CN111117977B

CN111117977B - 一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用

Info

Publication number: CN111117977B
Application number: CN202010010362.4A
Authority: CN
Inventors: 胡松青; 樊壬水; 侯轶
Original assignee: Guangzhou Yingzan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou yingzan Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-01-06
Filing date: 2020-01-06
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2040-01-06
Also published as: WO2021139295A1; CN111117977A

Abstract

本发明公开了一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用。本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重组多肽连接酶原，其体外自激活能力获得了显著的提高。本发明还提供了一种重组多肽连接酶原的制备方法，实现了所述的重组多肽连接酶原的高效可溶表达，所述方法简便高效，原料简单，表达量高，分离纯化易行，易于大量表达，适合工业化生产；本发明还提供了一种重组多肽连接酶原的激活方法，实现了重组多肽连接酶原的高效激活，激活产物催化效率与环化、连接活性显著；所述的激活产物可用于多肽或蛋白质的环化、多肽与多肽或蛋白质之间的连接、蛋白质与蛋白质之间的连接、蛋白质或多肽与其它化合物的连接中，具有广阔的应用前景。

Description

一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用。

背景技术

生物活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用。与线性多肽相比，环肽不但具有较高的结构稳定性、热稳定性和生物利用度，而且能够抗水解，在化学变性剂条件下能保持完整生物活性，更为重要的是环化能够不同程度地增强多肽原有生理活性。因此，将线性多肽首尾环化成环状一直是国际生物化学与食品药品领域致力解决的关键问题。

受制备技术的限制，目前环肽主要用于价格昂贵的药物开发。目前来说，制备环肽的主要方法有：天然环肽分离精制、化学合成及微生物发酵合成。然而，天然产物中环肽含量非常低，分离提纯困难；化学合成需要繁琐的基团保护，降低了反应产率和产品纯度；发酵法则需要特殊菌株，能生产的环肽种类少。相对于上述环肽合成方式，近年来环肽的酶法合成表现出极高的应用前景，还可克服其它制备方法产量和纯度低、副产物产生、分离纯化复杂等缺点。

2014年，新加坡学者首次报道了从药用植物蝶豆(Clitoria ternatea)豆荚中分离纯化出特异性天冬酰氨内肽酶Butelase 1，发现其能高效催化线性多肽分子内环化，具有底物范围广、识别基序简单、催化速度快等特点。但是，植物提取容易受原料限制，提取工艺耗时长、产率低，耗时3天从1kg豆荚中仅得到的5mg天然Butelase 1。因此，通过重组异源表达技术生产和纯化生产活性Butelase 1是研究热点。截止目前，在原核表达方面仅有澳大利亚学者Amy M.James通过大肠杆菌异源表达全长氨基酸序列的Butelase 1，但其活性远不及天然提取的Butelase 1。也有学者尝试利用酵母表达系统重组表达Butelase 1，但是，与大肠杆菌原核表达系统相比，真核的酵母表达体系表达量低，表达周期长，分离纯化成本高。

发明内容

本发明的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种重组多肽连接酶原；所述的重组多肽连接酶原的体外自激活能力获得了显著的提高。

本发明的第二目的在于提供一种重组多肽连接酶原的制备方法，实现了所述的重组多肽连接酶原的高效可溶表达。

本发明的第三目的在于提供一种重组多肽连接酶原的激活方法，所述激活方法获得的重组多肽连接酶原激活产物活性强，催化效率高。

本发明的第四目的在于提供所述的重组多肽连接酶原或其激活产物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种重组多肽连接酶原，具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。所述重组多肽连接酶原的氨基酸序列与野生型蝶豆源多肽连接酶原的氨基酸序列SEQ ID NO:2相比，具有以下氨基酸突变：338位赖氨酸突变为天冬氨酸；358位脯氨酸突变为天冬酰胺；359位谷氨酸突变为天冬氨酸，将1～20位信号肽截短，以及N末端融合有MBP标签。

编码所述的重组多肽连接酶原的DNA分子，具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。所述的核苷酸序列基于大肠杆菌表达系统对密码子进行了优化，能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

一种重组表达载体，含有编码所述的重组多肽连接酶原的核苷酸序列。

优选的，所述的重组表达载体含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

一种重组多肽连接酶原的制备方法，包括如下步骤：

将编码所述的重组多肽连接酶原的核苷酸序列克隆入表达载体中构建重组表达载体；再将所述的重组表达载体转化原核表达系统中进行诱导表达，固液分离收集菌体沉淀，纯化后得到所述的重组多肽连接酶原。

所述的原核表达系统优选为大肠杆菌表达系统；更优选为大肠杆菌ROSETTA(DE3)。

所述的重组表达载体的优选为通过T7启动子进行表达。

所述的表达载体优选为含有MBP标签的表达载体，更优选为pMAL-c5x或pMAL-c5x-His，可以极大地增加目的蛋白表达的可溶性。

所述的诱导表达的具体操作步骤优选为：将阳性转化体接种于LB培养液进行培养，当菌液OD₆₀₀达到0.5～0.9时，加入终浓度为0.1～0.6mmol/L的IPTG，15～30℃诱导12～28h；所述的LB培养液中含有卡那霉素30～50μg/mL和氨苄青霉素50～100μg/mL。

所述的将阳性转化体接种于LB培养液进行培养的具体操作为：

(1)将所述的阳性转化体在LB培养液中于25～40℃振荡培养过夜得到种子液；

(2)将种子液接种到LB培养液中，于25～40℃，150～250r/min条件下培养。

步骤(2)中所述的接种量优选按与LB培养液的体积比为1:50～1:150进行接种。

所述的纯化的步骤优选为：裂解细胞后收集上清液，将上清液过亲和层析柱，洗脱得到纯化后的重组多肽连接酶原。

所述的裂解细胞的方法优选为：用超声破碎法冰浴裂解细胞。

所述的超声破碎法中，优选将菌体于缓冲液A中重悬后进行；所述的缓冲液A的配方为20mMNaH₂PO₄-Na₂HPO₄、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT，pH＝7。

所述的缓冲液A的用量优选为每克菌体加入10mL缓冲液A。

所述的超声破碎法的条件优选为：功率为50～200W，超声1～5s，间隔1～5s，持续2～30min。

所述的裂解细胞后收集上清液的操作优选为：裂解后的菌体进行冷冻离心后弃沉淀，过膜，得到所述的上清液。

所述的冷冻离心的条件优选在4℃条件下12000r/min离心40min。

所述的过膜优选为用0.22μm微孔滤膜过滤。

所述的亲和层析柱优选为MBP标签亲和层析柱。

所述的洗脱优选为先用缓冲液A平衡，再用缓冲液B洗脱；所述的缓冲液B的配方为：20mMNaH₂PO₄-Na₂HPO₄、100mM NaCl、1mM EDTA、10mM麦芽糖，pH＝7。

一种重组多肽连接酶原的激活方法，包括如下步骤：将重组多肽连接酶原先在pH为3.5～6的环境下进行第一次透析，再于pH为4.5～7的环境下进行第二次透析，固液分离去除沉淀，得到所述的重组多肽连接酶原激活产物。

所述的激活方法优选在25～45℃下进行。

所述的第一次透析优选在包含如下组分的缓冲液Ⅰ中进行：20～50mM乙酸-乙酸钠、50～200mMNaCl、1～5mM EDTA、2～5mM DTT。

所述的第一次透析的时间优选为8～24h。

所述的第二次透析优选在包含如下组分的缓冲液Ⅱ中进行：20～50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄或Na₂HPO₄-柠檬酸、50～200mM NaCl、1～5mM EDTA、0.5～1mM DTT。

所述的第二次透析的时间优选为2～8h。

所述的透析优选在透析袋中进行，所述的透析袋优选为截留分子量为3～10kDa的透析袋。

一种重组多肽连接酶原激活产物，通过所述的重组多肽连接酶原激活方法得到。

所述的重组多肽连接酶原或所述的重组多肽连接酶原激活产物的应用，包括用于多肽或蛋白质的环化、多肽与多肽或蛋白质之间的连接、蛋白质与蛋白质之间的连接、蛋白质或多肽与其它化合物的连接中。

