KR101026526B1

KR101026526B1 - 대장균에서 외래단백질을 분비 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101026526B1
Application number: KR1020090006094A
Authority: KR
Inventors: 판철호; 이주영; 엄병헌; 김상무; 송대근
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2009-01-23
Filing date: 2009-01-23
Publication date: 2011-04-01
Also published as: US8304210B2; US20110033890A1; KR20100086717A; WO2010085012A1

Abstract

본 발명은 대장균에서 외래단백질의 세포밖 분비 효율 향상을 위한 신호서열 펩티드에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 3으로 기재되는 신호서열 펩티드의 C-말단에 연결된 외래단백질로 구성되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 대장균에서 상기 외래 단백질의 세포밖 분비 효율 향상을 위한 유전자 컨스트럭트에 관한 것이다. 본 발명은 재조합 단백질의 세포질 밖으로의 분비 효율을 향상시킴으로써, 재조합 단백질의 생산에 유용하게 사용할 수 있다.

외래단백질, 대장균, 분비향상, 아가레이즈, 신호서열 펩티드

Description

대장균에서 외래단백질을 분비 생산하는 방법{Method for the secretory production of heterologous protein in Escherichia coli}

본 발명은 대장균에서 외래단백질의 세포밖 분비 효율 향상을 위한 신호서열 펩티드에 관한 것이다.

재조합 단백질의 제조기술은 1970년대 중반부터 시작된 이래로 그 적용의 범위가 빠른 속도로 확대되어, 이제는 기초 연구 분야에서 빈번히 쓰이는 기본적인 도구이다. 또한, 생산기술 분야에서는 인체용 의약품의 제조뿐만 아니라 농수산 관련의 단백질 제품의 생산에까지 그 사용범위가 넓어지고 있는 추세이다. 특히, 2006년에는 전세계 단백질 의약품 시장규모가 437억 달러에 달하였고, 2011년에는 그 2배인 885억 달러에 이를 것으로 추정되고 있다. 우리나라의 단백질 의약품 시장규모는 2006년에 14억 달러로 전 세계의 3.2% 수준에 불과하나, 연평균 30% 이상의 고성장을 지속하여, 2011년에는 64억 달러의 시장규모를 형성할 것으로 예상된다.

한편, 효소는 1964년 IUB(International Union of Biochemistry)에 의하여 대략 600여 종이 알려져 있었으나 현재는 약 3,000여 종이 알려져 있고, 이 중 산업적으로 응용되고 있는 효소는 150여 종에 이른다. 2000년에 산업용 효소의 전체 시장은 약 15억 달러로 추산되었으며, 이 중 세제용 효소가 가장 높은 약 33%의 시장 점유율을 차지하고 그 밑에 식품에 쓰이는 전분당 효소, 의학용 효소, 연구용 효소, 진단용 효소 등이 나머지 시장을 구성하였다. 특히, 유전자 재조합 기술을 이용한 효소 생산이 전통적 효소 시장에 매우 빠른 속도로 침투하고 있는 실정이다. 예를 들면, 치즈 제조용인 키모신(chymosin)은 유전자 재조합 기술을 이용한 제품이 현재 미국시장의 60%를 점유하고 다른 용도의 효소도 점차 유전자 재조합 기술로 생산하고 있다.

