CN109293752A - 鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF17及其编码基因与应用 - Google Patents

鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF17及其编码基因与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109293752A
CN109293752A CN201811214275.XA CN201811214275A CN109293752A CN 109293752 A CN109293752 A CN 109293752A CN 201811214275 A CN201811214275 A CN 201811214275A CN 109293752 A CN109293752 A CN 109293752A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sorf17
yersinia pestis
albumen
sequence
virulence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811214275.XA
Other languages
English (en)
Inventor
颜焱锋
曹诗洋
黄银
朱伟民
张佩
贾辰熙
杨瑞馥
杜宗敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Original Assignee
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS filed Critical Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority to CN201811214275.XA priority Critical patent/CN109293752A/zh
Publication of CN109293752A publication Critical patent/CN109293752A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF17及其编码基因与应用。鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF17的氨基酸序列如序列表中序列2所示。向Bal b/c小鼠腹股沟皮下注射100CFU鼠疫菌△sORF17‑150、鼠疫菌△sORF17回补株或鼠疫菌201株，然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况。结果表明，与鼠疫菌201株(在第5d开始死亡且第5‑8d全部死亡)相比，鼠疫菌△sORF17‑150的毒力显著下降(未发生死亡)；鼠疫菌△sORF17回补株能够完全回补毒力。由此可见，sORF17蛋白对鼠疫耶尔森菌的毒力有重要影响。本发明具有重大的应用价值。

Description

鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF17及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF17及其编码基因与应用。
背景技术
鼠疫是中国法定的甲类传染病，其病原菌为鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。鼠疫是自然疫源性疾病，中国的鼠疫疫源地主要分布于17个省及自治区，总面积多达60多万平方公里。鼠疫耶尔森氏菌是一种革兰氏染色阴性的短小杆菌，主要由节肢动物跳蚤通过叮咬传染给宿主啮齿类动物，并有可能传播给人类导致腺鼠疫、肺炎鼠疫和败血症等的发生，给人类造成了巨大的生命和财产损失。世界卫生组织已将鼠疫列为重新抬头的传染病，因此，必须要给予高度重视。
关于细菌蛋白质的活性和结构已有大量细致的研究，这些蛋白均由传统意义上的编码区翻译而成。近几年，发现基因间区域能够编码小蛋白质，并逐渐发现细菌中越来越多的小蛋白质(小肽)发挥了重要功能。小肽是由小开放阅读框(ORF)编码的多肽。与术语“肽”(其可以指无论大小的固有无序多肽)相反，较小的多肽来自较大前体(例如前导肽)蛋白水解加工，或通过核糖体非依赖性机制合成的多肽，但这里的“小肽”被定义为直接通过翻译小ORF而得到的那些小蛋白质，通常指小于100个氨基酸的小ORF蛋白，其中大多数尚未被注释过。除了对小肽进行生物信息学鉴定和分类具有很大挑战之外，其功能的确定通常需要深入细致的研究。这些被忽视的小蛋白质在细菌内发挥了重要的功能，是未来研究的重要问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的鼠疫菌基因组编码的具有重要功能的小肽。
本发明首先保护sORF17蛋白；sORF17蛋白可为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与鼠疫耶尔森菌毒力相关的蛋白质。
编码所述sORF17蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：
b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
b3)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于鼠疫耶尔森氏菌且编码所述sORF17蛋白的DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，来源于鼠疫耶尔森氏菌且编码所述sORF17蛋白的DNA分子。
