CN109182366A - 热敏型尿嘧啶-dna糖基化酶的制备方法 - Google Patents

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CN109182366A CN201811169648.6A CN201811169648A CN109182366A CN 109182366 A CN109182366 A CN 109182366A CN 201811169648 A CN201811169648 A CN 201811169648A CN 109182366 A CN109182366 A CN 109182366A
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章瑞程
杨浩
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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，一种热敏型尿嘧啶‑DNA糖基化酶的制备方法，包括：将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列连入PTYB11载体得到表达载体，转入大肠杆菌进行表达纯化。本发明使用PTYB11载体作为表达载体，并对密码子进行了优化，获得大量的可溶性蛋白。PTYB11载体带有CBD标签，可使得后续的纯化过程变得更为容易。

Description

热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法。
背景技术
热敏尿嘧啶-DNA糖基化酶(热敏UDG酶)的作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，有缺失碱基的DNA链在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。
热敏UDG酶在PCR防污染体系中具有非常重要的作用，因为PCR反应灵敏度高，环境中即使存在很微量的核酸也能被迅速扩增最后导致假阳性。为了防止模板被污染，目前比较好的方法是在PCR反应体系中加入UDG酶，用dUTP取代dTTP，这样即使污染DNA被扩增，所扩增出来的产物是含有dU的DNA链可以被UDG酶所特异性地消化掉，但UDG酶不会消化不含dUTP的DNA链。所以说，通过这种方式，第一轮产生的带有dUTP的PCR产物会被UDG酶降解，并在随后PCR变性这步的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，不会作为第二轮扩增的模板对PCR产生假阳性，从而保证扩增结果的特异性，准确性，同时在变性这一步，热敏UDG酶也会被灭活掉不会影响后续的反应。
目前热敏UDG酶主要来源于对非热敏UDG酶的突变，还有来源于极端嗜冷生物(海洋微生物、海洋鱼类等)。在非热敏UDG酶基础上做突变可能会导致灭活不完全的问题所以不好用。而来源于极端嗜冷生物的基因由于是热敏感的，在表达和纯化过程中可能会导致酶活性的下降和酶活不稳定等问题，而且如果序列来源于哺乳动物则非常难表达出有活性的蛋白，因为大部分都是包涵体的形式存在。所以目前对于热敏UDG酶的序列选择、克隆构建和后续的表达纯化是目前的难题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
发明人通过选择合适的表达环境，得以表达出活性好，纯度高的热敏UDG酶。
具体的，本发明涉及一种热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，包括：
将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列连入PTYB11载体得到表达载体，转入大肠杆菌进行表达纯化。
SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列能够表达SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为Oryzias latipes来源的UDG酶，其具有优秀的消化稳定性，并且热敏特性更好，更易被灭活。
由于热敏蛋白和来源于真核动物的蛋白在原核表达系统中一般是以包涵体的形式存在，本发明使用PTYB11载体作为表达载体，并对密码子进行了优化，获得大量的可溶性蛋白。PTYB11载体带有CBD标签，可使得后续的纯化过程变得更为容易。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中UDG-B三次消化实验结果；
图2为本发明一个实施例中UDG-M三次消化实验结果；
图3为本发明一个实施例中UDG-O三次消化实验结果。
具体实施方式
本发明涉及一种热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，包括：
将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列连入PTYB11载体得到表达载体，转入大肠杆菌进行表达纯化。
在一些实施方式中，以SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为模板，SEQ ID NO：11和12所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，将扩增产物连入PTYB11载体。
在一些实施方式中，所述PCR扩增时的退火温度为56℃～60℃，退火温度还可以选择56℃、57℃、58℃或59℃。
在一些实施方式中，所述大肠杆菌为ER2566菌株。
在一些实施方式中，所述表达的方法包括：
