扩增芽孢杆菌锚定蛋白的编码基因的引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的反向引物。扩增芽孢杆菌锚定蛋白的编码基因的反应程序优选为98℃10min；98℃10s，55℃5s，72℃20s，共35个循环；72℃5min。扩增前噬菌体裂解酶Lys0859的编码基因的引物优选包括核苷酸序列如SEQID NO：6所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的反向引物。扩增前噬菌体裂解酶Lys0859的编码基因的反应程序优选为98℃10min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，共35个循环；72℃5min。
在本发明中，所述重叠PCR扩增用引物包括核苷酸序列优选如SEQ ID NO：4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的反向引物，其中SEQ ID NO：4所示的正向引物带有HindIII酶切位点，所述SEQ ID NO：7所示的反向引物带有EcoRI酶切位点。
得到融合基因后，本发明将所述融合基因克隆至穿梭质粒中，得到重组质粒。
本发明对所述穿梭质粒的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的穿梭质粒即可，例如pDG364质粒。所述克隆的方法优选包括同源重组方法，具体为采用限制性内切酶HindIII和EcoRI对穿梭质粒和融合片段cotG-0859进行双酶切，酶切产物经纯化后连接，验证鉴定阳性重组质粒。
本发明将所述重组质粒转化芽孢杆菌宿主菌中，得到展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌。
在本发明中，所述转化方法优选为将所述重组质粒经过线性化后，采用化学转化法转化至芽孢杆菌宿主菌感受态中。所述融合基因优选整合至枯草芽孢杆菌宿主菌基因组中的淀粉酶基因中。所述整合的方法优选为将大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pDG364中克隆入amyE(淀粉酶)基因的上下同源臂，将重组质粒pDG364-cotG-0859导入枯草芽孢杆菌感受态细胞后，经过同源臂双交换将外源融合片段cotG-0859整合至枯草芽孢杆菌的amyE基因中。
在本发明中，优选包括展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌的鉴定。所述鉴定的方法优选包括淀粉酶活性鉴定、菌液PCR鉴定和基因组鉴定。由于所述融合基因优选整合至枯草芽孢杆菌宿主菌基因组中的淀粉酶基因中，影响淀粉酶活性，因此选择丧失淀粉酶活性的菌株进行菌液PCR鉴定。所述菌液PCR鉴定用引物包括amyE-F(SEQ ID NO：10)/amyE-R(SEQ ID NO：11)和BS168-F(SEQ ID NO：12)/BS168-R(SEQ ID NO：13)。所述基因组鉴定用引物包括amyE-F(SEQ ID NO：10)/amyE-R(SEQ ID NO：11)、G8-F(SEQ ID NO：8)/G8-R(SEQ ID NO：9)、amyE-F(SEQ ID NO：10)/G8-R(SEQ ID NO：9)、G8-F(SEQ ID NO：8)/amyE-R(SEQ ID NO：11)。三种鉴定结果均显示，本发明成功将cotG-0859成功插入枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因中，得到展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌。
本发明还提供了一种所述重组芽孢杆菌产生的重组芽孢。
在本发明中，所述重组芽孢的制备方法优选为将活化的重组芽孢杆菌接种至DSM培养基中，在37℃、180rpm条件下培养48h，收集菌体洗涤后获得重组枯草芽孢杆菌的芽孢。所述活化的重组芽孢杆菌的接种量优选为0.8～1.2％，更优选为1.0％。所述收集菌体的方法优选包括离心，所述离心的转速优选为8500rpm，更优选为10min。所述洗涤用溶液优选包括PBS液。所述重组芽孢杆菌的芽孢还优选包括纯化。所述纯化的方法优选为溶菌酶处理后收集沉淀，用氯化钠溶液洗涤，用含溶菌酶的Tris-HCl重悬沉淀，37℃处理1h，处理再次离心收集沉淀，再用1mol/LNaCl去离子水、0.05％SDS、TEP缓冲液，洗涤后得到纯芽孢。
在本发明中，所述重组芽孢杆菌的芽孢具有良好的温度耐受性、pH值耐受性、人工胃液耐受性、胆盐耐受性、人工肠液耐受性以及对金属离子和EDTA耐受性。同时所述重组芽孢杆菌的芽孢对不同血清型的猪链球菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、产气荚膜梭菌均有不同程度的抑菌效果，而野生型枯草芽孢杆菌仅对金黄色葡萄球菌有抑菌效果。
本发明提供了所述重组芽孢杆菌、所述构建方法得到的重组芽孢杆菌或所述重组芽孢在制备抗菌剂或饲料中的应用，所述抗菌剂优选包括以下至少一种：猪链球菌抑菌剂、金黄色葡萄球菌抑菌剂、李斯特菌抑菌剂和产气荚膜梭菌抑菌剂。
下面结合实施例对本发明提供的一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例用于说明本发明，但是本发明的实施方式不限与此。如未特别说明，本研究所使用的试剂、方法设备均为常用试剂。
实施例1
重组穿梭质粒pDG364-cotG-0859的构建方法
1.试剂的配置
①50×TAE配方：称量Tris 242g，Na2EDTA 37.2g，量取57.1mL冰醋酸，加入去离子水定容至1L。
②1％琼脂糖凝胶：1g琼脂糖溶于100mL 1×TAE中，微波炉加热混合均匀，加入3μL核酸染料混合均匀，倒入水平胶框，插入梳子自然冷却。
2.锚定蛋白cotG的PCR扩增
