CN114854782B - 一种高效表达具有高活性的重组多肽连接酶原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效表达具有高活性的重组多肽连接酶原的方法。本发明方法是将含有编码序列如SEQ ID NO.1所示重组多肽连接酶原的DNA分子以及序列如SEQ ID NO.3所示核糖体结合位点的重组表达载体转化入工程细胞E.coli Rosetta gami B(DE3)后，再进行诱导表达。该方法将重组多肽连接酶酶活得率从160.88U/L发酵液提高到7448.40U/L发酵液，提高了约46倍。本发明所述方法简便高效，原料简单，分离纯化易行，易于大量表达，适合工业化生产，具有广阔的应用前景。

Description

一种高效表达具有高活性的重组多肽连接酶原的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种高效表达具有高活性的重组多肽连接酶原的方法。
背景技术
Butelase-1是一种天冬酰胺内肽酶（AEP）类连接酶，2014年首次报道了从药用植物蝶豆（Clitoria ternatea）豆荚中分离纯化出Butelase-1，发现其可以特异性识别多肽/蛋白质C端的N（D）HV三肽基序，对N端的选择性则较小（第一位可以是除Pro以外的其他19种天然氨基酸，第二位更偏好脂肪族氨基酸，比如异亮氨酸/亮氨酸/缬氨酸/半胱氨酸），而且它的催化速率可以达到1.34×106M-1s-1，是其他连接酶的10000倍以上，因此与其他多肽/蛋白质连接酶相比，Butelase-1具有底物范围广、识别基序简单、催化速度快、可实现“无痕”环化等特点。
但是，受制备技术的限制，目前Butelase-1的制备方法仍不完善。从植物中天然提取的方法受原料限制，并且提取工艺复杂繁琐、耗时长、产率低，耗时3天仅能从1 kg新鲜豆荚中得到5 mg天然Butelase-1。因此，利用异源表达技术制备活性Butelase-1是当前的研究热点。
到目前为止，有学者尝试利用毕赤酵母真核表达系统重组表达Butelase-1，但是，与大肠杆菌原核表达系统相比，真核表达体系表达量低，表达周期长，分离纯化成本高，更优选的表达系统应为大肠杆菌原核表达系统。澳大利亚学者James通过大肠杆菌异源表达全长氨基酸序列的Butelase-1，但其活性远不及天然提取的Butelase-1，孵育12 h仅得到少量产物。中国学者Zhao通过大肠杆菌异源表达去除信号肽的Butelase-1酶原，重组Butelase-1酶原的N端带有一个MBP促溶标签，实现了重组Butelase-1酶原的可溶表达，虽然活性较澳大利亚学者James获得的重组Butelase-1有所提高，但激活后活性Butelase-1的量较少，活性也不及天然提取的Butelase-1。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种高效表达具有高活性的重组多肽连接酶原的方法，所述的重组多肽连接酶原激活后产物的活性获得了显著的提高。
本发明的另一目的在于提供一种具有高活性的重组多肽连接酶原。
本发明的再一目的在于提供上述具有高活性的重组多肽连接酶原的应用。
本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种高效表达具有高活性的重组多肽连接酶原的方法，是将含有编码重组多肽连接酶原的DNA分子以及核糖体结合位点（RBS）的重组表达载体转化入工程细胞后，再进行诱导表达，获得具有高活性的重组多肽连接酶原；其中：
所述的重组多肽连接酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，与中国发明专利202010010362.4记载的重组多肽连接酶原相比，具有以下氨基酸突变：66位缬氨酸突变成为亮氨酸、139位缬氨酸突变成为亮氨酸、168位缬氨酸突变成为亮氨酸、218位缬氨酸突变成为亮氨酸、366位缬氨酸突变成为亮氨酸，并且，将编码亮氨酸的密码子突变为稀有密码子CUA。
所述的核糖体结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述的重组表达载体的骨架载体优选为原核表达载体；更优选为pMAL系列载体；最优选为pMAL-c5x-His。
所述的工程细胞优选为大肠杆菌细胞；更优选为Rosetta gami B(DE3)细胞。
所述的DNA分子的序列优选如SEQ ID NO.2所示。
优选的，在获得具有高活性的重组多肽连接酶原后，继续进行如处理：将所述的重组多肽连接酶原先在pH为3.5～6的环境下进行第一次透析，再于pH为4.5～7的环境下进行第二次透析，固液分离去除沉淀，得到重组多肽连接酶原的激活产物。
所述的激活方法优选在25～45℃下进行。
所述的第一次透析优选在包含如下组分的缓冲液Ⅰ中进行：20～50 mM乙酸-乙酸钠、50～200 mM NaCl、1～5 mM EDTA、2～5 mM DTT。
所述的第一次透析的时间优选为8～12 h。
所述的第二次透析优选在包含如下组分的缓冲液Ⅱ中进行：20～50 mM Na2HPO4-NaH2PO4、50～200 mM NaCl、1～5 mM EDTA、0.5～1 mM DTT。
所述的第二次透析的时间优选为2～8 h。
所述的透析优选在透析袋中进行，所述的透析袋优选为截留分子量为3～10 kDa的透析袋。
一种具有高活性的重组多肽连接酶原，为上述方法中的重组多肽连接酶原。
上述重组多肽连接酶原相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
1）编码所述的重组多肽连接酶原的DNA分子；
2）含有1）中所述DNA分子的表达盒；
3）含有1）中所述DNA分子的重组表达载体，或含有2）中所述表达盒的重组表达载体；
4）含有1）中所述DNA分子的重组工程细胞株，或含有2）中所述表达盒的重组工程细胞株，或含有3）所述重组表达载体的重组工程细胞株；
5）所述的重组多肽连接酶原的激活产物。
所述的DNA分子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。
所述的重组表达载体的骨架载体优选为上述方法中的骨架载体。
所述的工程细胞株优选为上述方法中的工程细胞株。
