CN109055339A - Tev蛋白酶突变体、基因、生物材料、制备方法、试剂或试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种TEV蛋白酶突变体、基因、生物材料、制备方法、试剂或试剂盒和应用，涉及基因工程技术领域。该TEV蛋白酶突变体与具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，突变至少如下七个氨基酸残基：第17位由T突变为S；第56位由L突变为V；第68位由N突变为D；第77位由I突变为V；第135位由S突变为G；第219位由S突变为V；第233位由Q突变为H。该TEV蛋白酶突变体具有良好的酶活性、稳定性和特异性。上述TEV蛋白酶突变体的基因、生物材料、TEV蛋白酶突变体的制备方法或包含上述TEV蛋白酶突变体的试剂或试剂盒，以及上述技术方案的应用与TEV蛋白酶突变体基于相同的发明构思。

Description

TEV蛋白酶突变体、基因、生物材料、制备方法、试剂或试剂盒 和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种TEV蛋白酶突变体、基因、生物材料、制备方法、试剂或试剂盒和应用。

背景技术

原核表达广泛应用于生物工程中，利用原核表达系统表达的基因来源不计其数，涵盖众多领域的研究方向，包括蛋白纯化、定位以及功能分析等。根据表达系统的不同主要可分为大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统等等。其中的大肠杆菌表达系统因为培养方法简单、表达背景清楚、表达成本低而技术最为成熟，应用也最为广泛。

但大肠杆菌表达系统缺乏真核表达系统基因翻译后修饰所特有的酶类、辅助因子等物质，常常表达出的外源基因蛋白不能正确折叠形成天然构象而出现包涵体表达，并且包涵体形式的目的蛋白往往给蛋白复性带来困难，同时也往往给蛋白的活性大打折扣甚至很多完全失活。针对该弊端，外源蛋白表达实验中除了优化培养诱导条件，添加促溶促表达标签表达目的蛋白，继而采用酶切去除标签也可以提高外源基因蛋白的表达量及活性。

TEV蛋白酶是来源于烟草蚀斑病毒(Tobacco Etch Virus,TEV)的NIa蛋白的催化片段，分子量约27KDa，它能特异性地识别七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser，并在Gln和Gly/Ser氨基酸残基之间进行酶切，常用于去除融合蛋白的Glutathione S-transferase(GST)、His或者其它标签。酶切后，在目的蛋白的N端仅有一个额外的Gly/Ser氨基酸残基，从而最大限度地减少了对目的蛋白结构和功能的影响。

野生型TEV在大肠杆菌表达和纯化存在一定的缺陷，野生型TEV在表达时，在其自身的特定位点上会发生分子内自剪切，从而使得该蛋白酶的活性和稳定性大大降低，而且在大肠杆菌表达时，大部分都以包涵体的形式存在，产量和水溶性都很低。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种TEV蛋白酶突变体，具有良好的稳定性、特异性、酶活性和较高的表达量。

本发明的第二目的在于提供一种表达上述TEV蛋白酶突变体的基因，可以表达出上述TEV蛋白酶突变体。

本发明的第三目的在于提供一种含有表达上述TEV蛋白酶突变体的基因的生物材料，可用于克隆和制备上述TEV蛋白酶突变体。

本发明的第四目的在于提供一种上述TEV蛋白酶突变体的制备方法。

本发明的第五目的在于提供一种包含上述TEV蛋白酶突变体的试剂或试剂盒。

本发明的第六目的在于提供一种上述TEV蛋白酶突变体，表达上述TEV蛋白酶突变体的基因、上述生物材料、上述TEV蛋白酶突变体的制备方法或包含上述TEV蛋白酶突变体的试剂或试剂盒的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

本发明提供了一种TEV蛋白酶突变体，与具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，突变至少如下七个氨基酸残基：

