CN103805532A - 一种坏死梭杆菌重组omp蛋白及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种坏死梭杆菌重组OMP蛋白及制备方法。该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，克隆上述核苷酸，连接到表达载体pET28a(+)，并转化至表达宿主菌E.coliBL21（DE3）系统中进行诱导表达，获得基因工程产品；重组坏死梭杆菌外膜蛋白经western检测，发现具有与天然坏死梭杆菌外膜蛋白相似的免疫反应活性，可以用于制备坏死梭杆菌基因工程疫苗或作为建立检测坏死梭杆菌特异性诊断方法的检测抗原。
Description
技术领域
本发明公开一种坏死梭杆菌其重组OMP蛋白及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum，F. necrophorum)多寄生在人和动物的口腔、胃肠道及消化道中，是人类和动物多种化脓、坏死病灶的病原菌，由坏死梭杆菌感染引起的疾病统称为坏死梭杆菌病(Necrobacillosis)。坏死梭杆菌感染引起的疾病，常见于动物肝脓肿(liver abscesses)、腐蹄病 (footrot)及人类的急慢性咽喉炎(Lemierre's syndrome)等，多呈慢性经过，治疗不及时，严重影响生产性能，甚至死亡，病灶多见于蹄部、唇部及生殖道，还可引起肝、肾等内脏脓肿坏死，孕畜感染，导致流产或子代发病等。近年来，坏死梭杆菌引起的疾病发病率较高，严重影响养殖业的生产性能，坏死梭杆菌病是重要的传染病之一，给养殖业带来经济损失十分巨大。
实践证实，药物预防存在粪便污染降低药效，传统全菌体灭活菌苗对其他血清型缺乏交叉保护，且成本高，操作复杂、费时。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种坏死梭杆菌重组OMP蛋白，是单一抗原，弥补利用全菌检测坏死梭杆菌抗体技术特异性差的缺点。
本发明的目的之二是提供所述重组OMP蛋白的制备方法，可用于重组OMP蛋白的规模化生产。
本发明的目的之三是提供所述重组OMP蛋白在疫苗中的应用。
本发明公开的梭杆菌属坏死梭杆菌，命名为：梭杆菌属坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum），简称：FN(An)；该疫苗株已于2013年4月19日保藏《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为：CGMCC NO.7672，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明提供的坏死梭杆菌重组OMP蛋白，编码上述重组蛋白的其氨基酸序列为SEQ ID No.1，核苷酸序列为SEQ ID No.2。
本发明提供一种坏死梭杆菌重组OMP蛋白制备方法，包括以下步骤：
A、以F. necrophorum（An）基因组DNA为模板，序列SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示为上、下游引物，PCR扩增F. necrophorum的OMP基因片段，连接至pMD?18-T Simple载体，获得克隆重组质粒pMD?18-T Simple-OMP；
B、限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切pMD?18-T Simple-OMP和原核表达载体pET28a(+)，连接，获得重组原核表达质粒pET28a-OMP；
C、将上述获得的重组质粒pET28a-OMP转化表达宿主菌中，IPTG诱导表达，获得坏死梭杆菌重组OMP蛋白粗品。
镍亲和层析柱纯化步骤C得到的坏死梭杆菌重组OMP蛋白粗品，获得坏死梭杆菌重组OMP蛋白；
步骤C中的表达为菌株BL21（DE3），在IPTG浓度大于0.4mmol/L，诱导温度高于16℃时，均可获得坏死梭杆菌重组OMP蛋白坏死梭杆菌重组OMP蛋白。
本发明所述的坏死梭杆菌重组OMP蛋白可用于生产制备预防坏死梭杆菌病的疫苗。
本发明的有益效果在于：坏死梭杆菌重组OMP蛋白经western blot检测，发现具有与天然坏死梭杆菌OMP相似的免疫反应活性，可以用于制备坏死梭杆菌基因工程疫苗或作为建立检测坏死梭杆菌特异性诊断方法的检测抗原。
按照本发明生产的产品适用于：
A、本发明产物可作为检测坏死梭杆菌抗体的间接ELISA方法的检测抗原；
B、可用于预防坏死梭杆菌病感染的基因工程亚单位疫苗。
本发明产品优点有：
A、该重组蛋白是单一抗原，弥补利用全菌检测坏死梭杆菌抗体技术特异性差缺点；
B、作为ELISA抗原检测坏死梭杆菌抗体，特异性较强，避免交叉反应的发生；
C、简单易操作、成本低、适合规模化生产，市场前景较好。
附图说明
图1为OMP基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为克隆重组质粒pMD?18-T Simple-OMP的电泳图；
