CN108251546A - 一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，包括以下步骤：(1)菌株培养；(2)菌种保存；(3)提取菌株的基因组DNA提取；(4)菌株鉴定；(5)全基因组获得；(6)信号肽预测；(7)表达载体的构建；(8)质粒获得；(9)菌株诱导表达重组蛋白；(10)重组蛋白表达鉴定。本发明建立了有效的内源性信号肽预测方法，发现信号肽1320能够改善外源蛋白在植物乳杆菌中的表达状况，而且能够有效展示在细菌表面。通过本发明方法预测获得的1320信号肽以及制备获得的含有1320信号肽序列的表达载体，能够很好的植入到植物乳杆菌内，因此可用于植物乳杆菌载体疫苗开发和表面展示。

Description

一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法及其应用。
背景技术
信号肽是异源表达系统应用过程中的关键点之一，它们起到了定位、提高表达效果、增强可溶性等作用。原核表达系统是最常用的异源表达方式，其表达量大、易于纯化，受到多种药物制备设计的青睐。比如大肠杆菌常用的信号肽GST标签，对某些特殊结构蛋白也能有效表达。然而，广泛应用于食品医药领域的乳酸菌载体尚无商品化的信号肽系统，这也限制了其应用。USP等乳酸菌信号肽在多年前已经发现，但乳酸菌的异质性无法在不同乳酸菌中得以运用，所以亟待开发有效的方法快速寻找获得特异性乳酸菌载体的信号肽系统，应用于异源表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法及其应用，以获得特异性植物乳杆菌载体的信号肽系统。
为实现上述目的，本发明的技术方案为一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，包括以下步骤：
(1)菌株培养：将实验菌株涂布于固体MRS培养基中于37℃厌氧环境培养24h，挑取单克隆转接至MRS液体培养基中，继续培养，再次涂布于MRS固体培养基中；
(2)菌种保存：挑取单克隆进行菌种保存；
(3)提取菌株的基因组DNA；
(4)菌株鉴定：利用PCR扩增对菌株基因组DNA进行鉴定；
(5)全基因组获得：将经过步骤(4)鉴定的菌株基因组DNA进行测序获得该菌株的全基因组序列；
(6)信号肽预测：对所述菌株的全基因组序列进行注释分析，将所述菌株编码的氨基酸序列输入SignalP 4.10在线预测软件预测获得若干可能的信号肽序列，并利用LAB-Secreome数据库对这些信号肽进行预测分类，获得若干条待定信号肽序列；
(7)表达载体的构建：构建含有待定信号肽序列的实验组表达载体和不含待定信号肽序列的对照组表达载体；
(8)质粒获得：将实验组表达载体和对照组表达载体分别通过电转化导入至NZ3900感受态细胞内，筛选阳性克隆提取获得实验组质粒和对照组质粒；
(9)菌株诱导表达重组蛋白：将实验组质粒和对照组质粒分别通过电转化导入至由实验菌株制备的感受态内，筛选阳性克隆后进行扩大培养，加入诱导剂继续培养诱导两组菌株表达重组蛋白；
(10)重组蛋白表达鉴定：分别提取菌株内的重组蛋白，通过Western blot技术和间接免疫荧光技术验证导入实验组质粒的菌株的重组蛋白表达情况，能够表达重组蛋白的待定信号肽序列即为目标内源性信号肽。
优选的，所述步骤(1)中的菌株为植物乳杆菌CGMCC 1.557；在 MRS液体培养基培养时，每隔12h再次以1％体积转接至新的MRS液体培养基中，连续传代50次。
优选的，所述步骤(4)中，用于菌株鉴定的引物有两对，一对为植物乳杆菌CGMCC1.557的16S rRNA的通用检测引物，所述通用检测引物的DNA序列如下：
20F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，
1500R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；
另一对是以植物乳杆菌CGMCC 1.557的16S-23S rRNA基因位点为模板设计的特异性引物，所述特异性引物的DNA序列如下：
F1：5’-GCCGCCTAAGGTGGGACAGAT-3’，