以野生型枯草芽孢杆菌(B.subtilis 168)(购买自中国典型培养物保藏中心)基因组为模板，以cotG-F和cotG-R为引物，采用PCR法扩增cotG目的片段。PCR扩增体系见表1，PCR扩增程序见表2，将得到的PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳进行检验，其中cotG片段理论大小分别为613bp，见图1中(a)，验证正确后，使用San Prep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，保存于-20℃备用。
表1 cotG片段的PCR扩增体系
表2 cotG片段的PCR扩增程序
上游引物cotG-F：5′-CGAAGCTTATGTTGGGCCACTATTCCCATTCTGACATCGAAG-3′(SEQID NO：4)，其中下划线为HindIII酶切位点)。
下游引物cotG-R：5′-TCGATCCAGACGAGCCTCCTTTGTATTTCTTTTTGACTACCCAGCAATTG-3′(SEQ ID NO：5)。扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：14(ATGTTGGGCCACTATTCCCATTCTGACATCGAAGAAGCGGTGAAATCCGCAAAAAAAGAAGGTTTAAAGGATTATTTATACCAAGAGCCTCATGGAAAAAAACGCAGTCATAAAAAGTCGCACCGCACTCACAAAAAATCTCGCAGCCATAAAAAATCATACTGCTCTCACAAAAAATCTCGCAGTCACAAAAAATCATTCTGTTCTCACAAAAAATCTCGCAGCCACAAAAAATCATACTGCTCTCACAAGAAATCTCGCAGCCACAAAAAATCGTACCGTTCTCACAAAAAATCTCGCAGCTATAAAAAATCTTACCGTTCTTACAAAAAATCTCGTAGCTATAAAAAATCTTGCCGTTCTTACAAAAAATCTCGCAGCTACAAAAAGTCTTACTGTTCTCACAAGAAAAAATCTCGCAGCTATAAGAAGTCATGCCGCACACACAAAAAATCTTATCGTTCCCATAAGAAATACTACAAAAAACCGCACCACCACTGCGACGACTACAAAAGACACGATGATTATGACAGCAAAAAAGAATACTGGAAAGACGGCAATTGCTGGGTAGTCAAAAAGAAATACAAA)所示。
3.前噬菌体裂解酶Lys0859的PCR扩增
以猪链球菌S.suis 0859基因组为模板，0859-F和0859-R为引物，PCR扩增前噬菌体裂解酶Lys0859目的片段。PCR扩增体系见表3，PCR扩增程序见表4，将上述PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳进行检验，其中0859片段理论大小分别为764bp，见图1中(a)，验证正确后，使用San Prep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，保存于-20℃备用。
表3 0859片段的PCR扩增体系
表4 0859片段的PCR扩增程序
上游引物0859-F：5′-AAGGAGGCTCGTCTGGATCGATGACAACAGTATTTGAAGTAGTCAATTTTG-3′(SEQ ID NO：6)；
下游引物0859-R：5′-CGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTGAAAATACCATAAGGCACA-3′(SEQ ID NO：7)，下划线为EcoRI酶切位点)。扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1 5(ATGACAACAGTATTTGAAGTAGTCAATTTTGCCAAAGACCTAGCCAACCGTGGTCAAGGTGTAGACTATGATGGTTGGTACGGTAATCAATGTGTAGACTTGCCTAACTGGATCAGTGGCAAATTTTTTGGCAAAGCTCTTTGGGGCAATGCCATTGATTTGATAAAGTCAGCCAAGCAACACGGCTTTGAGGTGCATTACATGCCTACTTCAGAACGTCCACGTCCAGGGGCTATCTTTGTCAAGAATTACTGGGCCAATGATGGTGGCAACTATGGGCATACGGGTTTGATTATCGGTGTTAGTGGCAATACTGTCCAAACAATCGAGCAAAACTTGGTAGGTAATCTGTCTGTCGGTGGTCCTGCTCAGTATTCTAGTCAGCAAATCAGCAATCTTGTTGGCTGGTTTTATCCACCTTACAGCGACTCTACTGCAGTGGCAACACAGTCAAGCAGTGGCAATCTCGGTAAGGTCAAAGACGAGCAGGGGACAATGACCGTTAAAGTATCTTTGCTCAATGTCCGAGACAAGCCTGGTTTAGACGGTAAAGTTGTGGCAACGTACACGAATAGCGAGCAGTTTAATTATGATTCGGTCTATATTGCCGATGGATACATTTGGGTATCGTATGTTAGCCGTAGCGGTGTACGTCGCTATGTAGCAGCAGGCGAGGAATCAAACCGTCGCAATGTTGTGCCTTATGGTATTTTCAAA)。
4.锚定蛋白cotG和噬菌体裂解酶Lys0859的融合
利用重叠PCR技术，得到融合基因片段cotG-0859。PCR扩增体系见表5，PCR扩增程序见表6，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检验，cotG-0859片段理论大小分别为1356bp，见图1中(b)，验证正确后使用San Prep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，保存于-20℃备用。