当培养所述大肠杆菌的OD值达到0.4～0.8时进行诱导，诱导温度为23℃～27℃，诱导时间为3.5h～4.5h；诱导完成后在表达培养基中进行蛋白表达；
在一些实施方式中，所述表达的方法包括：
当培养所述大肠杆菌的OD值达到0.6时进行诱导，诱导温度为25℃，诱导时间为4.0h；诱导完成后在表达培养基中进行蛋白表达。
在一些实施方式中，所述表达的条件包括：
将诱导后的大肠杆菌于14℃～16℃进行表达，表达时间为11h～13h。
在一些实施方式中，所述表达所用的培养基为LB培养基。
在一些实施方式中，所述纯化的方法包括：
依次使用Chitin柱、阴离子交换层析Q柱、阴离子交换SP柱对目的蛋白进行处理。
在一些实施方式中，所述PTYB11载体带有CBD标签，使用Chitin柱对目的蛋白进行处理时，将带有CBD标签的目的蛋白与Chitin柱结合，随后将目的蛋白与CBD标签酶切断开，收集酶切后的洗脱液。
热敏UDG酶在纯化过程中不稳定容易受到温度的影响，本发明使用亲和层析和离子交换层析纯化出的目的蛋白纯度高达95％以上，纯化工艺简单且纯化周期短，这大大降低了生产成本并且有利于维持蛋白的稳定性。
在一些实施方式中，将带有CBD标签的目的蛋白与Chitin柱结合时所用结合缓冲液成分包括：
40mM～60mM Tris-HCl，250mM～350mM NaCl，8％～12％甘油，pH＝7.8～8.2；
在一些实施方式中，将带有CBD标签的目的蛋白与Chitin柱结合时所用结合缓冲液成分包括：
50mM Tris-HCl，300mM NaCl，10％甘油，pH＝8.0。
在一些实施方式中，所述酶切所用的酶切缓冲液成分包括：
40mM～60mM Tris-HCl，40mM～60mM DTT，pH＝7.8～8.2；
在一些实施方式中，所述酶切所用的酶切缓冲液成分包括：
50mM Tris-HCl，50mM DTT，pH＝8.0。、
在一些实施方式中，所述酶切在2℃～10℃的环境中进行，还可以选择4℃、6℃或8℃；
在一些实施方式中，所示酶切的时间为6h～24h，还可以选择8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h。
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析Q柱、阴离子交换SP柱对目的蛋白进行处理在2℃～10℃的环境中进行，还可以选择4℃、6℃或8℃。
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析Q柱的结合缓冲液成分包括：
15mM～25mM Tris-HCl，8％～12％甘油，0.8mM～1.2mM EDTA，0.8mM～1.2mM DTT，pH＝7.8～8.2；
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析Q柱的结合缓冲液成分包括：
20mM Tris-HCl，10％甘油，1.0mM EDTA，1.0mM DTT，pH＝8.0。
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析Q柱的洗脱缓冲液成分包括：
15mM～25mM Tris-HCl，8％～12％甘油，0.8mM～1.2mM EDTA，0.8mM～1.2mM DTT，0.8M～1.2M NaCl，pH＝7.8～8.2；
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析Q柱的洗脱缓冲液成分包括：
20mM Tris-HCl，10％甘油，1.0mM EDTA，1.0mM DTT，1.0M NaCl，pH＝8.0。
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析SP柱的结合缓冲液成分包括：
15mM～25mM PB，8％～12％甘油，0.8mM～1.2mM EDTA，0.8mM～1.2mM DTT，pH＝5.8～6.2；
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析SP柱的结合缓冲液成分包括：
20mM PB，10％甘油，1.0mM EDTA，1.0mM DTT，pH＝6.0。
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析SP柱的洗脱缓冲液成分包括：
15mM～25mM PB，8％～12％甘油，0.8mM～1.2mM EDTA，0.8mM～1.2mM DTT，0.8M～1.2M NaCl，pH＝5.8～6.2；
在一些实施方式中，所述阴离子交换层析SP柱的结合缓冲液成分包括：
20mM PB，10％甘油，1.0mM EDTA，1.0mM DTT，pH＝6.0。
本发明使用PTYB11载体作为表达载体，并优化了表达条件，获得大量的可溶性蛋白。本发明所优化的纯化工艺在低温的条件下操作，且工艺简单、周期短，大大降低了生产成本和有利于蛋白的稳定。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 UDG的克隆构建
1.UDG-B来源于Bacillus sp.HJ171的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，使用大肠杆菌作为表达菌株需要对密码子进行优化，优化后的DNA序列如SEQ ID NO：4所示，克隆构建过程如下：
引物设计：
上游引物：SEQ ID NO：5
下游引物：SEQ ID NO：6
以生工合成的序列SEQ ID NO：4为模板进行PCR扩增，94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃充分延伸10min。
表达载体的获得：以合成序列为模板进行全长扩增后，胶回收700bp左右的片段、酶切(SalI/EcoRI)后连接载体PTYB11(购买于NEW England Biolabs)，转化ER2566并涂板，37℃培养过夜。