上述重组多肽连接酶原或上述重组多肽连接酶原相关的生物材料的应用，包括用于多肽或蛋白质的环化、多肽与多肽或蛋白质之间的连接、蛋白质与蛋白质之间的连接、蛋白质或多肽与其它化合物的连接。
当用于多肽或蛋白质的环化时，所述的多肽或蛋白质的C端含有天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸（NHV）序列，N端第一位氨基酸是除了脯氨酸以外的19种常见氨基酸，N端第二位氨基酸残基需是脂肪族氨基酸；所述的多肽或蛋白质优选为线性多肽或蛋白质。
所述的环化的形式为，多肽或蛋白质的C端的组氨酸-缬氨酸（HV）序列断裂，然后N端和C端首尾以酰胺键相连即得到环肽。
当用于多肽与多肽或蛋白质之间的连接、蛋白质与蛋白质之间的连接时，至少有一个多肽或蛋白质的C端含有天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸（NHV）序列，另一个多肽或蛋白质满足N端第一位氨基酸是除了脯氨酸以外的19种常见氨基酸，N端第二位氨基酸残基需是脂肪族氨基酸。
所述的连接的形式为，一条多肽或蛋白质的C端的组氨酸-缬氨酸(HV)序列断裂，然后和另一条多肽或蛋白质的N端形成酰胺键即得到连接产物。
所述的应用的条件优选为：温度为25～60℃，pH为4.5～7。
所述的应用优选在含有如下成分的缓冲液中进行：20～50 mM Na2HPO4-NaH2PO4、，50～200 mM NaCl，1～5 mM EDTA，0.5～1 mM DTT。
所述的缓冲液优选还含有0.05%～0.3%的Triton X-100。
一种用于高效表达具有高活性的重组多肽连接酶原的核糖体结合位点，为上述方法中的核糖体结合位点。
上述核糖体结合位点相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
1）含有所述核糖体结合位点的表达盒；
2）含有所述核糖体结合位点的重组表达载体，或含有1）中所述表达盒的重组表达载体；
3）含有所述核糖体结合位点的重组工程细胞株，或含有1）中所述表达盒的重组工程细胞株，或含有2）所述重组表达载体的重组工程细胞株。
所述的重组表达载体的骨架载体优选为上述方法中的骨架载体。
所述的工程细胞株优选为上述方法中的工程细胞株。
上述核糖体结合位点或上述核糖体结合位点相关的生物材料的应用，应用于高效表达具有高活性的重组多肽连接酶原。
所述的诱导表达具体包括如下步骤：
（1）取重组工程细胞株，接种于LB液体培养基中培养，得到重组工程细胞种子液；
（2）取所得种子液接种于LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD600=0.6～0.8；
（3）向所得菌液中加入IPTG至终浓度为0～10 μmol/L，诱导细胞表达目的蛋白，离心收集菌体沉淀，所得菌体沉淀中包含所述的重组多肽连接酶原；
所述的LB培养基均优选为含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。
步骤（1）中所述的培养的条件优选为振荡培养；更优选为于37℃振荡培养过夜。
步骤（2）中所述的重组工程细胞种子液和LB培养基的配比优选为体积比1:50～110；更优选为体积比1:100。
步骤（2）中所述的培养的条件优选为温度35～38℃、转速150～200 r/min；更优选为温度37℃、转速180 r/min。
步骤（3）中所述的加入诱导剂IPTG至终浓度为0～10 μmol/L优选为加入诱导剂IPTG至终浓度为6 μmol/L。
步骤（3）中所述的诱导的条件优选为于16～20℃诱导16～20 h；更优选为于18℃诱导18 h。
步骤（3）中所述的离心的条件优选为4℃下3000～5000 g离心20～40 min；更优选为4℃下4000 g离心30 min。
优选的，还包括如下步骤：
（4）向所得菌体沉淀中加入裂解缓冲液，震荡重悬菌体；
（5）将所得重悬液超声处理，离心除去沉淀，过滤，得到上清液；
（6）通过直链淀粉树脂亲和层析纯化目的蛋白，收集洗脱液，即获得所述的重组多肽连接酶原。
步骤（4）中所述的裂解缓冲液的配方优选为：20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4、100mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT，pH为7.0。
步骤（4）中所述的菌体沉淀和裂解缓冲液的配比优选为质量体积比1 g:5～10mL；更优选为1 g:5 mL。
步骤（5）中所述的超声处理的条件优选为功率200～300 W，超声4～6 s，间隔4～5s，持续20～30 min；更优选为功率250 W，超声5 s，间隔5 s，持续30 min。
步骤（5）中所述的离心的条件优选为4℃下10000～15000 g离心20～40 min；更优选为4℃下12000 g离心30 min。
步骤（5）中所述的过滤优选为使用孔径为0.22 μm微孔滤膜过滤。
步骤（6）中所述的直链淀粉树脂亲和层析所用的结合缓冲液配方优选为：20mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT，pH为7.0。
步骤（6）中所述的直链淀粉树脂亲和层析所用的洗脱缓冲液配方优选为：20mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、5 mmol/L麦芽糖，pH为7.0。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明采用大肠杆菌原核表达的方法，制备了可溶性的且能被高效激活的重组多肽连接酶原，目的蛋白含量占总蛋白的80%～90%，表达量高，且分离纯化只需一次亲和层析，简单高效，易于大量表达，适合工业化生产。
2、本发明在对原核表达体系进行密码子优化的基础上，将66位、139位、168位、218位和366位缬氨酸突变成为亮氨酸，并将编码亮氨酸的密码子突变成为稀有密码子CUA，从而降低了蛋白质的翻译速率，酶原有重组时间正确折叠，激活后酶活性增高。
3、通过优化蛋白表达的RBS元件和表达菌株E.coliRosetta gami B(DE3)等工作，将重组多肽连接酶原激活产物的酶活得率从160.88 U/L发酵液提高到7448.40 U/L发酵液，提高约46倍，且重组多肽连接酶原激活产物的催化能力与野生型多肽连接酶相当。
