CN106834252B - 一种高稳定型MazF突变体及其应用 - Google Patents

一种高稳定型MazF突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高稳定型MazF突变体及其应用。本发明提供了一种蛋白质，为如下1)或2)：1)所示的蛋白为将野生型MazF蛋白氨基酸序列中第48位半胱氨酸置换为丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，得到的蛋白；2)所示的蛋白为将1)所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明了，突变体在野生型序列48位发生氨基酸替换，该突变体在保持了野生型MazF毒蛋白相当的核酸内切酶活性的条件下，有效提高了活性保持时间与结构稳定性。该突变体可用于各类基于mazEF毒素‑抗毒素系统建立的合成生物学模块，在细菌TAs自杀机制研究、抗菌及抗病毒具有广泛应用。

Description

一种高稳定型MazF突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高稳定型MazF突变体及其应用。
背景技术
毒素-抗毒素系统(Toxin-Antitoxin system，TA)是原核生物中的一对基因操纵元件，通常为中间有一个或数个碱基重叠的相邻基因，分别编码一个稳定的毒素蛋白和不稳定的抗毒素，可以在细菌应对各种胁迫条件时诱导其生长抑制或程序性死亡，具有重要的生理调节功能。在典型的TA中，抗毒素基因编码的不稳定抗毒素易被降解，使毒素能够从毒素-抗毒素复合物中得以释放,进而发挥其毒性作用。TA最先发现于低拷贝质粒上，通过“分离后致死”效应维持质粒的稳定传递，随后被发现大量存在于细菌的基因组中。毒素蛋白的作用靶标很多，已经明确的包括破坏细胞膜、抑制细胞壁形成、剪切mRNA及rRNA、抑制核糖体亚基的功能及抑制螺旋酶的活性等。其中，对细胞最重要和常见的毒性表现为对翻译水平的调控，进而导致细菌的生长抑制或死亡。
由于基于TA编码的毒素对细菌的显著抑制活性，对其采用人为干预的方式进行激活，释放毒素进而杀死致病菌的抗菌策略已引起了广泛关注。与传统的抗生素治疗原理不同，该策略利用了细菌特有的TA基因元件，由于未经过临床上的筛选压力，因而在对抗耐药菌方面有独特的优势。此外，这种利用细菌内源毒素的策略不仅对人及其它高等生物的安全性较高，而且不易导致新耐药菌的产生。
根据抗毒素与毒素的特性与作用机制的不同，已经发现的TA可以分为六种类型，其中最为典型的是II型。II型TA的毒素和抗毒素为两个相互作用的蛋白，抗毒素通过与毒素的结合中和毒素的活性。由于抗毒素不稳定，易被ClpXP和Lon蛋白酶降解，得以释放毒素，导致细菌的生长抑制或死亡。
目前，研究最为充分的II型TA是大肠杆菌来源的mazEF基因元件,分别编码毒素MazF和抗毒素MazE。MazF是一种特异剪切ACA位点的RNA内切酶，可以高效剪切mRNA和rRNA。蛋白质晶体结构研究发现，MazE对MazF的中和作用是通过与MazF形成一个六聚体结构(包含2个MazE和4个MazF)实现的。由于其机构和活性的深入解析，MazE/MazF被广泛应用于体内、体外的抑菌模型及相关实验中，对于研究基于TA的新型抗菌(特别是抗耐药菌)策略具有重要的意义。此外，将MazF蛋白的表达和激活与病毒相关的生物信号分子相结合，在抗HIV和HCV病毒方面也得到了应用。
Engelberg-Kulka研究组发现一种由大肠杆菌产生的群感分子EDF(extracellular death factor)能够通过作用于mazEF系统诱导细胞死亡。EDF是一个序列为NNWNN的五肽，由zwf基因的mRNA经过特定剪切及翻译后ClpXP蛋白酶的修饰而形成，通过与MazF关键位点的结合抑制MazE/MazF复合体的形成,从而激活MazF并显著增强其毒性。Nora R等建立了一种以两端修饰的嵌合核酸为底物的MazF体外活性评价方法，该底物中间含有一个可以被MazF剪切的ACA，通过剪切后底物荧光强度的升高来定量评价MazF蛋白的活性。采用类似的方法，可以在体外条件下进行毒素活性、抗毒素与毒素的相互作用、以及可以干扰TA正常作用的小分子筛选(例如EDF类小分子)等研究工作。
尽管毒素蛋白相对于抗毒素较为稳定，但在研究中发现,其自身的稳定性不高、活性保持时间有限，经较短时间的处理或存放会带来显著的活性差异。而毒素蛋白由于自身对宿主菌的毒性，其表达纯化步骤十分复杂，从而使稳定的高活性毒素蛋白的制备成为制约相关研究工作的瓶颈。因此，根据结构生物学信息对毒素蛋白进行点突变和定向改造，构建高稳定性高活性的毒素蛋白具有重要的意义。
发明内容
本发明的构思是：根据大肠杆菌来源的MazF毒素蛋白的结构及其与抗毒素MazE及核酸结合的关键位点，确定候选的突变位点，扩增MazF的系列突变体基因，并通过融合表达和亲和层析获得MazF突变体。通过体外、体内筛选获得活性保持、稳定性大幅提升的MazF突变体，并将其应用于相关的生物医学功能载体中。
本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质，为如下1)或2)：
1)所示的蛋白为将野生型MazF蛋白氨基酸序列中第48位半胱氨酸进行修饰，得到的蛋白；
2)所示的蛋白为将1)所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且由1)衍生的蛋白质。
上述蛋白质中，所述修饰为氨基酸置换。
上述蛋白质中，所述氨基酸置换为将第48位的半胱氨酸置换为丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
上述蛋白质中，所述野生型MazF蛋白来源于大肠杆菌；
或所述野生型MazF蛋白来源于大肠杆菌，其氨基酸序列为序列2。
编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种融合蛋白或蛋白组合物。
本发明提供的融合蛋白或蛋白组合物，包括抗毒素蛋白MazE和权利要求1-5中任一所述蛋白；
或一种融合蛋白或蛋白组合物，包括抗毒素蛋白MazE部分片段和权利要求1-5中任一所述蛋白。
上述的融合蛋白或蛋白组合物中，所述抗毒素蛋白MazE源于大肠杆菌；
或所述抗毒素蛋白MazE部分片段为大肠杆菌MazE蛋白C端部分中包括但不限于可中和MazF毒性的氨基酸序列。
上述蛋白或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在剪切核酸中的应用也是本发明保护的范围；
或上述蛋白在作为核酸内切酶中的应用也是本发明保护的范围；
或上述的蛋白或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备核酸内切酶中的应用也是本发明保护的范围；
或上述蛋白或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在抑制细菌生长或促进细菌死亡中的应用也是本发明保护的范围；
或上述蛋白或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备抑制细菌生长或促进细菌死亡产品中的应用也是本发明保护的范围；
或上述蛋白或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或上述的融合蛋白在筛选干扰毒素-抗毒素系统相互作用的小分子化合物中的应用也是本发明保护的范围；
或上述蛋白或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或上述的融合蛋白在制备筛选干扰毒素-抗毒素系统相互作用的小分子化合物产品中的应用也是本发明保护的范围；
或上述蛋白或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或上述的融合蛋白或蛋白组合物在构建抗性筛选模块、抗菌载体、抗HIV载体、抗HCV载体或抗肿瘤载体中的应用也是本发明保护的范围；
或上述蛋白或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或上述的融合蛋白或蛋白组合物在制备构建抗性筛选模块、抗菌载体、抗HIV载体、抗HCV载体或抗肿瘤载体产品中的应用也是本发明保护的范围；
或本发明还提供一种产品，其活性成分为上述蛋白或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或上述的融合蛋白或蛋白组合物。
上述中，所述核酸为RNA或mRNA或DNA或RNA和DNA的结合体；
或所述产品具有如下1)-4)中至少一种功能：
1)剪切核酸；
2)抑制细菌生长或促进细菌死亡；
3)筛选干扰毒素-抗毒素系统相互作用的小分子化合物；
4)构建抗性筛选模块、抗菌载体、抗HIV载体、抗HCV载体或抗肿瘤载体。
本发明的实验证明，本发明发现一个突变体MazF(C48A)，其较野生型MazF具有更高的稳定性，从而可以降低用药剂量或给药次数，可以应用于生物技术及医药领域，用于mazEF基因抗性筛选模块、筛选MazE/MazF相互作用的干扰分子、抗HIV、抗HCV及抗肿瘤的mazF基因或mazEF操纵子的功能载体构建，以及其它可能的医药用途载体。
附图说明
图1为MazF及突变体MazF表达质粒转染阳性菌株PCR验证；
泳道1为1000bp Marker，泳道2、3为pET28a-mazE--mazF阳性菌，泳道4、5为pET-mazE-mazF(C48A)阳性菌。