R1：5’-TTACCTAACGGTAAATGCGA-3’。
进一步，步骤(9)中，所述的诱导剂为SppIP，所述诱导剂的工作浓度为50ng/mL，诱导培养时间为7～8h。
进一步，本发明还提供了所述植物乳杆菌CGMCC 1.557的全基因组，其基因组含有1个染色质，2个质粒，其序列总长度为3,156,839bp，GC含量为44.61％，注释基因数目3087个，tRNA 70个，ncRNA 4个，5S rRNA、 16S rRNA、23S rRNA的数目分别为6、5、5，CDS序列2997个，CRISPR 位点1个。
进一步，所述的目标内源性信号肽为信号肽1320。
本发明的所述的植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法获得的内源性信号肽在植物乳杆菌中的应用。
优选的，含有1320信号肽序列的表达载体构建如下：
(1)人工合成序列SynF5，所述SynF5的DNA序列为：
5’-CCATGGAGATTTTAGCC-3’；
(2)将美洲型ORF5序列与Mpep序列连接在一起，形成新序列 ORF5M；
(3)将SynF5序列、1320信号肽序列、ORF5M依次相连获得合成片段SynF5-1320-ORF5M；
(4)添加HA标签：利用融合PCR对合成片段SynF5-1320-ORF5M添加HA标签获得片段SynF5-1320-ORF5M-HA；
(5)通过无缝克隆将片段SynF5-1320-ORF5M-HA与线性化的 pSIP411质粒相连接即获得含有1320信号肽序列的表达载体。
进一步，所述美洲型ORF5序列为优化后的美洲型ORF5序列，所述优化后的美洲型ORF5具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸全序列；且先将美洲型ORF5序列进行优化，然后再与Mpep序列连接。
本发明具有如下优点：
本发明建立了有效的内源性信号肽预测方法，发现信号肽1320能够改善外源蛋白在植物乳杆菌中的表达状况，而且能够有效展示在细菌表面。通过本发明方法预测获得的1320信号肽以及制备获得的含有1320 信号肽序列的表达载体，能够很好的植入到植物乳杆菌内，因此可用于植物乳杆菌载体疫苗开发和表面展示。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明中经过优化的美洲型ORF5序列。
图1为植物乳杆菌CGMCC 1.557分子鉴定图。
图2为植物乳杆菌CGMCC 1.557全基因组完成图。
图3为测序获得的植物乳杆菌CGMCC 1.557的信号肽1320序列。
图4为优化前的美洲型ORF5序列的示意图。
图5为ORF5M序列的示意图。
图6为合成片段SynF5-1320-ORF5M与合成片段SynF5-ORF5M的示意图。
图7为质粒pSIP-1320-O5MH和质粒pSIP-O5MH的示意图。
图8为分别转入两种质粒的植物乳杆菌的蛋白提取液的Western blot 鉴定结果。
图9为分别转入两种质粒的植物乳杆菌的间接免疫荧光鉴定结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明以植物乳杆菌CGMCC 1.557宿主细胞为例，建立乳酸菌重组菌信号肽系统的预测与筛选方法，从而获得一种应用于植物乳杆菌 CGMCC 1.557宿主细胞的内源性表面展示信号肽。
实施例1植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法
一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，包括以下步骤：
1、菌株培养
(1)取出植物乳杆菌CGMCC 1.557的保菌液，使用接种环蘸取少量菌液涂布于固体MRS培养基中，放入培养箱中。
(2)37℃厌氧环境培养24h。
(3)取出培养皿，用无菌枪头挑取单克隆菌落，转接新的MRS液体培养基，继续培养。
(4)每隔12h再次以1％体积转接，连续传代50次。
(5)将经过传代的菌液再次涂布于固体培养基中，挑取单克隆用于实验或冷冻保藏。
2、菌种保存
本发明使用含有30％甘油MRS培养基作为保菌液进行菌种的冷冻保藏，方法如下：