含有所述核酸分子的表达序列、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种重组鼠疫耶尔森菌甲，其制备方法如下：抑制鼠疫耶尔森菌中所述sORF17蛋白的表达量和/或活性，得到的重组菌即为重组鼠疫耶尔森菌甲；与鼠疫耶尔森菌相比，重组鼠疫耶尔森菌甲的毒力降低。
所述“抑制鼠疫耶尔森菌中所述sORF17蛋白的表达量和/或活性”可通过RNA干扰、同源重组、基因敲除、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到抑制所述sORF17蛋白的表达量和/或活性的目的。
所述“抑制鼠疫耶尔森菌中sORF17蛋白的表达量和/或活性”具体通过向鼠疫耶尔森菌中导入抑制sORF17蛋白的表达量和/或活性的物质实现。
所述“抑制sORF17蛋白的表达量和/或活性的物质”具体可为以质粒pKD4为模板，采用实施例中表1的17-150-K-F和17-150-K-R组成的引物对进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物甲。所述“抑制sORF17蛋白的表达量和/或活性的物质”具体可为以质粒pKD4为模板，采用实施例中表1的17-200-K-F和17-200-K-R组成的引物对进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物乙。PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙均为带有同源臂的kana突变盒。
上述任一所述抑制sORF17蛋白的表达量和/或活性的物质也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种重组鼠疫耶尔森菌乙，其制备方法如下：提高鼠疫耶尔森菌中所述sORF17蛋白的表达量和/或活性，得到的重组菌即为重组鼠疫耶尔森菌乙；与鼠疫耶尔森菌相比，重组鼠疫耶尔森菌乙的毒力增强。
所述“提高鼠疫耶尔森菌中sORF17蛋白的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到提高sORF17蛋白的表达量和/或活性的效果。
所述“提高鼠疫耶尔森菌中sORF17蛋白的表达量和/或活性”可通过向鼠疫耶尔森菌中导入提高sORF17蛋白的表达量和/或活性的物质实现。所述“提高sORF17蛋白的表达量和/或活性的物质”可为编码所述sORF17蛋白的核酸分子。所述向鼠疫耶尔森菌中导入提高sORF17蛋白的表达量和/或活性的物质具体可通过向鼠疫耶尔森菌中导入含有编码sORF17蛋白的核酸分子的重组载体实现。所述含有编码sORF17蛋白的核酸分子的重组载体具体可为将pBAD24质粒的限制性内切酶NheI和HindIII识别序列间的小片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子，得到重组质粒。
本发明还保护S1)或S2)或S3)。
S1)所述sORF17蛋白，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表达序列、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控鼠疫耶尔森菌毒力中的应用。
S2)所述sORF17蛋白，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表达序列、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在预防鼠疫中的应用。
S3)上述任一所述抑制sORF17蛋白的表达量和/或活性的物质在预防鼠疫中的应用。
上述任一所述鼠疫耶尔森菌具体可为鼠疫耶尔森菌201株。
在本发明的实施例中，向Bal b/c小鼠腹股沟皮下注射100CFU鼠疫菌△sORF17-150(相当于重组鼠疫耶尔森菌甲)、鼠疫菌△sORF17回补株或鼠疫菌201株，然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况。结果表明，与鼠疫菌201株(在第5d开始死亡且第5-8d全部死亡)相比，鼠疫菌△sORF17-150的毒力显著下降(未发生死亡)；鼠疫菌△sORF17回补株能够完全回补毒力。由此可见，sORF17蛋白对鼠疫耶尔森菌的毒力有重要影响。本发明具有重大的应用价值。
附图说明
图1为实施例3耐酸实验的结果。
图2为实施例4绘制的生长曲线。
图3为实施例5小鼠毒力实验中各组小鼠的生存曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中涉及的引物名称和核苷酸序列见表1。
表1
注：单下划线为限制性内切酶NheI的识别序列，双下划线为限制性内切酶HindIII的识别序列。
鼠疫耶尔森菌201株记载于如下文献中：Song Y，Tong Z，Wang J，Wang L，Guo Z，Han Y，Zhang J，Pei D，Zhou D，Qin H et al.Complete genome sequence of Yersiniapestis strain 91001，an isolate avirulent to humans.DNA research：aninternational journal for rapid publication of reports on genes and genomes2004，11(3):179-197.