阳性克隆的筛选：挑取单克隆并摇菌、诱导表达，筛选有表达的单克隆、提取质粒，并送测序，选取测序正确的克隆进行后续的表达和纯化。
2.UDG-M来源于Micrococcus luteus的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，使用大肠杆菌作为表达菌株需要对密码子进行优化，优化后的DNA序列如SEQ ID NO：8所示，克隆构建过程如下：
引物设计：
上游引物：SEQ ID NO：9
下游引物：SEQ ID NO：10
以生工合成的序列SEQ ID NO：8为模板进行PCR扩增，94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃充分延伸10min。
表达载体的获得：以合成序列为模板进行全长扩增后，胶回收650bp左右的片段、酶切(SalI/EcoRI)后连接载体PTYB11(购买于NEW England Biolabs)，转化ER2566并涂板，37℃培养过夜。
阳性克隆的筛选：挑取单克隆并摇菌、诱导表达，筛选有表达的单克隆、提取质粒，并送测序，选取测序正确的克隆进行后续的表达和纯化。
3、UDG-O来源于Oryzias latipes的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，使用大肠杆菌作为表达菌株需要对密码子进行优化，优化后的DNA序列如SEQ ID NO：2中显示，克隆构建过程如下：
引物设计：
上游引物：SEQ ID NO：11
下游引物：SEQ ID NO：12
以生工合成的序列SEQ ID NO：2为模板进行PCR扩增，94℃变性10min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃充分延伸10min。
表达载体的获得：以合成序列为模板进行全长扩增后，胶回收900bp左右的片段、酶切(SalI/EcoRI)后连接载体PTYB11(购买于NEW England Biolabs)，转化ER2566并涂板，37℃培养过夜。
阳性克隆的筛选：挑取单克隆并摇菌、诱导表达，筛选有表达的单克隆、提取质粒，并送测序，选取测序正确的克隆进行后续的表达和纯化。
实施例2 UDG表达条件优化
1.培养基优化：
三组重组热敏UDG酶分别在大肠杆菌中表达，使用ER2566菌株。取100ul甘油菌接菌至150ml LB培养基中，37℃200rpm活化6h后OD600值达到0.3，进行转接，取10ml上述种子菌液分别转接至500ml的LB培养基、TB培养基和自诱导培养基中进行培养，当37℃200rpm培养至OD值达到0.6，开始进行诱导，诱导温度设置为25℃，诱导时间为4h。
结果表明自诱导培养基中无目的蛋白表达，说明自诱导培养基并不适合作为表达培养基。而LB培养基和TB培养基均有表达，TB培养基的表达量比LB培养基的要大，但裂解后的现象显示TB培养基所有条件裂解后是浑浊的，LB培养基较为澄清的，说明LB培养基诱导表达出来的目的蛋白性质更稳定。所以选择LB培养基作为最终的表达培养基。
2.表达温度和时间的优化：
选定LB培养基后做表达温度和表达时间的优化，表达温度设置为15℃、20℃和25℃。表达时间设置为4h、8h、12h。结果显示所有条件下均有表达，随着表达温度的提高和表达时间的延长，表达量呈上升的趋势。但裂解后的现象显示15℃条件下的裂解液最为澄清，为了提高得率，采用12h作为表达时间。所以选择15℃，12h作为最终的表达条件。
实施例3纯化工艺优化
亲和层析：因为pTYB11载体带有CBD标签，所以第一步纯化使用Chitin柱(购买于NEW England Biolabs)。结合缓冲液为：50mM Tris-HCl，300mM NaCl，10％甘油，pH8.0。当目的蛋白结合在柱子上后使用2CV的酶切缓冲液充满柱子，酶切缓冲液为：50mM Tris-HCl，50mM DTT，pH8.0。4℃过夜酶切后再使用酶切缓冲液对目的蛋白进行洗脱，不带标签的UDG酶会被洗脱下来，这样就能得到纯度较高的UDG酶。
2、离子交换层析：根据三个序列的UDG的等电点如下表所示，采用不同的离子交换层析。
(1)UDG-B和UDG-M使用阳离子交换层析SP柱，结合缓冲液为：20mM PB，10％甘油，1mM EDTA，1mM DTT，pH6.0，洗脱缓冲液在结合缓冲液的基础上加入1M NaCl。
(2)UDG-O使用阴离子交换层析Q柱，走穿透模式，目的蛋白上样时候穿出，而杂蛋白挂柱。结合缓冲液为：20mM Tris-HCl，10％甘油，1mM EDTA，1mM DTT，pH8.0,洗脱缓冲液在结合缓冲液的基础上加入1M NaCl。为了浓缩目的蛋白，UDG-O在过完Q柱后上SP柱进行浓缩，结合缓冲液为：20mM PB，10％甘油，1mM EDTA，1mM DTT，pH6.0,洗脱缓冲液在结合缓冲液的基础上加入1M NaCl。能得到纯度95％以上的目的蛋白。
离子交换层析过程也在4℃下进行。
表1：3种UDG酶蛋白质信息
蛋白信息 等电点 分子量
UDG-B 5.8 27KD
UDG-M 7.15 24KD
UDG-O 9.15 33KD
实施例4热敏UDG酶活性检测
UDG-B、UDG-M和UDG-O分别进行活性检测，在模板为含U碱基DNA的荧光定量PCR体系中，加入梯度稀释的热敏UDG酶对U模板进行消化反应，形成模板梯度，在下一步的热启动反应中，热敏UDG酶被灭活，聚合酶对余下的模板进行扩增，形成梯度曲线，根据梯度曲线对待检样品进行酶活标定。结果表明，三个热敏UDG酶均有活性，能够消化含U的模板，但经过三次重复实验，结果表明酶UDG-B和UDG-M消化不稳定，且UDG-B的活性较低。而UDG-O消化稳定，三次重复曲线较为一致，UDG-O的活性较UDG-B和UDG-M都高。三次消化实验的结果如图1～3所示：