表5 cotG-0859片段的PCR扩增体系
表6 cotG-0859片段的PCR扩增程序
上游引物cotG-F：5′-CGAAGCTTATGTTGGGCCACTATTCCCATTCTGACATCGAAG-3168(SEQID NO：4)，下划线为HindIII酶切位点)
下游引物0859-R：5′-CGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTGAAAATACCATAAGGCACA-3168(SEQ ID NO：7)，下划线为EcoRI酶切位点。得到的融合基因cotG-0859的核苷酸序列如SEQ ID NO：16(AAGCTTATGTTGGGCCACTATTCCCATTCTGACATCGAAGAAGCGGTGAAATCCGCAAAAAAAGAAGGTTTAAAGGATTATTTATACCAAGAGCCTCATGGAAAAAAACGCAGTCATAAAAAGTCGCACCGCACTCACAAAAAATCTCGCAGCCATAAAAAATCATACTGCTCTCACAAAAAATCTCGCAGTCACAAAAAATCATTCTGTTCTCACAAAAAATCTCGCAGCCACAAAAAATCATACTGCTCTCACAAGAAATCTCGCAGCCACAAAAAATCGTACCGTTCTCACAAAAAATCTCGCAGCTATAAAAAATCTTACCGTTCTTACAAAAAATCTCGTAGCTATAAAAAATCTTGCCGTTCTTACAAAAAATCTCGCAGCTACAAAAAGTCTTACTGTTCTCACAAGAAAAAATCTCGCAGCTATAAGAAGTCATGCCGCACACACAAAAAATCTTATCGTTCCCATAAGAAATACTACAAAAAACCGCACCACCACTGCGACGACTACAAAAGACACGATGATTATGACAGCAAAAAAGAATACTGGAAAGACGGCAATTGCTGGGTAGTCAAAAAGAAATACAAAGGAGGCTCGTCTGGATCGATGACAACAGTATTTGAAGTAGTCAATTTTGCCAAAGACCTAGCCAACCGTGGTCAAGGTGTAGACTATGATGGTTGGTACGGTAATCAATGTGTAGACTTGCCTAACTGGATCAGTGGCAAATTTTTTGGCAAAGCTCTTTGGGGCAATGCCATTGATTTGATAAAGTCAGCCAAGCAACACGGCTTTGAGGTGCATTACATGCCTACTTCAGAACGTCCACGTCCAGGGGCTATCTTTGTCAAGAATTACTGGGCCAATGATGGTGGCAACTATGGGCATACGGGTTTGATTATCGGTGTTAGTGGCAATACTGTCCAAACAATCGAGCAAAACTTGGTAGGTAATCTGTCTGTCGGTGGTCCTGCTCAGTATTCTAGTCAGCAAATCAGCAATCTTGTTGGCTGGTTTTATCCACCTTACAGCGACTCTACTGCAGTGGCAACACAGTCAAGCAGTGGCAATCTCGGTAAGGTCAAAGACGAGCAGGGGACAATGACCGTTAAAGTATCTTTGCTCAATGTCCGAGACAAGCCTGGTTTAGACGGTAAAGTTGTGGCAACGTACACGAATAGCGAGCAGTTTAATTATGATTCGGTCTATATTGCCGATGGATACATTTGGGTATCGTATGTTAGCCGTAGCGGTGTACGTCGCTATGTAGCAGCAGGCGAGGAATCAAACCGTCGCAATGTTGTGCCTTATGGTATTTTCAAACACCACCACCACCACCACTAAGAATTC)所示，其中5′端和3′端下划线部分为HindIII酶切位点和ECORI酶切位点。融合基因中还包含连接肽核苷酸序列(GGAGGCTCGTCTGGATCG，SEQ ID NO：17)。
5.融合基因片段cotG-0859和pDG364载体的酶切
使用限制性内切酶HindIII和EcoRI对含有amyE(淀粉酶)基因的上下同源臂的pDG364质粒和融合片段cotG-0859进行双酶切。融合片段cotG-0859酶切体系见表7，pDG364质粒酶切体系见表8，酶切条件：37℃水浴1h。酶切产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检验，验证正确后使用San Prep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，保存于-20℃备用。
表7融合片段cotG-0859酶切体系
表8 pDG364质粒酶切体系
6.连接
利用T4 DNA连接酶，将酶切的融合基因cotG-0859和pDG364质粒进行连接。连接条件4℃，12h。连接体系见表9。
表9连接体系
7.转化
1)培养基的配置：①LB培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，去离子水定容至1L，pH 7.0，121℃高压灭菌20min。②100mg/mL氨苄青霉素的配方：1g氨苄青霉素溶于10mL水中混合均匀，使用0.22μm滤器过滤除菌。③氨苄青霉素(终浓度为100μg/mL)的LA平板的配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，14g琼脂，加入去离子水定容至1L，pH 7.0，121℃高压灭菌20min。待冷却至55℃后，加入1mL100mg/mL氨苄青霉素混合均匀，倾倒于无菌培养皿中，直至凝固。
2)转化