附图说明
图1为重组多肽连接酶原表达的SDS-PAGE图；其中，泳道M为预染蛋白Marker；泳道1～5依次为总蛋白、上清蛋白、沉淀、穿透蛋白和洗脱蛋白；
图2为重组多肽连接酶原激活后的SDS-PAGE图；其中，泳道M为预染蛋白Marker；泳道1～3分别是重组多肽连接酶原、重组多肽连接酶原激活产物和激活后上清液；
图3为重组多肽连接酶原激活前和激活后的活性测试图；
图4为重组多肽连接酶原激活产物环化多肽KB1-NHV的HPLC图；
图5为重组多肽连接酶原激活产物环化多肽KB1-NHV的产物峰的MALDI-TOF/MS图；
图6为重组多肽连接酶原激活产物环化多肽Lunasin的HPLC图；
图7为Peak1和Peak2的MALDI-TOF/MS图；
图8为重组多肽连接酶原激活产物的酶动力学曲线与参数图；
图9是优化前后重组多肽连接酶原激活产物的比酶活对比图；
图10是稀有密码子突变前后重组多肽连接酶原激活产物的总酶活对比图；
图11是不同强度RBS调控重组多肽连接酶原激活产物的总酶活对比图；
图12宿主细胞为Rosetta和Rosetta gami B(DE3)时重组多肽连接酶原激活产物的总酶活对比图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
除无特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
实施例1构建含编码重组多肽连接酶原的核苷酸序列的重组载体
构建含编码重组多肽连接酶原的核苷酸序列的重组载体，包括如下步骤：
（1）根据重组多肽连接酶原的氨基酸序列（SEQ ID NO.1），利用PCR的方法，人工合成编码所述重组多肽连接酶原的DNA分子，具体如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1（方框内为突变氨基酸）：
MIRDDFLRLPSQASKFFQADDNVEGTRWAVLVAGSKGYVNYRHQADVCHAYQILKKGGLKDENIILFMYDDIAYNESNPHPGVIINHPYGSDVYKGVPKDYVGEDINPPNFYAVLLANKSALTGTGSGKVLDSGPNDHLFIYYTDHGGAGVLGMPSKPYIAASDLNDLLKKKHASGTYKSIVFYVESCESGSMFDGLLPEDHNIYVMGASDTGESSWLTYCPLQHPSPPPEYDVCVGDLFSVAWLEDCDVHNLQTETFQQQYEVVKNKTIVALIEDGTHVVQYGDVGLSKQTLFVYMGTDPANDNNTFTDKNSLGTPRKAVSQRDADLIHYWEKYRRAPEGSSRKAEAKKQLREVMAHRMHIDNSLKHIGKLLFGIEKGHKMLNNVRPAGLPVVDDWDCFKTLIRTFETHCGSLSEYGMKHMRSFANLCNAGIRKEQMAEASAQACVSIPDNPWSSLHAGFSV。
SEQ ID NO.2：
ATGATTCGTGATGATTTTCTGCGTCTGCCGAGCCAGGCGAGCAAGTTTTTCCAGGCGGATGATAATGTGGAAGGCACCCGTTGGGCCGTTCTGGTTGCGGGCTCTAAAGGCTATGTTAATTATCGCCATCAGGCGGATGTTTGTCATGCCTATCAGATTCTGAAAAAAGGCGGTCTGAAAGATGAAAATATCATTCTATTTATGTATGATGATATTGCCTATAATGAGAGTAATCCACATCCGGGCGTGATCATTAATCATCCGTATGGTAGCGATGTGTACAAGGGCGTTCCTAAAGATTATGTTGGTGAGGATATTAATCCTCCGAATTTTTATGCAGTGCTGCTGGCCAATAAGTCTGCACTGACCGGCACCGGCTCAGGCAAAGTTCTGGATAGCGGTCCGAATGATCATCTATTTATCTATTATACGGATCATGGCGGCGCCGGCGTGTTAGGGATGCCGAGCAAACCGTATATCGCCGCGTCTGATCTGAATGATCTACTGAAGAAAAAACACGCAAGCGGTACATATAAGTCAATCGTGTTTTATGTGGAATCTTGCGAAAGTGGCTCAATGTTTGATGGCTTACTGCCAGAAGATCATAATATCTATGTGATGGGTGCGTCAGATACAGGTGAATCTTCTTGGCTAACGTATTGTCCACTGCAACATCCGAGTCCTCCTCCAGAATATGATGTTTGCGTTGGCGATCTGTTTTCAGTTGCTTGGTTAGAAGATTGCGATGTGCATAACCTCCAGACGGAAACCTTTCAGCAGCAGTATGAAGTGGTTAAAAACAAAACCATCGTTGCCCTGATTGAAGATGGCACACATGTGGTTCAGTATGGGGACGTGGGCCTGTCTAAACAGACCTTATTTGTGTATATGGGTACTGATCCAGCCAATGATAACAACACCTTTACGGATAAAAATAGCTTAGGGACGCCACGCAAAGCCGTGTCTCAGCGCGATGCCGACTTAATTCATTATTGGGAAAAATATCGTCGCGCACCAGAAGGTAGTAGTCGCAAAGCCGAAGCCAAAAAACAGTTACGCGAAGTTATGGCACATCGCATGCATATTGATAATAGCCTAAAGCACATCGGCAAGCTGCTGTTTGGCATTGAAAAAGGCCATAAAATGCTGAATAATGTGCGCCCTGCGGGACTGCCGGTGGTGGATGATTGGGATTGCTTTAAAACCCTGATTCGTACCTTTGAAACCCATTGCGGGAGCCTGAGCGAATATGGCATGAAACACATGCGCAGCTTTGCCAATCTGTGCAATGCGGGCATTCGTAAAGAACAGATGGCCGAAGCGAGCGCGCAGGCGTGCGTGAGCATTCCGGACAATCCGTGGAGCAGCCTGCATGCGGGGTTTAGCGTGTGA。