当用于多肽或蛋白质的环化时，所述的多肽或蛋白质的C端含有天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸(NHV)序列，N端第一位氨基酸是除了脯氨酸以外的19种常见氨基酸，N端第二位氨基酸残基必须是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或者半胱氨酸(I、L、V或C)；所述的多肽或蛋白质优选为线性多肽或蛋白质。

所述的环化的形式为，多肽或蛋白质的C端的组氨酸-缬氨酸(HV)序列断裂，然后N端和C端首尾以酰胺键相连即得到环肽。

当用于多肽与多肽或蛋白质之间的连接、蛋白质与蛋白质之间的连接时，至少有一个多肽或蛋白质的C端含有天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸(NHV)序列，另一个多肽或蛋白质满足N端第一位氨基酸是除了脯氨酸以外的19种常见氨基酸，N端第二位氨基酸残基必须是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或者半胱氨酸(I、L、V或C)。

所述的连接的形式为，一条多肽或蛋白质的C端的组氨酸-缬氨酸(HV)序列断裂，然后和另一条多肽或蛋白质的N端形成酰胺键即得到连接产物。

所述的应用的条件优选为：温度为25～60℃，pH为4.5～7。

所述的应用优选在含有如下成分的缓冲液中进行：20～50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、Na₂HPO₄-柠檬酸或2-吗啉乙磺酸，50～200mM NaCl，1～5mM EDTA，0.5～1mM DTT。

所述的缓冲液优选还含有0.05％～0.3％的Triton X-100。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明采用大肠杆菌原核表达的方法，制备了可溶性的且能被高效激活的重组多肽连接酶原，目的蛋白含量占总蛋白的60～70％，表达量高，且分离纯化只需一次亲和层析，简单高效，易于大量表达，适合工业化生产。

2、本发明针对原核表达体系进行了密码子优化，同时定点突变了野生型Butelase1的三个氨基酸，可以增强重组多肽连接酶原的体外自激活能力，同时提高重组多肽连接酶原激活产物的催化效率。

3、本发明利用带有MBP标签的表达载体(例如pMAL-c5x-His载体)来进行目的蛋白的表达，使得表达的蛋白在N端具有一个MBP促溶标签。不但增加了目的蛋白的表达量和可溶性，而且，经MBP标签亲和层析，可以简化重组多肽连接酶原的分离纯化。

4、本发明采用低pH激活的方法，获得的激活产物具有和天然提取的多肽连接酶Butelase 1相同的功能作用，可以进行多肽或蛋白质的环化、多肽与多肽或蛋白质之间的连接、蛋白质与蛋白质之间的连接、蛋白质或多肽与其它化合物的连接；而且，与现有技术中其它的大肠杆菌原核表达得到的多肽连接酶Butelase1相比，具有更高的催化效率和更专一的环化活性。

5、相对于现有技术中通过天然提取方法获得Butelase 1，本发明的方法无需以蝶豆作为原料，只需要简单的培养基作为原料，制备多肽连接酶的过程不受原料限制，在生物化工、医药和食品等领域具有广阔的前景；相对于现有技术中通过酵母表达系统重组表达获得Butelase 1，本发明的方法表达周期更短，表达量更高，分离纯化更简单。

附图说明

图1为MBP标签亲和层析纯化重组多肽连接酶原的SDS-PAGE图；其中，泳道1～4依次为总蛋白、上清蛋白、穿透蛋白和洗脱蛋白。

图2为重组多肽连接酶原激活的SDS-PAGE图；其中，泳道1和2分别是重组多肽连接酶原和重组多肽连接酶原激活产物。

图3为重组多肽连接酶原激活前后的相对酶活图。

图4为重组多肽连接酶原激活产物环化多肽KB1-NHV的液相色谱图。

图5为重组多肽连接酶原激活产物环化多肽KB1-NHV的产物峰的MALDI-TOF图。

图6为重组多肽连接酶原激活产物环化抗菌肽SoD6-NHV的MALDI-TOF图。

图7为重组多肽连接酶原激活产物环化抗菌肽P113-NHV的MALDI-TOF图。

图8为重组多肽连接酶原激活产物进行多肽分子间连接的MALDI-TOF图。

图9为重组多肽连接酶原激活产物环化向日葵胰蛋白酶抑制剂的MALDI-TOF图。

图10是实施例11中不同菌株表达得到的重组多肽连接酶原激活产物的相对酶活结果分析图。

图11是实施例12中野生型重组多肽连接酶原激活产物和突变型重组多肽连接酶原激活产物的相对酶活结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

除无特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。

实施例1构建含编码重组多肽连接酶原的核苷酸序列的重组载体

构建含编码重组多肽连接酶原的核苷酸序列的重组载体，包括如下步骤：

(1)根据所述重组多肽连接酶原的氨基酸序列，进行大肠杆菌表达系统的密码子优化后，获得能在大肠杆菌中进行高效表达的DNA分子，利用拼接PCR的方法，人工合成编码所述重组多肽连接酶原的DNA分子，具体如SEQ ID NO:3所示。

(2)pMAL-c5x-His载体的构建

通过Nde I：CATATG和BamHI：GGATCC两个酶切位点，将基因片段“GTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACGGATCC”接入pMAL-c5x载体(由广州英赞生物科技有限公司提供)，得到的pMAL-c5x-His载体能够表达带有His标签的目的蛋白。

(3)将编码重组多肽连接酶原的DNA分子与表达载体pMAL-c5x-His进行重组

合成引物序列如下，Nde I-FP：ACGCCATATGATTCGTGATGATTTTCTGCG；Sal I-RP：ACGCGTCGACTCACACGCTAAACCCCG。利用PCR技术对重组多肽连接酶原的DNA分子进行扩增，以人工合成编码所述重组多肽连接酶原的DNA分子为模板，加入25μL2×PfuMaxHiFiPCRProMix(由广州英赞生物科技有限公司生产，EnzyValley，货号P217)、上下游引物Nde I-FP和Sal I-RP各1μL以及适量的灭菌水，进行PCR扩增。扩增条件为：98℃30s；98℃10s，58℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃5min。琼脂糖凝胶电泳回收大小约1.4kb的目的基因片段，以Nde I和Sal I(购于NEB)双酶切目的基因片段和载体pMAL-c5x-His，并用T4 DNA酶(购于天根生物科技有限公司)进行连接反应，连接产物转化至DH5a感受态细胞(购于天根生物科技有限公司)中。

(4)挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，并将阳性单克隆送往测序公司测序验证，证实编码重组多肽连接酶原的DNA分子的正确性，培养验证正确的感受态细胞，并提取质粒，所获得的质粒即为含有编码重组多肽连接酶原的DNA分子的重组载体。

实施例2重组多肽连接酶原在重组大肠杆菌中的表达和鉴定

将实施例1获得的重组载体转化到宿主细胞大肠杆菌ROSETTA(DE3)(购于上海唯地生物技术有限公司)中，挑选大肠杆菌阳性转化体，接种于含有少量卡那霉素30μg/mL和氨苄青霉素50μg/mL的LB培养液中，在摇床中于25℃振荡培养过夜作为种子液，取种子液按体积比1:150的比例接种至含有卡那霉素30μg/mL和氨苄青霉素50μg/mL的LB培养液中，于25℃，150r/min条件下培养至菌液OD₆₀₀达到0.5，向每瓶菌液加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L，于15℃诱导表达28h后，离心收集菌体沉淀。

取IPTG诱导前后菌液各1mL，12000r/min离心1min后取沉淀，加入150μL缓冲液A(20mMNaH₂PO₄-Na₂HPO₄、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT，pH7.0)，震荡均匀，冰浴超声破碎，(超声条件为：功率50W，超声1s，间隔1s，持续2min)，离心取上清液，沉淀物加入150μL缓冲液A，震荡重悬。取上清及沉淀组分悬液进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达情况。SDS-PAGE电泳检测发现，诱导后的大肠杆菌菌体中表达有可溶性的重组多肽连接酶原。

实施例3重组多肽连接酶原纯化

将实施例1获得的重组载体转化到宿主细胞大肠杆菌ROSETTA(DE3)中，挑选大肠杆菌阳性转化体，接种于含有少量卡那霉素40μg/mL和氨苄青霉素75μg/mL的LB培养液中，在摇床中于40℃振荡培养过夜作为种子液，取种子液按体积比1:50的比例接种至含有卡那霉素40μg/mL和氨苄青霉素75μg/mL的LB培养液中，于40℃，250r/min条件下培养至菌液OD₆₀₀达到0.9，向每瓶菌液加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L，于28℃诱导表达15h后，离心收集菌体沉淀，-20℃冻存备用。