第17位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸；

第56位氨基酸残基由亮氨酸突变为缬氨酸；

第68位氨基酸残基由天冬酰胺突变为天冬氨酸；

第77位氨基酸残基由异亮氨酸突变为缬氨酸；

第135位氨基酸残基由丝氨酸突变为甘氨酸；

第219位氨基酸残基由丝氨酸突变为缬氨酸；

第233位氨基酸残基由谷氨酰胺突变为组氨酸。

优选地，所述TEV蛋白酶突变体具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

优选地，所述TEV蛋白酶突变体的N端和/或C端连接有标签。

优选地，所述TEV蛋白酶突变体的C端连接有His标签。

优选地，所述TEV蛋白酶突变体为由大肠杆菌表达系统表达得到的蛋白质。

本发明还提供了编码上述TEV蛋白酶突变体的基因。

优选地，具有如SEQ ID NO.4所示序列。

本发明还提供了含有上述基因的生物材料，包括表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组微生物；

优选地，所述重组载体包括将表达所述TEV蛋白酶突变体的基因插入pET-28a载体得到的重组质粒；

优选地，所述重组微生物包括将所述重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。

本发明还提供了上述TEV蛋白酶突变体的制备方法，包括在宿主中表达编码所述TEV蛋白酶突变体的基因；

优选地，先将表达所述TEV蛋白酶突变体的基因插入pET-28a载体得到的重组质粒；然后将所述重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，培养所述重组菌以得到所述TEV蛋白酶突变体。

本发明还提供了包含上述TEV蛋白酶突变体的试剂或试剂盒。

本发明还提供了上述TEV蛋白酶突变体、表达上述TEV蛋白酶突变体的基因、上述生物材料、上述TEV蛋白酶突变体的制备方法或包含上述TEV蛋白酶突变体的试剂或试剂盒的应用，包括如下(x1)-(x6)中的至少一种：

(x1)识别蛋白或多肽中的Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly序列；

(x2)识别蛋白或多肽中的Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser序列；

(x3)酶切蛋白或多肽；

(x4)制备基于大肠杆菌表达系统表达的蛋白；

(x5)基因工程；

(x6)蛋白质工程。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种TEV蛋白酶突变体，可以使TEV蛋白酶不仅保持天然TEV酶的功能活性，且在较广的温度范围内表现出更好的稳定性和特异性，TEV在pH7.0，30℃时可达到最佳活性，但在pH 6.0-8.5和温度4-30℃C的广泛范围内皆有活性，使得反应条件的选择可根据目的蛋白的情况而灵活变动；该TEV蛋白酶突变体可以降低TEV对自身分子的分子内剪切，以提高TEV蛋白酶的活性和稳定性，同时还可以提高TEV蛋白酶的水溶性和TEV蛋白酶的表达量。

基于本发明提供的TEV蛋白酶突变体的发明构思，本发明还提供了表达上述TEV蛋白酶突变体的基因、上述生物材料、上述TEV蛋白酶突变体的制备方法或包含上述TEV蛋白酶突变体的试剂或试剂盒，以及上述技术方案的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的不同诱导条件下TEV蛋白酶突变体的表达；

图2为本发明实施例1提供的TEV蛋白酶突变体的纯化；

图3为本发明实施例1提供的TEV蛋白酶突变体的定量；

图4为相同时间不同量的TEV蛋白酶突变体的酶切结果。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种TEV蛋白酶突变体，命名为rTEV，与具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列相比，突变至少如下七个氨基酸残基：

第17位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸；第56位氨基酸残基由亮氨酸突变为缬氨酸；第68位氨基酸残基由天冬酰胺突变为天冬氨酸；第77位氨基酸残基由异亮氨酸突变为缬氨酸；第135位氨基酸残基由丝氨酸突变为甘氨酸；第219位氨基酸残基由丝氨酸突变为缬氨酸；第233位氨基酸残基由谷氨酰胺突变为组氨酸。

该rTEV包含上述至少7个突变位点，可以使TEV蛋白酶不仅保持天然TEV酶的功能活性，且在较广的温度范围内表现出更好的稳定性和特异性，TEV在pH7.0，30℃时可达到最佳活性，但在pH 6.0-8.5和温度4-30℃的广泛范围内皆有活性，使得反应条件的选择可根据目的蛋白的情况而灵活变动。其中，1μl rTEV在Buffer(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0，0.1mM DTT)中与30μg底物30℃反应1h，可酶解完全。rTEV酶活力为10U/μL，酶切效率较高。

该rTEV可以降低TEV对自身分子的分子内剪切，以提高蛋白酶的活性和稳定性；还可以提高TEV蛋白酶的水溶性和TEV蛋白酶的表达量。

在一些可选的实施方式中，该rTEV具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

在一些可选的实施方式中，该rTEV的N端和/或C端连接有标签，以便于后续蛋白的分离、纯化和鉴定，所述标签例如可以为但不限于为His标签、Flag标签、GST标签、MBP标签、NusA标签、SUMO标签。在一些优选的实施方式中，该rTEV的C端连接有His标签，优选使用6×His标签，通过Ni-NTA树脂去除，以达到纯化目的蛋白的目的。