（2）载体上RBS的替换。合成引物序列如下：
RBS-FP：5'-CGCTAAAGACATAAGGCAAGACACCCATAGATTATGAAAATCGAAGAAGG-3'；
RBS-RP：5'-GCCTTATGTCTTTAGCGTGTTGGTCAATTGCTCGTGAAAA-3'。
利用PCR技术用如SEQ ID NO.3所示的RBS替换原载体的RBS，以（1）中的DNA分子为模板，加入25 μL 2×PfuMax HiFi PCR ProMix （由广州英赞生物科技有限公司生产，EnzyValley，货号P217）、上下游引物RBS-FP和RBS-RP各1 μL以及适量的灭菌水，进行PCR扩增。扩增条件为：98℃ 30 s；98℃ 10 s，63℃ 30 s，72℃ 2 min 30 s，共30个循环；72℃ 5min。琼脂糖凝胶电泳回收大小约7.1 kb的目的基因片段，用Dpn I快切酶消化模板后将消化产物转化至DH5α感受态细胞中。
SEQ ID NO.3：
ACGCTAAAGACATAAGGCAAGACAC。
（3）挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，并将阳性单克隆送往测序公司测序验证，证实编码重组多肽连接酶原的DNA分子的正确性，培养验证正确的感受态细胞，并提取质粒，所获得的质粒即为改造后含有编码重组多肽连接酶原的DNA分子的重组载体。
实施例2表达重组多肽连接酶原的转化体的制备
将实施例1获得的重组载体转化到宿主细胞E.coliRosetta gami B(DE3)中，挑取单菌落，接种至LB液体培养基（含100 μg/mL氨苄青霉素）培养至菌液OD600=0.6，加入IPTG至终浓度为6 μmol/L，18℃诱导18 h，收集菌体沉淀超声破碎，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，发现所制备的转化体能够高效表达重组多肽连接酶原。
实施例3重组多肽连接酶原在重组大肠杆菌中的表达和鉴定
将实施例2获得的能够表达重组多肽连接酶原的阳性转化体菌种，接种至含100 μg/mL氨苄青霉素的5 mL LB液体培养基中，放置于37℃摇床中震荡培养过夜；取过夜培养的种子液，按体积比1:100接种至250 mL含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床中继续震荡培养至菌液OD600=0.6；向每瓶菌液加入IPTG至终浓度为6 μmol/L，18℃继续震荡诱导18 h；离心收集诱导后菌体并称重，记录菌体湿重；取诱导前及诱导后菌液各1mL，12000 g离心1 min后取沉淀，加入150 μL裂解缓冲液（20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4、100mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT，pH为7.0），震荡均匀，超声破碎（250 W功率，超声0.5 s，间隔0.5 s，超声时长1 min），离心取上清液，沉淀物加入150 μL裂解缓冲液，震荡重悬。取上清及沉淀组分悬液进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达情况如图1所示，表达结果为上清液在94 kDa处有明显蛋白条带，而沉淀组分悬浮液在此处没有明显蛋白条带。
实施例4重组多肽连接酶原纯化
（1）首先将重组菌体超声破碎。向-20℃冻存的菌体沉淀中加入20 mL裂解缓冲液重悬菌体，用超声波细胞破碎仪冰浴裂解菌体，超声条件为：功率250 W，超声5 s，间隔5 s，持续30 min。将裂解后菌体放入高速冷冻离心机，4℃下12000 g离心30 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。
（2）其次为直链淀粉树脂亲和层析。纯化选用的层析柱是MBP Trap™ HP 5 mL（购自GEHealthcare）。结合缓冲液A：20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4、100 mmol/L NaCl、1 mmol/LEDTA、pH为7.0，缓冲液B：20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L麦芽糖，pH为7.0，0.22 μm滤膜过滤。
（3）将MBP Trap™ HP 5 mL接入快速蛋白质纯化仪柱位阀中，用超纯水清洗系统和柱子，再用结合缓冲液A平衡柱子，然后用样品泵将步骤（1）所述上清液上样，上样完毕，先用缓冲液A清洗柱子，将没有结合上柱子的蛋白或者是杂质冲洗干净，再用洗脱缓冲液B进行洗脱，收集含有目的蛋白重组多肽连接酶原的洗脱峰。分别对各个洗脱峰取样20 μL，用SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果如图1所示。
实施例5重组多肽连接酶原的激活
将实施例4中收集到的洗脱液在37℃条件下，用10 kDa透析袋在激活缓冲液（20mmol/L 乙酸-乙酸钠、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、5 mmol/L DTT，pH为4.5）中透析12 h激活后，再将透析袋转移至活性缓冲液（20mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4、100 mmol/LNaCl、1 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L DTT，pH为6.0）中4℃透析8 h，离心去除沉淀，上清液中包含具有环化活性的重组多肽连接酶原激活产物。取样20 μL，用SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果如图2所示，激活产物在约40 kDa左右出现蛋白条带，说明在低pH条件下，重组多肽连接酶原能够很好地自激活。并且从图3可以看到，未激活的重组多肽连接酶原没有活性，激活后得到的激活产物活性显著。
实施例6重组多肽连接酶原激活产物的活性测试