图3为表达重组质粒pET28a-OMP酶切鉴定电泳图；
图4为重组表达质粒pET28a-OMP经IPTG诱导表达的坏死梭杆菌重组OMP蛋白蛋白的SDS-PAGE电泳图；
图5为重组表达质粒pET28a-OMP表达的蛋白，经Western blot鉴定；
图6为重组OMP蛋白抑制小鼠腹腔巨噬细胞增殖试验。
具体实施方案
通过以下实施例对本发明进行详细的阐述，使本发明的目的更加明确。
实验材料:
质粒pMD?18-T Simple，购自TaKaRa公司；原核表达质粒pET-28a（+），购自Novagen公司；克隆宿主菌E.coliTOP10、 表达宿主菌E.coli BL21（DE3）和Fusobacterium necrophorum(An)菌株，由中国农业科学院特产研究所保藏。
酶与试剂：分子克隆工具酶和试剂，购自TaKaRa公司；DNA提取、质粒抽提、PCR产物纯化、胶回收试剂盒，购自天根公司；镍亲和层析柱，购自GE Healthcare；Protein Refolding Kit，购自Merck。
PCR引物：由上海生工生物工程公司合成。
LB培养基：蛋白胨1.0%，酵母浸出液0.5%，氯化钠1.0%，蒸馏水定容。蛋白胨、酵母浸出液，购自Oxoid公司。
分子生物学操作方法：PCR（聚合酶链式反应）、质粒抽提、限制性核酸内切酶酶切、DNA片段胶回收、连接和大肠杆菌转化等实验均属常规操作方法，参见《分子克隆实验指南》。
FN（An）重组OMP蛋白的表达量通过SDS-PAGE电泳测定：SDS-PAGE电泳参考《蛋白质技术手册》完成。
实施例1：坏死梭杆菌重组OMP蛋白的表达
1、构建重组表达质粒pET28a-OMP
参考OMP蛋白的基因序列，利用Oligo 6.0软件设计一对扩增坏死梭杆菌OMP蛋白特异性扩增引物（SEQ ID No.3：5′-gaa ttc GCA AAT AAA ATA ACT GTG GGA-3′和SEQ ID No.4：5′-ctc gag TTA ATG CAT TCG GTT TCT TCC T-3′），再根据表达载体的多克隆酶切位点信息在上、下游引物的5’端分别添加限制性内切酶XhoI和EcoRI酶切位点，引物由上海生工生物工程公司合成。
以Fusobacterium necrophorum（An）株基因组DNA为模版，使用上述引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4， PCR扩增OMP基因。25μL PCR反应体系：dNTP (2.5 mmol/L) 2μL，
10×Ex Taq Buffer 2.5μL，Ex TaqTM DNA polymerase (5 U/μL) 0.2μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1μL，基因组DNA 1μLμmol/L)，加ddH2O补齐体积至25μL。PCR反应条件：95℃，5min，94℃，45s，47℃，40s，72℃，2min，30个循环；72℃延伸5min。OMP基因扩增结果如图1所示（泳道1为OMP基因PCR扩增产物，M为DL 500 DNA Marker），在2442bp左右有一明显扩增条带，与预期片段大小一致。反应结束后，回收PCR扩增产物，限制内切酶XhoI和EcoRI双酶切PCR扩增产物，插入经同样酶切消化处理的pMD?18-T Simple载体，连接并转化至克隆宿主菌E.coli TOP10感受态细胞，涂布于含0.1mg/mL氨苄青霉素的Lb培养基平板，37℃培养过夜；挑取单菌落经双酶切与原质粒鉴定正确后，送测序公司测序，得到插入序列与插入位置均正确的重组表达载体，命名为pMD?18-T Simple-OMP。pMD?18-T Simple-OMP酶切鉴定结果如图2所示（泳道M为DL 500 DNA Marker；泳道1-2为限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切重组质粒pMD?18-T Simple-OMP所得的特异性条带；泳道3为重组质粒pMD?18-T Simple-OMP原质粒）。坏死梭杆菌omp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
利用限制性内切酶XhoI和EcoRI分别酶切阳性克隆质粒pMD?18-T Simple-OMP和表达载体pET28a，胶回收后，T4 DNA连接酶连接过夜，然后转化E.coli TOP10感受态细胞，抽提表达质粒pET28a-OMP，电泳和酶切鉴定OMP基因已正确插入表达质粒pET28a。 PCR和双酶切鉴定结果如图3所示（泳道M为DL 15,000 DNA Marker；泳道1为重组质粒PCR扩增产物特异条带；泳道2为pET28a-OMP用XhoI和EcoRI双酶切，酶切产物经电泳得到特异性的条带；泳道3为pET28a-OMP原质粒）。
、坏死梭杆菌重组OMP蛋白在E.coli BL21（DE3）中的表达