图2为MazE-MazF融合蛋白PAGE电泳图。
图3为纯化后MazF突变体PAGE电泳图。
图4为MC4100菌株中mazEF操纵子基因敲除；
A，以pKOV重组质粒的基因敲除方法示意图；B，基因敲除的PCR验证。
图5为过表达野生型和突变体MazF对细胞存活率的影响。
图6为过表达野生型和突变体MazF对细胞悬液OD600的影响。
图7为野生型和突变体MazF对枯草芽孢杆菌总RNA的降解情况。
图8为经不同处理时间后MazF与MazF(C48A)剪切含ACA位点嵌合核酸底物导致的荧光强度变化情况；柱图中的每一个系列，蓝色、红色、绿色三个值对应的分别为蛋白经1、3、7天的低温保存后反应体系的荧光强度。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范畴。
如本文所用，属于MazE、MazF、MazEF在无特殊说明的情况下均指来源于大肠杆菌K12菌株的mazEF操纵子相应的抗毒素、毒素以及抗毒素-毒素复合体。文中突变体的表示方法为：突变前氨基酸+突变位点+突变后氨基酸，例如C48A，是指在N端第48位的半胱氨酸C突变为丙氨酸A。
如本文所用，MazF(C48A)突变体是指通过氨基酸替换所得到。该突变体的活性与野生型相当，但稳定性提高了3倍以上，使得以其为组分的各类反应体系更为有效。与之相应的，mazF(C48A)突变体基因序列，可以应用于构建抗性筛选模块、抗病毒功能载体。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中所使用的载体、菌株、试剂及其来源：
大肠杆菌MC4100(下面也称为MC4100(WT)，CGMCC 1.1560)菌株、枯草芽孢杆菌(CGMCC 1.1630)菌株购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心(CGMCC)，大肠杆菌BW25113(Baba et al,2006)；载体pET28a购自Novagen公司(69864-3CN)，pBAD33购自优宝生物(www.youbio.cn)，pKOV质粒(Link AJ,Phillips D,Church GM.Methods forgenerating precise deletions and insertions in the genome of wild-typeEscherichia coli:application to open reading frame characterization.JBacteriol.1997Oct；179(20):6228-37)；限制性内切酶、Taq DNA聚合酶菌购自Takara公司；Phanta DNA聚合酶购自诺唯赞公司，抗生素购自Sigma公司。DNA合成与测序均由上海生工生物有限公司完成。PCR扩增、酶切、连接、回收、转化、质粒提取等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。
实施例1、MazF突变体的制备
一、表达大肠杆菌野生型MazF的表达载体pBAD33-mazF的构建
1、MC4100(WT)基因组的提取
①MC4100(WT)菌株于LB培养基中，37℃、220rpm过夜培养12-16h；
②取2ml培养菌液，12000rpm离心收集菌体，移液枪吸尽上清培养基；
③向菌体沉淀中加入200μl Buffer GA，涡旋振荡重悬；
④加入20μl蛋白酶K，移液枪吹打混匀，使菌体蛋白彻底裂解；
⑤加入220μl Buffer GB，振荡15s，70℃金属浴10min，溶液澄清透亮；
⑥简短离心，加入220μl无水乙醇，涡旋振荡15s，产生少许絮状沉淀；
⑦简短离心，将上述溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中，加入500μl Buffer GD，12000rpm离心30s，弃废液；
⑧向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液，重复一遍；
⑨12000rpm空管离心2min后，吸附柱于室温敞口放置5-10min；
⑩将吸附柱置于干净的离心管中，加入50-100μl的洗脱液灭菌蒸馏水，室温静置2min，12000rpm离心2min，即得到MC4100(WT)的基因组。
2、扩增大肠杆菌野生型mazF基因
①设计扩增mazF片段的正反向引物；
mazF-F：5’-GAGGTACCATGGTAAGCCGATACGTAC-3’(KpnI)
mazF-R：5’-AACTGCAGCTACCCAATCAGTACGTT-3’(PstI)
②以高保真DNA聚合酶Phanta PCR扩增mazF基因片段；
反应体系(50μl体系)：2×Phanta Max Buffer 25μl，10mM dNTP Mix 1μl，PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，MC4100基因组1μl，mazF-F和mazF-R各5μl，灭菌蒸馏水17μl；
反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃彻底延伸5min。
反应结束后，利用琼脂糖凝胶来回收DNA产物。
(3)用限制性内切酶KpnI/PstI对PCR扩增产物和pBAD33质粒进行双酶切；
反应条件如下：
pBAD33双酶切(100μl体系)：质粒pBAD33(4-5μg)，KpnI/PstI 5μl/5μl，10×Buffer 10μl，灭菌蒸馏水50μl；
mazF片段双酶切(50μl体系)：mazF 20μl(1-2μg)，KpnI/PstI 2μl/2μl，10×Buffer 5μl，灭菌蒸馏水21μl；
37℃水浴反应1-2h。
(4)乙醇沉淀法回收酶切产物
①每100μl酶切体系加400μl灭菌蒸馏水和150μl中酚，充分混匀，12000rpm离心5min；
②小心吸取上层清液至无菌的EP管，加入150μl氯仿充分混匀，12000rpm离心5min；
③用移液枪吸取上清于另一无菌的EP管，加入48μl乙酸钠(3M，pH4.7)混匀，再加入4μl糖原(10mg/ml)混匀，最后加入850μl无水乙醇，充分混匀；
④将混合放入-20℃冰箱静置1h以上，在4℃条件下，12000rpm离心10min，出现白色絮状沉淀；
⑤用700μl 70％乙醇漂洗两遍，12000rpm离心2min，室温下挥干，加入65℃预热的无菌蒸馏水15μl，重新溶解片段，用吸光光度法测量片段浓度和纯度。
(5)T4连接酶连接线性化载体与片段
连接体系设为10μl：质粒片段1μl，mazF片段1μl，10×Buffer 1μl，T4DNA Ligase0.2μl，无菌蒸馏水6.8μl，在22℃条件下连接1-2h，直接进行转化或-20℃保存。
(6)热激转化
①-80℃保存的DH5α感受态细胞于冰上解冻，同时将连接产物在冰上预冷；
②将2μl连接产物加入50μl感受态细胞中混匀，冰浴30min；
③42℃热激80s，立即加入800μl LB或SOC液体培养基，冰浴2-3min；
④37℃、200rpm，复苏转化后的细胞1h后，取300μl菌液涂布LB平板(氯霉素30μg/ml)，37℃倒置培养。
(7)菌落PCR验证
①设置反应体系(10μl体系)：2×Taq Master Mix 5μl，引物对pBAD33F/R各1μl，无菌蒸馏水3μl；
②随机挑选7个克隆于7个反应体系中，并以空质粒pBAD33作为对照；
③PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃彻底延伸5min；
④1％琼脂糖凝胶，110V电泳20min(阳性菌落PCR产物在胶上位置应为300bp左右)。
(8)测序验证
挑取阳性克隆，接至3ml LB培养基氯(霉素30μg/ml)中，37℃温度下220rpm过夜培养，用质粒提取试剂盒提取质粒。
以pBAD33通用引物pBAD-F(引物序列：ATGCCATAGCATTTTTATCC)测定质粒DNA序列，测序结果如下：
该质粒为将序列1所示的野生型MazF基因替换pBAD33载体的KpnI和PstI酶切位点间的片段得到的质粒，命名为pBAD33-mazF，该质粒表达野生型MazF基因。
野生型MazF基因的核苷酸序列为序列1，该基因表达的野生型MazF蛋白的氨基酸序列为序列2。
用Blast序列比对软件比对无误后，继续后续工作。
二、表达突变体MazF(mutant)的表达载体pBAD-mazF(mutant)的构建
根据大肠杆菌来源的MazF毒素蛋白的结构及其与抗毒素MazE及核酸结合的关键位点，确定候选的突变位点：15、29、48、50、79、81、86位氨基酸为可能的定点突变位点，通过overlap PCR反应构建突变体载体。
(1)引物设计
以突变碱基为中心，overlap碱基为19bp，非重叠区域为相同的12bp，引物序列如下：
mazF V15A(F)：5’-GGCGATCTGATTTGGGCTGATTTTGACCC-3’
mazF V15A(R)：5’-GCCCAAATCAGATCGCCCATATCGGGTAC-3’
mazF R29A(F)：5’-CGAGCAAGCTGGACATGCTCCAGCTGTTGT-3’
mazF R29A(R)：5’-GCATGTCCAGCTTGCTCGCTACCTTTTGTC-3’
mazF C48A(F)：5’-CAAAACAGGTATGTGTCTGGCTGTTCCTTGTAC-3’
mazF C48A(R)：5’-GCCAGACACATACCTGTTTTGTTGTTGTACATG-3’