在50 μL的活性缓冲液（20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4、100 mmol/L NaCl、1 mmol/LEDTA、0.5 mmol/L DTT，pH为6.0）中，加入终浓度为0.5 μg/mL实施例4中的重组多肽连接酶原激活产物和50 μmol/L KB1-NHV多肽（氨基酸序列为GLPVCGETCVGGTCNTPGCTCSWPVCTRNHV）。42℃温育一定时间后，加入终浓度为100 mmol/L的HCl来终止反应。反应液用0.22 μm微孔滤膜过滤，然后取20 μL通过RP-HPLC分析鉴定。
酶活力单位定义（U）为：以KB1-NHV线性多肽为底物，在活性缓冲液中，反应温度42℃的条件下，1 min催化1 nmol KB1-NHV环化所需的酶量为1 U。
实施例7重组多肽连接酶催化KB1-NHV环化产物的鉴定
实施例6中反应液的RP-HPLC分析结果如图4所示，图中出现两个色谱峰，保留时间分别为12.3 min和13.6 min，其中保留时间为13.7min的色谱峰为产物峰。通过MALDI-TOF/MS对产物进行分析鉴定，质谱图如图5，结果显示产物的分子量为2898.22 Da，和环状KB1理论分子量（2898.33 Da）相符，所以确定该产物为环化产物。
实施例8重组多肽连接酶原激活产物合成环状多肽的应用
在50 μL的活性缓冲液中，加入终浓度为100 μg/mL重组多肽连接酶原激活产物和100 μM多肽（氨基酸序列为LTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDDSKWQHQQDSCRKQLQGVNHV），42℃孵育6 h，将反应液装于200 Da的透析袋中，4℃下在超纯水中透析16 h脱盐后，用RP-HPLC分析。液相色谱结果如图6，可以看到图中出现两个色谱峰，保留时间分别为9.7 min和11.1min，通过MALDI-TOF/MS鉴定两个峰，质谱图如图7，结果显示峰1的分子量与底物的理论分子量相同，峰2与产物的理论分子量相同，因此可以确定峰2为环化产物，并根据液相色谱峰面积计算环化产物的得率为91.7%。
实施例9本发明中重组多肽连接酶原激活产物与现有Butelase-1的比较
2014年新加坡学者从1 kg药用植物蝶豆（Clitoria ternatea）新鲜豆荚中分离纯化得的5 mg天然Butelase-1，工艺耗时长且复杂，提取产率也很低，不适合大量生产。本发明采用大肠杆菌原核表达的方法，获得了体外自激活能力显著提高的重组多肽连接酶原，不仅表达量高，而且分离纯化只需一次亲和层析，简单高效，易于大量表达，适合工业化生产。所述的重组多肽连接酶原激活后得到的重组多肽连接酶原激活产物（简称Butelase-1(R)）的生物活性及催化效率出众。
本发明所得的重组多肽连接酶原激活产物酶动力学参数：K m=229.89 μmol/L，k cat=2.53 s-1，k cat/K m=11048 M-1s-1，酶动力学曲线如图8所示，与2014年Nguyen提取的天然Butelase-1（简称Butelase-1(natural)）几乎一致，说明本发明所得的重组多肽连接酶原激活产物的活性水平已达到天然Butelase-1。
本发明所得的重组多肽连接酶原激活产物与2019年澳大利亚学者Amy M James大肠杆菌异源表达的Butelase-1（简称Butelase-1(2019)）相比，具有更高的催化效率和更专一的环化活性。所述重组多肽连接酶原激活产物能催化向日葵胰蛋白酶抑制剂环化，酶反应10 min环化产物的得率为75%，未检测到水解产物；在相同的酶反应条件下，Butelase-1(2019)催化向日葵胰蛋白酶抑制剂反应24 h后，环化产物的得率仅约为10%，并且约1%的底物被水解。由此可见，所述重组多肽连接酶原激活产物比Butelase-1(2019)有更高的催化效率和更专一的环化活性。
本发明所得的重组多肽连接酶原与2019年国内学者Ni Pi酵母表达系统重组表达获得的Butelase-1（简称rBTase）相比，具有表达周期更短，表达量更高，分离纯化更简单的优势。本发明的重组多肽连接酶原表达周期为15 h，表达量为每升发酵液得到200 mg目的蛋白，分离纯化只需一次MBP标签柱亲和层析。rBTase表达周期为96 h，表达量为每升发酵液得到16 mg目的蛋白，分离纯化需联用凝胶排阻层析和Ni离子亲和层析才能达到纯度符合要求的目的蛋白。
本发明所得的重组多肽连接酶原与2021年国内学者Zhao大肠杆菌异源表达的Butelase-1（简称Butelase-1(2021)）相比，具有更高的催化效率。如实施例5中所述，所述重组多肽连接酶原激活产物能催化KB1-NHV多肽环化，计算得到所述重组多肽连接酶原激活产物的比酶活为386.93 U/mg，而Butelase-1(2021)的比酶活为69.12 U/mg，如图9所示。由此可见，所述重组多肽连接酶原激活产物比Butelase-1(2021)有更高的催化效率。
实施例10稀有密码子替换后的研究
将66、139、168、218、366位缬氨酸突变为亮氨酸的重组表达载体转化到宿主细胞大肠杆菌Rosetta中，分别挑选大肠杆菌阳性转化体进行诱导表达，利用一次MBP Trap™HP 5 mL层析柱纯化得到重组多肽连接酶原，并在实施例4所描述的激活条件和酶活测试条件下进行激活和活性测试，结果如图10所示，突变后的重组蛋白激活产物更好，为正向突变。
实施例11 RBS的筛选
在本发明研究过程中，共设计了9种其他的RBS来调控表达重组多肽连接酶。
首先利用在线网站RBS Calculator（https://salislab.net/software/predict_rbs_calculator）计算所用载体pMAL-c5x-His原有RBS的强度（T.I.R），再利用RBSCalculator设计不同强度的RBS（RBS1-RBS9）。设计RBS的方法是，首先输入蛋白CDS序列，继续输入目标翻译起始速率即RBS强度，之后选择宿主菌株后提交，即可得到所需强度的RBS（如表1所示）。