取1L发酵液发酵得到的冻存菌体，按每克菌体加入10mL缓冲液A(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄、200mMNaCl、1mM EDTA、1mM DTT，pH7.0)重悬菌体，用超声波细胞破碎仪冰浴裂解菌体，超声条件为：功率200W，超声5s，间隔5s，持续30min。将裂解后菌体放入高速冷冻离心机，4℃下12000r/min离心30min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。

微滤膜滤过液用MBPTrap^TM HP 5mL层析柱进行分离。将层析柱接入快速蛋白质纯化仪柱位阀中，用超纯水清洗系统和柱子，再用缓冲液A平衡柱子，然后用样品泵将滤过液上样，用缓冲液A清洗柱子，将没有结合上柱子的蛋白或者是杂质冲洗干净；再用缓冲液B(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄、100mM NaCl、1mMEDTA、10mM麦芽糖，pH7.0)进行一步洗脱，蛋白变性电泳检测洗脱峰，收集含有目的蛋白重组多肽连接酶原的洗脱峰，收集得到的体积为8mL，浓度为4.0mg/mL，即1L发酵液纯化得到的32mg重组多肽连接酶原。洗脱液的蛋白浓度采用紫外分光光度法，测量波长为280nm，摩尔吸光系数133620M^-1cm^-1，分子量为94239Da。取样20μL，用SDS-PAGE蛋白电泳检测。结果如图1所示，泳道1～4依次为总蛋白、上清蛋白、穿透蛋白和洗脱蛋白，洗脱蛋白中分子量为94.3kDa位置是目的蛋白重组多肽连接酶原的条带；出乎意料地发现，本发明只需要通过一次MBP标签亲和层析，就得到了电泳纯的重组多肽连接酶原，无需再进行其他纯化步骤(如Ni离子亲和层析等)；同时，通过SDS-PAGE灰度分析法，确定本发明中目的蛋白含量占总蛋白的60～70％，表达量高。

实施例4重组多肽连接酶原的激活

将实施例1获得的重组载体转化到宿主细胞大肠杆菌ROSETTA(DE3)中，挑选大肠杆菌阳性转化体，接种于含有少量卡那霉素50μg/mL和氨苄青霉素100μg/mL的LB培养液中，在摇床中于37℃振荡培养过夜作为种子液，取种子液按体积比1:100的比例接种至含有卡那霉素50μg/mL和氨苄青霉素100μg/mL的LB培养液中，于37℃，200r/min条件下培养至菌液OD₆₀₀达到0.8，向每瓶菌液加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，于18℃诱导表达18h后，离心收集菌体沉淀。按实施例3所述步骤分离纯化制备重组多肽连接酶原，4℃冷藏备用。

将重组多肽连接酶原在37℃条件下，用10kDa的透析袋在缓冲液Ⅰ(20mM乙酸-乙酸钠、100mMNaCl、1mM EDTA、5mM DTT，pH4.5)中透析12h激活后，将装有蛋白液的透析袋转移至缓冲液Ⅱ(20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM DTT，pH6.0)中透析6h，离心去除沉淀，即得到具有环化活性的重组多肽连接酶原激活产物。取样20μL，用SDS-PAGE蛋白电泳检测。结果如图2所示，泳道1和2分别是重组多肽连接酶原和重组多肽连接酶原激活产物，激活产物在约40kDa左右出现蛋白条带，说明在低pH条件下，重组多肽连接酶原能够很好地自激活。

进一步对激活前的重组多肽连接酶原与激活产物的相对酶活进行测试。在50μL的反应缓冲液(20mMNaH₂PO₄-Na₂HPO₄、50mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM DTT、0.05％Triton X-100，pH6.0)中，加入0.5μM激活前的重组多肽连接酶原或激活产物和50μM Kalata B1-NHV多肽(氨基酸序列为GLPVCGETCVGGTCNTPGCTCSWPVCTRNHV)。37℃温育30min后，加入终浓度为100mM的HCl来终止反应。反应液用0.22μm微孔滤膜过滤，然后取20μL通过HPLC进行分析。酶溶液的摩尔浓度采用紫外分光光度法，测量波长为280nm，摩尔吸光系数133620M^-1cm^-1。

通过液相峰面积计算环化产物的得率，将重组多肽连接酶原激活产物环化KB1-NHV多肽产物的得率定为酶活100％，从而来计算相对酶活。结果如图3所示，未进行激活的重组多肽连接酶原没有活性，激活后得到的激活产物活性显著；进一步说明了所述方法可以成功激活所述的重组多肽连接酶原。

实施例5重组多肽连接酶原激活产物的活性测试

将实施例3获得的重组多肽连接酶原在45℃条件下，用3kDa的透析袋在缓冲液Ⅰ(50mM乙酸-乙酸钠、200mM NaCl、5mM EDTA、2mM DTT，pH6.0)中透析24h激活后，将装有蛋白液的透析袋转移至缓冲液Ⅱ(50mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、200mM NaCl、5mM EDTA、1mM DTT，pH7.0)中透析8h，离心去除沉淀，即得到具有环化活性的重组多肽连接酶原激活产物。

在50μL的反应缓冲液(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄、50mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM DTT、0.05％Triton X-100，pH6.0)中，加入0.5μM重组多肽连接酶原激活产物和50μM KalataB1-NHV多肽(氨基酸序列为GLPVCGETCVGGTCNTPGCTCSWPVCTRNHV)。37℃温育20min后，加入终浓度为100mM的HCl来终止反应。反应液用0.22μm微孔滤膜过滤，然后取20μL通过HPLC进行分析鉴定。结果如图4所示，Kalata B1-NHV多肽的环化产物在线性多肽约1min后出峰，约有70％的产率；为了鉴定产物峰的身份，接取产物峰液相的流出液，取1μL点板通过MALDI-TOF进行分析鉴定，结果如图5所示，产物的分子量为2898.33Da，和理论的环化产物分子量吻合，即该产物峰就是环化产物峰。所以本发明利用大肠杆菌原核表达系统生产的重组多肽连接酶原激活产物具有良好的环化多肽的活性。

环化判定：线性多肽KBI-NHV分子量为3152.65Da，反应之后得到环化产物cyclic-KB1的分子量为2898.33Da。

实施例6重组多肽连接酶原激活产物合成环状抗菌肽的应用

将实施例3获得的重组多肽连接酶原在25℃条件下，用5kDa的透析袋在缓冲液Ⅰ(30mM乙酸-乙酸钠、50mM NaCl、3mM EDTA、4mM DTT，pH3.5)中透析8h激活后，将装有蛋白液的透析袋转移至缓冲液Ⅱ(30mM Na₂HPO₄-柠檬酸、50mM NaCl、2mM EDTA、0.75mM DTT，pH4.5)中透析2h，离心去除沉淀，即得到重组多肽连接酶原激活产物。

在50μL的反应缓冲液(50mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄、200mM NaCl、5mM EDTA、1mM DTT、0.3％TritonX-100，pH7.0)中，加入0.5μM重组多肽连接酶原激活产物和50μM菠菜叶细胞壁抗菌肽SoD6-NHV多肽(氨基酸序列为GIFSNMYARTPAGYFRGPAGYAANHV)或人唾液组胺素5的片段P113-NHV多肽(氨基酸序列为GLAKRHHGYKRKFHNHV)。60℃温育2h后，加入终浓度为100mM的HCl来终止反应。反应液用0.22μm微孔滤膜过滤，经Ziptip脱盐柱脱盐后，取1μL点板通过MALDI-TOF进行分析鉴定。结果如图6和7，所述重组多肽连接酶原激活产物能够很好地将线性的SoD6-NHV或P113-NHV抗菌肽进行首尾连接的环化，并且都是表现出专一性的环化作用，达到了合成环状抗菌肽的目的，根据MADLI-TOF质谱峰强计算环化产物cyclic-SoD6的得率为95％，环化产物cyclic-P113的得率为95％。