将E.coli DH5α感受态细胞在冰上慢慢解冻，缓慢加入20μL连接产物。轻轻混匀后，在冰上放置30min，然后42℃水浴热激90s，再迅速置于冰上冷却5min。在超净工作台中，向EP管中加入900μL LB培养基，充分混合均匀，在37℃180rpm振荡培养1h后，5000rpm，离心5min，去除部分上清，最后将菌液均匀涂布于氨苄青霉素(终浓度为100μg/mL)的LA平板上，在37℃培养箱中倒置培养。
8.阳性克隆子的鉴定
1)菌株的活化：待培养皿长出单菌落后，挑取转化子。将转化子接种至含5mL LB(终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素)的细菌瓶中，在37℃180rpm振荡培养12-16h。
2)菌液PCR鉴定：挑取单菌落的菌液为模板，G8-F/G8-R为引物，PCR反应体系见表10。PCR扩增程序见表11。将上述PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳进行检验，其理论大小为1356bp验证正确，见图1中(c)。
表10转化子鉴定PCR扩增体系
表11转化子鉴定PCR扩增程序
上游引物G8-F：5′-TTACGCGAAATACGGGCAGACAT-3′，SEQ ID NO：8)；
下游引物G8-R：5′-TTTTTAAAGGATTTGAGCGTAGCG-3′，SEQ ID NO：9)。
3)酶切鉴定：上述的阳性克隆子扩大培养，使用质粒提取试剂盒(Omega E.Z.N.APlasmid Mini Kit I)提取重组质粒pDG364-cotG-0859，将提取的重组质粒进行酶切验证。酶切体系见表12。酶切条件：37℃水浴1h。将上述酶切产物使用1％琼脂糖凝胶电泳进行检验，目的条带大小在1000-2000之间，与目的大小一致，见图1中(d)。将验证后的重组质粒交由擎科生物工程(武汉)股份有限公司进行测序。经比对，测序结果与原始序列一致，表明重组质粒pDG364-cotG-0859构建成功。
表12重组质粒pDG364-cotG-0859酶切体系
实施例2
重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859的构建方法
1.质粒的线性化
质粒pDG364-cotG-0859酶切体系见表13，37℃水浴1h。通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检验，验证正确后使用San Prep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，保存于-20℃备用。
表13质粒pDG364-cotG-0859酶切体系
2.B.subitilis 168感受态的制备
1)培养基的配置：①10×Spizizen’s medium的配置：2g(NH4)2S04、14g K2HPO4、6gKH2PO4、1g柠檬酸钠、100mL去离子水，121℃高压蒸汽灭菌20min，加入0.1ml 1mol/LMgSO4。②HS培养基的配方：在10×Spizizen’s medium的基础上添加0.5％葡萄糖、50μg/mL DL-色氨酸、50μg/mL尿嘧啶、0.02％酪蛋白水解物、0.1％酵母提取物、8μg/ml精氨酸、0.4μg/ml组氨酸、1mmol/L MgSO4。③LS培养基的配方：在10×Spizizen’s medium的基础上添加0.5％葡萄糖、5μg/mL DL-色氨酸、5μg/mL尿嘧啶、0.01％酪蛋白水解物、0.1％酵母提取物、1mmol/L MgSO4、2.5mM MgCl2、0.5mM CaCl2。④0.5mol/L EGTA的配方：称取19.02g EGTA溶于90mL去离子水，在不断搅拌下滴加5mol/L氢氧化钠溶液控制PH在8.0之间，冷却移入100mL容量瓶中稀释至刻度。
2)B.subitilis 168感受态细胞的制备：取甘油冻存的枯草芽孢杆菌B.subitilis168菌株在LA平板上画线，于37℃恒温培养箱培养12h，直至出现单菌落。接种新鲜的B.subitilis 168单菌落于5mL HS培养基中，置摇床中37℃过夜；接种1mL过夜的HS培养基于20mL LS培养基中，置摇床中30℃3-4小时。
3.重组质粒转化至B.subitilis 168感受态细胞
取上述1mL LS培养基，加入20μL 0.5mol/L EGTA，轻轻混匀，室温孵育5min；加入12μL线性化质粒pDG364-cotG-0859，轻轻混匀，37℃180rpm，震荡2h；涂布于氯霉素平板(终浓度为5μg/mL)，置于37℃培养箱中培养过夜。
实施例3
重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859的鉴定方法
1.重组枯草芽孢杆菌的淀粉酶活性鉴定
1)培养基的配置：①含有淀粉的LA培养基配方：在LA培养基的基础上加入l％的可溶性淀粉，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却至55℃后，倾倒于无菌培养皿中，直至凝固。②2mol/L NaCl：称量11.6g NaCl溶于100mL去离子水，混合均匀。
2)枯草芽孢杆菌的活化：取甘油冻存的重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859菌株和B.subtilis 168菌株在LA固体培养基上画线，于37℃恒温培养箱培养12h，直至出现单菌落。
3)枯草芽孢杆菌产淀粉酶活性鉴定：用无菌枪头挑取重组枯草芽孢杆菌rBScotG -0859和B.subtilis 168菌株的单菌落，点在含有1％淀粉的LA培养基中，两种菌株分别做三个重复，37℃恒温培养箱培养12h。
4)菌株产淀粉酶测定结果：将上述培养12h的平板用5％碘液(购买自索莱宝)染色5min，然后用2mol/L NaCl洗涤两次，结果见图2。
2.重组枯草芽孢杆菌的菌液PCR鉴定
1)菌株的复苏：取甘油冻存的重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859菌株在抗性平板(5μg/mL氯霉素)画线，于37℃恒温培养箱培养12h，直至出现单菌落。挑取抗性平板上单菌落于LB培养基(氯霉素终浓度为5μg/mL)，37℃恒温培养箱培养18h。