实施例5热敏UDG酶活性检测
UDG-B、UDG-M和UDG-O分别进行灭活实验，将1U热敏UDG酶使用92℃10min灭活后检测活性，结果显示UDG-B和UDG-M的荧光曲线均略有抬起，说明灭活不完全，而UDG-O的荧光曲线无明显抬起，说明灭活完全。结论是UDG-O更适合应用于一步法体系。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东菲鹏生物有限公司
<120> 热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 297
<212> PRT
<213> Oryzias latipes
<400> 1
Met Ile Gly Gln Lys Thr Ile Asn Ser Phe Phe Ser Pro Val Ser Lys
1 5 10 15
Lys Arg Leu Ser Gln Glu Thr Asn Lys Thr Thr Glu Asp Asp Ile Glu
20 25 30
Pro Lys Lys Pro Lys Ile Ala Ala Val Asp Pro Glu Pro Gln Ser Ser
35 40 45
Pro Leu Ser Pro Glu Gln Leu Asp Lys Ile Ala Arg Asn Lys Lys Ala
50 55 60
Ala Leu Glu Lys Leu Ala Ser Gly Leu Thr Pro Gln Gly Phe Ser Glu
65 70 75 80
Ser Trp Arg Arg Glu Leu Trp Ser Glu Phe Ser Lys Pro Tyr Phe Lys
85 90 95
Asp Leu Thr Lys Phe Val Ser Asp Glu Arg Lys Arg Gly Thr Val Tyr
100 105 110
Pro Pro Ala Glu Gln Ile Phe Thr Trp Thr Gln Met Cys Asp Ile Arg
115 120 125
Asp Val Lys Val Val Ile Leu Gly Gln Asp Pro Tyr His Gly Pro Gly
130 135 140
Gln Ala His Gly Leu Cys Phe Ser Val Lys Arg Pro Ile Ser Pro Pro
145 150 155 160
Pro Ser Leu Glu Asn Met Tyr Lys Glu Leu Val Ser Asp Ile Glu Gly
165 170 175
Phe Lys His Pro Gly His Gly Asp Leu Thr Gly Trp Ala Gln Gln Gly
180 185 190
Val Leu Leu Leu Asn Ala Val Leu Thr Val Arg Ala His Gln Ala Asn
195 200 205
Ser His Lys Asp Lys Gly Trp Glu Val Phe Thr Asp Ala Val Val Gln
210 215 220
Trp Leu Ser Asn Asn Leu Gln Gly Leu Val Phe Leu Leu Trp Gly Ser
225 230 235 240
Tyr Ala Gln Lys Lys Gly Ser Ala Ile Asn Arg Lys His His His Val
245 250 255
Leu Gln Ala Val His Pro Ser Pro Leu Ser Ala His Arg Gly Phe Phe
260 265 270
Gly Cys Lys His Phe Ser Lys Ala Asn Glu Leu Leu Lys Lys Ser Gly
275 280 285
Lys Ser Pro Ile Asp Trp Lys Ala Leu
290 295
<210> 2
<211> 891
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgatcggtc agaaaaccat caactctttc ttctctccgg tttctaaaaa acgtctgtct 60
caggaaacca acaaaaccac cgaagacgac atcgaaccga aaaaaccgaa aatcgctgct 120
gttgacccgg aaccgcagtc ttctccgctg tctccggaac agctggacaa aatcgctcgt 180
aacaaaaaag ctgctctgga aaaactggct tctggtctga ccccgcaggg tttctctgaa 240
tcttggcgtc gtgaactgtg gtctgaattt tctaaaccgt acttcaaaga cctgaccaaa 300
ttcgtttctg acgaacgtaa acgtggtacc gtttacccgc cggctgaaca gatcttcacc 360
tggacccaga tgtgcgacat ccgtgacgtt aaagttgtta tcctgggtca ggacccgtac 420
cacggtccgg gtcaggctca cggtctgtgc ttctctgtta aacgtccgat ctctccgccg 480
ccgtctctgg aaaacatgta caaagaactg gtttctgaca tcgaaggttt caaacacccg 540
ggtcacggtg acctgaccgg ttgggctcag cagggtgttc tgctgctgaa cgctgttctg 600
accgttcgtg ctcaccaggc taactctcac aaagacaaag gttgggaagt tttcaccgac 660