단백질 산업이 증가하면서 재조합 단백질은 사용 목적과 생산 규모에 따라서 여러 종류의 발현시스템으로 생산되고 있다. 생물학적 숙주에 따라 상기 발현시스템에는 여러 종류가 있는데, 대표적으로 많이 쓰이는 것은 대장균이나 효모와 같은 미생물을 이용하거나 곤충세포, 동물세포, 식물세포를 이용하는 방법 등이 있다. 특히, 대장균 발현 시스템은 유전자 조작이 용이하고 경제적인 방법으로 널리 알려져 있다. 그러나, 싸이토카인(cytokine)과 같은 진핵 세포 유래의 단백질을 생산하고자 할 경우에는 당화(glycosylation) 등과 같은 번역 후 수식이 불가능하고, 배양 배지로의 단백질 분비가 어려우며, 많은 단백질의 경우에서 이황화결합(disulfide bond)의 접힘(folding)이 제대로 이루어지지 않아 불용체(inclusion body)와 같은 불용성 단백질 형태로 생산되어 활성을 갖지 못하는 등의 단점이 있 다. 이에 분비 발현, 분자 샤페론(molecular chaperon)의 공동발현(co-expression), 재접힘(re-folding) 연구 등을 통하여 이러한 문제점을 조금씩 극복해 가고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 단백질의 분비효율을 향상시킬 수 있는 요소가 어떤 것인지 확인하기 위하여 예의 노력한 결과, 베타-아가레이즈 AgaB34(Gene bank 등록번호 EU200967; nts 서열번호 1, aa 서열번호 2)로부터 N-말단 23개 아미노산 잔기(서열번호 3)로 구성된 폴리펩티드가 대장균에서 외래단백질의 분비 향상을 위한 신호서열 펩티드가 될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 대장균에서 외래 단백질의 세포밖 분비 효율 향상을 위한 신호서열 펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신호서열 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 대장균에서 상기 외래 단백질의 세포밖 분비 효율 향상을 위한 유전자 컨스트럭트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터가 형질도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 대장균에서 외래 단백질의 세포밖 분비 효율 향상 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의하여 제조된 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 원래 형태의 외래단백질 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 폴리펩티드로 구성되는 대장균에서 외래 단백질의 세포밖 분비 효율 향상을 위한 신호서열 펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신호서열 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신호서열 펩티드의 C-말단에 연결된 외래단백질로 구성되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 대장균에서 상기 외래 단백질의 세포밖 분비 효율 향상을 위한 유전자 컨스트럭트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터가 형질도입된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 대장균에서 재조합 단백질의 세포밖 분비 효율이 향상된 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 재조합 단백질을 제공한다.

아울러, 본 발명은 원래 형태의 외래단백질 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

본 발명에 있어서, 용어 "외래단백질(heterologous protein)" 또는 "목적 단백질(target protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.

"재조합 단백질(recombinant protein)" 또는 "융합단백질(fusion protien)"은 원래의 외래단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다. 본 발명의 신호서열 펩티드와 목적 단백질이 연결된 재조합 융합 단백질 형태 또는 단백질 절단효소에 의해 신호서열 펩티드가 재조합 융합 단백질로부터 제거된 목적 단백질의 재조합 단백질을 의미한다.

"신호서열 펩티드(signal sequence peptide)"는 바이러스, 원핵생물세포 또는 진핵생물세포에서 발현되는 외래 단백질을 페리플라즘 또는 세포 외부로 분비하기 위해 상기 외래 단백질이 세포내막을 통과할 수 있도록 도와주는 효율적인 펩티드를 의미한다.

"단백질 절단효소 인식 부위"는 단백질 절단효소가 인식하여 절단하는 특정 자리의 아미노산 서열을 의미한다.

"발현벡터"는 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

"작동 가능하게 연결된"은 프로모터에서 전사가 개시하고 암호화 서열을 통해 종료암호로 진행하는데 작용하도록 단편이 배열되는 것을 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 폴리펩티드로 구성되는 대장균에서 외래 단백질의 세포밖 분비 효율 향상을 위한 신호서열 펩티드를 제공한다.