质粒小提试剂盒为Qiagen公司的产品。
实施例1、sORF17蛋白的发现
鼠疫耶尔森氏菌由传播媒介到哺乳动物宿主的过程经历了从环境温度26℃到37℃的转变，很多毒力基因在37℃被启动，开始大量表达，这大大增加了鼠疫耶尔森氏菌对宿主的毒力。与此同时，环境温度为37℃时部分小肽的丰度也有显著上升，很可能与鼠疫耶尔森氏菌的毒力相关。
1、制备鼠疫菌201株在26℃(模拟跳蚤体内环境)的菌体蛋白样品1和鼠疫菌201株在37℃(模拟小鼠体内环境)的菌体蛋白样品2。
2、完成步骤1后，采用蛋白酶(胰蛋白酶、Lys-C、Glu-C、Arg-C、Asp-N、间胰蛋白酶、Lys-N或糜蛋白酶)分别对菌体蛋白样品1和菌体蛋白样品2进行氨基酸切割，然后质谱分析，筛选出与菌体蛋白样品1相比，菌体蛋白样品2中表达量显著上调的小肽。
3、结合鼠疫菌201株RNA-seq数据，从菌体蛋白样品2中表达量显著上调的小肽中筛选出一个小肽，命名为sORF17蛋白。
sORF17蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。编码sORF17蛋白的基因(以下简称sORF17基因)如序列表中序列1所示。
实施例2、sORF17基因敲除株和回补株的构建
一、sORF17基因敲除株(即鼠疫菌△sORF17-150和鼠疫菌△sORF17-200)的构建
构建基因突变株是研究基因功能最重要的方法之一。本发明的发明人运用一步法突变技术敲除sORF17基因。该方法基于大肠杆菌的λ-Red重组系统，能够使sORF17基因与带有同源臂的抗性基因(即kana突变盒)发生同源重组，被抗性基因替换，从而sORF17基因功能失效。该方法中，首先将编码λ-Red重组系统的pKD46质粒导入鼠疫菌201株，该质粒能够通过阿拉伯糖诱导表达Exo、Beta和Gam三种蛋白(Exo蛋白是λ核酸外切酶，能够切开双链DNA；Beta蛋白能介导单链DNA互补复性与其退火反应；Gam蛋白能抑制对DNA的外切酶活性)；然后转入带有同源臂的抗性基因(即kana突变盒)，在重组酶作用下与鼠疫菌201株染色体上的sORF17基因进行同源重组，从而使该sORF17基因失活；最后，提高培养温度，将温度敏感型质粒pKD46消除。
1、质粒pKD46的提取
(1)将含pKD46质粒的大肠杆菌DH5α接种于5mL LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养至对数期，得到培养菌液。
(2)取步骤(1)得到的培养菌液，用质粒小提试剂盒提取质粒，得到质粒pKD46(约177bp)。
2、鼠疫菌201株感受态细胞的制备
(1)将鼠疫菌201株接种于LB液体培养基，26℃、200rpm振荡培养至对数期，得到菌液1。
(2)取菌液1，接种于LB液体培养基(接种比为1:50)，26℃、200rpm振荡培养，得到OD620nm值为0.5-0.6的菌液2。
(3)取菌液2，加入阿拉伯糖，得到诱导体系；该诱导体系中，阿拉伯糖的浓度为10mmol/L。
(4)取诱导体系，26℃、200rpm振荡培养2h，得到菌液3。
(5)取菌液3，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体。
(6)取步骤(5)收集的菌体，先用无菌的10％(v/v)甘油水溶液洗涤两次，再用100μL 10％(v/v)甘油水溶液重悬，得到鼠疫菌201株感受态细胞。
将鼠疫菌201株感受态细胞置于冰浴备用。
3、电转化
(1)取鼠疫菌201株感受态细胞，加入200μg质粒pKD46，混匀后加入预冷的电击杯，冰浴10min，然后置于电转仪中进行电击(电击参数为25μF、200Ω、2.5KV)。
(2)完成步骤(1)后，取所述电击杯，加入1mL LB液体培养基，混匀后吸至EP管(规格为1.5mL)中，26℃、200rpm振荡培养2h；最后取100μL菌液均匀涂布于LB固体平板(Amp抗性)上，26℃倒置培养36h，得到若干单克隆。
(3)分别将各个单克隆涂板增菌(Amp抗性，LB平板)，取少量菌体于无菌水中，99℃处理10min，离心，收集上清。
(4)分别以上清为模板，以pkd46-F：5’-GGAGCGCATGGCAGAACAC-3’和pkd46-R：5’-CAGAGCGGCAATAAGTCG-3’为引物进行PCR扩增。如果PCR扩增产物中含有893bp的DNA片段，则对应的单克隆为阳性单克隆。阳性单克隆即含KD46质粒的鼠疫菌201株。
将各个阳性单克隆甘油保种，-20℃保存。
4、kana突变盒扩增
以质粒pKD4为模板，采用17-150-K-F和17-150-K-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约1500bp的PCR扩增产物，该PCR扩增产物即为带有同源臂的kana突变盒。
5、含KD46质粒的鼠疫菌201株感受态细胞的制备
按照步骤2的方法，将鼠疫菌201株替换为步骤3得到的阳性单克隆(即含KD46质粒的鼠疫菌201株)，其它步骤均不变，得到含KD46质粒的鼠疫菌201株感受态细胞。
6、电转化
(1)取含KD46质粒的鼠疫菌201株感受态细胞，加入1-2μg步骤4得到的PCR扩增产物，充分混匀后冰浴10min，再加入预冷的电击杯(直径1mm)。
(2)完成步骤1后，将所述电击杯置于电转仪中进行电击(电击参数为25μF、200Ω、2.5KV)。
(3)完成步骤(2)后，取所述电击杯，加入1mL LB液体培养基，混匀后吸至EP管(规格为1.5mL)中，26℃、200rpm振荡培养2h；最后取100μL菌液均匀涂布于LB固体平板(Amp抗性和kana抗性)上，26℃倒置培养36h，得到若干单克隆。