将构建的表达重组质粒pET28a-OMP转化至E.coliBL21（DE3）表达后，挑单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220r/min，过夜培养。按照1%的比例接种新鲜配制含50μg/mL卡那霉素LB液体培养基，37℃，220r/min培养3h左右，加入终浓度为0.4mM IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白；4℃，8000 g离心细菌培养物获得细菌沉淀，超声波破碎处理后，经SDS-PAGE电泳检测发现，重组OMP蛋白存于超声破碎产物沉淀中，提示重组OMP蛋白为包涵体表达。SDS-PAGE分析结果如图4所示（泳道M为蛋白质Marker；泳道1为重组表达质粒pET28a-OMP超声破碎处理后沉淀；泳道2为重组表达质粒pET28a-OMP超声破碎处理后获得的上清；泳道3为空载体pET28a（+）超声破碎后沉淀；泳道4为空载体pET28a（+）超声破碎处理后所得上清）。经Western blot检测，表达的重组OMP蛋白质具有免疫活性，结果见图5所示（泳道M为预染分子质量蛋白标准；泳道1为重组表达质粒pET28a-OMP菌体超声破碎获得的沉淀）。
实施例2：坏死梭杆菌重组OMP蛋白的免疫原性分析
利用Western blotting分析坏死梭杆菌重组OMP蛋白的免疫原性。方法为：将蛋白产物经过12%SDS-PAGE电泳后，通过半干转膜至硝酸纤维素膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭过夜，用TBST漂洗后，以100倍稀释的兔全菌血清作为一抗，37℃孵育1h, 漂洗，加入1：3000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗 20 mL，37℃孵育1h，TBST漂洗3次，10 min/次，DAB显色试剂盒显色。
实施例3：坏死梭杆菌重组OMP蛋白抑制小鼠巨噬细胞（AnA-1）增殖实验
RPMI-1640完全培养基（10% (V/V) FBS）制备小鼠腹腔巨噬细胞（ANA-1）细胞悬浮液，，调整细胞密度5×106个细胞/mL， 100μL/孔接种于96孔板中，37℃， 5% CO2培养箱中培养大约20小时，细胞贴比率在70-80%左右，弃培养液，PBS清洗细胞表面1次，用培养基调节重组OMP蛋白浓度为100μg/mL，每孔加样品100μL，5% CO2，37℃孵育16h，倒置显微镜下观察，PBS清洗2-3次，每孔避光加入20μL MTS和100μL培养基， 37℃，5% CO2培养箱中继续避光培养大约4小时，490nm处测定每孔吸光值。
坏死梭杆菌重组OMP蛋白抑制小鼠巨噬细胞增殖试验结果所示，当外源重组OMP蛋白浓度较高时，AnA-1细胞迅速死亡，无法将MTS氧化还原成紫色螯合物，具体表现在样品吸光度低；随着重组OMP蛋白稀释倍数的增加，被抑制增殖的AnA-1细胞不断减少，细胞氧化还原MTS的量不断增多，溶液吸光度不断增加。
〈110〉
〈120〉一种坏死梭杆菌重组OMP蛋白及制备方法
〈160〉4
〈210〉1
〈211〉814
〈212〉AA
〈213〉坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）
〈400〉SEQ ID No.1
ANKITVGNSS SGIYGLNNTE ISNTGNITTG ASSTAIYYSD 40
VEKDSAGNIT AVKNTTTGLK NAGTIVLNGD DSVGLTYEPG 80
NISGTVTFEN TADITSSGDK NVGMFAKRAQ NGASYDTINQ 120
GSITLGNSAS LSNPNVAMYT NATSIGSNPL KNMGNITVGD 160
YSVAMYGFEE NSSGNIKVGN GSIGLSQRTE MSMYQEVFNR 200
FIQESVGVYT VGSGQTITST GSTFNLGDTS FGFVNIGNNT 240
ITSTGGSATL PNNATFIYSS DETSHITNST NISSSGAIGR 280
NYGIYASGIV DNSGNIDFGS GVGNLGIYMV KGGKGTNTAT 320
ITVGASDVTN ELFGVGMAAG YIGDATTAPT TGTVENQGTI 360
NVNGPYSIGM YGAKTGTIVT NKHDIILNAS NTTGIYVEEG 400
AKAINDGTIK TGASGLSNVN GVVLGSGSTL ENNRTINIAA 440
TASNGVLLKG GTIANYGSIT VSGSGSEETK LLNSTPTSRG 480
IGSVVIEAPA GATTATITAG GVVVTPTIVS TTARNPISVS 520
ADSIGLYVNT SGKDFTSSIT GLGHLTSQAD LIIGTEAAAS 560
TISKYIQIKD NKILDPYNNA ILSSGVSKWN VYSGSLGWIT 600