mazF P50A(F)：5’-TATGTGTCTGTGTGTTGCTTGTACAACGC-3’
mazF P50A(R)：5’-CAACACACAGACACATACCTGTTTTGTTG-3’
mazF K79A(F)：5’-CGTTAGCTGATCAGGTAGCAAGTATCGCCTG-3’
mazF K79A(R)：5’-GCTACCTGATCAGCTAACGCTACGCCATCAC-3’
mazF I81A(F)：5’-CTGATCAGGTAAAAAGTGCCGCCTGGCGGGC-3’
mazF I81A(R)：5’-GCACTTTTTACCTGATCAGCTAACGCTACGC-3’
mazF R86A(F)：5’-TATCGCCTGGCGGGCAGCAGGAGCAACGAAG-3’
mazF R86A(R)：5’-GCTGCCCGCCAGGCGATACTTTTTACCTGATC-3’
(2)以上述一构建的pBAD33-mazF质粒为模板，用上述(1)的引物对分别进行PCR反应，得到多个PCR产物。
上述反应的体系(50μl体系)如下：
质粒模板0.5μl(PAGE纯化),引物对F/R 2μl，5×Fast Alteration Buffer 10μl，DNA Polymerase 1.5μl，灭菌蒸馏水34μl；
反应程序：95℃预变性2min；94℃变性20s，55℃退火10s，68℃延伸2.5min，20个循环；68℃彻底延伸5min。
(3)质粒模板pBAD33-mazF的消化降解
向50μl上述获得的每个PCR产物中加入1μl DpnI酶并混匀，37℃反应1.5h，彻底降解模板DNA。
(4)热激转化与阳性克隆筛选
将5μl酶消化产物加入50μl感受态细胞中混匀，冰浴30min以上；随后42℃热激80s，冰浴2.5min，最后向EP管中加入1ml SOC培养基，180rpm、37℃复苏1h。取200μl复苏后的菌液涂布LB平板(氯霉素30μg/ml)。
菌液提取质粒测序验证同上述一。
结果如下：
质粒pBAD33-mazF V15A为将pBAD33-mazF质粒中的野生型基因mazF替换为突变基因mazF V15A得到的质粒，该质粒表达突变蛋白MazF V15A。
突变基因mazF V15A的核苷酸序列为将野生型基因mazF核苷酸序列第44位的T替换为C，得到的序列。
突变蛋白MazF V15A的氨基酸序列为将野生型蛋白MazF氨基酸序列第15位的Val替换为Ala，得到的序列。
质粒pBAD33-mazF R29A为将pBAD33-mazF质粒中的野生型基因mazF替换为突变基因mazF R29A得到的质粒，该质粒表达突变蛋白MazF R29A。
突变基因mazF R29A的核苷酸序列为将野生型基因mazF核苷酸序列第85-86位的CG替换为GC，得到的序列。
突变蛋白MazF R29A的氨基酸序列为将野生型蛋白MazF氨基酸序列第29位的Arg替换为Ala，得到的序列。
质粒pBAD33-mazF C48A为将pBAD33-mazF质粒中的野生型基因mazF替换为突变基因mazF C48A得到的质粒，该质粒表达突变蛋白MazF C48A(序列3)。
突变基因mazF C48A的核苷酸序列为将野生型基因mazF核苷酸序列第142-143位的TG替换为GC，得到的序列。
突变蛋白MazF C48A的氨基酸序列为将野生型蛋白MazF氨基酸序列第48位的Cys替换为Ala，得到的序列(序列4)。
质粒pBAD33-mazF P50A为将pBAD33-mazF质粒中的野生型基因mazF替换为突变基因mazF P50A得到的质粒，该质粒表达突变蛋白MazF P50A。
突变基因mazF P50A的核苷酸序列为将野生型基因mazF核苷酸序列第148位的C替换为G，得到的序列。
突变蛋白MazF P50A的氨基酸序列为将野生型蛋白MazF氨基酸序列第50位的Pro替换为Ala，得到的序列。
质粒pBAD33-mazF K79A为将pBAD33-mazF质粒中的野生型基因mazF替换为突变基因mazF K79A得到的质粒，该质粒表达突变蛋白MazF K79A。
突变基因mazF K79A的核苷酸序列为将野生型基因mazF核苷酸序列第235-236位的AA替换为GC，得到的序列。
突变蛋白MazF K79A的氨基酸序列为将野生型蛋白MazF氨基酸序列第79位的Lys替换为Ala，得到的序列。
质粒pBAD33-mazF I81A为将pBAD33-mazF质粒中的野生型基因mazF替换为突变基因mazFI81A得到的质粒，该质粒表达突变蛋白MazFI81A。
突变基因mazF I81A的核苷酸序列为将野生型基因mazF核苷酸序列第238-239位的AT替换为GC，得到的序列。
突变蛋白MazFI81A的氨基酸序列为将野生型蛋白MazF氨基酸序列第81位的Ile替换为Ala，得到的序列。
质粒pBAD33-mazF R86A为将pBAD33-mazF质粒中的野生型基因mazF替换为突变基因mazFR86A得到的质粒，该质粒表达突变蛋白MazF R86A。
突变基因mazF R86A的核苷酸序列为将野生型基因mazF核苷酸序列第256-257位的AT替换为GC，得到的序列。
突变蛋白MazF R86A的氨基酸序列为将野生型蛋白MazF氨基酸序列第86位的Arg替换为Ala，得到的序列。
实施例2、表达突变体MazF(C48A)的表达载体的构建
本实施例中，根据研究目的的不同，分别构建两套表达载体：一种为单独表达载体pET28a-mazF(his)6及pET28a-mazF(C48A)-(his)6质粒及其菌株BL21(DE3)，主要用于诱导表达毒素，评估毒素的体内活性；另外一种为融合表达载体pET28a-mazE--mazF(his)6及pET28a-mazE--mazF(C48A)-(his)6的构建及其表达菌株BL21(DE3)，主要用于过表达毒素和抗毒素的融合蛋白，进行毒蛋白的分离纯化。
一、pET28a-mazF(his)6及pET28a-mazF(C48A)-(his)6质粒的构建
①引物设计：
mazF-2(F)：5’-TGCCATGGTAAGCCGATACGTAC(NcoI)-3’
mazF-2(R)：5’-CTCGAGCCCAATCAGTACGTTAATT(XhoI)-3’
②以高保真DNA聚合酶Phanta PCR扩增野生型mazF基因或突变体mazF基因；反应体系(50μl体系)：2×Phanta Master Mix 25μl，mazF-2F/R 5μl，pBAD33-mazF或pBAD33-mazF(C48A)质粒模板，灭菌蒸馏水14μl；
反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃彻底延伸5min，4℃保存；
③胶回收mazF及mazF(C48A)片段(DNA纯化回收试剂盒)，同实施例1；
④NcoI/XhoI双酶切目的基因片段及pET28a质粒载体
pET28a质粒双酶切(50μl体系)：质粒pET28a 2.5μg，NcoI/XhoI 3μl/3μl，10×Buffer 5μl，灭菌蒸馏水19μl；mazF或mazF(C48A)片段双酶切(50μl体系)：mazF 10μl(1-1.5μg)，NcoI/XhoI 2μl/2μl，10×Buffer 5μl，灭菌蒸馏水31μl，37℃水浴1-2h；
⑤酶切产物回收，同实施例1；
⑥T4连接酶连接
双酶切片段的连接(10μl体系)：质粒片段1μl，mazF片段0.5μl，10×Buffer1μl，T4DNA Ligase 0.3μl，灭菌蒸馏水7.2μl；反应体系在22℃水浴中反应1h；
⑦热激转化DH5α感受态(同实施例1)，通过菌落PCR筛选阳性菌落，并接菌至3ml新鲜LB(卡那霉素50μg/ml)中过夜培养，采用质粒小提试剂盒提取质粒，采用pET28a质粒的通用测序引物T7(T7引物序列：TAATACGACTCACTATAGGG)确认基因的正确插入。
得到如下两种质粒：
质粒pET28a-mazF(his)6为将基因mazF替换pET28a载体的NcoI和XhoI双酶切位点间得到的质粒，表达融合蛋白MazF(his)6(His标签为载体自带序列)。
融合基因mazF(his)6的核苷酸序列为将野生型基因mazF核苷酸序列的3’末端添加6个his密码子得到的序列。
融合蛋白MazF(his)6的氨基酸序列为将野生型蛋白MazF氨基酸序列的C末端添加6个his得到的序列。
质粒pET28a-mazF(C48A)(his)6为将基因mazF(C48A)替换pET28a载体的NcoI和XhoI双酶切位点间得到的质粒，表达融合蛋白MazF(his)6。
融合基因mazF(C48A)(his)6的核苷酸序列为将突变体基因mazF(C48A)核苷酸序列的3’末端添加6个his密码子得到的序列。
融合蛋白MazF(C48A)(his)6的氨基酸序列为将突变体MazF(C48A)氨基酸序列的C末端添加6个his得到的序列。
采用上述方法制备如下质粒：
质粒pET28a-mazF(V15A)(his)6为将基因mazF(V15A)替换pET28a载体的NcoI和XhoI双酶切位点间得到的质粒，表达融合蛋白MazF(his)6。
融合基因mazF(V15A)(his)6的核苷酸序列为将突变体基因mazF(V15A)核苷酸序列的3’末端添加6个his密码子得到的序列。
融合蛋白MazF(V15A)(his)6的氨基酸序列为将突变体MazF(V15A)氨基酸序列的C末端添加6个his得到的序列。