环化判定：线性多肽SoD6-NHV分子量为2789.12Da，反应之后得到环化产物cyclicSoD6的分子量为2534.83Da。

环化判定：线性多肽P113-NHV分子量为2085.38Da，反应之后得到环化产物cyclicP113的分子量为1831.12Da。

实施例7重组多肽连接酶原激活产物对多肽进行分子间连接的应用

将实施例3获得的重组多肽连接酶原在37℃条件下，用10kDa的透析袋在缓冲液Ⅰ(20mM乙酸-乙酸钠、100mM NaCl、2mM EDTA、5mM DTT，pH5.0)中透析16h激活后，转移至缓冲液Ⅱ(20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM DTT，pH6.5)中透析4h，离心去除沉淀，即得到重组多肽连接酶原激活产物。

在50μL的反应缓冲液(30mM NaH₂PO₄-柠檬酸、100mM NaCl、2mM EDTA、0.75mM DTT、0.1％TritonX-100，pH 4.5)中，加入0.5μM重组多肽连接酶原激活产物、50μM八肽KALVINHV(简称K)和1mM六肽GIGGIR(简称G)。25℃温育1h后，加入终浓度为100mM的HCl来终止反应。反应液用0.22μm微孔滤膜过滤，经Ziptip脱盐柱脱盐后，取1μL点板通过MALDI-TOF进行分析鉴定。结果如图8，所述重组多肽连接酶原激活产物能够很好地将八肽KALVINHV和六肽GIGGIR进行分子间连接，得到产物十二肽KALVINGIGGIR(简称KG)，根据MADLI-TOF质谱峰强计算连接产物的得率为80％。

连接判定：线性八肽KALVINHV(简称K)分子量为893.03Da，线性六肽GIGGIR(简称G)分子量为571.66Da，反应之后得到连接产物十二肽KALVINGIGGIR(简称KG)的分子量为1210.47Da。

实施例8重组多肽连接酶原激活产物环化向日葵胰蛋白酶抑制剂

在50μL的反应缓冲液(20mM 2-吗啉乙磺酸、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM DTT，pH5.5)中，加入1mg/mL实施例4获得的重组多肽连接酶原激活产物、250μM多肽底物向日葵胰蛋白酶抑制剂SFTI-NHV线形肽(氨基酸序列：GRCTKSIPPICFPNHV)。37℃温育1h后，加入终浓度为100mM的HCl来终止反应。反应液用0.22μm微孔滤膜过滤，经Ziptip脱盐柱脱盐后，取1μL点板通过MADLI-TOF进行分析鉴定。结果如图9，所述的重组多肽连接酶原激活产物能够将多肽底物SFTI-NHV进行环化。根据MADLI-TOF质谱峰强计算环化产物的得率为75％，未检测到水解产物，说明该酶制剂的催化效率和环化专一性优良。

环化判定：线性多肽SFTI-NHV分子量为1769.11Da，反应之后得到环化产物cyclicSFTI的分子量为1514.83Da。

实施例9本发明中重组多肽连接酶原激活产物与现有Butelase 1的比较

2014年新加坡学者从1kg药用植物蝶豆(Clitoria ternatea)豆荚中分离纯化得到的5mg天然Butelase1，工艺耗时长且复杂，提取产率也较低，大量生产时会受到蝶豆原料来源的限制。本发明采用大肠杆菌原核表达的方法，获得了体外自激活能力显著提高的重组多肽连接酶原，表达量高，且分离纯化只需一次亲和层析，简单高效，易于大量表达，适合工业化生产。激活所述的重组多肽连接酶原后得到的重组多肽连接酶原激活产物的生物活性及催化效率出众。

本发明所得的重组多肽连接酶原激活产物与2019年澳大利亚学者Amy M.James异源表达的Butelase 1(简称Butelase 1₍₂₀₁₉₎)相比，具有更高的催化效率和更专一的环化活性。如实施例8中所述，所述重组多肽连接酶原激活产物能催化向日葵胰蛋白酶抑制剂环化，酶反应1h环化产物的得率为75％，未检测到水解产物。在相同的酶反应条件下，Butelase 1₍₂₀₁₉₎催化向日葵胰蛋白酶抑制剂反应24h后，根据报道的MADLI-TOF质谱峰强计算环化产物的得率仅约为10％，并且约1％的底物被水解。由此可见，所述重组多肽连接酶原激活产物比Butelase 1₍₂₀₁₉₎有更高的催化效率和更专一的环化活性。

本发明所得的重组多肽连接酶原与2019年国内学者Ni Pi酵母表达系统重组表达获得的Butelase 1(简称rBTase)相比，具有表达周期更短，表达量更高，分离纯化更简单的优势。本发明的重组多肽连接酶原表达周期为15h，表达量为每升发酵液得到32mg目的蛋白，分离纯化只需一次MBP标签柱亲和层析。rBTase表达周期为96h，表达量为每升发酵液得到16mg目的蛋白，分离纯化需联用凝胶排阻层析和Ni离子亲和层析才能达到纯度符合要求的目的蛋白。

实施例10表达载体的筛选

在本发明的研究过程中，曾尝试过用pET-28a、pHUE-ubiquitin、pET-28a-SUMO和pMAL-c5x-His四种载体(载体均由广州英赞生物科技有限公司提供)来表达重组多肽连接酶原。

构建的pET-28a重组载体，表达的重组蛋白为组氨酸标签+全长多肽连接酶原，氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示，将pET-28a重组载体转入大肠杆菌ROSETTA(DE3)中进行表达。结果为无目标蛋白的表达。

构建的pHUE-ubiquitin重组载体，表达的重组蛋白为组氨酸标签+泛素标签+全长多肽连接酶原，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，将pHUE-ubiquitin重组载体转入大肠杆菌ROSETTA(DE3)中进行表达，结果为少量目标蛋白为可溶表达，大部分均为包涵体表达。

构建的pET-28a-SUMO重组载体，表达的重组蛋白为组氨酸标签+SUMO标签+全长多肽连接酶原，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，将pHUE-ubiquitin重组载体转入大肠杆菌ROSETTA(DE3)中进行表达。结果为目标蛋白为可溶表达，但是目标蛋白未能和镍离子亲和层析柱有效结合，即不能纯化得到重组多肽连接酶原。

构建的pMAL-c5x-His重组载体，表达的重组蛋白为MBP标签+全长多肽连接酶原，氨基酸序列如SEQID NO:1所示，将pMAL-c5x-His重组载体转入大肠杆菌ROSETTA(DE3)中进行表达。结果为目标蛋白为可溶表达，利用一次MBPTrapTM HP 5mL层析柱纯化即能得到重组多肽连接酶原。

综上，经过多种载体的表达筛选研究，本发明优选采用含有MBP标签的表达载体，更优选的表达载体如pMAL-c5x、pMAL-c5x-His等载体。

实施例11表达菌株的筛选

在本发明研究过程中，曾尝试过用大肠杆菌BL21(DE3)(购于天根生物科技有限公司)和大肠杆菌ROSETTA(DE3)表达菌株，来表达重组多肽连接酶原。

将实施例1获得的重组载体转化到宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)和大肠杆菌ROSETTA(DE3)中，分别挑选大肠杆菌阳性转化体进行诱导表达，结果均为重组多肽连接酶原可溶表达。利用一次MBPTrapTM HP5mL层析柱纯化均能得到重组多肽连接酶原，并在实施例4所描述的激活条件和酶活测试条件下进行激活和活性测试，结果如图10所示，大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组蛋白激活得到产物没有环化活性；大肠杆菌ROSETTA(DE3)表达的重组蛋白激活得到的产物则具有良好的环化活性。

综上，经过表达菌株的筛选研究，得到优选的表达菌株为大肠杆菌ROSETTA(DE3)。

实施例12突变位点的优化研究

在本发明的研究过程中，曾尝试过两种突变方案。

突变方案一的重组多肽连接酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，与野生型蝶豆源多肽连接酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2相比，具有以下氨基酸突变：338位赖氨酸突变为天冬氨酸；358位脯氨酸突变为天冬酰胺；359位谷氨酸突变为天冬氨酸。

突变方案二的重组多肽连接酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，与野生型蝶豆源多肽连接酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2相比，具有以下氨基酸突变：368位赖氨酸突变为谷氨酸；369位赖氨酸突变为谷氨酸。