(4)分别将各个单克隆涂板增菌(Amp抗性和kana抗性，LB平板)，取少量菌体于无菌水中，99℃处理10min，离心，收集上清。
(5)分别以上清为模板，以引物对甲(由17-I-150-F和Kana-I-R组成，用于进行上搭桥PCR鉴定)、引物对乙(由Kana-I-F和17-I-150-R组成，用于进行下搭桥PCR鉴定)或引物对丙(由17-N-F和17-N-R组成，用于进行基因内部PCR鉴定)为引物进行PCR扩增。如果某单克隆采用引物对甲扩增得到的PCR扩增产物中含有约500bp的DNA片段，采用引物对乙扩增得到的PCR扩增产物中含有约500bp的DNA片段，采用引物对丙扩增得到的PCR扩增无条带，则该单克隆为阳性单克隆。
将阳性单克隆甘油保种，-80℃保存。
7、pKD46质粒消除
(1)分别取步骤6得到的阳性单克隆，接种于LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养48h，得到菌液。
(2)完成步骤(1)后，取100μL菌液，用LB液体培养基稀释1000倍后均匀涂布于LB固体平板(两种类型的LB固体平板，一种为kana抗性，另一种为Amp抗性)上，26℃倒置培养36h。
如果某阳性单克隆在LB固体平板(kana抗性)出现克隆，而LB固体平板(Amp抗性)没有出现克隆，说明该阳性单克隆的pKD46质粒已消除。挑取LB固体平板(kana抗性)上的单克隆(即鼠疫菌△sORF17-150)，甘油保种，-80℃保存。
按照上述步骤，将步骤4中的17-150-K-F替换为17-200-K-F、17-150-K-R替换为17-200-K-R，将步骤6中(5)的17-I-150-F替换为17-I-200-F、17-I-150-R替换为17-I-200-R，其它步骤均不变，得到鼠疫菌△sORF17-200。将鼠疫菌△sORF17-200甘油保种，-80℃保存。
二、sORF17基因回补株(即鼠疫菌△sORF17回补株)的构建
1、pBAD24质粒的提取
(1)将含pBAD24质粒的大肠杆菌DH5α接种于5mL LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养至对数期，得到培养菌液。
(2)取步骤(1)得到的培养菌液，用质粒小提试剂盒提取质粒，得到pBAD24质粒(约4542bp)。
2、构建重组质粒pBAD24-sORF17
(1)以鼠疫菌201株的基因组DNA为模板，采用17-F和17-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，回收约300bp的DNA片段。
(3)取步骤(2)回收的DNA片段，采用限制性内切酶NheI和HindIII酶切，回收酶切片段。
(4)取pBAD24质粒，采用限制性内切酶NheI和HindIII酶切，回收约4Kb的载体骨架。
(5)将步骤(3)回收的酶切片段和步骤(4)回收的载体骨架进行连接，得到重组质粒pBAD24-sORF17。
将重组质粒pBAD24-sORF17进行测序。根据测序结果，对重组质粒pBAD24-sORF17描述如下：将pBAD24质粒的限制性内切酶NheI和HindIII识别序列间的小片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子。
3、制备鼠疫菌△sORF17-150感受态细胞
按照步骤一中2的方法，将鼠疫菌201株替换为鼠疫菌△sORF17-150，其它步骤均不变，得到鼠疫菌△sORF17-150感受态细胞。
4、电转化
(1)取鼠疫菌△sORF17-150感受态细胞，加入200μg重组质粒pBAD24-sORF17，混匀后加入预冷的电击杯，冰浴10min，然后置于电转仪中进行电击(电击参数为25μF、200Ω、2.5KV)。
(2)完成步骤(1)后，取所述电击杯，加入1mL LB液体培养基，混匀后吸至EP管(规格为1.5mL)中，26℃、200rpm振荡培养2h；最后取100μL菌液均匀涂布于LB固体平板(Amp抗性和kana抗性)上，26℃倒置培养36h，得到若干单克隆。
(3)分别将各个单克隆涂板增菌(Amp抗性，LB平板)，取少量菌体于无菌水中，99℃处理10min，离心，收集上清。
(4)分别以上清为模板，以17-F和17-R为引物进行PCR扩增。如果PCR扩增产物中含有约300bp的DNA片段，则对应的单克隆为阳性单克隆。将各个阳性单克隆(即鼠疫菌△sORF17回补株)甘油保种，-80℃保存。
采用免疫印迹法检测待测菌(鼠疫菌201株、鼠疫菌△sORF17-150、鼠疫菌△sORF17-200或鼠疫菌△sORF17回补株)的sORF17蛋白在其菌液上清和菌液沉淀中的表达情况。结果表明，鼠疫菌201株的sORF17蛋白在其菌液上清和菌液沉淀中均表达，鼠疫菌△sORF17-150和鼠疫菌△sORF17-200的sORF17蛋白在相应的菌液上清和菌液沉淀中均没有表达，鼠疫菌△sORF17回补株的sORF17蛋白在其菌液上清和菌液沉淀中均有表达且表达量高于鼠疫菌201株。
实施例3、耐酸实验
最小培养基记载于如下文献中：F Sebbane，CO Jarrett，JR Linkenhoker，BJHinnebusch.Evaluation of the role of constitutive isocitrate lyase activityin Yersinia pestis infection of the flea vector and mammalian host.Infection&Immunity，2004，72(12)：7334-7.
待测菌下降的百分比＝在含20mM葡萄糖的最小培养基(pH3.5)中的菌数/在含20mM葡萄糖的最小培养基(pH6.5)中的菌数×100％。
一、实验一