本发明还提供了编码该rTEV的基因，本发明所述的编码该rTEV基因包含表达上述该rTEV的核苷酸序列，还可以包括用于调节蛋白表达和/或辅助蛋白分离纯化的核苷酸序列，例如可以为但不限于为启动子序列、增强子序列和/或用于表达蛋白标签的序列。在一些优选的实施方式中，所述编码rTEV的基因具有如SEQ ID NO.4所示序列。

本发明还提供了含有编码该rTEV的基因的生物材料，包括表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组微生物，以用于贮存、克隆或者表达该rTEV的基因。例如可以为但不限于为将所述基因克隆至克隆载体或者表达载体，在使用时将其转化或转染至宿主细胞即可。在一些优选的实施方式中，所述重组载体包括将表达该rTEV的基因插入pET-28a载体得到的重组质粒，使用时可以将所述重组质粒转染至大肠杆菌表达即可。在一些优选的实施方式中，所述重组微生物包括将所述重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。

本发明还提供了该rTEV的制备方法，包括在宿主中表达编码该rTEV的基因。

该制备方法通过将上述编码该rTEV的基因在宿主中表达即可，例如可以为但不限于为在大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、植物表达系统或者哺乳动物表达系统均可。

在一些优选的实施方式中，先将表达该rTEV的基因插入pET-28a载体得到的重组质粒；然后将所述重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，培养所述重组菌以得到rTEV。

本发明还提供了包含该rTEV的试剂或试剂盒，所述试剂或所述试剂盒还可以包括和该rTEV配套的试剂和/或耗材，例如可以为但不限于为其他具有酶切作用的DNA蛋白酶，用于溶解蛋白酶的Buffer，SDS-PAGE相关试剂或实验耗材，以用于更便捷的酶切以及检测相关蛋白或多肽。

本发明还提供了该rTEV，表达该rTEV的基因、上述生物材料、该rTEV的制备方法或包含该rTEV的试剂或试剂盒的应用。包括如下(x1)-(x6)中的至少一种：

(x1)识别蛋白或多肽中的Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly序列；(x2)识别蛋白或多肽中的Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser序列；(x3)酶切蛋白或多肽；(x4)制备基于大肠杆菌表达系统表达的蛋白；(x5)基因工程；(x6)蛋白质工程。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

本实施例提供了一种TEV蛋白酶突变体，命名为rTEV，TEVw为野生型TEV蛋白酶，具有如下表所示的突变位点：

表1rTEV的突变位点

氨基酸位置	TEVw氨基酸名	rTEV氨基酸名
			17	T	S
56	L	V
			68	N	D
77	I	V
			135	S	G
219	S	V
			233	Q	H

rTEV的制备方法如下：

根据表1rTEV的核苷酸序列进行全基因合成，并以Nde I为N端酶切位点、Xho I为C端酶切位点，亚克隆至最终的表达载体pET-28a中。经过上海生工生物工程技术服务有限公司测序，最终验证所得重组质粒序列与理论七突变TEV蛋白酶的序列一致。

rTEV的表达纯化：

1.转化：取1μl重组的pET-28a载体转化BL21(DE3)，42℃热击90s后冰上静置2min后涂布含有终浓度为30μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，LB Borth Agar由生工提供，货号A507003-0250，使用时4g粉末用100mL ddH₂O溶解，37℃培养过夜。挑取表达菌株BL21(DE3)的单菌落于三角瓶中(10mL LB培养基，LB Borth由生工提供，货号A507002-0250，使用时25g用1L ddH₂O溶解，30μg/mL卡那霉素)37℃，220rpm过夜培养。

2.小试培养选择最佳的诱导条件：将过夜培养的菌液按1:100比例分别接种于10mL LB培养基中，添加终浓度30μg/mL卡那霉素，37℃，220rpm培养。当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mM的IPTG，220rpm，分别20℃诱导过夜；25℃诱导过夜；28℃诱导4h，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。4000rpm离心10min收集菌体，弃上清，菌体用500μL PBS(pH7.4)缓冲液悬浮，超声破碎6min，超0.5s停1.5s，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μL包涵体溶解液(8M Urea，50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH8.0)溶解，分别取40μL样品和10μL 5×protein loading buffer混匀，沸水欲10min。