质粒pET28a-mazF(R29A)(his)6为将基因mazF(R29A)替换pET28a载体的NcoI和XhoI双酶切位点间得到的质粒，表达融合蛋白MazF(his)6。
融合基因mazF(R29A)(his)6的核苷酸序列为将突变体基因mazF(R29A)核苷酸序列的3’末端添加6个his密码子得到的序列。
融合蛋白MazF(R29A)(his)6的氨基酸序列为将突变体MazF(R29A)氨基酸序列的C末端添加6个his得到的序列。
质粒pET28a-mazF(P50A)(his)6为将基因mazF(R29A)替换pET28a载体的NcoI和XhoI双酶切位点间得到的质粒，表达融合蛋白MazF(his)6。
融合基因mazF(P50A)(his)6的核苷酸序列为将突变体基因mazF(R29A)核苷酸序列的3’末端添加6个his密码子得到的序列。
融合蛋白MazF(P50A)(his)6的氨基酸序列为将突变体MazF(R29A)氨基酸序列的C末端添加6个his得到的序列。
质粒pET28a-mazF(K79A)(his)6为将基因mazF(K79A)替换pET28a载体的NcoI和XhoI双酶切位点间得到的质粒，表达融合蛋白MazF(his)6。
融合基因mazF(K79A)(his)6的核苷酸序列为将突变体基因mazF(K79A)核苷酸序列的3’末端添加6个his密码子得到的序列。
融合蛋白MazF(K79A)(his)6的氨基酸序列为将突变体MazF(K79A)氨基酸序列的C末端添加6个his得到的序列。
质粒pET28a-mazF(I81A)(his)6为将基因mazF(I81A)替换pET28a载体的NcoI和XhoI双酶切位点间得到的质粒，表达融合蛋白MazF(his)6。
融合基因mazF(I81A)(his)6的核苷酸序列为将突变体基因mazF(I81A)核苷酸序列的3’末端添加6个his密码子得到的序列。
融合蛋白MazF(I81A)(his)6的氨基酸序列为将突变体MazF(I81A)氨基酸序列的C末端添加6个his得到的序列。
质粒pET28a-mazF(R86A)(his)6为将基因mazF(R86A)替换pET28a载体的NcoI和XhoI双酶切位点间得到的质粒，表达融合蛋白MazF(his)6。
融合基因mazF(R86A)(his)6的核苷酸序列为将突变体基因mazF(R86A)核苷酸序列的3’末端添加6个his密码子得到的序列。
融合蛋白MazF(R86A)(his)6的氨基酸序列为将突变体MazF(R86A)氨基酸序列的C末端添加6个his得到的序列。
二、融合表达载体pET28a-mazE--mazF(his)6及pET28a-mazE--mazF(C48A)-(his)6的构建
载体构建的思路是先将mazE(42-82)基因和mazF基因通过一个linker连接，形成一个融合蛋白，从而中和MazF蛋白的毒性，实现融合蛋白的大量表达；其次，表达完成后，通过酶切反应将两个蛋白分离，纯化得到目的蛋白。
①引物设计
扩增mazE(42-82)引物对A/B及扩增mazF或mazF(C48A)引物对C/D，引物B和C部分序列碱基互补，且两个片段之间有一个Factor Xa酶切位点(linker)。引物序列为：
A：5’-TGCCATGGGCTTAATTATTGAGCCAGTGC-3’(NcoI)
B：5’-GGATCCACGACCTTCAATACCTCCCCAGACTTCCTTATCTTT-3’
C：5’-GGAGGTATTGAAGGTCGTGGATCCGGGATGGTAAGCCGATACGT-3’
D：5’-CTCGAGCCCAATCAGTACGTTAATT-3’(XhoI)
②融合片段mazE--mazF(his)6及mazE--mazF(C48A)-(his)6的构建
1)片段mazE(42-82)+linker
反应体系(50μl体系)：2×Phanta Master Mix 25μl，引物对A/B 5μl，MC4100基因组1μl，灭菌蒸馏水14μl；
反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃彻底延伸5min；
胶回收试剂盒回收147bp引物对A/B扩增片段，同实施例1；
2)片段linker+mazF及linker+mazF(C48A)的构建
反应体系(50μl体系)：2×Phanta Master Mix 25μl，引物对C/D 5μl，pBAD33-mazF或pBAD33-mazF(C48A)1μl，灭菌蒸馏水14μl；
反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃彻底延伸5min；
胶回收试剂盒回收360bp引物对C/D扩增片段或360bp引物对C/D扩增片段，同实施例1；
3)片段连接
反应体系(50μl体系)：2×Phanta Master Mix 25μl，引物对A/D 5μl，引物对A/B扩增片段0.5μl和不同大小的引物对C/D扩增片段0.5μl，灭菌蒸馏水14μl；
反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃彻底延伸5min；
得到扩增片段mazE--linker+mazF和mazE-linker+mazF(C48A)。
③酶切
分别用NcoI和XhoI双酶切扩增片段mazE--linker+mazF、mazE--linker+mazF(C48A)和pET28a载体；回收酶切产物。
④T4DNA连接酶分别将上述mazE--linker+mazF酶切产物、mazE-linker+mazF(C48A)酶切产物与载体酶切产物连接，连接产物分别转化DH5α感受态细胞，在卡那霉素抗性的LB平板上过夜培养，PCR验证阳性克隆(引物为T7，图1，mazF代表mazE--linker+mazF酶切产物与载体的连接产物转化的菌落，mazF(C48A)代表mazE--linker+mazF酶切产物与载体的连接产物转化的菌落)；挑取阳性克隆过夜培养，提取质粒并测序确认表达载体的DNA序列。
得到如下两种质粒质粒pET28a-mazE--mazF(his)6和质粒pET28a-mazE--mazF(C48A)(his)6：
质粒pET28a-mazE--mazF(his)6为将融合基因mazE--mazF替换pET28a载体(载体自带(his)6)的NcoI和XhoI双酶切位点间得到的质粒，表达融合蛋白MazE--MazF(his)6。
融合基因mazE--mazF依次由突变基因mazE-、连接肽编码基因和野生型mazF基因组成；融合基因mazE--mazF(his)6的核苷酸序列为序列5；其中序列5第1-123位为突变基因mazE-，第124-150位为连接肽编码基因，第151-483位为野生型mazF基因。
融合蛋白mazE--mazF(his)6依次由突变体MazE-、连接肽、野生型MazF蛋白和6个his组成；融合蛋白MazE--MazF(his)6的氨基酸序列为序列6；其中序列6第1-41位为突变体MazE-，第42-50位为连接肽，第51-163位为野生型MazF蛋白，第166-171位为6个his。
质粒pET28a-mazE--mazF(C48A)(his)6为将融合基因mazE--mazF(C48A)替换pET28a载体的NcoI和XhoI双酶切位点间得到的质粒，表达融合蛋白MazE--MazF(C48A)(his)6。
融合基因mazE--mazF(C48A)依次由突变基因mazE-、连接肽编码基因和突变基因mazF(C48A)组成；融合基因mazE--mazF(C48A)(his)6的核苷酸序列为序列7；其中序列7第1-123位为突变基因mazE-，第124-150位为连接肽编码基因，第151-483位为突变基因mazF(C48A)。
融合蛋白MazE--MazF(C48A)(his)6依次由突变体MazE-、连接肽、突变蛋白mazF(C48A)和6个his组成；融合蛋白MazE--MazF(his)6的氨基酸序列为序列8；其中序列8第1-41位为突变体MazE-，第42-50位为连接肽，第51-163位为突变蛋白MazF(C48A)，第166-171位为6个his。
采用同样的方法制备表达其他融合蛋白突变体的载体：质粒pET28a-mazE--mazF(V15A)(his)6、质粒pET28a-mazE--mazF(R29A)(his)6、质粒pET28a-mazE--mazF(P50A)(his)6、质粒pET28a-mazE--mazF(K79A)(his)6、质粒pET28a-mazE--mazF(I81A)(his)6、质粒pET28a-mazE--mazF(R86A)(his)6。
实施例3、MazF突变体体内活性分析
一、MazF及突变体MazF(C48A)的体内毒性评价方法一
1、重组菌的构建
1)、MC4100菌株mazEF操纵子的敲除构建MC4100(ΔmazEF)
MC4100(ΔmazEF)为将大肠杆菌MC4100菌株基因组中的mazEF基因敲除，得到重组菌MC4100(ΔmazEF)。
具体构建如下:
根据大肠杆菌基因组序列信息，在mazEF的两侧分别选取500bp左右的同源臂(左右两侧同源臂的序列分别为序列9和10)，通过overlap PCR的方法将同源臂连接，进而克隆进pKOV同源重组质粒。然后将构建好的质粒电转入MC4100感受态细胞中，在LB培养基中30℃复苏1h，随后取100μl涂布LB平板(氯霉素34μg/ml)，43℃过夜培养。挑取生长状态良好的1-5个单克隆，重悬于1ml的LB培养基中，稀释104-105倍，涂布于5％sucrose的LB平板上，30℃过夜筛选。挑取克隆，分别在LB和LB+5％sucrose的平板上，反筛。最后利用PCR验证阳性菌落。基本原理参照图4。图中，A为同源臂设计与pKOV质粒的构建原理示意图；B为基因敲除菌的阳性验证，上图为验证引物的设计方法，下图为分别以AD和BC为引物验证敲除菌(-，泳道3、5，)和野生菌(+，泳道2,、4)的琼脂糖凝胶电泳结果，泳道1为marker。从结果可以明显看到，敲除菌中不再含有mazEF操纵子序列。