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<211> 245
<212> PRT
<213> Bacillus sp. HJ171
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225 230 235 240
Trp Gln Leu Pro Gln
245
<210> 4
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggaactgt tcgacgaaca gaccccgaaa tctccggctc agaaacaggc tatcctggac 60
aacgttcgtc tgccggaaga ctggaaaaaa gctctggcta acgaactgac ctctaacaac 120
atggacgacc tgcgtgcttt cctgaaagaa gcttaccagt ctgaaaactc tatctacccg 180
ccggctccgc tgatcttcaa cgctctgaac ctgaccccgc tgtctcaggt taaagttgtt 240
atcctgggtc aggacccgta ccacggtccg ggtcaggcga tgggtctgag cttctctgtt 300
ccgaaggcta tcccgaaacc gccgtctctg aacaacctgc tgaaagaaat ggcttctgac 360
gttggtatcg ctccgtctaa acacggtgac ctgacctact gggctcagca gggtgttctg 420
ctgctgaact cttctctgac cgttcgtgaa tctgaaccga actctcacca gaacaacggt 480
tgggaacagt tcaccgacgc tgttatcgac gttgttaacg aacagaccga acacaccgtt 540
ttcatcctgt ggggttctaa agctcagaaa aaaggtaaat acatcaacac cgacaaacac 600
ctgatcctga ccgctgttca cccgtctccg ctggctgcta accgtggtgg tttcttcggt 660
tctaaaccgt tctctaaaac caacgactac ctggttcagt acggtcagac cccgatcgac 720
tggcagctgc cgcag 735
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acgcgtcgac gaactgttcg acgaacagac 30
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccggaattct tactgcggca gctgccagtc g 31
<210> 7
<211> 225
<212> PRT
<213> Micrococcus luteus
<400> 7
Met Glu Phe Ile Ala Pro Leu Asp Pro Gly Trp Glu Ala Ala Leu Ala
1 5 10 15
Pro Gln Ala Ala Ala Phe Glu Gln Val Gly Glu Ala Leu Arg Ala Arg
20 25 30
Arg Ala Ala Gly Glu Gln Val Leu Pro Ala Pro Glu His Ile Leu Arg
35 40 45
Ala Phe Arg Gln Pro Phe Ala Asp Val Arg Val Leu Val Leu Gly Gln
50 55 60
Asp Pro Tyr Pro Thr Pro Gly His Pro Ile Gly Leu Ser Phe Ala Val
65 70 75 80
Asp Arg His Val Arg Pro Leu Pro Arg Ser Leu Ala Asn Ile His Arg
85 90 95
Glu Leu His Asp Asp Leu Gly Ile Ala Pro Pro Ala His Gly Asp Leu
100 105 110
Ser Ala Trp Thr Asp Gln Gly Val Leu Leu Leu Asn Arg Ala Leu Ser
115 120 125
Val Arg Ala Gly Ala Pro Gly Ser His Arg Gly Leu Gly Trp Glu Gln
130 135 140
Ile Thr Glu Ala Ala Val Arg Ala Leu Cys Ala Arg Gly Thr Pro Leu
145 150 155 160
Val Gly Leu Leu Trp Gly Ala Asp Ala Arg Arg Met Ala Pro Leu Leu
165 170 175
Thr Ala Ala Gly Ala Gly Val Val Glu Ser Pro His Pro Ser Pro Leu
180 185 190
Ser Ala His Arg Gly Phe Phe Gly Ser Arg Pro Phe Ser Arg Val Asn
195 200 205
Arg Leu Leu Glu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Val Asp Trp Arg Leu Pro
210 215 220
Asp
225
<210> 8
<211> 675