野生型重组多肽连接酶原、所述突变方案一重组多肽连接酶原和所述突变方案二重组多肽连接酶原，在实施例2所记载的表达条件下进行表达，在实施例3所记载的纯化条件下进行纯化，在实施例4所记载的激活条件下进行激活。得到相应的产物1、产物2和产物3。在实施例4所记载的酶活测试条件下进行活性测试。结果如图11所示，突变方案一所获得的产物2相对酶活比产物1好，说明其催化效率更高，为正向突变；突变方案二所获得的产物3和产物1活性无明显差别。

综上，突变方案一可以有效地提高重组多肽连接酶原激活产物的催化效率，效果显著，可以作为优选方案。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种重组多肽连接酶原及其制备、激活方法与应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 853

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys

1 5 10 15

Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr

20 25 30

Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe

35 40 45

Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala

50 55 60

His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile

65 70 75 80

Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

85 90 95

Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu

100 105 110

Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys

115 120 125

Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro

145 150 155 160

Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

180 185 190

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

195 200 205

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

210 215 220

Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser

245 250 255

Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

260 265 270

Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

275 280 285

Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

290 295 300

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala

305 310 315 320

Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln

325 330 335

Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

340 345 350

Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn

355 360 365

Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile

370 375 380

Glu Gly Arg Ile Ser His Met Ile Arg Asp Asp Phe Leu Arg Leu Pro

385 390 395 400

Ser Gln Ala Ser Lys Phe Phe Gln Ala Asp Asp Asn Val Glu Gly Thr

405 410 415

Arg Trp Ala Val Leu Val Ala Gly Ser Lys Gly Tyr Val Asn Tyr Arg

420 425 430

His Gln Ala Asp Val Cys His Ala Tyr Gln Ile Leu Lys Lys Gly Gly

435 440 445

Leu Lys Asp Glu Asn Ile Ile Val Phe Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr

450 455 460

Asn Glu Ser Asn Pro His Pro Gly Val Ile Ile Asn His Pro Tyr Gly

465 470 475 480

Ser Asp Val Tyr Lys Gly Val Pro Lys Asp Tyr Val Gly Glu Asp Ile

485 490 495

Asn Pro Pro Asn Phe Tyr Ala Val Leu Leu Ala Asn Lys Ser Ala Leu

500 505 510

Thr Gly Thr Gly Ser Gly Lys Val Leu Asp Ser Gly Pro Asn Asp His

515 520 525

Val Phe Ile Tyr Tyr Thr Asp His Gly Gly Ala Gly Val Leu Gly Met

530 535 540

Pro Ser Lys Pro Tyr Ile Ala Ala Ser Asp Leu Asn Asp Val Leu Lys

545 550 555 560

Lys Lys His Ala Ser Gly Thr Tyr Lys Ser Ile Val Phe Tyr Val Glu

565 570 575

Ser Cys Glu Ser Gly Ser Met Phe Asp Gly Leu Leu Pro Glu Asp His

580 585 590

Asn Ile Tyr Val Met Gly Ala Ser Asp Thr Gly Glu Ser Ser Trp Val

595 600 605

Thr Tyr Cys Pro Leu Gln His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Tyr Asp Val

610 615 620

Cys Val Gly Asp Leu Phe Ser Val Ala Trp Leu Glu Asp Cys Asp Val

625 630 635 640

His Asn Leu Gln Thr Glu Thr Phe Gln Gln Gln Tyr Glu Val Val Lys

645 650 655

Asn Lys Thr Ile Val Ala Leu Ile Glu Asp Gly Thr His Val Val Gln

660 665 670

Tyr Gly Asp Val Gly Leu Ser Lys Gln Thr Leu Phe Val Tyr Met Gly

675 680 685

Thr Asp Pro Ala Asn Asp Asn Asn Thr Phe Thr Asp Lys Asn Ser Leu

690 695 700

Gly Thr Pro Arg Asp Ala Val Ser Gln Arg Asp Ala Asp Leu Ile His

705 710 715 720

Tyr Trp Glu Lys Tyr Arg Arg Ala Asn Asp Gly Ser Ser Arg Lys Ala

725 730 735

Glu Ala Lys Lys Gln Leu Arg Glu Val Met Ala His Arg Met His Ile

740 745 750

Asp Asn Ser Val Lys His Ile Gly Lys Leu Leu Phe Gly Ile Glu Lys

755 760 765

Gly His Lys Met Leu Asn Asn Val Arg Pro Ala Gly Leu Pro Val Val

770 775 780

Asp Asp Trp Asp Cys Phe Lys Thr Leu Ile Arg Thr Phe Glu Thr His

785 790 795 800

Cys Gly Ser Leu Ser Glu Tyr Gly Met Lys His Met Arg Ser Phe Ala

805 810 815

Asn Leu Cys Asn Ala Gly Ile Arg Lys Glu Gln Met Ala Glu Ala Ser

820 825 830

Ala Gln Ala Cys Val Ser Ile Pro Asp Asn Pro Trp Ser Ser Leu His

835 840 845

Ala Gly Phe Ser Val

850

<210> 2

<211> 482

<212> PRT

<213> 蝶豆(Clitoria ternatea)

<400> 2

Met Lys Asn Pro Leu Ala Ile Leu Phe Leu Ile Ala Thr Val Val Ala

1 5 10 15

Val Val Ser Gly Ile Arg Asp Asp Phe Leu Arg Leu Pro Ser Gln Ala

20 25 30

Ser Lys Phe Phe Gln Ala Asp Asp Asn Val Glu Gly Thr Arg Trp Ala

35 40 45

Val Leu Val Ala Gly Ser Lys Gly Tyr Val Asn Tyr Arg His Gln Ala

50 55 60

Asp Val Cys His Ala Tyr Gln Ile Leu Lys Lys Gly Gly Leu Lys Asp

65 70 75 80

Glu Asn Ile Ile Val Phe Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Asn Glu Ser

85 90 95

Asn Pro His Pro Gly Val Ile Ile Asn His Pro Tyr Gly Ser Asp Val

100 105 110

Tyr Lys Gly Val Pro Lys Asp Tyr Val Gly Glu Asp Ile Asn Pro Pro

115 120 125

Asn Phe Tyr Ala Val Leu Leu Ala Asn Lys Ser Ala Leu Thr Gly Thr

130 135 140

Gly Ser Gly Lys Val Leu Asp Ser Gly Pro Asn Asp His Val Phe Ile

145 150 155 160

Tyr Tyr Thr Asp His Gly Gly Ala Gly Val Leu Gly Met Pro Ser Lys

165 170 175

Pro Tyr Ile Ala Ala Ser Asp Leu Asn Asp Val Leu Lys Lys Lys His

180 185 190

Ala Ser Gly Thr Tyr Lys Ser Ile Val Phe Tyr Val Glu Ser Cys Glu

195 200 205

Ser Gly Ser Met Phe Asp Gly Leu Leu Pro Glu Asp His Asn Ile Tyr

210 215 220

Val Met Gly Ala Ser Asp Thr Gly Glu Ser Ser Trp Val Thr Tyr Cys

225 230 235 240

Pro Leu Gln His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Tyr Asp Val Cys Val Gly