2)、MC4100(ΔmazEF)菌株感受态的制备
①MC4100(ΔmazEF)菌株接入新鲜的LB培养基中，37℃、220rpm过夜复苏；
②取过夜复苏菌液0.5ml(1:100)接菌50ml LB液体培养基，至生长对数期(OD600＝0.4)；
③培养菌液转移至无菌离心管中，冰浴10min，4℃、4000rpm离心10min收集菌体；
④弃上层清液，加入30ml预冷的0.1M CaCl2-MgCl2(1:4)缓冲液洗涤，4℃、4000rpm离心10min；
⑤弃上层清液，加入2ml预冷的CaCl2溶液重悬，分装成100μl每管，-80℃保存备用。
3)、重组菌构建
重组菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF为将实施例1构建好的pBAD33-mazF导入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。
重组菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF(C48A)为将实施例1构建好的pBAD33-mazF(C48A)导入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。
重组菌pBAD为将空载体pBAD33导入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。
重组菌MazF为将质粒pBAD33-mazF导入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。
重组菌R29A为将质粒pBAD33-mazFR29A导入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。
重组菌C48A为将质粒pBAD33-mazFC48A导入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。
重组菌K79A为将质粒pBAD33-mazFK79A导入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。
重组菌R86A为将质粒pBAD33-mazFR86A导入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。
上述重组菌的制备方法如下：将构建好的质粒，热激转化导入MC4100(ΔmazEF)后，在1ml无菌LB培养基中复苏1h，取200μl菌液涂布平板(氯霉素30μg/ml)，37℃恒温培养过夜，利用Taq酶PCR验证阳性菌落，得到重组菌。
2、L-阿拉伯糖诱导毒素过表达
重组菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF和重组菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF(C48A)过夜复苏菌液，按照1:100分别转接至6ml M9液体培养基(0.5％甘油和0.2％氨基酸混合物)，50ml试管37℃、220rpm培养，至对数生长期OD600为0.5，加入诱导剂L-阿拉伯糖至质量百分含量为0.1％诱导培养，每隔一段时间(0min、30min、60min、120min……)取样进行菌落计数；
3、细菌菌落计数
分别取重组菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF和重组菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF(C48A)诱导后不同时间培养菌液加入900μl LB液体培养基，吹打混匀，并颠倒彻底混合均匀(10-1倍)；重复上述步骤五次，梯度稀释菌液(10-2-10-6)；取各个稀释浓度的菌液5μl点样LB固体培养基(氯霉素30μg/ml，葡萄糖0.2％)；37℃恒温培养12h后计数生长的菌落。
将未加阿拉伯糖诱导的菌液作为对照，分析毒素过表达不同时间之后存活细菌的数量，数量越多，说明毒素活性越弱。
结果如图5所示，MazF表示重组菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF，C48A表示表示重组菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazFC48A，表明，MazF(C48A)与MazF活性相当，均能抑制大肠杆菌MC4100生长。
将实施例1中的其余突变载体和空载体pBAD33导入的重组菌均按照上述方法实验，结果见图5，可以看出，其它突变体的活性明显低于野生型，即相应点突变对MazF活性具有较大影响。
二、MazF及MazF(C48A)的体内毒性评价方法二
1、重组菌的构建
重组菌mazF为将实施例2构建好的pET28a-mazF(his)6导入BL21(DE3)中得到的菌。
重组菌C48A为将实施例2构建好的pET28a-mazF(C48A)-(his)6导入BL21(DE3)中得到的菌。
重组菌V15A为将实施例2构建好的pET28a-mazF(V15A)-(his)6导入BL21(DE3)中得到的菌。
重组菌R29A为将实施例2构建好的pET28a-mazF(R29A)-(his)6导入BL21(DE3)中得到的菌。
重组菌P50A为将实施例2构建好的pET28a-mazF(P50A)-(his)6导入BL21(DE3)中得到的菌。
重组菌K79A为将实施例2构建好的pET28a-mazF(K79A)-(his)6导入BL21(DE3)中得到的菌。
重组菌I81A为将实施例2构建好的pET28a-mazF(I81A)-(his)6导入BL21(DE3)中得到的菌。
重组菌R86A为将实施例2构建好的pET28a-mazF(R86A)-(his)6导入BL21(DE3)中得到的菌。
2、诱导检测
将上述1的重组菌分别过夜复苏；按照1:100转接于6ml LB培养基，37℃、220rpm培养至对数生长期OD600为0.5，加入诱导剂IPTG至1mM诱导毒素基因表达；每隔一段时间(0h、0.5h、1h、2h、3h、4h)取样测其OD600，绘制生长曲线；
随着毒素的表达，同诱导的空质粒相比，毒素表达导致细菌生长基本停滞。不同突变体表达对细菌生长的影响如图6所示，各突变体的活性存在显著差异，其中，MazF(C48A)与MazF活性相当(250min对应的最下面两个点所在的线)。
实施例4、MazF及MazF(C48A)的表达与纯化
一、重组菌的制备
重组菌BL21(DE3)/pET28a-mazE--mazF(his)6为将实施例2中制备的质粒pET28a-mazE--mazF(his)6导入BL21(DE3)得到的重组菌。
重组菌BL21(DE3)/pET28a-mazE--mazF(C48A)-(his)6为将实施例2中制备的质粒pET28a-mazE--mazF(C48A)-(his)6导入BL21(DE3)得到的重组菌。
二、表达
将重组菌BL21(DE3)/pET28a-mazE--mazF(his)6和重组菌BL21(DE3)/pET28a-mazE--mazF(C48A)-(his)6过夜复苏；按照1:100转接于100ml LB培养基，在500ml三角瓶中37℃、220rpm培养至对数生长期(OD600＝0.5)，加入IPTG至1mM，30℃诱导培养4h；4℃、8000rpm离心10min收集菌体，于-80℃保存备用，实现目的蛋白的表达。
三、MazF(His)6及MazF(C48A)-(His)6亲和层析纯化
①8ml预冷的结合液(50mM Tris-HCl,300mM NaCl,10mM imidazole,pH8.0)分别加入冻存的诱导后重组菌BL21(DE3)/pET28a-mazE--mazF(his)6和诱导后重组菌BL21(DE3)/pET28a-mazE--mazF(C48A)-(his)6菌体中解冻；
②菌体混悬均匀后于10ml烧杯中冰浴，超声破碎30min，超声3s间歇5s；
③4℃、9000rpm离心10min，小心吸取上清，0.22μm滤膜过滤；
④2ml Ni-NTA用结合液平衡后，加入上步过滤之后的上清，4℃结合1h以上；
⑤静置5min，待柱床形成后释放流穿液；
⑥加入漂洗液(50mM Tris-HCl,300mM NaCl,20mM imidazole,pH8.0)漂洗15ml；
⑦加入洗脱液(50mM Tris-HCl,300mM NaCl,250mM imidazole,pH8.0)3ml收集；
⑧洗脱液用孔径为3k的超滤管4℃、4000rpm浓缩，并置换蛋白质结合液，得到融合蛋白mazE--mazF(his)6和融合蛋白mazE--mazF(C48A)-(his)6。图2为MazE—MazF纯化过程的PAGE电泳图，泳道1为蛋白Marker，泳道2为细胞裂解液，泳道3为层析柱流出液，泳道4为第一次漂洗流出液，泳道5为第二次漂洗流出液，泳道6为洗脱得到的蛋白样品。