2)菌株的PCR鉴定：上述重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859菌株为模板，以amyE-F/amyE-R、BS168-F/BS168-R为引物进行PCR扩增。PCR产物经过1％琼脂凝胶进一步验证。
上游引物amyE-F：5′-GGGATTTTTGACTCCGAAGTAAGTC-3′(SEQ ID NO：10)；
下游引物amyE-R：5′-ATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACT-3′(SEQ ID NO：11)；
上游引物BS168-F：5′-CATTGATTTGTATTCACTCTGCCAAGTTG-3′(SEQ ID NO：12)；
下游引物BS168-R：5′-CATCAATGACCACAAGCTCATCTGTGAT-3′(SEQ ID NO：13)。
3)菌液PCR鉴定结果：重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859菌株为模板，以amyE-F/amyE-R进行PCR扩增，理论片段大小为4448bp，BS168-F/BS168-R为引物，理论片段大小为4800bp，见图3。
3.重组枯草芽孢杆菌的基因组鉴定
1)菌株的复苏：取甘油冻存的重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859菌株和B.subtilis168在LA固体培养基上画线，于37℃恒温培养箱培养12h，直至出现单菌落。挑取单菌落至5mL LB培养基，37℃180mm振荡培养8h。
2)提取基因组：参照试剂盒提取说明书(康为世纪)提取重组菌rBScotG-0859和野生菌B.subtilis 168基因组。
3)基因组PCR鉴定：上述提取的基因组为模板，以amyE-F/amyE-R、G8-F/G8-R、amyE-F/G8-R、G8-F/amyE-R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系见表14。PCR扩增程序见表15。
表14基因组PCR扩增体系
表15基因组鉴定PCR扩增程序
上游引物G8-F：5′-TTACGCGAAATACGGGCAGACAT-3′，SEQ ID NO：8)；
下游引物G8-R：5′-TTTTTAAAGGATTTGAGCGTAGCG-3′，SEQ ID NO：9)。
上游引物amyE-F：5′-GGGATTTTTGACTCCGAAGTAAGTC-3′(SEQ ID NO：10)；
下游引物amyE-R：5′-ATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACT-3′(SEQ ID NO：11)；
3)基因组PCR鉴定结果：PCR产物经过1％琼脂凝胶进一步验证。用引物amyE-F/amyE-R扩增野生菌和重组菌分别2000bp和4448bp；引物G8-F/G8-R扩增野生菌和重组菌分别0bp和1544bp；引物amyE-F/G8-R扩增野生菌和重组菌分别0bp和2161bp；引物G8-F/amyE-R扩增野生菌和重组菌分别0bp和3562bp。野生型枯草芽孢杆菌除amyE-F/amyE-R为引物外，其他引物均无特殊条带，结果表明基因片段Emr-cotG-0859成功插入枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因，见图4。
实施例4
枯草芽孢杆菌芽孢的制备方法
1.DSM培养基的配置：0.8％营养肉汤、0.1％KCl、0.025％MgSO4·7H2O、0.01mmMnCl2、调节pH至7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min，培养基冷却至室温，加入过滤除菌的1.0μmol/LFeSO4(现用现加，现配)、1.0mmol/LCaCl21.0mL(现用现加)。
2.试剂的配置：①30mL 0.5mol/LNaCl：称量0.87g NaCl溶于30mL去离子水中混合均匀；②30mL Tris-HCl(50mmol/L，pH7.2；含溶菌酶终浓度为50μg/mL)：称量0.2355gTris-HCl溶于30mL去离子水，再加入1.5mg溶菌酶混合均匀。③1mol/L NaCl：1.74g NaCl溶于30mL去离子水中混合均匀；④0.05％SDS：0.05g SDS溶于100mL去离子水混合均匀。⑤TEP缓冲液的配置：首先配置200mM PMSF：0.3484g PMSF溶于10mL异丙醇混合均匀备用。0.2355g Tris-HCl溶于30mL去离子水，再加入0.1116g EDTA，最后加入300μL 200mM PMSF混合均匀。
3.菌株的复苏：同实施例3中步骤3中菌株的复苏。
4.芽孢的制备：将上述活化的菌株按1％的接种量接种于DSM培养基中，37℃180rpm条件下培养48h。8500rpm，10min离心收集菌体，PBS洗涤菌体两遍，即获得重组枯草芽孢杆菌的芽孢。
4.芽孢的纯化：溶菌酶处理法进行芽孢的纯化，使用以下溶液对沉淀进行洗涤，8500rpm离心10min，弃上清收集沉淀。(1)30mL 0.5mol/LNaCl溶液洗涤沉淀，(2)30mLTris-HCl(50mmol/L，pH 7.2；含溶菌酶终浓度为50μg/mL)重悬沉淀，37℃条件下处理1h，8500rpm离心10min，弃上清收集沉淀。(3)1mol/LNaCl(4)去离子水(5)0.05％SDS(6)TEP缓冲液(7)去离子水洗涤三遍。最后，将芽孢重悬于无菌水中，65℃水浴1h，杀死未芽孢化的营养型细胞，获得纯芽孢，-20℃保存备用。
实施例5
重组枯草芽孢杆菌芽孢的耐受性实验
1.重组枯草芽孢杆菌芽孢温度耐受性研究