245 250 255

Asp Leu Phe Ser Val Ala Trp Leu Glu Asp Cys Asp Val His Asn Leu

260 265 270

Gln Thr Glu Thr Phe Gln Gln Gln Tyr Glu Val Val Lys Asn Lys Thr

275 280 285

Ile Val Ala Leu Ile Glu Asp Gly Thr His Val Val Gln Tyr Gly Asp

290 295 300

Val Gly Leu Ser Lys Gln Thr Leu Phe Val Tyr Met Gly Thr Asp Pro

305 310 315 320

Ala Asn Asp Asn Asn Thr Phe Thr Asp Lys Asn Ser Leu Gly Thr Pro

325 330 335

Arg Lys Ala Val Ser Gln Arg Asp Ala Asp Leu Ile His Tyr Trp Glu

340 345 350

Lys Tyr Arg Arg Ala Pro Glu Gly Ser Ser Arg Lys Ala Glu Ala Lys

355 360 365

Lys Gln Leu Arg Glu Val Met Ala His Arg Met His Ile Asp Asn Ser

370 375 380

Val Lys His Ile Gly Lys Leu Leu Phe Gly Ile Glu Lys Gly His Lys

385 390 395 400

Met Leu Asn Asn Val Arg Pro Ala Gly Leu Pro Val Val Asp Asp Trp

405 410 415

Asp Cys Phe Lys Thr Leu Ile Arg Thr Phe Glu Thr His Cys Gly Ser

420 425 430

Leu Ser Glu Tyr Gly Met Lys His Met Arg Ser Phe Ala Asn Leu Cys

435 440 445

Asn Ala Gly Ile Arg Lys Glu Gln Met Ala Glu Ala Ser Ala Gln Ala

450 455 460

Cys Val Ser Ile Pro Asp Asn Pro Trp Ser Ser Leu His Ala Gly Phe

465 470 475 480

Ser Val

<210> 3

<211> 2562

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60

ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120

ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180

atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240

accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300

aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360

gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420

aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480

ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540

gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600

aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660

ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720

gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780

ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840

ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900

ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggtga aagatccgcg tattgccgcc 960

actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020

tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080

gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140

aacctcggga tcgagggaag gatttcacat atgattcgtg atgattttct gcgtctgccg 1200

agccaggcga gcaagttttt ccaggcggat gataatgtgg aaggcacccg ttgggccgtt 1260

ctggttgcgg gctctaaagg ctatgttaat tatcgccatc aggcggatgt ttgtcatgcc 1320

tatcagattc tgaaaaaagg cggtctgaaa gatgaaaata tcattgtgtt tatgtatgat 1380

gatattgcct ataatgagag taatccacat ccgggcgtga tcattaatca tccgtatggt 1440

agcgatgtgt acaagggcgt tcctaaagat tatgttggtg aggatattaa tcctccgaat 1500

ttttatgcag tgctgctggc caataagtct gcactgaccg gcaccggctc aggcaaagtt 1560

ctggatagcg gtccgaatga tcatgttttt atctattata cggatcatgg cggcgccggc 1620

gtgttaggga tgccgagcaa accgtatatc gccgcgtctg atctgaatga tgtgctgaag 1680

aaaaaacacg caagcggtac atataagtca atcgtgtttt atgtggaatc ttgcgaaagt 1740

ggctcaatgt ttgatggctt actgccagaa gatcataata tctatgtgat gggtgcgtca 1800

gatacaggtg aatcttcttg ggtgacgtat tgtccactgc aacatccgag tcctcctcca 1860

gaatatgatg tttgcgttgg cgatctgttt tcagttgctt ggttagaaga ttgcgatgtg 1920

cataacctcc agacggaaac ctttcagcag cagtatgaag tggttaaaaa caaaaccatc 1980

gttgccctga ttgaagatgg cacacatgtg gttcagtatg gggacgtggg cctgtctaaa 2040

cagaccttat ttgtgtatat gggtactgat ccagccaatg ataacaacac ctttacggat 2100

aaaaatagct tagggacgcc acgcgatgcc gtgtctcagc gcgatgccga cttaattcat 2160

tattgggaaa aatatcgtcg cgcaaatgat ggtagtagtc gcaaagccga agccaaaaaa 2220

cagttacgcg aagttatggc acatcgcatg catattgata atagcgtgaa gcacatcggc 2280

aagctgctgt ttggcattga aaaaggccat aaaatgctga ataatgtgcg ccctgcggga 2340

ctgccggtgg tggatgattg ggattgcttt aaaaccctga ttcgtacctt tgaaacccat 2400

tgcgggagcc tgagcgaata tggcatgaaa cacatgcgca gctttgccaa tctgtgcaat 2460

gcgggcattc gtaaagaaca gatggccgaa gcgagcgcgc aggcgtgcgt gagcattccg 2520

gacaatccgt ggagcagcct gcatgcgggg tttagcgtgt ga 2562

<210> 4

<211> 483

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ile Arg Asp Asp Phe Leu Arg Leu Pro Ser Gln

20 25 30

Ala Ser Lys Phe Phe Gln Ala Asp Asp Asn Val Glu Gly Thr Arg Trp

35 40 45

Ala Val Leu Val Ala Gly Ser Lys Gly Tyr Val Asn Tyr Arg His Gln

50 55 60

Ala Asp Val Cys His Ala Tyr Gln Ile Leu Lys Lys Gly Gly Leu Lys

65 70 75 80

Asp Glu Asn Ile Ile Val Phe Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Asn Glu

85 90 95

Ser Asn Pro His Pro Gly Val Ile Ile Asn His Pro Tyr Gly Ser Asp

100 105 110

Val Tyr Lys Gly Val Pro Lys Asp Tyr Val Gly Glu Asp Ile Asn Pro

115 120 125

Pro Asn Phe Tyr Ala Val Leu Leu Ala Asn Lys Ser Ala Leu Thr Gly

130 135 140

Thr Gly Ser Gly Lys Val Leu Asp Ser Gly Pro Asn Asp His Val Phe

145 150 155 160

Ile Tyr Tyr Thr Asp His Gly Gly Ala Gly Val Leu Gly Met Pro Ser

165 170 175

Lys Pro Tyr Ile Ala Ala Ser Asp Leu Asn Asp Val Leu Lys Lys Lys

180 185 190

His Ala Ser Gly Thr Tyr Lys Ser Ile Val Phe Tyr Val Glu Ser Cys

195 200 205

Glu Ser Gly Ser Met Phe Asp Gly Leu Leu Pro Glu Asp His Asn Ile

210 215 220

Tyr Val Met Gly Ala Ser Asp Thr Gly Glu Ser Ser Trp Val Thr Tyr

225 230 235 240

Cys Pro Leu Gln His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Tyr Asp Val Cys Val

245 250 255

Gly Asp Leu Phe Ser Val Ala Trp Leu Glu Asp Cys Asp Val His Asn

260 265 270

Leu Gln Thr Glu Thr Phe Gln Gln Gln Tyr Glu Val Val Lys Asn Lys

275 280 285

Thr Ile Val Ala Leu Ile Glu Asp Gly Thr His Val Val Gln Tyr Gly

290 295 300

Asp Val Gly Leu Ser Lys Gln Thr Leu Phe Val Tyr Met Gly Thr Asp

305 310 315 320

Pro Ala Asn Asp Asn Asn Thr Phe Thr Asp Lys Asn Ser Leu Gly Thr

325 330 335

Pro Arg Lys Ala Val Ser Gln Arg Asp Ala Asp Leu Ile His Tyr Trp

340 345 350

Glu Lys Tyr Arg Arg Ala Pro Glu Gly Ser Ser Arg Lys Ala Glu Ala

355 360 365

Lys Lys Gln Leu Arg Glu Val Met Ala His Arg Met His Ile Asp Asn

370 375 380

Ser Val Lys His Ile Gly Lys Leu Leu Phe Gly Ile Glu Lys Gly His

385 390 395 400

Lys Met Leu Asn Asn Val Arg Pro Ala Gly Leu Pro Val Val Asp Asp

405 410 415

Trp Asp Cys Phe Lys Thr Leu Ile Arg Thr Phe Glu Thr His Cys Gly

420 425 430

Ser Leu Ser Glu Tyr Gly Met Lys His Met Arg Ser Phe Ala Asn Leu

435 440 445

Cys Asn Ala Gly Ile Arg Lys Glu Gln Met Ala Glu Ala Ser Ala Gln

450 455 460

Ala Cys Val Ser Ile Pro Asp Asn Pro Trp Ser Ser Leu His Ala Gly

465 470 475 480

Phe Ser Val

<210> 5

<211> 558

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr

20 25 30

Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala

35 40 45

Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile

50 55 60

Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn

65 70 75 80

Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly

85 90 95

Ile Arg Asp Asp Phe Leu Arg Leu Pro Ser Gln Ala Ser Lys Phe Phe

100 105 110

Gln Ala Asp Asp Asn Val Glu Gly Thr Arg Trp Ala Val Leu Val Ala

115 120 125

Gly Ser Lys Gly Tyr Val Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp Val Cys His

130 135 140

Ala Tyr Gln Ile Leu Lys Lys Gly Gly Leu Lys Asp Glu Asn Ile Ile

145 150 155 160

Val Phe Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Asn Glu Ser Asn Pro His Pro