본 발명자들은 단백질의 분비효율을 향상시킬 수 있는 요소를 확인하기 위하여 예의 노력한 결과, 본 발명의 구체적인 실시예에서 베타-아가레이즈 AgaB34(Gene bank 등록번호 EU200967; nts 서열번호 1, aa 서열번호 2)로부터 N-말단 23개 아미노산 잔기(서열번호 3)로 구성된 폴리펩티드(이하, ASP: Agarase Signal sequence Peptide)가 사용될 수 있음을 예측하고(도 1 참조), 상기 ASP가 제거된 아가레이즈의 분비 효율을 야생형 아가레이즈와 비교한 결과, 세포밖으로의 분비 효율이 거의 없어진 것을 확인하였고(도 2 참조), 또한, 상기 ASP를 리포터 단백질인 GFP와 융합하여 발현한 결과, 상기 GFP의 세포밖으로의 분비 효율이 현저하게 향상된 것을 확인하였다(도 3 참조). 이에, 상기 ASP는 대장균에서 외래단백질과 융합된 재조합 단백질의 세포밖으로의 분비 효율 향상에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 서열번호 3으로 기재되는 폴리펩티드는 해양 미생물인 아가리보란스 알부스(Agarivorans albus) YKW-34에서 분리된 아가레이즈(agarase) 유전자인 베타-아가레이즈 AgaB34(Gene bank 등록번호 EU200967; nts 서열번호 1, aa 서열번호 2)로부터 N-말단 23개 아미노산 잔기(서열번호 3)에 해당하는 신호서열 펩티드인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 신호서열 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12로 기재되는 것을 특징으로 한다.

상기 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 당업자가 원하는 모든 단백질이 가능하며, 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청, 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 재조합 단백질로 발현할 수 있다.

상기 유전자 컨스트럭트는 신호서열 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 연결될 외래유전자의 삽입을 위한 제한효소 부위를 추가로 포함한다. 상기 외래유전자는 제한효소 부위를 통해 클로닝될 수 있다. 본 발명의 유전자 컨스트럭트는 신호서열 펩티드와 외래유전자 사이에, 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하 는 폴리뉴클레오티드가 추가로 포함될 수도 있고, 이 경우에는 상기 유전자 컨스트럭트와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 외래단백질 분비 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 외래단백질이 생산될 수 있도록 할 수 있다. 상기 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 또는 퓨린(Furin) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용될 수 있다.

상기 발현벡터는 골격 벡터에 신호서열 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 외래 단백질의 유전자가 작동 가능하게 연결되어 포함되며, 상기 골격 벡터는 pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a(+), pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균에 형질전환 가능한 다양한 벡터를 사용하는 것이 바람직하고, pET28a(+)를 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

이때, 상기 발현벡터는 숙주세포인 대장균에 형질도입되어 재조합 단백질을 발현할 수 있도록 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 대장균에서 외래 단백질의 세포밖 분비 효율이 향상된 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 베타-아가레이즈 AgaB34의 서열번호 3으로 기재된 N-말단 23개 아미노산 잔기인 ASP(도 1 참조)가 제거됨으로써 아가레이즈의 분비 효율이 거의 사라졌고(도 2 참조), 상기 ASP를 리포터 단백질인 GFP와 융합하여 발현한 결과, 상기 GFP의 세포밖으로의 분비 효율이 현저하게 향상된 것을 확인하였다(도 3 참조). 이에, 상기 ASP는 대장균에서 외래단백질과 융합된 재조합 단백질의 세포밖으로의 분비 효율 향상에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 재조합 단백질은 상술한 본 발명의 발현벡터가 형질전환된 형질전환체에서 발현하여 단백질을 회수함으로써 생산할 수 있다. 회수 방법은 당업자에게 공지된 세포 배양액으로부터 단백질을 정제하는 통상의 방법을 사용할 수 있다.

구체적으로,

1) 상기 신호서열 펩티드; 단백질 절단효소 인식부위; 및 외래단백질을 순차적으로 포함하는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트가 작동 가능하게 연결된 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 단계 1)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하는 단계;

4) 단계 3)의 배양액으로부터 상기 재조합 단백질을 분리하는 단계; 및,

5) 단계 4)의 분리된 재조합 단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 분리하는 단 계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 제조방법을 제공한다.