(1)121℃湿热灭菌保菌管和甘油15min，以备使用。
(2)每管分装300uL甘油，并将连续转接3次的菌液加入分装的甘油中。
(3)将菌液转移到保菌管中，混匀后低温保藏。
3、菌株基因组DNA提取
(1)将植物乳杆菌CGMCC 1.557的单个菌落接种于MRS培养基中，37℃厌氧培养至平台期，离心加入20ug/mL溶菌酶。
(2)37℃处理30min，除去溶菌酶，加入SDS，蛋白酶K等除去杂质蛋白，高盐环境下沉淀获得基因组DNA。
(3)利用苯酚：氯仿：异戊醇法进行抽提。
(4)乙酸盐沉淀法获得基因组DNA沉淀，放入70～75％乙醇洗涤一次，室温晾干。
(5)加入至含RNase的TE缓冲液中充分溶解。
4、利用通用引物和特异性引物进行PCR扩增鉴定菌株
(1)以基因组DNA为模板，利用16S rRNA的通用检测引物 20F/1500R以及植物乳杆菌的特异性检测引物F1/R1，按照Taq预混液说明书分别进行PCR扩增。
(2)Tm值根据引物说明进行设定。
(3)完成后1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(4)回收扩增产物进行连接，交付测序。
根据GenBank提交的植物乳杆菌的16S rRNA序列，设计一对特异性引物F1/R1，目的片段的大小为512bp。并根据16S rRNA的通用检测引物20F/1500R扩增的目的片段大小为1465bp。引物序列见表1。
表1植物乳杆菌特异性引物
如图1所示，通过这两对引物进行PCR扩增，分别得到符合目的片段大小的电泳条带，由此证明，上述实验提取获得的确定为植物乳杆菌 CGMCC 1.557的基因组DNA。
5、全基因组测序
(1)超声破碎基因组DNA，构建文库。
(2)上机测序。
(3)去除接头序列，组装基因组序列。
(4)使用二代测序对三代测序进行矫正。
(5)绘制植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC 1.557菌株全基因组完成图，见图2。
植物乳杆菌CGMCC 1.557的染色质DNA的长度为3156839bp， GenBank号为CP016270.1；含有两个质粒，一个质粒的长度为 67395bp，GenBank号为CP016271.1，另一个质粒的长度为49005bp， GenBank号为CP016272.1。
6、信号肽分析
(1)NCBI数据库进行基因注释，见表2。
表2植物乳杆菌CGMCC 1.557的基因注释
(2)信号肽预测
将植物乳杆菌CGMCC 1.557编码的氨基酸序列，依次输入SignalP 4.10在线预测软件中，设置参数后共预测获得126个可能的信号肽序列。将这些氨基酸序列输入LAB-Secreome数据库中，预测获得6类不同特性的信号肽和21个未知分类的信号肽，见表3。
表3植物乳杆菌CGMCC 1.557信号肽预测结果
(3)信号肽选择
根据表3预测的信号肽，选择脂质体锚定信号肽1320作为候选信号肽表达系统，其氨基酸序列为：
MNFKTAAKVTVVAGASVLFLAACGSSKSSSSSKQTANWTESAELPTMDISKSTDVVSSNALNNTNEGLYRLGKN
实施例2植物乳杆菌内源性信号肽的应用
将实施例1预测获得的内源性信号肽1320应用到植物乳杆菌 CGMCC 1.557中，并鉴定其对异源蛋白表达能力的影响。
1、含信号肽1320表达载体的构建
(1)pSIP411质粒线性化
利用NEB NcoI/XhoI双酶切表达质粒pSIP411，经胶回收获得线性化质粒pSIP411。
(2)合成片段
为了保证前端酶切位点，人工合成了15个核苷酸序列，命名为 SynF5，SynF5的序列如下：
CCATGGAGATTTTAGCC；
并连接上信号肽1320序列，1320序列见图3。
对美洲型ORF5序列进行优化，优化前的美洲型ORF5序列见图4。再将优化后的美洲型ORF5与Mpep序列连接在一起形成新序列，对该序列命名为ORF5M，ORF5M序列见图5。图5中下划线部分代表Mpep序列。
将SynF5序列、信号肽1320序列以及ORF5M序列依次拼接合成片段I，将该片段命名为SynF5-1320-ORF5M。将SynF5序列以及ORF5M 序列拼接合成片段II，将该片段命名为SynF5-ORF5M。合成片段见图6。