1)取实施例4纯化的重组芽孢rBScotG-0859在65、75、85℃处理60min。分别在培养的第5、10、15、30、60min取样，处理后的芽孢用无菌PBS做10-1、10-2、10-3......10倍递度稀释；同时取未经处理的芽孢作对照，进行芽孢计数，最后计算芽孢存活率。以上样品均重复3次，以平均数为准。
2)重组芽孢rBScotG-0859温度耐受试验结果：由表16知，随着时间的延长，重组芽孢的存活率呈下降的趋势。重组芽孢65℃处理60min存活率达到91％，重组芽孢75℃处理60min存活率达到85％。85℃处理芽孢存活率明显下降，以上结果表明，重组芽孢对温度具有中等程度的抵抗能力。
表16重组枯草芽孢杆菌芽孢在不同温度下的存活率
2.重组枯草芽孢杆菌芽孢pH耐受性研究
1)不同pH缓冲液的配置：在0.85％生理盐水中加入稀盐酸或氢氧化钠调整pH至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，121℃高压灭菌15min。
2)取实施例4纯化的重组芽孢rBScotG-0859沉淀接种于上述不同pH缓冲液中，37℃处理30min取样，同时取未经处理的芽孢作对照，稀释涂板进行芽孢计数，最后计算芽孢存活率。
3)重组芽孢rBScotG-0859pH耐受试验结果：由表17知，重组芽孢rBScotG-0859处理30min在pH＝1的酸性环境中存活率达到70.76％，在pH＝7中存活率最高，在pH＝5、6微酸性环境中芽孢的存活率达到90％以上，总体来看，芽孢在中性环境中更稳定，且对强酸环境具有较强的抵抗性。
表17重组枯草芽孢杆菌芽孢在不同pH环境下的存活率
3.重组枯草芽孢杆菌芽孢人工胃液耐受性研究
1)人工胃液的配置：取16.4mL浓盐酸加入生理盐水稀释，使pH为2.0，然后加入1％的胃蛋白酶，充分搅拌溶解，使用0.22μm滤器过滤除菌。
2)取实施例4纯化的重组芽孢rBScotG-0859沉淀接种于人工胃液，于37℃中处理60min。分别在培养的第5、10、15、30、60min取样，同时取未经处理的芽孢作对照，稀释涂板进行芽孢计数，最后计算芽孢存活率。
3)重组芽孢rBScotG-0859人工胃液耐受试验结果：由表18知，随着处理时间的延长，重组枯草芽孢杆菌芽孢的存活率逐渐下降，人工胃液处理10min重组芽孢的存活率达到93％，处理30min和1h后重组芽孢的存活率保持在76％，说明重组枯草芽孢杆菌芽孢对人工胃液具有较强的耐受性。
表18重组枯草芽孢杆菌芽孢在人工胃液中的存活率
4.重组枯草芽孢秆菌芽孢胆盐耐受性研究
1)胆盐的配置：在生理盐水中加入猪胆盐，使其质量分数为0.3％充分混合均匀，用0.22μm滤器过滤除菌。
2)取人工胃液处理1h后的重组芽孢，用无菌生理盐水洗涤两次，芽孢沉淀接种于0.3％胆盐溶液，于37℃中处理5h。分别在培养的第1、3、5h取样，同时取未经处理的芽孢作对照，稀释涂板进行芽孢计数，最后计算芽孢存活率。
3)重组芽孢rBScotG-0859人工胆盐耐受试验结果：由表19知，重组枯草芽孢杆菌芽孢在0.3％胆盐中，37℃水浴孵育1、3、5h存活率分别为87.46％、96.02％、91.60％，说明重组芽孢对0.3％猪胆盐的具有很强的耐受性。
表19重组枯草芽孢杆菌芽孢在0.3％胆盐中的存活率
5.重组枯草芽孢秆菌芽孢人工肠液耐受性研究
1)人工肠液的配置：称量KH2PO46.8g溶于800mL去离子水中，使用0.1mol/L NaOH调pH至6.8，定容至1L，然后加入1％的胰蛋白酶，充分搅拌至完全溶解，用0.22μm滤器过滤除菌。
2)取人工胃液处理1h后的重组芽孢，用无菌生理盐水洗涤两次，芽孢沉淀接种于人工肠液，于37℃中处理6h。分别在培养的第0.5、1、2、4、6h取样，同时取未经处理的芽孢作对照，稀释涂板进行芽孢计数，最后计算芽孢存活率。
3)重组芽孢rBScotG-0859人工肠液耐受试验结果：由表20知，重组枯草芽孢杆菌在人工肠液中处理0.5h、1h、2h、4h、6h后存活率分别是96.91％、93.83％、93.65％、88.14％、88.14％，处理4h和6h芽孢的存活率未发生变化，说明芽孢对人工肠液具有很强的耐受能力。
表20重组枯草芽孢杆菌芽孢在人工肠液中的存活率
6.重组枯草芽孢杆菌芽孢对金属离子和EDTA耐受性研究
1)金属离子和EDTA的配置：配置0.1mol/L Cu2+、0.1mol/L Ca2+、0.1mol/L Mg2+、0.1mol/L Mn2+、0.1mol/L Zn2+、0.1mol/L Ba2+、0.1mol/L Fe2+、0.1mol/L EDTA，用0.22μm滤器过滤除菌。
2)取实施例4纯化的重组芽孢rBScotG-0859沉淀接种于0.1mol/L金属离子和EDTA中，于37℃中分别处理1h，同时取未经处理的芽孢作对照，稀释涂板进行芽孢计数，最后计算芽孢存活率。
3)重组芽孢rBScotG-0859对金属离子和EDTA耐受试验结果：由表21知，重组芽孢在0.1mol/L金属离子和EDTA环境中处理1h，存活率达到80％以上，其Ca2+、Ba2+存活率约75％，说明重组芽孢对金属离子和EDTA具有很强的耐受性。
表21重组枯草芽孢杆菌芽孢在金属离子和EDTA中的存活率
实施例6
重组枯草芽孢杆菌芽孢的抑菌功能研究
1.培养基的配置：①TSA+5％FBS培养基的配置：称量40g TSA溶于1L去离子水中，混合均匀，121℃高压灭菌20min，待冷却至55℃后，加入50mL犊牛血清混合均匀，倾倒于无菌培养皿中，直至凝固；②TSB培养基的配置：称量30g TSB溶于1L去离子水中，混合均匀，121℃高压灭菌20min；③半固体培养基的制备：TSA培养基2.5g，TSB 1.5g溶于100mL去离子水中，混合均匀，121℃高压灭菌20min。
2.指示菌的制备：将甘油保存的不同血清型的猪链球和单增李斯特菌在TSA+5％FBS固体培养基上画线，于37℃恒温培养箱培养12h，挑取单菌落于5mL TSB+5％FBS液体培养基，37℃，180rpm过夜培养，过夜培养的菌液接种于5mL TSB+5％FBS液体培养基，37℃，180rpm培养4h达到对数期，使用麦氏比浊仪将浓度调至0.5MCF。