상기 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 또는 퓨린(Furin) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 재조합 단백질의 세포질 밖으로의 분비 효율을 향상시킴으로써, 재조합 단백질의 생산에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 발현벡터 제작

<1-1> 아가레이즈에서 신호서열 펩티드 추정

해양 미생물인 아가리보란스 알부스(Agarivorans albus) YKW-34에서 분리된 아가레이즈(agarase) 유전자인 베타-아가레이즈 AgaB34(Gene bank 등록번호 EU200967; nts 서열번호 1, aa 서열번호 2)로부터 N-말단 23개 아미노산 잔기(nts 서열번호 12, aa 서열번호 3)에 해당하는 추정의 분비서열을 아가레이즈 신호 서 열(agarase signal peptide: ASP)로 명명하였다(도 1).

<1-2> 아가레이즈에 신호서열 펩티드가 제거된 발현벡터

상기 ASP와 아가레이즈가 융합 단백질로 발현되도록 하는 발현벡터 pET23b-agarase(WT)와 ASP 없이 아가레이즈만 발현되도록 하는 발현벡터 pET23b-agarase(ΔASP)를 제작하여, 상기 ASP 유무에 따른 대장균에서 아가레이즈 분비생산 여부를 조사하였다.

1) 구체적으로, pET23b-agarase(WT)와 pET23b-agarase(ΔASP)를 제작하기 위한 PCR 주형으로 AgaB34 유전자(pUSS1, Fu et al., J. Microbiol. Biotechnol, 2008)를 사용하였다. pET23b-agarase(WT)의 경우, ASP-Agar_F_Nde I(서열번호 4: 5'-AAA CAT ATG AAA GGA TTC ACC AAA CAT TC-3') 및 Agar_R_Xho I(서열번호 5: 5'-AAA CTC GAG CAA TTT GAA GCG CTG G-3')의 프라이머 쌍을 이용하였고, pET23b-agarase(ΔASP)의 경우, Agar_F_Nde I(서열번호 6: 5'-GAA GAA CAT ATG GCT GAT TGG GAT AAC ATC CC-3')과 Agar_R_Xho I(서열번호 5)의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 주형 유전자 1 ㎕, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(10 pmole/㎕) 각 1 ㎕, 10 mM dNTP 1 ㎕, 10× pfu 완충용액 5 ㎕, pfu(2.5 U/㎕) 0.5 ㎕ 및 H₂O 40.5 ㎕를 포함하는 최종 부피 50 ㎕의 반응액으로 하기 조건에서 수행하였다. 즉, 초기 변성 95℃에서 2분 후, 변성 95℃에서 20초씩, 어닐링 50~60℃에서 40초씩, 신장 72℃에서 3분씩 40회 반복하였다. PCR 산물을 1.0~1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 분리한 후, QIAquick Gel extraction kit(Qiagen, USA)를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 DNA 단편을 pJET1.2/blunt 벡터(Fermentas, Canada)와 22℃에서 5분간 연결한 후, E. coli DH5α 세포에 형질도입하여 앰피실린이 50 ㎍/㎖으로 함유된 LB 고체 배지에 도포하였다. 자라난 콜로니를 다시 액체 LB 배지에서 배양하였고, DNA-spinTM plasmid DNA Purification kit(iNtRON, 한국)를 이용해 pJET1.2/blunt에 클로닝된 유전자를 분리하였다. 상기 분리된 유전자를 BglⅡ로 절단한 후 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.

2) pJET1.2/blunt에 클로닝된 PCR 산물을 NdeI과 XhoI을 사용하여 분리하고 동일한 제한효소로 처리한 pET23b(+) 벡터에 연결하여 발현벡터 pET23b-agarase(WT)와 pET23b-agarase(ΔASP)를 제작하였다. 이때, 각 발현벡터는 상기 재조합 단백질의 정제의 편이를 위하여, C-말단에 6개의 히스티딘이 융합되어 발현되도록 제작되었다.