(3)PCR扩增
根据合成片段SynF5-1320-ORF5M的序列，设计一对特异性引物 SIP-1320-F/O5M-R。根据合成片段SynF5-ORF5M的序列，设计一对特异性引物SIP-O5M-F/O5M-R。引物序列见表4。
表4引物序列
使用NEBHigh-Fidelity 2X Master Mix，SIP-1320-F/O5M-R扩增异源蛋白SynF5-1320-ORF5M，利用SIP-O5M-F/O5M-R扩增异源蛋白 SynF5-ORF5M。
分别以合成片段SynF5-1320-ORF5M和合成片段SynF5-ORF5M为模板，利用O5M-HA-R01/HA-R02引物进行融合PCR方法，添加HA标签，回收两条PCR产物。
(4)无缝克隆
将回收的线性化pSIP411分别与片段SynF5-1320-ORF5M-HA和 SynF5-ORF5M-HA进行Gibson Assembly Master Mix(2×)混合，配置成 20ul的反应体系，50℃30min获得无缝克隆产物。从而使片段 SynF5-1320-ORF5M-HA和片段SynF5-ORF5M-HA分别连接至线性化质粒pSIP411上，以获得质粒pSIP-1320-O5MH和质粒pSIP-O5MH。质粒示意图见图7。
(5)电转化
将Gibson组装产物加入新鲜制备的NZ3900感受态细胞，冰上孵育 20min，电击5ms，加入预热M17复苏培养基。
(6)克隆筛选及质粒提取
红霉素平板抗性筛选获得阳性克隆，扩增培养后，收集菌体，经溶菌酶处理后按照Axygen质粒提取说明书提取质粒pSIP-1320-O5MH和 pSIP-O5MH。
2、植物乳杆菌CGMCC 1.557诱导表达ORF5M
(1)感受态制备
将复苏的植物乳杆菌CGMCC 1.557培养至平台期，以1％体积接种含有2％Gly的MRS培养基中，37℃培养至OD值为0.3～0.5，10,000× g/min离心10min，收集Gly刺激培养的培养物，弃上清，加入高压灭菌的洗液重悬菌体，离心弃上清，重复上第二步两次(共清洗三次)，再利用洗液重悬菌体，完成植物乳杆菌CGMCC 1.557感受态的制备，分装至各个小管，40或者80μL/管备用。
(2)电转化
将质粒pSIP-1320-O5MH和pSIP-O5MH加入制备的植物乳杆菌 CGMCC 1.557感受态中，冰浴20min，加入预冷的电转杯中，以1750kV 电击5ms，迅速转移电击后菌体于37℃温育的无抗性MRS液体培养基中，37℃温箱中培养3h，离心收集细菌，全部涂布于红霉素抗性平板中，继续培养24-48h，观察阳性克隆转化子。
(3)克隆筛选及诱导表达
挑取阳性克隆，进行克隆PCR。挑选鉴定阳性的克隆继续培养 12～24h至平台期。以1％接种量接种阳性植物乳杆菌CGMCC 1.557于红霉素抗性液体培养基中，待其生长至OD值为0.3～0.5时加入诱导剂 SppIP，工作浓度为50ng/mL，继续培养7～8h，获得表达重组蛋白的细菌。
(4)蛋白提取
10,000rpm/min离心收集表达重组蛋白的植物乳杆菌CGMCC 1.557 和未诱导植物乳杆菌CGMCC 1.557，PBS重悬细菌连续清洗两次，离心弃去上清，按照比例加入PBS，重悬菌体。
加入0.1μm规格的氧化锆磨介，经组织研磨仪研磨20min后，取出蛋白提取液，加入5×上样缓冲液充分混匀，沸水煮6min即可储存在冰箱中，用于后续的蛋白检测实验。
(5)Western blot
配制相应浓度的聚丙烯酰胺凝胶，装配好凝胶装置后置于 SDS-PAGE缓冲液中备用。拔出加样梳，将样品离心后加入加样孔中，连接电源进行垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。
完成SDS-PAGE后切割凝胶放置于事先浸泡转膜缓冲液的PVDF膜上，加上滤纸构成“三明治”结构，随后进行半干法转膜，30min后取出转有蛋白的PVDF膜，加入5％脱脂乳室温封闭2h，剪取目的条带大小周围的部分，弃去多余的膜，置于一抗液体中(商品化抗体或者抗多肽血清)4℃孵育过夜，经TBST漂洗4次，每次8min。再加入二抗液体中室温孵育1h，再次使用TBST连续漂洗4次，每次8min。