TPTLDPGTGK VTNLYMAKIP YTEWSKNQDT YNFTDGLEQR 640
YGVEELETRE NQLFQKLNSI GNNEEVLLYQ AFDEMMGHQY 680
ANVQQRIQAT ASILDKELKY LKKEWDTKSK DSNKIKAFGM 720
RGEYKTDTAG VMDYSSHAQG FAYLHEKETV QLGNTTGWYA 760
GLIHHEFKFK DIGKSKEEML QAKWGVFKST AFDHNNSLNW 800
TISGEMFVGR NRMH 814
〈210〉2
〈211〉2442
〈212〉DNA
〈213〉坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）
〈400〉SEQ ID No.2
GCAAATAAAA TAACTGTGGG AAATTCATCA TCCGGAATCT 40
ATGGATTAAA TAATACAGAA ATCTCGAATA CAGGAAATAT 80
AACAACAGGT GCTTCTTCCA CAGCGATTTA CTATTCTGAT 120
GTAGAAAAAG ATAGCGCCGG AAATATAACG GCAGTTAAGA 160
ATACGACAAC AGGACTTAAA AATGCAGGAA CAATTGTATT 200
AAATGGGGAT GATTCCGTAG GATTAACTTA TGAACCGGGA 240
AATATTTCAG GAACTGTAAC ATTTGAAAAT ACAGCAGATA 280
TAACAAGCAG TGGGGATAAG AATGTCGGAA TGTTTGCAAA 320
ACGCGCTCAA AATGGTGCTT CCTATGATAC GATAAACCAA 360
GGAAGCATTA CATTAGGAAA CTCTGCTTCA TTGAGCAATC 400
CAAATGTGGC TATGTATACC AACGCAACCT CAATCGGAAG 440
CAATCCATTA AAAAATATGG GAAATATCAC AGTAGGAGAT 480
TATTCCGTCG CTATGTATGG ATTTGAAGAA AATAGTAGTG 520
GAAACATCAA AGTCGGAAAT GGTTCAATAG GATTGTCTCA 560
AAGAACGGAA ATGTCAATGT ATCAGGAAGT ATTCAACAGG 600
TTCATCCAAG AATCTGTGGG AGTATATACG GTAGGAAGCG 640
GACAAACAAT AACAAGTACA GGAAGCACTT TTAACTTAGG 680
AGATACCTCA TTTGGATTTG TAAATATAGG GAATAATACG 720
ATTACAAGTA CAGGTGGAAG TGCAACTTTA CCTAATAATG 760
CAACCTTTAT TTATTCCAGT GATGAAACCA GTCATATCAC 800
TAACAGTACC AATATTAGTT CAAGTGGGGC TATCGGTCGT 840
AACTATGGAA TATATGCTTC CGGAATAGTG GATAACTCAG 880
GAAATATTGA TTTTGGAAGT GGAGTTGGCA ACTTAGGTAT 920
CTATATGGTT AAAGGTGGAA AAGGAACAAA CACTGCTACC 960
ATTACCGTAG GAGCCTCAGA TGTAACTAAT GAATTATTTG 1000
GCGTAGGTAT GGCAGCCGGA TACATAGGAG ATGCTACTAC 1040
AGCTCCTACA ACAGGAACAG TAGAAAATCA AGGTACCATC 1080
AATGTAAATG GTCCATATAG TATAGGAATG TATGGAGCAA 1120
AAACAGGGAC TATAGTTACA AACAAGCATG ATATTATTTT 1160
AAATGCTAGT AATACTACAG GGATCTATGT AGAAGAAGGG 1200
GCGAAGGCAA TAAATGACGG AACCATAAAA ACTGGTGCTA 1240
GTGGACTTTC CAATGTTAAT GGAGTGGTTT TAGGTTCAGG 1280
TTCTACACTA GAAAATAATA GAACAATCAA TATTGCAGCA 1320
ACGGCAAGTA ATGGAGTTCT ATTAAAAGGA GGAACAATAG 1360
CTAACTATGG AAGCATTACT GTATCAGGTT CCGGCTCTGA 1400
AGAAACAAAA CTATTAAATT CAACACCAAC TTCTAGAGGA 1440
ATCGGTTCTG TAGTGATAGA AGCGCCTGCC GGAGCAACAA 1480