<1-3> GFP 에 신호서열 펩티드가 융합된 발현벡터

상기 ASP와 GFP가 융합 단백질로 발현되도록 하는 발현벡터 pET23b-ASP-GFP와 ASP 없이 GFP만 발현되도록 하는 발현벡터 pET23b-GFP를 제작하여, 상기 ASP 유무에 따른 대장균에서 GFP 분비생산 여부를 조사하였다. 대조군으로는 pET23b(+)와 ASP만을 발현되도록 하는 발현벡터 pET23b-ASP를 제작하여 사용하였다.

1) 구체적으로, pET23b-ASP-GFP와 pET23b-GFP를 제작하기 위한 PCR 주형으로 EGFP 유전자(Biovision, USA)를 사용하였다. pET23b-ASP를 제작하기 위한 PCR 주형으로 pET23b-agarase(WT) 플라스미드를 사용하였다. pET23b-ASP의 경우, pET23b_F(서열번호 7: 5'-GGA TCG AGA TCT CGA TCC CGC-3')와 ASP-R_Nco I_EcoR I(서열번호 8: 5'-AAA GAA TTC CAT GGC AGC AGC TGT TGC ATT TAT TGC-3'), pET23b-ASP-GFP의 경우, ASP-GFP_F_Nco I(서열번호 9: 5'-GAA GAA CCA TGG TGA GCA AGG GCG AG-3')과 GFP_R_Xho I(서열번호 11: 5'-GAA GAA CTC GAG ATC TGA GTC CGG A-3'), pET23b-GFP의 경우, GFP_F_Nde I(서열번호 10: 5'-GAA CAT ATG GTG AGC AAG GGC GAG-3')과 GFP_R_Xho I(서열번호 11)의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 산물을 pJET1.2/blunt에 클로닝한 후, pET23b(+) 벡터로 다시 클로닝하여, pET23b-ASP, pET23b-ASP-GFP 및 pET23b-GFP를 제작하였다.

<1-4> 단백질 발현

실시예 1-2 및 1-3에서 제작된 각각의 발현벡터를 재조합 단백질 발현 대장균인 E. coli C41(DE3)에 형질도입한 후 얻어진 형질전환체를 50 ㎕/㎖의 앰피실린 첨가된 LB 액체배지에 0.1%로 접종하여 37℃에서 14시간 진탕 배양하면서, 세포성장을 600 ㎚에서 측정하였다. 600 ㎚에서 흡광도가 0.5가 되었을 때, 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 0.5 mM의 농도로 IPTG를 첨가하였다. IPTG를 넣고 배양온도를 30℃로 낮추어 추가로 4시간을 진탕 배양하였다. 배양 후 원심분리하여 상등액과 균체를 회수하였다.

<1-5> 세포내 단백질 추출

대장균 세포질에 존재하는 재조합 단백질을 분석하기 위하여 초음파 파쇄기(모델 Sonic dismembrator model 500, Fisher, USA)를 이용하여 대장균 세포를 파쇄하였다. 즉, 원심분리하여 회수한 대장균체에 20 mM Tris-Cl (pH 8.0) 완충용액을 넣어 세포를 현탁한 후, 10% 진폭(amplitude)에서 초음파로 세포를 파쇄하였다. 이 과정은 열이 많이 발생하므로 시료를 얼음에 놓고 실시하였다. 세포벽 파쇄 후 13,000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하여 세포 파쇄물들을 제거하고 상등액을 사용하여 아가레이즈 효소활성을 측정하였다.