(3)Factor Xa分别酶切上述融合蛋白，采用亲和层析去除MazE(请提供具体方法)，得到蛋白MazF(his)6和蛋白MazF(C48A)(his)6，结果如图3所示，图中泳道1为蛋白Marker，泳道2为融合蛋白酶切后的混合物，泳道3为纯化的目的蛋白。
每1mg融合蛋白加入0.1mg Factor Xa酶，37℃水浴反应1h，酶切产物重新用Ni-NTA结合，重复上述步骤④-⑦，最后用贮存液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,5％glycerol,pH8.0)置换高盐的溶液，-80℃保存备用。
(4)Tricine SDS-PAGE
①缓冲液配置
a、AB-3：48g丙烯酰胺与1.5g甲叉丙烯酰胺于100ml超纯水中溶解完全；
b、正极液(10×)：1M Tris-HCl pH 8.9；负极液(10×)：1M Tris，1M Tricine，1％SDS，pH8.2；制胶缓冲液(3×)：3M Tris，0.3％SDS，pH8.45；
c、制胶配方如下表所示：
②电泳
正极加入500ml(1×)的正极液，负极加入200ml(1×)负极液，置于冰水浴中，浓缩胶电泳电压为60V，分离胶电泳电压为100V，电泳直至溴酚蓝条带迁移至胶的最下端；
③染色
用考马斯亮蓝染色液(R250 0.1％，异丙醇25％，乙酸10％，蒸馏水65％)染色分离胶1.5-3h；
④脱色
用脱色液(乙醇10％，乙酸5％，蒸馏水85％)脱色3次以上，直至蓝色背景基本去除。
(5)BCA法测量蛋白浓度
①按所需体积配置BCA工作液(A液/B液＝49/1)，混合均匀于37℃水浴预热；
②标准蛋白的配置：配置蛋白终浓度依次为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0(mg/ml)的标准蛋白样，每个样品体积为20μl，加入96孔板中；
③每个样品蛋白取20μl加入96孔板中，每个样品设三个重复孔，振摇均匀；
④向每个标准样和测试样的孔中加入预热的工作液200μl，振摇均匀，37℃恒温反应30min；
⑤用酶标仪检测各个蛋白在562nm波长处的吸光度，以空白组吸光度为对照，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算样品蛋白MazF(his)6及MazF(C48A)(his)6的浓度。
样品蛋白MazF(his)6的浓度为1.5mg/ml，MazF(C48A)(his)6的浓度为0.9mg/ml。
采用同样的方法将质粒pET28a-mazE--mazF(V15A)(his)6、质粒pET28a-mazE--mazF(R29A)(his)6、质粒pET28a-mazE--mazF(P50A)(his)6、质粒pET28a-mazE--mazF(K79A)(his)6、质粒pET28a-mazE--mazF(I81A)(his)6、质粒pET28a-mazE--mazF(R86A)(his)6进行诱导表达和纯化，得到突变蛋白mazF(V15A)、mazF(R29A)、mazF(P50A)、mazF(K79A)、mazF(I81A)和mazF(R86A)。
实施例5、MazF(his)6及MazF(C48A)(his)6的体外活性
1、定性水解总RNA
①枯草芽孢杆菌总RNA提取
首先将葡聚糖凝胶、枪头、1.5ml离心管、TE溶液等进行121℃高温蒸汽灭菌，除去可能存在的RNA酶。取枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1630过夜培养菌液1-1.5ml，4℃、12000rpm离心1min收集菌体；用含有15mg/ml溶解酶的TE溶液100μl重悬菌体，37℃孵育15min；用1mlRLT(Trizol)充分混悬细胞，室温静置5min；加入200μl氯仿，上下颠倒混匀，剧烈涡旋振荡15s，室温放置2min，4℃、12000rpm离心10min；缓慢取出分层后菌液，小心将上层无色水相转移至新EP管，加入等体积预冷的75％乙醇混匀；分两次加入吸附柱，4℃、12000rpm离心30s，弃废液；用700μl缓冲液RW1漂洗柱体一次，4℃、12000rpm离心30s，弃废液；用500μl缓冲液RW2漂洗柱体两次，4℃、12000rpm离心30s，弃废液；4℃、12000rpm离心2min，弃废液，室温晾干5-10min；加入50μl灭菌蒸馏水洗脱，4℃、12000rpm离心2min收集核酸，测其OD260/280为2.0左右，-80℃保存备用。
②MazF及MazF(C48A)水解总RNA
设置反应体系10μl，反应溶液为TE(10mM Tris-HCl，EDTA 1mM，pH8.0)，加入100ngMazF(his)6或MazF(C48A)(his)6蛋白，及2μg RNA底物，不加蛋白的空白组为对照，37℃水浴反应30min，加入上样缓冲液终止反应，1.2％琼脂糖凝胶电泳验证反应产物的完整情况(图7)。
将实施例4制备的其余突变蛋白mazF(V15A)(his)6、mazF(R29A)(his)6、mazF(P50A)(his)6、mazF(K79A)(his)6、mazF(I81A)(his)6和mazF(R86A)(his)6采用上述方法检测，结果如图7所示。图中，C为未加入毒素蛋白的对照组，其余为各个毒素蛋白反应后的结果
可以看出，各个毒素蛋白对RNA降解的程度存在差异，与野生型MazF接近的突变体为C48A和V15A，该结果与细菌生长OD600值的结果相吻合。
2、MazF及MazF(C48A)的体外活性——荧光定量
①底物
5’-6-FAM-AAGTCrGACATCAG-BHQ1-3’为单链DNA/RNA的杂合链，5’端嵌合了荧光素基团6-FAM，3’端嵌合了荧光猝灭基团BHQ-1，rG为核糖核苷酸，ACA为MazF(His)6或MazF(C48A)-(His)6的识别位点，完整的该底物由于荧光基团和荧光猝灭基团相距很近，在荧光素的激发光谱内，并不能产生发射光；而当MazF(His)6或MazF(C48A)-(His)6水解底物，产生5’端和3’端产物，此时荧光素基团与荧光猝灭基团距离拉远，在荧光素的最大激发光下，产生荧光，酶标仪捕捉的信号RFUs反映蛋白的活性。
本研究所用底物委托上海生工生物有限公司代为合成。
②反应体系
反应总体积为100μl，反应溶液为TE(10mM Tris-HCl，EDTA 1mM，pH8.0)，加入1μg实施例4制备的MazF(his)6或MazF(C48A)(his)6蛋白及0.5μM底物，不加蛋白的空白组作为对照；
③反应条件
在96孔板(costar black plate)中进行，酶标仪恒温25℃，激发光为485nm，发射光530nm，无截留，体系混合均匀后于酶标仪中暗光检测60min，检测间隔1min；
④定量计算
反应前3min的3个检测值作为初始值，最后3min的3个检测值最为最终值，两者的荧光值之差作为MazF(his)6或MazF(C48A)(his)6蛋白的60min酶活。
结果表明，两个蛋白均带来体系荧光强度的显著增长。
实施例6、MazF(C48A)(his)6与野生型MazF(his)6稳定性比较
将100μl实施例4制备的MazF(C48A)(his)6与野生型MazF(his)6的蛋白贮存液(TE保存，浓度0.1mg/ml)，于4℃条件下保存。
为了检测不同时间酶的活性，分别取第保存1、3、7天的蛋白样品进行荧光定量检测，每次所用的蛋白质量为1μg，荧光素嵌合底物为0.5μM，比较其相对荧光强度变化，从而确定各个蛋白的稳定性，具体如下：
①荧光素嵌合底物
5’-6-FAM-AAGTCrGACATCAG-BHQ1-3’为单链DNA/RNA的杂合链，5’端嵌合了荧光素基团6-FAM，3’端嵌合了荧光猝灭基团BHQ-1，rG为核糖核苷酸，ACA为MazF(His)6或MazF(C48A)-(His)6的识别位点，完整的该底物由于荧光基团和荧光猝灭基团相距很近，在荧光素的激发光谱内，并不能产生发射光；而当MazF(His)6或MazF(C48A)-(His)6水解底物，产生5’端和3’端产物，此时荧光素基团与荧光猝灭基团距离拉远，在荧光素的最大激发光下，产生荧光，酶标仪捕捉的信号RFUs反映蛋白的活性。
本研究所用底物委托上海生工生物有限公司代为合成。
②反应体系
反应总体积为100μl，反应溶液为TE(10mM Tris-HCl，EDTA 1mM，pH8.0)，加入1μgMazF(his)6或MazF(C48A)(his)6蛋白及0.5μM荧光素嵌合底物，不加蛋白的空白组作为对照；
③反应条件
在96孔板(costar black plate)中进行，酶标仪恒温25℃，激发光为485nm，发射光530nm，无截留，体系混合均匀后于酶标仪中暗光检测60min，检测间隔1min；
④定量计算
反应前3min的3个检测值作为初始值，最后3min的3个检测值最为最终值，两者的荧光值之差作为MazF(his)6及MazF(C48A)(his)6的60min酶活。
结果如附图8所示，图中每个柱形图从左到右为蓝色、红色、绿色，分别表示在保存1、3、7天之后的相同反应体系的荧光强度。在1天时，C48A活性与MazF基本相当，但随着时间的延长，野生型活性迅速下降，而mazF(C48A)的活性则得到较好保持。7天后样品活性，mazF(C48A)和MazF的值分别为174.8和54.9，本发明突变体稳定性较野生型提高三倍以上。
将上述制备的突变蛋白mazF(V15A)、mazF(R29A)、mazF(P50A)、mazF(K79A)、mazF(I81A)和mazF(R86A)按照上述检测，均没有mazF(C48A)稳定性高。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 中国药科大学