(1)取待测菌(鼠疫菌△sORF17-150、鼠疫菌△sORF17-200或鼠疫菌201株)，接种于LB液体培养基，26℃、200rpm振荡培养至对数期，得到菌液1。
(2)取菌液1，接种于LB液体培养基(接种比为1:50)，26℃、200rpm振荡培养，得到OD620nm值为1.0的菌液2。
(3)取菌液2，用含20mM葡萄糖的最小培养基(pH6.5)或含20mM葡萄糖的最小培养基(pH3.5)稀释100倍，得到菌液稀释液。
(4)取菌液稀释液，静置30min，然后倍比稀释，涂板计数，计算静置30min时待测菌下降的百分比。
按照上述步骤，将步骤(4)中的静置30min替换为静置60min，其它步骤均不变，得到静置60min时待测菌下降的百分比。
二、实验二
(1)取鼠疫菌△sORF17回补株，接种于LB液体培养基，26℃、200rpm振荡培养至对数期，得到菌液1。
(2)取菌液1，接种于LB液体培养基(接种比为1:50)，26℃、200rpm振荡培养，得到OD620nm值为0.8的菌液2。
(3)取菌液2，加入阿拉伯糖，得到诱导体系；该诱导体系中，阿拉伯糖的浓度为0.2％(m/v)。
(4)取所述诱导体系，26℃、200rpm振荡培养2h，得到菌液3。
(5)取菌液3，用含20mM葡萄糖的最小培养基(pH6.5)或含20mM葡萄糖的最小培养基(pH3.5)稀释100倍，得到菌液稀释液。
(6)取菌液稀释液，静置30min，然后倍比稀释，涂板计数，计算静置30min时鼠疫菌△sORF17回补株下降的百分比。
按照上述步骤，将步骤(6)中的静置30min替换为静置60min，其它步骤均不变，得到静置60min时鼠疫菌△sORF17回补株下降的百分比。
部分实验结果见图1(1为鼠疫菌201株，2为鼠疫菌△sORF17-150，3为鼠疫菌△sORF17回补株)。结果表明，与鼠疫菌201株相比，鼠疫菌△sORF17-150和鼠疫菌△sORF17-200的耐酸能力均显著下降；鼠疫菌△sORF17回补株的耐酸能力在30min时能够恢复70％，60min时可100％恢复。
实施例4、生长曲线
1、取鼠疫菌△sORF17回补株的单克隆，接种于LB液体培养基，26℃、200rpm振荡培养，得到OD620nm值为0.8的菌液1。
2、取菌液1，加入阿拉伯糖，得到诱导体系；该诱导体系中，阿拉伯糖的浓度为0.2％(m/v)。
3、取所述诱导体系，26℃、200rpm振荡培养2h，得到菌液2。
4、取菌液2，接种于LB液体培养基(接种比为1:50)，26℃、200rpm振荡培养，测定不同培养时间时菌液的OD620nm值。以培养时间为横坐标，对应的菌液OD620nm值为纵坐标，绘制生长曲线。
取待测菌(鼠疫菌△sORF17-150、鼠疫菌△sORF17-200或鼠疫菌201株)的单克隆，接种于LB液体培养基，26℃、200rpm振荡培养，测定不同培养时间时菌液的OD620nm值。以培养时间为横坐标，对应的菌液OD620nm值为纵坐标，绘制生长曲线。
部分实验结果见图2。结果表明，与鼠疫菌201株相比，鼠疫菌△sORF17-150和鼠疫菌△sORF17-200的生长速度均明显降低，达到平台期的时间明显滞后，生长状态受到显著抑制；sORF17基因回补后(即鼠疫菌△sORF17回补株)，生长状态恢复正常。
实施例5、小鼠毒力实验
取30只Bal b/c小鼠，随机分为突变组、回补株和对照组三组(每组10只)。进行如下处理：
突变组：实验第1d，每只小鼠腹股沟皮下注射100CFU鼠疫菌△sORF17-150；然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况；
回补组：实验第1d，每只小鼠腹股沟皮下注射100CFU鼠疫菌△sORF17回补株；然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况；
对照组：实验第1d，每只小鼠腹股沟皮下注射100CFU鼠疫菌201株；然后正常喂养14d；期间观察小鼠的生存情况。
实验结果见表2。结果表明，回补组和对照组的小鼠在第5d开始死亡且第5-8d全部死亡；突变组未发生死亡，观察结束时还剩余10只。由此可见，与鼠疫菌201株相比，鼠疫菌△sORF17-150的毒力显著下降；鼠疫菌△sORF17回补株能够完全回补毒力，排除极性突变。
表2-1
表2-2
用GraphPad Prism软件(网址为：https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/)绘制各组小鼠的生存曲线绘制，结果见图3。
用GraphPad Prism软件自带的卡方检验方法Logrank与Gehan-Breslow-Wilcoxon分析各组之间的差异是否具有统计学意义。对照组和突变组的差异统计结果见表3，对照组和回补组的差异统计结果见表4。结果表明，对照组和突变组的差异统计结果中p值<0.0001，有显著统计学差异；对照组和回补组的差异统计结果中p值为0.3053，没有显著差异。
表3
表4
生存曲线比较
时序检验
卡方 1.278
自由度 1
P值 0.2582
P值汇总 无显著性差异
生存曲线是否有显著性差异 否
Gehan-Breslow-Wilcoxon检验
卡方 1.051
自由度 1
P值 0.3053
P值汇总 无显著性差异
生存曲线是否有显著性差异 否
上述结果表明，sORF17蛋白对鼠疫耶尔森菌的毒力有重要影响。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF17及其编码基因与应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 261
<212> DNA