CTGCAACAAT CACAGCAGGA GGAGTTGTTG TAACACCAAC 1520
AATAGTAAGC ACAACAGCTA GAAATCCAAT CTCTGTATCG 1560
GCAGATAGTA TAGGACTATA TGTAAATACG TCAGGAAAAG 1600
ATTTCACTTC ATCTATAACA GGATTGGGTC ATTTAACCTC 1640
TCAAGCTGAT TTAATCATAG GAACAGAAGC AGCGGCAAGT 1680
ACAATCAGCA AATATATTCA AATAAAGGAT AATAAAATAT 1720
TAGATCCATA TAATAACGCA ATATTATCAA GTGGAGTATC 1760
AAAATGGAAT GTTTATTCTG GTTCATTGGG TTGGATAACG 1800
ACTCCTACTT TGGATCCAGG AACGGGAAAA GTTACCAATC 1840
TATATATGGC AAAAATTCCT TATACAGAAT GGTCGAAAAA 1880
TCAAGATACC TATAATTTCA CAGACGGATT GGAACAACGA 1920
TATGGAGTAG AAGAATTAGA AACAAGAGAA AATCAATTAT 1960
TTCAAAAGTT AAACAGCATT GGAAATAACG AAGAAGTTTT 2000
ATTGTATCAA GCTTTTGATG AAATGATGGG ACATCAATAT 2040
GCCAATGTGC AACAAAGAAT CCAAGCAACC GCTTCCATCT 2080
TAGACAAAGA ATTGAAATAT CTCAAGAAAG AATGGGATAC 2120
CAAGTCAAAA GATTCCAACA AGATCAAAGC TTTTGGAATG 2160
CGAGGAGAAT ACAAAACGGA TACTGCTGGA GTCATGGATT 2200
ATAGCTCGCA TGCACAAGGA TTTGCTTATT TACACGAAAA 2240
GGAAACGGTG CAACTTGGGA ATACCACCGG TTGGTATGCA 2280
GGTTTGATTC ATCATGAATT TAAGTTCAAA GACATTGGAA 2320
AATCGAAAGA AGAAATGCTA CAAGCAAAAT GGGGAGTCTT 2360
CAAATCGACT GCTTTTGATC ATAACAATAG TTTGAACTGG 2400
ACCATATCTG GAGAAATGTT TGTAGGAAGA AACCGAATGC 2440
AT 2442
〈210〉3
〈211〉27
〈212〉DNA
〈213〉人工序列 引物p1
〈400〉SEQ ID No.3
GAA TTC GCA AAT AAA ATA ACT GTG GGA
〈210〉4
〈211〉28
〈212〉DNA
〈213〉人工序列 引物p2
〈400〉SEQ ID No.4
CTC GAG TTA ATG CAT TCG GTT TCT TCC T
Claims (5)
1.一种梭杆菌属坏死梭杆菌，命名为：梭杆菌属坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum），简称：FN(An)； 2013年4月19日保藏《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为：CGMCC 7672。
2. 一种坏死梭杆菌重组OMP蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.权利要求2所述的坏死梭杆菌重组OMP蛋白的制备方法，其特征在于：
A、以权利1所述的FN（An）基因组DNA为模板，按照如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的上下游引物PCR扩增获得坏死梭杆菌OMP基因片段，与pMD?18-T Simple连接，形成pMD?18-T Simple-OMP重组质粒；
B、限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切pMD?18-T Simple-OMP和原核表达载体pET28a(+)，连接，获得重组原核表达质粒pET28a-OMP；
C、将上述获得的重组质粒pET28a-OMP转化表达宿主菌，IPTG诱导表达，获得坏死梭杆菌重组OMP蛋白粗品。
4. 根据权利要求3所述坏死梭杆菌重组OMP蛋白的制备方法，其特征在于：步骤C中的表达菌株为BL21；基因工程菌在IPTG终浓度大于0.4mmol/L，诱导温度高于16°C时，均可获得坏死梭杆菌重组OMP蛋白。
5. 权利要求2所述坏死梭杆菌重组OMP蛋白用于制备预防坏死梭杆菌病的基因工程亚单位疫苗。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140521 |