<120> 一种高稳定型MazF突变体及其应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 336
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 1
atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60
aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120
aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc 180
gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt 240
atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa 300
ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt gggtag 336
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp
1 5 10 15
Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val
20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys
35 40 45
Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu
50 55 60
Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val Lys Ser
65 70 75 80
Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro
85 90 95
Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile Gly
100 105 110
<210> 3
<211> 336
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 3
atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60
aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120
aacaaaacag gtatgtgtct ggctgttcct tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc 180
gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt 240
atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa 300
ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt gggtag 336
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 4
Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp
1 5 10 15
Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val
20 25 30
Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Ala
35 40 45
Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu
50 55 60
Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val Lys Ser
65 70 75 80
Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro
85 90 95
Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile Gly
100 105 110
<210> 5
<211> 489
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 5
ttaattattg agccagtgcg taaagagccc gtatttacgc ttgctgaact ggtcaacgac 60
atcacgccgg aaaacctcca cgagaatatc gactggggag agccgaaaga taaggaagtc 120
tggggaggta ttgaaggtcg tggatccggg atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc 180
gatctgattt gggttgattt tgacccgaca aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca 240
gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct 300
tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat 360
ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag 420
aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt 480
gggctcgag 489
<210> 6
<211> 169
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 6
Leu Ile Ile Glu Pro Val Arg Lys Glu Pro Val Phe Thr Leu Ala Glu
1 5 10 15
Leu Val Asn Asp Ile Thr Pro Glu Asn Leu His Glu Asn Ile Asp Trp
20 25 30
Gly Glu Pro Lys Asp Lys Glu Val Trp Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly
35 40 45
Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp
50 55 60
Val Asp Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro
65 70 75 80
Ala Val Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys
85 90 95
Leu Cys Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val
100 105 110
Val Leu Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val
115 120 125
Lys Ser Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val
130 135 140
Ala Pro Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile
145 150 155 160
Gly Leu Glu His His His His His His
165
<210> 7
<211> 489
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 7
ttaattattg agccagtgcg taaagagccc gtatttacgc ttgctgaact ggtcaacgac 60
atcacgccgg aaaacctcca cgagaatatc gactggggag agccgaaaga taaggaagtc 120
tggggaggta ttgaaggtcg tggatccggg atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc 180
gatctgattt gggttgattt tgacccgaca aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca 240
gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac aacaaaacag gtatgtgtct ggctgttcct 300
tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat 360
ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag 420
aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt 480
gggctcgag 489
<210> 8
<211> 169
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 8
Leu Ile Ile Glu Pro Val Arg Lys Glu Pro Val Phe Thr Leu Ala Glu
1 5 10 15
Leu Val Asn Asp Ile Thr Pro Glu Asn Leu His Glu Asn Ile Asp Trp
20 25 30
Gly Glu Pro Lys Asp Lys Glu Val Trp Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly
35 40 45
Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp
50 55 60
Val Asp Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro
65 70 75 80
Ala Val Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys
85 90 95
Leu Ala Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val
100 105 110
Val Leu Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val
115 120 125
Lys Ser Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val
130 135 140
Ala Pro Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile
145 150 155 160
Gly Leu Glu His His His His His His
165
<210> 9
<211> 603
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 9
tacatcacct cgtcgatctc ttcgtagact ttatcgacta ccggaccaag cgtcgtccaa 60
tcgaagccaa cgttggcgca acgtttctgg attttttgcg cacgcattaa agccggtaaa 120
ctacgaggaa tatcgtccag cgccgaatgc tgcgctttct gcgcgcgctc ttcggttttg 180
atttgctccc aacgggcaag cacttcacta ctgttttcgg cagaactatc agcaaaaaca 240
tgcggatggc gacgctctaa tttatcgcta atagcagcgc aaatatcatt aaagtcaaag 300
cgcccttctt cctgagccat ttgcgcgtaa aacaccacct ggaatagcag atcgcccagt 360
tcaccgcgaa gatcgtcaaa atcttcacgg gcgatggcgt ccagcacttc gtaggtttct 420
tcaagggtgt aaggcgcaat ggtggcaaat gtctgctctt tatcccacgg gcagccgttt 480
tccggatcgc gcaggcgctg cataatagtg agcaaacggt cgatttgatt cattgaattg 540
tcctgaaaat tgcgggtctg tcaggtggaa acctgtgacc agaatagaag tgagttagta 600
aca 603
<210> 10
<211> 520
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 10
cataaccctt tcctcaaacc gctatcatat gtagatacag tatatatcaa tctacattgt 60
agatacgagc aaatttcggc ctaactcccg tgcaaccgac gcgcgtcgat aacatccggc 120
acctggttga gtttacccag cacgcgcccc agcacttgca ggttgtaaat ctcaatggtc 180
atgtcgatgg tcgccagttg ctgtttggtg tcgctacggc tggcaacgcc aagcacgttc 240
accttctcgt tggcgagaat ggtcgtgata tcacgtaaca acccactacg atcattagct 300
accacgcgga ccaccagcga atatccggcg gagtagctct caccccatac cgcgtcaaca 360
atgcgttctg gcgcatggga gcgcagttcc gccagttgtt cgcaatcggc gcggtgtact 420
gaaataccgc gcccctgggt aatgaagccg acaatctcat ctccaggaat cggctggcag 480
cagcgcgcga tgtggtgcat caggttgcca acaccttcga 520

Claims (9)

1.一种蛋白质，为将野生型MazF蛋白氨基酸序列中第48位半胱氨酸进行修饰，得到的蛋白；
所述野生型MazF蛋白来源于大肠杆菌，其氨基酸序列为序列2；
所述修饰为氨基酸置换；
所述氨基酸置换为将第48位的半胱氨酸置换为丙氨酸。
2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.含有权利要求2所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
4.一种融合蛋白或蛋白组合物，包括抗毒素蛋白MazE和权利要求1所述蛋白；
或一种融合蛋白或蛋白组合物，包括抗毒素蛋白MazE部分片段和权利要求1所述蛋白。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白或蛋白组合物，其特征在于：
所述抗毒素蛋白MazE源于大肠杆菌；
或所述抗毒素蛋白MazE部分片段为大肠杆菌MazE蛋白C端部分中可中和MazF毒性的氨基酸序列。
6.权利要求1所述蛋白或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在剪切核酸中的应用；
或权利要求1所述蛋白在作为核酸内切酶中的应用；
或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备核酸内切酶中的应用；
或权利要求1所述蛋白或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备抑制细菌生长或促进细菌死亡产品中的应用；
或权利要求1所述蛋白或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或权利要求4或5所述的融合蛋白或蛋白组合物在筛选干扰毒素-抗毒素系统相互作用的小分子化合物中的应用；
或权利要求1所述蛋白或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或权利要求4或5所述的融合蛋白或蛋白组合物在制备筛选干扰毒素-抗毒素系统相互作用的小分子化合物产品中的应用；
或权利要求1所述蛋白或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或权利要求4或5所述的融合蛋白或蛋白组合物在构建抗性筛选模块、抗菌载体、抗HIV载体、抗HCV载体或抗肿瘤载体中的应用；
或权利要求1所述蛋白或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或权利要求4或5所述的融合蛋白或蛋白组合物在制备构建抗性筛选模块、抗菌载体、抗HIV载体、抗HCV载体或抗肿瘤载体产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述核酸为RNA或mRNA或DNA或RNA和DNA的结合体；
或所述产品具有如下1）-4）中至少一种功能：
1）剪切核酸；
2）抑制细菌生长或促进细菌死亡；
3）筛选干扰毒素-抗毒素系统相互作用的小分子化合物；
4）构建抗性筛选模块、抗菌载体、抗HIV载体、抗HCV载体或抗肿瘤载体。
8.一种产品，其活性成分为权利要求1所述蛋白或权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或权利要求4或5所述的融合蛋白或蛋白组合物。
9.根据权利要求8所述产品，其特征在于：所述产品具有如下1）-4）中至少一种功能：
1）剪切核酸；
2）抑制细菌生长或促进细菌死亡；
3）筛选干扰毒素-抗毒素系统相互作用的小分子化合物；
4）构建抗性筛选模块、抗菌载体、抗HIV载体、抗HCV载体或抗肿瘤载体。
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