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atggaattta tcgctccgct ggacccgggt tgggaagctg ctctggctcc gcaggcggcg 60
gcgttcgaac aggttggcga agctctgcgt gctcgtcgtg ctgctggtga acaggttctg 120
ccggctccgg aacacatcct gcgtgctttc cgtcagccgt tcgctgacgt tcgtgttctg 180
gttctgggtc aggacccgta cccgaccccg ggtcacccga tcggtctgtc tttcgctgtt 240
gaccgtcacg ttcgtccgct gccgcgttct ctggctaaca tccaccgtga actgcacgac 300
gacctgggta tcgctccgcc ggctcacggt gacctgtctg cttggaccga ccagggtgtt 360
ctgctgctga accgtgctct gtctgttcgt gctggtgctc cgggttctca ccgtggtctg 420
ggttgggaac agatcaccga agctgctgtt cgtgctctgt gcgctcgtgg taccccgctg 480
gttggtctgc tgtggggtgc tgacgctcgt cgtatggctc cgctgctgac cgctgctggt 540
gctggtgttg ttgaatctcc gcacccgtct ccgctgtctg ctcaccgtgg tttcttcggt 600
tctcgtccgt tctctcgtgt taaccgtctg ctggaagctg ctggtgctgc tccggttgac 660
tggcgtctgc cggac 675
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acgcgtcgac gaatttatcg ctccgctgga c 31
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccggaattct tagtccggca gacgccagtc aac 33
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acgcgtcgac atcggtcaga aaaccatcaa c 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccggaattct tacagagctt tccagtcgat c 31

Claims (10)

1.一种热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，包括：
将SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列连入PTYB11载体得到表达载体，转入大肠杆菌进行表达纯化。
2.根据权利要求1所述的热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，以SEQID NO：2所示的核苷酸序列为模板，SEQ ID NO：11和12所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，将扩增产物连入PTYB11载体。
3.根据权利要求1所述的热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，所述表达的条件包括：
将诱导后的大肠杆菌于14℃～16℃进行表达，表达时间为11h～13h。
4.根据权利要求3所述的尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，所述表达所用的培养基为LB培养基。
5.根据权利要求1～4任一项所述的热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法包括：
依次使用Chitin柱、阴离子交换层析Q柱、阴离子交换SP柱对目的蛋白进行处理。
6.根据权利要求8所述的热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，所述PTYB11载体带有CBD标签，使用Chitin柱对目的蛋白进行处理时，将带有CBD标签的目的蛋白与Chitin柱结合，随后将目的蛋白与CBD标签酶切断开，收集酶切后的洗脱液。
7.根据权利要求9所述的热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，将带有CBD标签的目的蛋白与Chitin柱结合时所用结合缓冲液成分包括：
40mM～60mM Tris-HCl，250mM～350mM NaCl，8％～12％甘油，pH＝7.8～8.2。
8.根据权利要求9所述的热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，所述酶切所用的酶切缓冲液成分包括：
40mM～60mM Tris-HCl，40mM～60mM DTT，pH＝7.8～8.2。
9.根据权利要求8～11任一项所述的热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，所述酶切在2℃～10℃的环境中进行。
10.根据权利要求8、13～16任一项所述的热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶的制备方法，其特征在于，所述阴离子交换层析Q柱、阴离子交换SP柱对目的蛋白进行处理在2℃～10℃的环境中进行。
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