<1-6> 세포밖 단백질 정제

원심분리하여 대장균체를 제거하고 배양액을 완충용액A(20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 5mM imidazole, 0.5M NaCl)로 평형시켜, 동일 완충용액으로 평형된 HisㆍBind Resin(Novagen, USA)으로 충진된 컬럼에 주입하였다. 10배 컬럼 부피의 완충용액B(20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 60mM imidazole, 0.5M NaCl)로 비특이 흡착된 단백질을 씻어낸 후, 완충용액C(20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.5 M imidazole, 0.5 M NaCl)로 재조합 단백질을 용출하여 형광도 측정에 사용하였다.

< 실시예 2> 아가레이즈 효소활성 측정

아가레이즈 활성 측정은 환원당을 측정하는 비색법을 사용하여 실시하였다. 기질인 0.1% 아가로오즈 용액을 1.5 ㎖ 튜브에 400 ㎕씩 넣고, 실시예 1의 pET23b-agarase(WT)와 pET23b-agarase(ΔASP)로부터 수득한 상등액 및 세포내 단백질 시료를 100 ㎕씩 넣은 후 37℃에서 흔들면서 효소 반응을 시켰다. 효소 반응 후 환원당과 반응하는 디니트로살리실산(DNS; dinitrosalicylic acid) 용액 500 ㎕을 넣고 100℃에서 5분간 끓인 후, 얼음물에 튜브를 담가 15분간 정치하였다. 575 ㎚에서의 흡광도를 측정하여 D-갈락토오스(galactose) 표준곡선과 비교하여 효소 활성을 계산하였다. 아가레이즈 효소 활성 1 유닛은 분당 1 μ㏖의 D-갈락토오스를 생산 하는 효소량으로 정의하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 ASP가 있는 경우 세포밖으로 분비된 아가레이즈의 양이 높은 것으로 나타났으나, ASP가 없는 경우 세포밖으로 분비된 아가레이즈의 양이 거의 없는 것으로 나타났다.

< 실시예 3> 형광광도 측정

96 웰 마이크로 플레이트에 실시예 1의 pET23b-ASP, pET23b-ASP-GFP 및 pET23b-GFP의 배양액을 200 ㎕씩 담아서 멀티 마이크로 플레이트 리더기(모델 Synergy^TM HT Multi-Mode Microplate reader, Biotek, USA)에서 시료의 형광을 측정하였다. 여기 파장은 485 ㎚를 선택하였고, 528 ㎚의 방출을 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 GFP에 ASP가 융합된 경우 세포밖으로 분비된 GFP의 양이 높은 것으로 나타났다.

도 1은 AgaB34의 ORF 및 신호 서열을 나타낸 도이다.

도 2는 아가레이즈에서 신호서열 펩티드(ASP)가 제거된 단백질의 세포밖 분비가 억제된 것을 나타낸 도이다:

2a: ASP가 제거되지 않은 경우; 및,

2b: ASP가 제거된 경우.

도 3은 GFP에 신호서열 펩티드(ASP)가 융합된 단백질의 세포밖 분비가 향상된 것을 나타낸 도이다.