<213> 鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）
<400> 1
catcggagga aaatgaaatc acatccgaat aagcatattc aagaggccat tgaatacgcg 60
ttgagtaaag gctgggtttg ggttccagca ggtaagtcag cacattgctt ctgcaagctg 120
cgctgcggcg ataaatcagg tgaacataca agtcaccaca gaagtgtatg gtcgactcca 180
gatgtaccgg agcaccatgc cacgcaaatc aggcaagcgg tcgaccagtg tggtcgcatc 240
aaaaaccaga tgagcaaaaa a 261
<210> 2
<211> 87
<212> PRT
<213> 鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）
<400> 2
His Arg Arg Lys Met Lys Ser His Pro Asn Lys His Ile Gln Glu Ala
1 5 10 15
Ile Glu Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Trp Val Trp Val Pro Ala Gly Lys
20 25 30
Ser Ala His Cys Phe Cys Lys Leu Arg Cys Gly Asp Lys Ser Gly Glu
35 40 45
His Thr Ser His His Arg Ser Val Trp Ser Thr Pro Asp Val Pro Glu
50 55 60
His His Ala Thr Gln Ile Arg Gln Ala Val Asp Gln Cys Gly Arg Ile
65 70 75 80
Lys Asn Gln Met Ser Lys Lys
85
<210> 3
<211> 470
<212> DNA
<213> 鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）
<400> 3
gagcttatag aaggaagaag ttagggggtg gggtcggtaa gttgatgaaa acagggagtg 60
ttctgataat ctatagccgt tttctgcggc cgtagacgtc agaaaataga cagtgttgac 120
acgcgctcac actataccta tcataatgac atcggaggaa aatgaaatca catccgaata 180
agcatattca agaggccatt gaatacgcgt tgagtaaagg ctgggtttgg gttccagcag 240
gtaagtcagc acattgcttc tgcaagctgc gctgcggcga taaatcaggt gaacatacaa 300
gtcaccacag aagtgtatgg tcgactccag atgtaccgga gcaccatgcc acgcaaatca 360
ggcaagcggt cgaccagtgt ggtcgcatca aaaaccagat gagcaaaaaa tagtagttag 420
tggcggtttt ggccgccatt tgttccaaag gtacattaat acttcactga 470

Claims (10)

1.sORF17蛋白，为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与鼠疫耶尔森菌毒力相关的蛋白质。
2.编码权利要求1所述sORF17蛋白的核酸分子。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：
b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
b3)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于鼠疫耶尔森氏菌且编码权利要求1所述sORF17蛋白的DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，来源于鼠疫耶尔森氏菌且编码权利要求1所述sORF17蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达序列、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
5.一种重组鼠疫耶尔森菌甲，其制备方法如下：抑制鼠疫耶尔森菌中权利要求1所述sORF17蛋白的表达量和/或活性，得到的重组菌即为重组鼠疫耶尔森菌甲；与鼠疫耶尔森菌相比，重组鼠疫耶尔森菌甲的毒力降低。
6.如权利要求5所述的重组鼠疫耶尔森菌甲，其特征在于：所述“抑制鼠疫耶尔森菌中所述sORF17蛋白的表达量和/或活性”通过向鼠疫耶尔森菌中导入抑制所述sORF17蛋白的表达量和/或活性的物质实现。
7.权利要求6中抑制所述sORF17蛋白的表达量和/或活性的物质。
8.一种重组鼠疫耶尔森菌乙，其制备方法如下：提高鼠疫耶尔森菌中权利要求1所述sORF17蛋白的表达量和/或活性，得到的重组菌即为重组鼠疫耶尔森菌乙；与鼠疫耶尔森菌相比，重组鼠疫耶尔森菌乙的毒力增强。
9.S1)或S2)或S3)：
S1)权利要求1所述sORF17蛋白，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达序列、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控鼠疫耶尔森菌毒力中的应用；