SDS-PAGE检测，准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液(Tris 3.0g，甘氨酸14.4g，SDS 1.0g，定容至1L)，上样量10μL，浓缩胶80V，20min，分离胶120V，60min，凝胶电泳结束考染20min，脱色，结果如图1所示，其中泳道1为诱导前样品；泳道2为20℃诱导后的上清；泳道3为20℃诱导后的沉淀；泳道4为25℃诱导后的上清；泳道5为25℃诱导后的沉淀；泳道6为28℃诱导后的上清；泳道7为28℃诱导后的沉淀。

3.大量诱导表达融合蛋白:将培养的菌液按1:100比例接种于3L的LB液体培养基中，30μg/mL卡那霉素，37℃，220rpm培养，当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5mM IPTG，28℃，220rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体。

4.蛋白纯化：将收集的细菌菌体用破碎Buffer溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率400W，20min(超声2s，暂停6s为一个循环)。超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，收集上清后进行下一步纯化。取5mL Ni-NTA，用5倍柱床体积的Binding Buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。填料和样品孵育1h后上柱，收集穿透液。5倍柱床体积的Binding Buffer清洗柱子，流速5mL/min。Wash Buffer洗杂，流速2mL/min，收集洗脱液。Elution Buffer洗脱，流速2mL/min，收集洗脱液。收集样品SDS-PAGE检测，结果如图2所示，其中泳道1为上样样品；泳道2为流出样品；泳道3-4为20mM Imidazole洗脱样品；泳道5-6为50mM Imidazole洗脱样品；泳道7为500mM Imidazole洗脱样品。

组分透析到：25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0，0.1mM DTT，50％Glycerol，4℃透析过夜，透析结束后用PEG20000浓缩，0.45μm滤膜过滤后-80℃保存。

5.纯化蛋白的检测：准备12％的SDS-PAGE，Tris-Gly电泳缓冲液，上样，浓缩胶80V，20min，分离胶120V，60min，凝胶电泳结束考染20min，脱色，结果如图3所示。

酶活测定

将rTEV对含ENLYFQG序列蛋白的特异性识别来进行酶活的测定，本实验以融合蛋白GST-Cys为酶切底物，在1×TEV Buffer(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0，0.1mM DTT)中，加入3μg融合蛋白和一定量的rTEV(rTEV的量依次为0U、0.14U、0.29U、0.43U、0.57U、0.71U、0.86U、1U、1.14U)，在30℃恒温反应1小时后，取40μL上述反应液，置于单独的EP管中。向上述EP管中各加入10μL 5×SDS Loading Buffer，样品煮沸5min，取10μL进行SDS-PAGE分析，相同时间不同量的rTEV酶切结果如图4所示。

对比例1

本对比例提供了一种TEV蛋白酶突变体，与实施例1的区别在于，未突变第233位氨基酸残，制备方法同实施例1。

对比例2

本对比例提供了一种TEV蛋白酶突变体，与实施例1的区别在于，第233位氨基酸残基由谷氨酰胺突变为精氨酸，制备方法同实施例1。

以上结果表明本发明TEV蛋白酶七突变体的表达纯化及酶切应用提供了一种高表达量、高酶活、强酶解效率的TEV蛋白酶七突变体的表达纯化方法。

效果例1

分别检测实施例1、对比例1和对比例2中菌液上清中的TEV蛋白酶突变体的含量，以及，分别检测1μL实施例1、对比例1和对比例2的菌液上清在Buffer(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0，0.1mM DTT)中与30μg底物(融合蛋白GST-Cys)分别在不同温度条件下完全酶解30μg底物的时间。

由上述实施例和对比例对比可以看出，实施例1提供的TEV蛋白酶突变体优于对比例1和对比例2提供的蛋白酶突变体；

由效果例1可以看出，在相同的实验条件下，实施例1提供的rTEV蛋白酶的酶解效果优于对比例1和对比例2，说明以TEV野生型为基础，突变7个位点的TEV蛋白酶优于只突变6个的TEV蛋白酶；根据实施例1与对比例2对比可以看出，将第233位氨基酸残基由谷氨酰胺突变为组氨酸优于突变为其他种类的氨基酸。