将携带9种RBS的重组表达载体转化到宿主细胞大肠杆菌Rosetta中，分别挑选大肠杆菌阳性转化体进行诱导表达，利用一次MBP Trap™ HP 5 mL层析柱纯化得到重组多肽连接酶原，并在实施例4所描述的激活条件和酶活测试条件下进行激活和活性测试，结果如图11所示，RBS7（即SEQ ID NO:3）调控的重组蛋白激活产物活性显著高于原有RBS和其他8种RBS调控的重组蛋白激活产物活性。
表1设计的9种不同强度RBS
RBS名称 序列（5'-3'） RBS强度（T.I.R）
Control AAGGA 1589.57
RBS1 GAAAGTTTGACAATAATCTATCAA 144.93
RBS2 GGCTATAATAAGTCAAGTTCGCAT 194.25
RBS3 TAGTAGAAAACTCTAGTAGAGTAT 289.48
RBS4 ACGTTCAAATACGAAATTAATTGTA 375.46
RBS5 TTCATCTTAAATAGGGAAAAAC 838.25
RBS6 ATAATTATACAACTAACGGAAAACAT 3185.56
RBS7 ACGCTAAAGACATAAGGCAAGACAC 6624.63
RBS8 GGAAACTAACACAACTATATAATTGAGCGCATAAAT 8695.17
RBS9 CTACAACAAATTTAAGGAGTTGTT 12518.44
实施例12表达菌株的筛选
在本发明研究过程中，曾尝试过用大肠杆菌Rosetta和大肠杆菌Rosetta gami B(DE3)作为表达菌株来表达重组多肽连接酶原。
将实施例1获得的重组表达载体转化到宿主细胞大肠杆菌Rosetta和大肠杆菌Rosetta gami B(DE3)中，分别挑选大肠杆菌阳性转化体进行诱导表达，结果均为重组多肽连接酶原可溶表达。利用一次MBP Trap™ HP 5 mL层析柱纯化均能得到重组多肽连接酶原，并在实施例4所描述的激活条件和酶活测试条件下进行激活和活性测试，结果如图12所示，大肠杆菌Rosetta表达的重组蛋白激活得到的产物有环化活性；大肠杆菌Rosetta gamiB(DE3)表达的重组蛋白激活得到的产物的环化活性，显著高于大肠杆菌Rosetta表达的重组蛋白激活产物。
综上，经过表达菌株的筛选研究，得到优选的表达菌株为大肠杆菌Rosetta gamiB(DE3)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种高效表达具有高活性的重组多肽连接酶原的方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重组多肽连接酶原的氨基酸序列
<400> 1
Met Ile Arg Asp Asp Phe Leu Arg Leu Pro Ser Gln Ala Ser Lys Phe
1 5 10 15
Phe Gln Ala Asp Asp Asn Val Glu Gly Thr Arg Trp Ala Val Leu Val
20 25 30
Ala Gly Ser Lys Gly Tyr Val Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp Val Cys
35 40 45
His Ala Tyr Gln Ile Leu Lys Lys Gly Gly Leu Lys Asp Glu Asn Ile
50 55 60
Ile Leu Phe Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Asn Glu Ser Asn Pro His
65 70 75 80
Pro Gly Val Ile Ile Asn His Pro Tyr Gly Ser Asp Val Tyr Lys Gly
85 90 95
Val Pro Lys Asp Tyr Val Gly Glu Asp Ile Asn Pro Pro Asn Phe Tyr
100 105 110
Ala Val Leu Leu Ala Asn Lys Ser Ala Leu Thr Gly Thr Gly Ser Gly
115 120 125
Lys Val Leu Asp Ser Gly Pro Asn Asp His Leu Phe Ile Tyr Tyr Thr
130 135 140
Asp His Gly Gly Ala Gly Val Leu Gly Met Pro Ser Lys Pro Tyr Ile
145 150 155 160
Ala Ala Ser Asp Leu Asn Asp Leu Leu Lys Lys Lys His Ala Ser Gly
165 170 175
Thr Tyr Lys Ser Ile Val Phe Tyr Val Glu Ser Cys Glu Ser Gly Ser
180 185 190
Met Phe Asp Gly Leu Leu Pro Glu Asp His Asn Ile Tyr Val Met Gly
195 200 205
Ala Ser Asp Thr Gly Glu Ser Ser Trp Leu Thr Tyr Cys Pro Leu Gln
210 215 220
His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Tyr Asp Val Cys Val Gly Asp Leu Phe
225 230 235 240
Ser Val Ala Trp Leu Glu Asp Cys Asp Val His Asn Leu Gln Thr Glu
245 250 255
Thr Phe Gln Gln Gln Tyr Glu Val Val Lys Asn Lys Thr Ile Val Ala
260 265 270
Leu Ile Glu Asp Gly Thr His Val Val Gln Tyr Gly Asp Val Gly Leu
275 280 285
Ser Lys Gln Thr Leu Phe Val Tyr Met Gly Thr Asp Pro Ala Asn Asp
290 295 300
Asn Asn Thr Phe Thr Asp Lys Asn Ser Leu Gly Thr Pro Arg Lys Ala
305 310 315 320
Val Ser Gln Arg Asp Ala Asp Leu Ile His Tyr Trp Glu Lys Tyr Arg