165 170 175

Gly Val Ile Ile Asn His Pro Tyr Gly Ser Asp Val Tyr Lys Gly Val

180 185 190

Pro Lys Asp Tyr Val Gly Glu Asp Ile Asn Pro Pro Asn Phe Tyr Ala

195 200 205

Val Leu Leu Ala Asn Lys Ser Ala Leu Thr Gly Thr Gly Ser Gly Lys

210 215 220

Val Leu Asp Ser Gly Pro Asn Asp His Val Phe Ile Tyr Tyr Thr Asp

225 230 235 240

His Gly Gly Ala Gly Val Leu Gly Met Pro Ser Lys Pro Tyr Ile Ala

245 250 255

Ala Ser Asp Leu Asn Asp Val Leu Lys Lys Lys His Ala Ser Gly Thr

260 265 270

Tyr Lys Ser Ile Val Phe Tyr Val Glu Ser Cys Glu Ser Gly Ser Met

275 280 285

Phe Asp Gly Leu Leu Pro Glu Asp His Asn Ile Tyr Val Met Gly Ala

290 295 300

Ser Asp Thr Gly Glu Ser Ser Trp Val Thr Tyr Cys Pro Leu Gln His

305 310 315 320

Pro Ser Pro Pro Pro Glu Tyr Asp Val Cys Val Gly Asp Leu Phe Ser

325 330 335

Val Ala Trp Leu Glu Asp Cys Asp Val His Asn Leu Gln Thr Glu Thr

340 345 350

Phe Gln Gln Gln Tyr Glu Val Val Lys Asn Lys Thr Ile Val Ala Leu

355 360 365

Ile Glu Asp Gly Thr His Val Val Gln Tyr Gly Asp Val Gly Leu Ser

370 375 380

Lys Gln Thr Leu Phe Val Tyr Met Gly Thr Asp Pro Ala Asn Asp Asn

385 390 395 400

Asn Thr Phe Thr Asp Lys Asn Ser Leu Gly Thr Pro Arg Lys Ala Val

405 410 415

Ser Gln Arg Asp Ala Asp Leu Ile His Tyr Trp Glu Lys Tyr Arg Arg

420 425 430

Ala Pro Glu Gly Ser Ser Arg Lys Ala Glu Ala Lys Lys Gln Leu Arg

435 440 445

Glu Val Met Ala His Arg Met His Ile Asp Asn Ser Val Lys His Ile

450 455 460

Gly Lys Leu Leu Phe Gly Ile Glu Lys Gly His Lys Met Leu Asn Asn

465 470 475 480

Val Arg Pro Ala Gly Leu Pro Val Val Asp Asp Trp Asp Cys Phe Lys

485 490 495

Thr Leu Ile Arg Thr Phe Glu Thr His Cys Gly Ser Leu Ser Glu Tyr

500 505 510

Gly Met Lys His Met Arg Ser Phe Ala Asn Leu Cys Asn Ala Gly Ile

515 520 525

Arg Lys Glu Gln Met Ala Glu Ala Ser Ala Gln Ala Cys Val Ser Ile

530 535 540

Pro Asp Asn Pro Trp Ser Ser Leu His Ala Gly Phe Ser Val

545 550 555

<210> 6

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met His His His His His His Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu

1 5 10 15

Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn

20 25 30

Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys

35 40 45

Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly

50 55 60

Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln

65 70 75 80

Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile

85 90 95

Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Ile Arg Asp Asp Phe Leu Arg Leu

100 105 110

Pro Ser Gln Ala Ser Lys Phe Phe Gln Ala Asp Asp Asn Val Glu Gly

115 120 125

Thr Arg Trp Ala Val Leu Val Ala Gly Ser Lys Gly Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Arg His Gln Ala Asp Val Cys His Ala Tyr Gln Ile Leu Lys Lys Gly

145 150 155 160

Gly Leu Lys Asp Glu Asn Ile Ile Val Phe Met Tyr Asp Asp Ile Ala

165 170 175

Tyr Asn Glu Ser Asn Pro His Pro Gly Val Ile Ile Asn His Pro Tyr

180 185 190

Gly Ser Asp Val Tyr Lys Gly Val Pro Lys Asp Tyr Val Gly Glu Asp

195 200 205

Ile Asn Pro Pro Asn Phe Tyr Ala Val Leu Leu Ala Asn Lys Ser Ala

210 215 220

Leu Thr Gly Thr Gly Ser Gly Lys Val Leu Asp Ser Gly Pro Asn Asp

225 230 235 240

His Val Phe Ile Tyr Tyr Thr Asp His Gly Gly Ala Gly Val Leu Gly

245 250 255

Met Pro Ser Lys Pro Tyr Ile Ala Ala Ser Asp Leu Asn Asp Val Leu

260 265 270

Lys Lys Lys His Ala Ser Gly Thr Tyr Lys Ser Ile Val Phe Tyr Val

275 280 285

Glu Ser Cys Glu Ser Gly Ser Met Phe Asp Gly Leu Leu Pro Glu Asp

290 295 300

His Asn Ile Tyr Val Met Gly Ala Ser Asp Thr Gly Glu Ser Ser Trp

305 310 315 320

Val Thr Tyr Cys Pro Leu Gln His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Tyr Asp

325 330 335

Val Cys Val Gly Asp Leu Phe Ser Val Ala Trp Leu Glu Asp Cys Asp

340 345 350

Val His Asn Leu Gln Thr Glu Thr Phe Gln Gln Gln Tyr Glu Val Val

355 360 365

Lys Asn Lys Thr Ile Val Ala Leu Ile Glu Asp Gly Thr His Val Val

370 375 380

Gln Tyr Gly Asp Val Gly Leu Ser Lys Gln Thr Leu Phe Val Tyr Met

385 390 395 400

Gly Thr Asp Pro Ala Asn Asp Asn Asn Thr Phe Thr Asp Lys Asn Ser

405 410 415

Leu Gly Thr Pro Arg Lys Ala Val Ser Gln Arg Asp Ala Asp Leu Ile

420 425 430

His Tyr Trp Glu Lys Tyr Arg Arg Ala Pro Glu Gly Ser Ser Arg Lys

435 440 445

Ala Glu Ala Lys Lys Gln Leu Arg Glu Val Met Ala His Arg Met His

450 455 460

Ile Asp Asn Ser Val Lys His Ile Gly Lys Leu Leu Phe Gly Ile Glu

465 470 475 480

Lys Gly His Lys Met Leu Asn Asn Val Arg Pro Ala Gly Leu Pro Val

485 490 495

Val Asp Asp Trp Asp Cys Phe Lys Thr Leu Ile Arg Thr Phe Glu Thr

500 505 510

His Cys Gly Ser Leu Ser Glu Tyr Gly Met Lys His Met Arg Ser Phe

515 520 525

Ala Asn Leu Cys Asn Ala Gly Ile Arg Lys Glu Gln Met Ala Glu Ala

530 535 540

Ser Ala Gln Ala Cys Val Ser Ile Pro Asp Asn Pro Trp Ser Ser Leu

545 550 555 560

His Ala Gly Phe Ser Val

565

<210> 7

<211> 853

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys

1 5 10 15

Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr

20 25 30

Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe

35 40 45

Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala

50 55 60

His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile

65 70 75 80

Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

85 90 95

Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu

100 105 110

Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys

115 120 125

Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro

145 150 155 160

Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

180 185 190

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

195 200 205

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

210 215 220

Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

225 230 235 240

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser

245 250 255

Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

260 265 270

Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

275 280 285

Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

290 295 300

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala

305 310 315 320

Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln

325 330 335

Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

340 345 350

Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn

355 360 365

Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile

370 375 380

Glu Gly Arg Ile Ser His Met Ile Arg Asp Asp Phe Leu Arg Leu Pro

385 390 395 400

Ser Gln Ala Ser Lys Phe Phe Gln Ala Asp Asp Asn Val Glu Gly Thr

405 410 415

Arg Trp Ala Val Leu Val Ala Gly Ser Lys Gly Tyr Val Asn Tyr Arg

420 425 430

His Gln Ala Asp Val Cys His Ala Tyr Gln Ile Leu Lys Lys Gly Gly

435 440 445

Leu Lys Asp Glu Asn Ile Ile Val Phe Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr

450 455 460

Asn Glu Ser Asn Pro His Pro Gly Val Ile Ile Asn His Pro Tyr Gly

465 470 475 480

Ser Asp Val Tyr Lys Gly Val Pro Lys Asp Tyr Val Gly Glu Asp Ile

485 490 495

Asn Pro Pro Asn Phe Tyr Ala Val Leu Leu Ala Asn Lys Ser Ala Leu

500 505 510

Thr Gly Thr Gly Ser Gly Lys Val Leu Asp Ser Gly Pro Asn Asp His

515 520 525

Val Phe Ile Tyr Tyr Thr Asp His Gly Gly Ala Gly Val Leu Gly Met

530 535 540

Pro Ser Lys Pro Tyr Ile Ala Ala Ser Asp Leu Asn Asp Val Leu Lys

545 550 555 560

Lys Lys His Ala Ser Gly Thr Tyr Lys Ser Ile Val Phe Tyr Val Glu

565 570 575

Ser Cys Glu Ser Gly Ser Met Phe Asp Gly Leu Leu Pro Glu Asp His

580 585 590

Asn Ile Tyr Val Met Gly Ala Ser Asp Thr Gly Glu Ser Ser Trp Val

595 600 605

Thr Tyr Cys Pro Leu Gln His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Tyr Asp Val

610 615 620

Cys Val Gly Asp Leu Phe Ser Val Ala Trp Leu Glu Asp Cys Asp Val

625 630 635 640

His Asn Leu Gln Thr Glu Thr Phe Gln Gln Gln Tyr Glu Val Val Lys

645 650 655

Asn Lys Thr Ile Val Ala Leu Ile Glu Asp Gly Thr His Val Val Gln

660 665 670

Tyr Gly Asp Val Gly Leu Ser Lys Gln Thr Leu Phe Val Tyr Met Gly

675 680 685

Thr Asp Pro Ala Asn Asp Asn Asn Thr Phe Thr Asp Lys Asn Ser Leu

690 695 700

Gly Thr Pro Arg Lys Ala Val Ser Gln Arg Asp Ala Asp Leu Ile His

705 710 715 720

Tyr Trp Glu Lys Tyr Arg Arg Ala Pro Glu Gly Ser Ser Arg Lys Ala

725 730 735

Glu Ala Glu Glu Gln Leu Arg Glu Val Met Ala His Arg Met His Ile

740 745 750

Asp Asn Ser Val Lys His Ile Gly Lys Leu Leu Phe Gly Ile Glu Lys

755 760 765

Gly His Lys Met Leu Asn Asn Val Arg Pro Ala Gly Leu Pro Val Val

770 775 780

Asp Asp Trp Asp Cys Phe Lys Thr Leu Ile Arg Thr Phe Glu Thr His

785 790 795 800

Cys Gly Ser Leu Ser Glu Tyr Gly Met Lys His Met Arg Ser Phe Ala

805 810 815

Asn Leu Cys Asn Ala Gly Ile Arg Lys Glu Gln Met Ala Glu Ala Ser

820 825 830

Ala Gln Ala Cys Val Ser Ile Pro Asp Asn Pro Trp Ser Ser Leu His

835 840 845

Ala Gly Phe Ser Val

850

<210> 8

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcgacaagc ttgcggccgc actcgagcac caccaccacc accactgaga tccggctgct 60

aacggatcc 69

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgccatatg attcgtgatg attttctgcg 30

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgcgtcgac tcacacgcta aaccccg 27

<210> 11

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Leu Pro Val Cys Gly Glu Thr Cys Val Gly Gly Thr Cys Asn Thr

1 5 10 15

Pro Gly Cys Thr Cys Ser Trp Pro Val Cys Thr Arg Asn His Val

20 25 30

<210> 12

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gly Ile Phe Ser Asn Met Tyr Ala Arg Thr Pro Ala Gly Tyr Phe Arg

1 5 10 15

Gly Pro Ala Gly Tyr Ala Ala Asn His Val

20 25

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gly Leu Ala Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg Lys Phe His Asn His

1 5 10 15

Val

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Lys Ala Leu Val Ile Asn His Val

1 5

<210> 15

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gly Ile Gly Gly Ile Arg

1 5

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Lys Ala Leu Val Ile Asn Gly Ile Gly Gly Ile Arg

1 5 10

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gly Arg Cys Thr Lys Ser Ile Pro Pro Ile Cys Phe Pro Asn His Val

1 5 10 15

Claims

1.一种重组多肽连接酶原，其特征在于：

如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。

2.一种DNA分子，其特征在于：

所述的DNA分子编码权利要求1所述的重组多肽连接酶原。

3.一种重组表达载体，其特征在于：

含有编码权利要求1所述的重组多肽连接酶原的核苷酸序列。

4.一种重组多肽连接酶原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将编码权利要求1所述的重组多肽连接酶原的核苷酸序列克隆入表达载体中构建重组表达载体；再将所述的重组表达载体转化原核表达系统中进行诱导表达，固液分离收集菌体沉淀，纯化后得到所述的重组多肽连接酶原。

5.根据权利要求4所述的重组多肽连接酶原的制备方法，其特征在于：

所述的原核表达系统为大肠杆菌表达系统和大肠杆菌ROSETTA (DE3)；

所述的表达载体为含有MBP标签的表达载体和pMAL-c5x或pMAL-c5x-His；

所述的诱导表达的具体操作步骤为：将阳性转化体接种于LB培养液进行培养，当菌液OD₆₀₀达到0.5～0.9时，加入终浓度为0.1～0.6 mmol/L的IPTG，15～30℃诱导12～28 h；所述的LB培养液中含有卡那霉素30～50 μg/mL和氨苄青霉素50～100 μg/mL。

6.一种重组多肽连接酶原的激活方法，其特征在于，包括如下步骤：

将通过权利要求4或5所述的制备方法制备得到的重组多肽连接酶原先在pH为3.5～6的环境下进行第一次透析，再于pH为4.5～7的环境下进行第二次透析，固液分离去除沉淀，得到重组多肽连接酶激活产物。

7.根据权利要求6所述的重组多肽连接酶原的激活方法，其特征在于：

所述的激活方法在25～45℃下进行；

所述的第一次透析在包含如下组分的缓冲液Ⅰ中进行：20～50 mM乙酸-乙酸钠、50～200 mM NaCl、1～5 mM EDTA、2～5 mM DTT；

所述的第一次透析的时间为8～24 h；

所述的第二次透析在包含如下组分的缓冲液Ⅱ中进行：20～50 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄或Na₂HPO₄-柠檬酸、50～200 mM NaCl、1～5 mM EDTA、0.5～1 mM DTT；

所述的第二次透析的时间为2～8 h。

8.一种重组多肽连接酶原激活产物，其特征在于：

通过权利要求6或7所述的重组多肽连接酶原的激活方法得到。

9.权利要求1所述的重组多肽连接酶原或权利要求8所述的重组多肽连接酶原激活产物的应用，其特征在于：

所述的应用包括用于多肽或蛋白质的环化、多肽与多肽或蛋白质之间的连接、蛋白质与蛋白质之间的连接、蛋白质或多肽与其它化合物的连接中；

当用于多肽或蛋白质的环化时，所述的多肽或蛋白质的C端含有天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸序列，N端第一位氨基酸是除了脯氨酸以外的19种常见氨基酸，N端第二位氨基酸残基为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或者半胱氨酸；

当用于多肽与多肽或蛋白质之间的连接、蛋白质与蛋白质之间的连接时，至少有一个多肽或蛋白质的C端含有天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸序列，另一个多肽或蛋白质的N端第一位氨基酸是除了脯氨酸以外的19种常见氨基酸，N端第二位氨基酸残基为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或者半胱氨酸。

10.根据权利要求9所述的重组多肽连接酶原或所述的重组多肽连接酶原激活产物的应用，其特征在于：

所述的应用的条件为温度为25～60℃，pH为4.5～7；

所述的应用在含有如下成分的缓冲液中进行：

（1）20～50 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、Na₂HPO₄-柠檬酸或2-吗啉乙磺酸，50～200 mM NaCl，1～5 mM EDTA，0.5～1 mM DTT；

或

（2）20～50 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、Na₂HPO₄-柠檬酸或2-吗啉乙磺酸，50～200 mM NaCl，1～5 mM EDTA，0.5～1 mM DTT，0.05%～0.3%的Triton X-100。