S2)权利要求1所述sORF17蛋白，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达序列、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在预防鼠疫中的应用；
S3)权利要求7所述抑制sORF17蛋白的表达量和/或活性的物质在预防鼠疫中的应用。
10.如权利要求5或6所述的重组鼠疫耶尔森菌甲、或、权利要求8所述的重组鼠疫耶尔森菌乙、或、权利要求9所述的应用，其特征在于：所述鼠疫耶尔森菌为鼠疫耶尔森菌201株。
CN201811214275.XA 2018-10-18 2018-10-18 鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF17及其编码基因与应用 Pending CN109293752A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811214275.XA CN109293752A (zh) 2018-10-18 2018-10-18 鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF17及其编码基因与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811214275.XA CN109293752A (zh) 2018-10-18 2018-10-18 鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF17及其编码基因与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109293752A true CN109293752A (zh) 2019-02-01

Family

ID=65157513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811214275.XA Pending CN109293752A (zh) 2018-10-18 2018-10-18 鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF17及其编码基因与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109293752A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111040025A (zh) * 2019-12-24 2020-04-21 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Yp_2058蛋白在调控鼠疫耶尔森菌毒力中的应用
CN111569047A (zh) * 2020-05-15 2020-08-25 西北农林科技大学 一种蛋白型锰离子螯合剂、免疫抑制剂及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101245100A (zh) * 2008-03-31 2008-08-20 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白与编码基因及其应用
WO2009060225A2 (en) * 2007-11-08 2009-05-14 The Secretary Of State For Defence Rodenticide
EP2163627A1 (en) * 2008-09-12 2010-03-17 Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin Attenuated liver-stage Plasmodium and vaccin containing the same
CN104789576A (zh) * 2015-01-23 2015-07-22 南华大学 鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR及其应用
CN108070036A (zh) * 2018-01-24 2018-05-25 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种鼠疫耶尔森氏菌F1Vmut融合蛋白的纯化方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009060225A2 (en) * 2007-11-08 2009-05-14 The Secretary Of State For Defence Rodenticide
CN101245100A (zh) * 2008-03-31 2008-08-20 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白与编码基因及其应用
EP2163627A1 (en) * 2008-09-12 2010-03-17 Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin Attenuated liver-stage Plasmodium and vaccin containing the same
CN104789576A (zh) * 2015-01-23 2015-07-22 南华大学 鼠疫耶尔森菌毒力调控子TyrR及其应用