325 330 335
Arg Ala Pro Glu Gly Ser Ser Arg Lys Ala Glu Ala Lys Lys Gln Leu
340 345 350
Arg Glu Val Met Ala His Arg Met His Ile Asp Asn Ser Leu Lys His
355 360 365
Ile Gly Lys Leu Leu Phe Gly Ile Glu Lys Gly His Lys Met Leu Asn
370 375 380
Asn Val Arg Pro Ala Gly Leu Pro Val Val Asp Asp Trp Asp Cys Phe
385 390 395 400
Lys Thr Leu Ile Arg Thr Phe Glu Thr His Cys Gly Ser Leu Ser Glu
405 410 415
Tyr Gly Met Lys His Met Arg Ser Phe Ala Asn Leu Cys Asn Ala Gly
420 425 430
Ile Arg Lys Glu Gln Met Ala Glu Ala Ser Ala Gln Ala Cys Val Ser
435 440 445
Ile Pro Asp Asn Pro Trp Ser Ser Leu His Ala Gly Phe Ser Val
450 455 460
<210> 2
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码重组多肽连接酶原的DNA分子
<400> 2
atgattcgtg atgattttct gcgtctgccg agccaggcga gcaagttttt ccaggcggat 60
gataatgtgg aaggcacccg ttgggccgtt ctggttgcgg gctctaaagg ctatgttaat 120
tatcgccatc aggcggatgt ttgtcatgcc tatcagattc tgaaaaaagg cggtctgaaa 180
gatgaaaata tcattctatt tatgtatgat gatattgcct ataatgagag taatccacat 240
ccgggcgtga tcattaatca tccgtatggt agcgatgtgt acaagggcgt tcctaaagat 300
tatgttggtg aggatattaa tcctccgaat ttttatgcag tgctgctggc caataagtct 360
gcactgaccg gcaccggctc aggcaaagtt ctggatagcg gtccgaatga tcatctattt 420
atctattata cggatcatgg cggcgccggc gtgttaggga tgccgagcaa accgtatatc 480
gccgcgtctg atctgaatga tctactgaag aaaaaacacg caagcggtac atataagtca 540
atcgtgtttt atgtggaatc ttgcgaaagt ggctcaatgt ttgatggctt actgccagaa 600
gatcataata tctatgtgat gggtgcgtca gatacaggtg aatcttcttg gctaacgtat 660
tgtccactgc aacatccgag tcctcctcca gaatatgatg tttgcgttgg cgatctgttt 720
tcagttgctt ggttagaaga ttgcgatgtg cataacctcc agacggaaac ctttcagcag 780
cagtatgaag tggttaaaaa caaaaccatc gttgccctga ttgaagatgg cacacatgtg 840
gttcagtatg gggacgtggg cctgtctaaa cagaccttat ttgtgtatat gggtactgat 900
ccagccaatg ataacaacac ctttacggat aaaaatagct tagggacgcc acgcaaagcc 960
gtgtctcagc gcgatgccga cttaattcat tattgggaaa aatatcgtcg cgcaccagaa 1020
ggtagtagtc gcaaagccga agccaaaaaa cagttacgcg aagttatggc acatcgcatg 1080
catattgata atagcctaaa gcacatcggc aagctgctgt ttggcattga aaaaggccat 1140
aaaatgctga ataatgtgcg ccctgcggga ctgccggtgg tggatgattg ggattgcttt 1200
aaaaccctga ttcgtacctt tgaaacccat tgcgggagcc tgagcgaata tggcatgaaa 1260
cacatgcgca gctttgccaa tctgtgcaat gcgggcattc gtaaagaaca gatggccgaa 1320
gcgagcgcgc aggcgtgcgt gagcattccg gacaatccgt ggagcagcct gcatgcgggg 1380
tttagcgtgt ga 1392
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 核糖体结合位点的核苷酸序列
<400> 3
acgctaaaga cataaggcaa gacac 25
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RBS-FP
<400> 4
cgctaaagac ataaggcaag acacccatag attatgaaaa tcgaagaagg 50
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RBS-RP
<400> 5
gccttatgtc tttagcgtgt tggtcaattg ctcgtgaaaa 40
<210> 6