3.采用牛津杯法验证抑菌效果：使用无菌的镊子将提前灭菌的牛津杯轻轻均匀的放置于含TSA+5％FBS 90cm培养皿，每个平皿放6个牛津杯(重组芽孢rBScotG-08593个重复和野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis 1683个重复)，使其中心距离不小于24mm，牛津杯距培养皿边缘的距离不小于15mm。取出0.1mL指示菌悬液与温度约为50℃的半固体培养基混合均匀，轻轻倒入放置牛津杯的培养皿，使其覆盖整个培养基。待半固体培养基凝固后取出牛津杯，分别加入0.1ml纯化的重组芽孢，同时设定B.subtilis 168为对照，依次标记培养基，轻轻放置37℃培养箱培养12h，做三个重复，取平均值。
4.重组芽孢的抑菌结果：芽孢的抑菌直径如表22，重组芽孢对不同血清型的猪链球菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、产气荚膜梭菌都有不同的抑菌效果，野生型枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌有抑菌效果，抑菌结果见图5。
表22野生菌株和重组菌株对不同宿主菌的抑菌直径
实施例7
枯草芽孢杆菌的生长曲线
1.菌株的复苏：重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859和野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis168的复苏同实施例3(3)中菌株的复苏。
2.样品的制备：使用LB培养基将复苏的重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859和野生型枯草芽孢杆菌168稀释100倍，取其100μL加入微孔板，每组做5个重复，于全自动生长曲线分析仪监测24h。
3.菌株的生长状况：由图6可知，前2h增长速度较慢，代谢活跃，2h后增长速度加快，细菌以稳定的几何级极快增长，8h达到平台期并维持8h，达到18h细菌有一定的下降，之后处于上下波动状态。整体来看，前噬菌体裂解酶Lys0859的表达不影响枯草芽孢杆菌的生长。
实施例8
枯草芽孢杆菌的产芽孢曲线
1.菌株的复苏：同实施例3中步骤3中菌株的复苏。
2.DSM培养基的配置：同实施案例4中步骤1。
3.测定产芽孢曲线：将复苏的B.subtilis 168、rBScotG-0859菌液按照1％的接种量分别接种于DSM培养基，37℃，180rpm恒定震荡培养，每隔2h取出培养液稀释涂板计算细菌总数，将培养液进行85℃处理5min杀死营养型细菌，稀释涂板计算形成的芽孢数。
4.枯草芽孢杆菌的产芽孢曲线结果：由图7中(a)细菌总数图知，随着时间的延长，细菌总数不断的增加，直至24h细菌总数仍在增加。由图7中(b)产芽孢图知，芽孢的形成起始于10h，直至24h细菌总数仍在增加。整体来看，野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis 168和重组枯草芽孢杆菌rBScotG-0859的营养型菌株的生长和芽孢的形成没有明显差异，说明前噬菌体裂解酶Lys0859的表达不影响枯草芽孢杆菌的生长。
实施例9
SDS-PAGE和Western-blot检验重组芽孢的融合蛋白表达情况
1.试剂的配置：①ST缓冲液的配置：1％SDS，50mM DTT。②脱色液的配置：量取甲醇330mL、冰醋酸100mL、去离子水570mL定容至1L。③电转液的配置：称取Tris 3.027g，甘氨酸14.26g，甲醇200mL，去离子水定容至1L。④Loading buffer：1mol/L Tris-HCl(pH＝6.8)60mL，50％甘油500mL，10％SDS 200mL，β-巯基乙醇50mL，1％溴酚蓝100mL，去离子水90mL。⑤考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝G-2501g，甲醇450mL，冰醋酸100mL，去离子水定容至1L。⑥PBST：8g/L NaCl，0.24g/L KH2PO4，0.2g/L KCl，3.63g/L Na2HPO4·12H2O溶于800mL去离子水中HCl调pH至7.4，加去离子水定容至1L，加入0.5mL Tween 20。⑦封闭液：5％脱脂奶粉，1g脱脂奶粉溶于20mL PBST中。
2.提取衣壳蛋白：取实施例4中步骤4中纯化的芽孢，5mL ST缓冲液与1×108CFU芽孢混合均匀于70℃处理30min，12000rpm离心10min，收集上清，上清过滤后使用超滤管浓缩衣壳蛋白。
3.配胶：按照所购买的聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂盒操作说明书进行配置，浓缩胶和分离胶都是12％。
4.煮样：衣壳蛋白加入5×SDS-PAGE Loading buffer，振荡混匀，置于金属浴95℃煮沸10min。
5.上样：将煮好的样品依次加入泳道上样孔中(一式两份)，80V，30min电压下使样品迁移至分离胶，之后电压为120V，50min，关闭电源。
6.染色：剥离其中一份胶体轻轻浸入考马斯亮蓝染色液，染色1h后取出。
7.脱色：胶体轻轻浸入脱色液中，不断换脱色液，直至胶体见蛋白条带。
8.转膜：剥离另一份胶体，利用电转仪装置将胶体上衣壳蛋白转至PVDF膜。将凝胶和PVDF膜在电转液浸泡后，PVDF膜铺在凝胶上，用玻璃棒来回滚动去除气泡。在外层各覆盖浸泡在电转液中的滤纸，保持湿润、无气泡，然后放入电泳装置中。接通电源开始电泳转移，1h后转移结束，取出PVDF膜。
9.封闭：室温下，PVDF膜移至封闭液中，封闭2h。
10.孵育一抗：弃去封闭液，TBST洗涤1次，洗涤10min，加入10mL稀释好的0859多抗(1∶5000)，37℃孵育2h，TBST洗涤3次，每次洗涤5min。