CN108070036A (zh) * 2018-01-24 2018-05-25 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种鼠疫耶尔森氏菌F1Vmut融合蛋白的纯化方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KNIGHT,B.M. ET AL: ""Yersinia pestis strain Strain 125 B plague Bombay plasmid pMT1, complete sequence ACCESSION NO: CP015119"", 《GENBANK DATABASE》 *
万成松等: ""鼠疫耶尔森菌的基因组学和后基因组学研究进展"", 《微生物学免疫学进展》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111040025A (zh) * 2019-12-24 2020-04-21 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 Yp_2058蛋白在调控鼠疫耶尔森菌毒力中的应用
CN111569047A (zh) * 2020-05-15 2020-08-25 西北农林科技大学 一种蛋白型锰离子螯合剂、免疫抑制剂及应用
CN111569047B (zh) * 2020-05-15 2023-02-10 西北农林科技大学 一种蛋白型锰离子螯合剂、免疫抑制剂及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102375732B1 (ko) 바실러스 리체니포르미스에서 단백질 생산을 증가시키기 위한 조성물 및 방법
López-Fernández et al. Understanding Mucor circinelloides pathogenesis by comparative genomics and phenotypical studies
CN113831395B (zh) 一种重组抗菌肽TrSub、制备方法及其应用
CN112250740B (zh) 葡萄糖转运蛋白及其在提高有机酸生产中的应用
CN109293752A (zh) 鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF17及其编码基因与应用
Liu et al. Multiple genetic tools for editing the genome of Riemerella anatipestifer using a counterselectable marker
Wang et al. Multiomic approaches reveal novel lineage-specific effectors in the potato and tomato early blight pathogen Alternaria solani
Xiang et al. Characterization of CRN-like genes from Plasmopara viticola: searching for the most virulent ones
CN104726432B (zh) 一种D型β‑葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌
Tian et al. The mold-specific MS8 gene is required for normal hypha formation in the dimorphic pathogenic fungus Histoplasma capsulatum
CN106834252B (zh) 一种高稳定型MazF突变体及其应用
CN110894218B (zh) 致病疫霉菌分泌的植物免疫激活蛋白scr50及其应用
CN109293751A (zh) 鼠疫耶尔森菌毒力相关蛋白sORF34及其编码基因与应用
US6492510B2 (en) Insertion sequence element derived from Ralstonia solanacearum
CN114807172B (zh) 一种盐响应的玉米功能基因
BR112012005263A2 (pt) promotor modificado
CN114214351A (zh) 一种志贺氏菌多糖表达质粒及其用途
CN112125963B (zh) 可可毛色二孢菌LtALTA1基因及其用途
CN109825531A (zh) 去除炭疽芽胞杆菌中pXO2质粒的方法
CN109825530A (zh) 去除炭疽芽胞杆菌中pXO1质粒的方法
CN111040025B (zh) Yp_2058蛋白在调控鼠疫耶尔森菌毒力中的应用
CN114854778B (zh) 一种岩藻多糖酶基因Fcn1及其应用
CN116947985B (zh) 重组抗菌肽Sub168-1/3R、重组菌株、载体、制备方法及饲料添加剂
CN117757828A (zh) Yp_1843蛋白在调控鼠疫耶尔森菌毒力中的应用
McDonald et al. Distribution and inheritance of a gene cluster encoding a sulfated tyrosine peptide in Xanthomonas spp

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20210611

AD01 Patent right deemed abandoned