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 环状多肽
<400> 6
Leu Thr Pro Cys Glu Lys His Ile Met Glu Lys Ile Gln Gly Arg Gly
1 5 10 15
Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Lys Trp Gln His Gln Gln
20 25 30
Asp Ser Cys Arg Lys Gln Leu Gln Gly Val Asn His Val
35 40 45
<210> 7
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Control
<400> 7
aagga 5
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RBS1
<400> 8
gaaagtttga caataatcta tcaa 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RBS2
<400> 9
ggctataata agtcaagttc gcat 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RBS3
<400> 10
tagtagaaaa ctctagtaga gtat 24
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RBS4
<400> 11
acgttcaaat acgaaattaa ttgta 25
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RBS5
<400> 12
ttcatcttaa atagggaaaa ac 22
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RBS6
<400> 13
ataattatac aactaacgga aaacat 26
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RBS7
<400> 14
acgctaaaga cataaggcaa gacac 25
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RBS8
<400> 15
ggaaactaac acaactatat aattgagcgc ataaat 36

Claims (3)

1.一种高效表达具有高活性的重组多肽连接酶原激活产物的方法，其特征在于：将含有编码重组多肽连接酶原的DNA分子以及核糖体结合位点的重组表达载体转化入工程细胞后，再进行诱导表达，获得具有高活性的重组多肽连接酶原；其中：
所述的重组多肽连接酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的编码重组多肽连接酶原的DNA分子的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的核糖体结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的重组表达载体的骨架载体为pMAL-c5x-His；
所述的工程细胞为Rosetta gami B(DE3)细胞；
在获得具有高活性的重组多肽连接酶原后，在37℃、pH为4.5的条件下，将所述的重组多肽连接酶原进行第一次透析，再于4℃、pH为6的条件下进行第二次透析，固液分离去除沉淀，得到重组多肽连接酶原激活产物；
所述的第一次透析在由如下成分组成的激活缓冲液中进行：20 mM乙酸-乙酸钠、100mM NaCl、1 mM EDTA、5 mM DTT；所述的第一次透析的时间为12 h；
所述的第二次透析在由如下成分组成的活性缓冲液中进行：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4、50～100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM DTT；所述的第二次透析的时间为8 h。
2.一种具有高活性的重组多肽连接酶原激活产物，其特征在于：由权利要求1所述的方法制得。
3.权利要求2中所述的重组多肽连接酶原激活产物的应用，其特征在于：用于多肽或蛋白质的环化；多肽与多肽之间的连接；多肽与蛋白质之间的连接；或蛋白质与蛋白质之间的连接；
当用于多肽或蛋白质的环化时，所述的多肽或蛋白质的C端是天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸序列，N端第一位氨基酸是甘氨酸或亮氨酸，N端第二位氨基酸是苏氨酸或亮氨酸；所述的多肽或蛋白质为线性多肽或蛋白质；
当用于多肽与多肽之间的连接时，有一个多肽的C端是天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸序列，另一个多肽N端第一位氨基酸是甘氨酸或亮氨酸，N端第二位氨基酸是苏氨酸或亮氨酸；
当用于多肽与蛋白质之间的连接时，多肽的C端是天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸序列，蛋白质N端第一位氨基酸是甘氨酸或亮氨酸，N端第二位氨基酸是苏氨酸或亮氨酸；或者蛋白质的C端是天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸序列，多肽N端第一位氨基酸是甘氨酸或亮氨酸，N端第二位氨基酸是苏氨酸或亮氨酸；
当用于蛋白质与蛋白质之间的连接时，有一个蛋白质的C端是天冬酰胺-组氨酸-缬氨酸序列，另一个蛋白质N端第一位氨基酸是甘氨酸或亮氨酸，N端第二位氨基酸是苏氨酸或亮氨酸；
所述的应用的条件为：温度为42℃，pH为6；
所述的应用在由如下成分组成的活性缓冲液中进行：20mM Na2HPO4-NaH2PO4，100 mMNaCl，1 mM EDTA，0.5 mM DTT。
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