由效果例1还可以看出，实施例1提供的rTEV适用的温度范围优于对比例1和对比例2提供的TEV蛋白酶，并且由于本效果以菌液的上清作为蛋白酶，从实验结果中实施例1的酶切时间更短结合菌液上清中TEV含量可以看出，实施例1提供的rTEV在上清中表达的含量更多，以致菌液可以更高效的酶解底物。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 生工生物工程（上海）股份有限公司

<120> TEV蛋白酶突变体、基因、生物材料、制备方法、试剂或试剂盒和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 236

<212> PRT

<213> 烟草蚀斑病毒(Tobacco Etch Virus)

<400> 1

Gly Glu Ser Leu Phe Lys Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Ser

1 5 10 15

Thr Ile Cys His Leu Thr Asn Glu Ser Asp Gly His Thr Thr Ser Leu

20 25 30

Tyr Gly Ile Gly Phe Gly Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu Phe

35 40 45

Arg Arg Asn Asn Gly Thr Leu Leu Val Gln Ser Leu His Gly Val Phe

50 55 60

Lys Val Lys Asn Thr Thr Thr Leu Gln Gln His Leu Ile Asp Gly Arg

65 70 75 80

Asp Met Ile Ile Ile Arg Met Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro Gln

85 90 95

Lys Leu Lys Phe Arg Glu Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu Val

100 105 110

Thr Thr Asn Phe Gln Thr Lys Ser Met Ser Ser Met Val Ser Asp Thr

115 120 125

Ser Cys Thr Phe Pro Ser Ser Asp Gly Ile Phe Trp Lys His Trp Ile

130 135 140

Gln Thr Lys Asp Gly Gln Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg Asp

145 150 155 160

Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr Asn

165 170 175

Asn Tyr Phe Thr Ser Val Pro Lys Asn Phe Met Glu Leu Leu Thr Asn

180 185 190

Gln Glu Ala Gln Gln Trp Val Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp Ser

195 200 205

Val Leu Trp Gly Gly His Lys Val Phe Met Ser Lys Pro Glu Glu Pro

210 215 220

Phe Gln Pro Val Lys Glu Ala Thr Gln Leu Met Asn

225 230 235

<210> 2

<211> 710

<212> DNA

<213> 烟草蚀斑病毒(Tobacco Etch Virus)

<400> 2

ggagaaagct tgtttaaggg accacgtgat tacaacccga tatcgagcac catttgtcat 60

ttgacgaatg aatctgatgg gcacacaaca tcgttgtatg gtattggatt tggtcccttc 120

atcattacaa acaagcactt gtttagaaga aataatggaa cactgttggt ccaatcacta 180

catggtgtat tcaaggtcaa gaacaccacg actttgcaac aacacctcat tgatgggagg 240

gacatgataa ttattcgcat gcctaaggat ttcccaccat ttcctcaaaa gctgaaattt 300

agagagccac aaagggaaga gcgcatatgt cttgtgacaa ccaacttcca aactaagagc 360

atgtctagca tggtgtcaga cactagttgc acattccctt catctgatgg catattctgg 420

aagcattgga ttcaaaccaa ggatgggcag tgtggcagtc cattagtatc aactagagat 480

gggttcattg ttggtataca ctcagcatcg aatttcacca acacaaacaa ttatttcaca 540

agcgtgccga aaaacttcat ggaattgttg acaaatcagg aggcgcagca gtgggttagt 600

ggttggcgat taaatgctga ctcagtattg tgggggggcc ataaagtttt catgagcaaa 660

cctgaagagc cttttcagcc agttaaggaa gcgactcaac tcatgaatga 710

<210> 3

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Gly Glu Ser Leu Phe Lys Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ile Cys His Leu Thr Asn Glu Ser Asp Gly His Thr Thr Ser Leu

20 25 30

Tyr Gly Ile Gly Phe Gly Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu Phe

35 40 45

Arg Arg Asn Asn Gly Thr Leu Val Val Gln Ser Leu His Gly Val Phe

50 55 60

Lys Val Lys Asp Thr Thr Thr Leu Gln Gln His Leu Val Asp Gly Arg

65 70 75 80

Asp Met Ile Ile Ile Arg Met Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro Gln

85 90 95

Lys Leu Lys Phe Arg Glu Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu Val

100 105 110

Thr Thr Asn Phe Gln Thr Lys Ser Met Ser Ser Met Val Ser Asp Thr

115 120 125

Ser Cys Thr Phe Pro Ser Gly Asp Gly Ile Phe Trp Lys His Trp Ile

130 135 140

Gln Thr Lys Asp Gly Gln Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg Asp