11.孵育二抗：加入10mL稀释好的二抗(1：5000)，于室温下孵育1h。加入TBST洗涤3次，每次洗涤10min。
12.显色：按照DAB显色试剂盒(碧云天)说明书操作。
SDS-PAGE结果表明：泳道1重组枯草芽孢杆菌在50kDa处有一特异性条带；泳道2原核表达pCold-0859蛋白在28kDa处有一特异性条带；泳道3野生型重组枯草芽孢杆菌B.subtilis 168没有出现特异性条带，见图8。
Western-blotting结果表明：泳道1重组枯草芽孢杆菌在50kDa处有一特异性条带；泳道2原核表达pCold-cotG-0859蛋白在50kDa处有一特异性条带；泳道3原核表达pCold-0859蛋白在28kDa处有一特异性条带，泳道4野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis 168没有出现特异性条带，见图9。
由上述结果可知，所述重组芽孢的表面成功表达目标融合蛋白。
实施例11
免疫荧光分析
1.试剂的配置：抗体结合buffer：在PBS中加入BSA和山羊血清使其质量浓度都为5％。
2.将实施例8中步骤4的纯化的芽孢悬液添加至1.5mL EP管内，4℃8000rpm离心15min。取1mL在冰上预冷后的抗体结合buffer悬浮芽孢沉淀，4℃封闭2h，离心弃掉上清，加入适量多抗(Anti-0859antibody)，使其稀释度为1∶400，在冰上放置2h。
3.孵育结束后，用PBS洗涤芽孢3次，4℃，4500mm离心10min，小心除尽上清。
4.向其中加入由PBS适当稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG(二抗)，使其稀释度为1∶400，在冰上放置2h。
5.孵育结束后，用PBS洗涤洗涤芽孢3次，4℃，4500rpm离心10min，小心除尽上清。
6.将芽孢沉淀用PBS再次悬浮后，取10μL悬液滴到载玻片上，盖上盖玻片，在黑暗条件下将其吹干，立刻用激光共聚焦显微镜观察。
结果见图10。由图10可知，与宿主菌产生的芽孢相比，重组芽孢表面可观察到清楚的荧光，说明重组芽孢表面展示表达有前噬菌体裂解酶。
由上述实施例结果可知，本发明将芽孢杆菌锚定蛋白的编码基因和前噬菌体裂解酶Lys0859编码基因融合形成融合蛋白，克隆至pDG364载体中，形成的pDG364-cotG-0859转化至B.subitilis 168感受态中，形成重组芽孢杆菌(见图11)。所述重组芽孢杆菌在内生芽孢形成时前噬菌体裂解酶Lys0859基因随着锚定蛋白的表达从而得以成功地展示在芽孢表面，且芽孢具有耐受高温、强酸强碱、胃肠道的环境，同时对猪链球菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、产气荚膜梭菌等革兰氏阳性菌具有抑菌效果，在应用于猪链球菌感染提供替抗制剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌，其特征在于，在芽孢杆菌的锚定蛋白表面展示前噬菌体裂解酶Lys0859。
2.根据权利要求1所述重组芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌锚定蛋白为cotG蛋白；
所述cotG蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述重组芽孢杆菌，其特征在于，所述前噬菌体裂解酶Lys0859的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1所述重组芽孢杆菌，其特征在于，所述锚定蛋白cotG和前噬菌体裂解酶Lys0859形成的融合蛋白的氨基酸序列SEQ IDNO:3所示。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述重组芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌168标准菌株。
6.一种权利要求1～5中任意一项所述重组芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备芽孢杆菌锚定蛋白cotG和前噬菌体裂解酶Lys0859的融合基因；
将所述融合基因克隆至穿梭质粒中，得到重组质粒；
将所述重组质粒转化芽孢杆菌宿主菌中，得到展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌。
7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，所述制备芽孢杆菌锚定蛋白和前噬菌体裂解酶Lys0859形成融合基因的方法包括分别扩增芽孢杆菌锚定蛋白cotG的编码基因和前噬菌体裂解酶Lys0859的编码基因，通过重叠PCR扩增，得到融合基因cotG-0859；
优选的，扩增芽孢杆菌锚定蛋白cotG的编码基因的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的反向引物；
扩增前噬菌体裂解酶Lys0859的编码基因的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的反向引物；
重叠PCR扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的反向引物。
8.根据权利要求6或7所述构建方法，其特征在于，所述融合基因整合至枯草芽孢杆菌宿主菌基因组中的淀粉酶基因中。
9.权利要求1～5中任意一项所述重组芽孢杆菌产生的重组芽孢。
10.权利要求1～5中任意一项所述重组芽孢杆菌、权利要求6～8中任意一项所述构建方法得到的重组芽孢杆菌或权利要求9所述重组芽孢在制备抗菌剂或饲料中的应用，所述抗菌剂优选包括以下至少一种：猪链球菌抑菌剂、金黄色葡萄球菌抑菌剂、李斯特菌抑菌剂和产气荚膜梭菌抑菌剂。
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