将洗净的PVDF膜平铺于放置保鲜膜的X线暗盒中，加上ECL显影液，在暗室中铺上胶片，关闭暗盒压片一定时间，取出胶片依次在显影液、水、定影液、水中各孵育1min，取出胶片拍照，观察结果。
如图8所示，Western Blot结果发现，含有1320信号肽的 pSIP-1320-O5MH质粒，诱导后能够表达出外源蛋白ORF5M，证明该序列能够促进外源蛋白在植物乳杆菌中的表达。
(6)间接免疫荧光
将诱导表达的乳杆菌加入PBS洗细菌两次后，8,000rpm/min离心 2min，加入含有1％BSA配制的一抗孵育液进行室温孵育，孵育时间为 1h 15min。PBS洗3次后，加入1:200稀释的FITC标记的荧光二抗，室温孵育1h。PBS洗4次后，进行制片观察。
制片方法：室温晾干乙醇清洗干净的盖玻片，暗环境下加入3μL菌液涂匀晾干，再加入5μL抗荧光猝灭剂(碧云天生物技术研究所)，最后将盖玻片反扣于载玻片上，滴加松柏油在高倍显微镜下仔细观察。
通过间接免疫荧光，对细菌表面的抗原进行检测，如图9所示，发现利用内源性信号肽1320能够有效将抗原展示在植物乳杆菌CGMCC 1.557表面。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 507
<212> DNA
<213> 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)
<400> 1
agtaacgata gtagtagtca tttacaatta atttataact tgacgttatg tgagttaaat 60
ggcactgatt ggttagctaa caagtttgat tgggcggtgg agagttttgt catttttccc 120
gttttgactc atattgtcag ttatggtgcc ttaactacga gtcatttctt agatactgtc 180
gctttagtca ctgtgagtac ggccggtttt gttcatggtc ggtatgtctt aagtagtatt 240
tatgcggtct gtgccttagc tgcgttgact tgtttcgtca ttcggtttgc gaagaattgt 300
atgagttggc gctatgcgtg tacgcggtat acgaactttt tattagatac taagggccgt 360
ttatatcggt ggcggagtcc agtcattatt gagaagcggg gcaaggttga ggtcgaaggt 420
catttaattg atttaaagcg ggttgtgtta gatggtagtg tggcgacgcc aattacgcgg 480
gtttcagcgg aacaatgggg tcggcca 507

Claims (9)

1.一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，其特征在于，所述预测方法包括以下步骤：
(1)菌株培养：将实验菌株涂布于固体MRS培养基中于37℃厌氧环境培养24h，挑取单克隆转接至MRS液体培养基中，继续培养，再次涂布于MRS固体培养基中；
(2)菌种保存：挑取单克隆进行菌种保存；
(3)提取菌株的基因组DNA；
(4)菌株鉴定：利用PCR扩增对菌株基因组DNA进行鉴定；
(5)全基因组获得：将经过步骤(4)鉴定的菌株基因组DNA进行测序获得该菌株的全基因组序列；
(6)信号肽预测：对所述菌株的全基因组序列进行注释分析，将所述菌株编码的氨基酸序列输入SignalP 4.10在线预测软件预测获得若干可能的信号肽序列，并利用LAB-Secreome数据库对这些信号肽进行预测分类，获得若干条待定信号肽序列；
(7)表达载体的构建：构建含有待定信号肽序列的实验组表达载体和不含待定信号肽序列的对照组表达载体；
(8)质粒获得：将实验组表达载体和对照组表达载体分别通过电转化导入至NZ3900感受态细胞内，筛选阳性克隆提取获得实验组质粒和对照组质粒；
(9)菌株诱导表达重组蛋白：将实验组质粒和对照组质粒分别通过电转化导入至由实验菌株制备的感受态内，筛选阳性克隆后进行扩大培养，加入诱导剂继续培养诱导两组菌株表达重组蛋白；