145 150 155 160

Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr Asn

165 170 175

Asn Tyr Phe Thr Ser Val Pro Lys Asn Phe Met Glu Leu Leu Thr Asn

180 185 190

Gln Glu Ala Gln Gln Trp Val Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp Ser

195 200 205

Val Leu Trp Gly Gly His Lys Val Phe Met Val Lys Pro Glu Glu Pro

210 215 220

Phe Gln Pro Val Lys Glu Ala Thr His

225 230

<210> 4

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgggcgaaa gcctgttcaa aggtccgcgt gactataacc cgattagcag cagcatttgc 120

catctgacga acgaatctga cggccatacc accagcctgt atggcatcgg ttttggcccg 180

ttcattatca cgaacaaaca cctgtttcgt cgcaacaatg gtaccctggt ggttcagtct 240

ctgcatggcg tctttaaagt gaaagatacc acgaccctgc agcaacacct ggtggatggt 300

cgtgacatga ttatcattcg catgccgaaa gactttccgc cgttcccgca gaaactgaaa 360

ttccgtgaac cgcaacgtga agaacgcatt tgcctggtca cgaccaattt tcagaccaaa 420

tcaatgagct ctatggtgtc agatacgtcg tgtacctttc cgtcgggtga cggcatcttc 480

tggaaacatt ggattcagac gaaagatggt caatgcggta gcccgctggt gtctacccgt 540

gacggtttta tcgttggcat tcacagtgcg tccaacttta cgaataccaa caattacttc 600

acgtcagttc cgaaaaactt tatggaactg ctgaccaatc aggaagcgca gcaatgggtc 660

agcggctggc gcctgaacgc cgattccgtt ctgtggggcg gtcacaaagt ctttatggtc 720

aaaccggaag aaccgttcca accggtcaaa gaagcgacgc actga 765

Claims (10)

1.一种TEV蛋白酶突变体，其特征在于，与具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，突变至少如下七个氨基酸残基：

第17位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸；

第56位氨基酸残基由亮氨酸突变为缬氨酸；

第68位氨基酸残基由天冬酰胺突变为天冬氨酸；

第77位氨基酸残基由异亮氨酸突变为缬氨酸；

第135位氨基酸残基由丝氨酸突变为甘氨酸；

第219位氨基酸残基由丝氨酸突变为缬氨酸；

第233位氨基酸残基由谷氨酰胺突变为组氨酸。

2.根据权利要求1所述的TEV蛋白酶突变体，其特征在于，所述TEV蛋白酶突变体具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的TEV蛋白酶突变体，其特征在于，所述TEV蛋白酶突变体的N端和/或C端连接有标签；

优选地，所述TEV蛋白酶突变体的C端连接有His标签。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的TEV蛋白酶突变体，其特征在于，所述TEV蛋白酶突变体为由大肠杆菌表达系统表达得到的蛋白质。

5.编码权利要求1-4中任一项所述的TEV蛋白酶突变体的基因。

6.根据权利要求6所述的基因，其特征在于，具有如SEQ ID NO.4所示序列。

7.含有权利要求5或6所述基因的生物材料，其特征在于，包括表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组微生物；

优选地，所述重组载体包括将表达所述TEV蛋白酶突变体的基因插入pET-28a载体得到的重组质粒；

优选地，所述重组微生物包括将所述重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。

8.权利要求1-4中任一项所述的TEV蛋白酶突变体的制备方法，其特征在于，在宿主中表达编码所述TEV蛋白酶突变体的基因；

优选地，先将表达所述TEV蛋白酶突变体的基因插入pET-28a载体得到的重组质粒；然后将所述重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，培养所述重组菌以得到所述TEV蛋白酶突变体。

9.包含权利要求1-4中任一项所述的TEV蛋白酶突变体的试剂或试剂盒。

10.权利要求1-4中任一项所述的TEV蛋白酶突变体、权利要求5或6所述的基因、权利要求7所述的生物材料、权利要求8所述的上述TEV蛋白酶突变体的制备方法或权利要求9所述的试剂或试剂盒的应用，其特征在于，包括如下(x1)-(x6)中的至少一种：

(x1)识别蛋白或多肽中的Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly序列；

(x2)识别蛋白或多肽中的Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser序列；

(x3)酶切蛋白或多肽；

(x4)制备基于大肠杆菌表达系统表达的蛋白；

(x5)基因工程；

(x6)蛋白质工程。