(10)重组蛋白表达鉴定：分别提取菌株内的重组蛋白，通过Western blot技术和间接免疫荧光技术验证导入实验组质粒的菌株的重组蛋白表达情况，能够表达重组蛋白的待定信号肽序列即为目标内源性信号肽。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，其特征在于：所述步骤(1)中的菌株为植物乳杆菌CGMCC 1.557；在MRS液体培养基培养时，每隔12h再次以1％体积转接至新的MRS液体培养基中，连续传代50次。
3.根据权利要求2所述的植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，用于菌株鉴定的引物有两对，一对为植物乳杆菌CGMCC 1.557的16S rRNA的通用检测引物，所述通用检测引物的DNA序列如下：
20F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，
1500R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；
另一对是以植物乳杆菌CGMCC 1.557的16S-23S rRNA基因位点为模板设计的特异性引物，所述特异性引物的DNA序列如下：
F1：5’-GCCGCCTAAGGTGGGACAGAT-3’，
R1：5’-TTACCTAACGGTAAATGCGA-3’。
4.根据权利要求2所述的植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，其特征在于：步骤(9)中，所述的诱导剂为SppIP，所述诱导剂的工作浓度为50ng/mL，诱导培养时间为7～8h。
5.根据权利要求2所述的植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，其特征在于：还获得了所述植物乳杆菌CGMCC 1.557的全基因组，其基因组含有1个染色质，2个质粒，其序列总长度为3,156,839bp，GC含量为44.61％，注释基因数目3087个，tRNA 70个，ncRNA 4个，5SrRNA、16S rRNA、23S rRNA的数目分别为6、5、5，CDS序列2997个，CRISPR位点1个。
6.根据权利要求5所述的植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，其特征在于：所述的目标内源性信号肽为信号肽1320。
7.根据权利要求6所述的所述的植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，其特征在于：构建含有1320信号肽序列的表达载体，具体步骤如下：
(1)人工合成序列SynF5，所述SynF5的DNA序列为：
5’-CCATGGAGATTTTAGCC-3’；
(2)将美洲型ORF5序列与Mpep序列连接在一起，形成新序列ORF5M；
(3)将SynF5序列、1320信号肽序列、ORF5M依次相连获得合成片段SynF5-1320-ORF5M；
(4)添加HA标签：利用融合PCR对合成片段SynF5-1320-ORF5M添加HA标签获得片段SynF5-1320-ORF5M-HA；
(5)通过无缝克隆将片段SynF5-1320-ORF5M-HA与线性化的pSIP411质粒相连接即获得含有1320信号肽序列的表达载体。
8.根据权利要求7所述的所述的植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法，其特征在于：所述美洲型ORF5序列为优化后的美洲型ORF5序列，所述优化后的美洲型ORF5具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸全序列；且先将美洲型ORF5序列进行优化，然后再与Mpep序列连接。
9.根据权利要求1～8任一项所述的植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法获得的内源性信号肽在植物乳杆菌中的应用。
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