<110> Korea Instititue of Science and Technology <120> Method for the secretory production of heterologous protein in Escherichia coli <130> 9P-01-13 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1362 <212> DNA <213> Agarivorans albus strain YKW-34 beta-agarase (agaB34) gene <400> 1 atgaaaggat tcaccaaaca ttcaatctta atggcgtgca gtattggctt agcaataaat 60 gcaacagctg ctgattggga taacatcccc attcctgccg aactagacgc aggacaatct 120 tgggagttac aacaaaacta ttctgactct tttaactact caggcaaaaa cagcacgttt 180 accggcaaat ggaaagacag ttactttcat agctggacag gcccaggcct tactcactgg 240 tcgagcgatg aatcgtgggt tggtgacggc aacctcatca ttagtgcttc gcgtcgccag 300 ggcaccaaca aagtaaacgc aggggtcatc acctctaaaa ccaaagtaaa ataccccatc 360 tttttagaag ccagtatcaa ggtgagtaac ttagagcttt catccaactt ctggttgtta 420 agcgaaaacg accagcgtga aatagatgta ttagaggtat acggtggcgc tcgccaagat 480 tggtacgcta agaacatgtc gaccaacttt catgttttct tccgtaataa cgacaactcg 540 ataaaaaatg attacaacga ccagactcac ttcacaccca cttggggaaa ctactggcgt 600 gacggtttcc accgctttgg tgtgtattgg aagagtccaa cagacgttac tttttacatc 660 gatggtcaaa aaaccacaaa aggcgcttgg agccaggtgg taatgaaaga caaagattac 720 accggtgcca ttcttgataa gagccgctac aacatggatc aagaagcatt cattattatt 780 gatactgaag accactcttg gcgctctgaa gcaggccaca tcgccactga tgcagattta 840 gccgacagtg ataaaaacaa gatgtatgta gattggatcc gcgtttacaa accaacgggc 900 ggttccacta ccccacctac tggcgatatt acgccaccga gtggttacac caatttacaa 960 ctggcacaca gcaatcgttg tgttgatgtc atcaatggcg ccttatggaa tggcagtact 1020 taccagcagt attcgtgtaa cacgggcaac aacaatcaac ggttcaagtt cactaaaata 1080 gccaacaatc aatacagcat taatgccaag gtaagtcagc tttgtatgga gcttgcatct 1140 ggcagctcgg caaatggcgc taaggtgcag caatggatat gtaatcacgc caactctaat 1200 caaacatgga gcctagaaga caagggcagt aatacttttg aaattagaaa taaacaaagc 1260 ggaaaatgct tagaggtcgc caacagttca aacgcaaatg gtggacaaat taggcaatgg 1320 gcctgcactg gcgcgactaa ccagcgcttc aaattcttgt ag 1362 <210> 2 <211> 453 <212> PRT <213> Agarivorans albus strain YKW-34 beta-agarase (agaB34) protein <400> 2 Met Lys Gly Phe Thr Lys His Ser Ile Leu Met Ala Cys Ser Ile Gly 1 5 10 15 Leu Ala Ile Asn Ala Thr Ala Ala Asp Trp Asp Asn Ile Pro Ile Pro 20 25 30 Ala Glu Leu Asp Ala Gly Gln Ser Trp Glu Leu Gln Gln Asn Tyr Ser 35 40 45 Asp Ser Phe Asn Tyr Ser Gly Lys Asn Ser Thr Phe Thr Gly Lys Trp 50 55 60 Lys Asp Ser Tyr Phe His Ser Trp Thr Gly Pro Gly Leu Thr His Trp 65 70 75 80 Ser Ser Asp Glu Ser Trp Val Gly Asp Gly Asn Leu Ile Ile Ser Ala 85 90 95 Ser Arg Arg Gln Gly Thr Asn Lys Val Asn Ala Gly Val Ile Thr Ser 100 105 110 Lys Thr Lys Val Lys Tyr Pro Ile Phe Leu Glu Ala Ser Ile Lys Val 115 120 125 Ser Asn Leu Glu Leu Ser Ser Asn Phe Trp Leu Leu Ser Glu Asn Asp 130 135 140 Gln Arg Glu Ile Asp Val Leu Glu Val Tyr Gly Gly Ala Arg Gln Asp 145 150 155 160 Trp Tyr Ala Lys Asn Met Ser Thr Asn Phe His Val Phe Phe Arg Asn 165 170 175 Asn Asp Asn Ser Ile Lys Asn Asp Tyr Asn Asp Gln Thr His Phe Thr 180 185 190 Pro Thr Trp Gly Asn Tyr Trp Arg Asp Gly Phe His Arg Phe Gly Val 195 200 205 Tyr Trp Lys Ser Pro Thr Asp Val Thr Phe Tyr Ile Asp Gly Gln Lys 210 215 220 Thr Thr Lys Gly Ala Trp Ser Gln Val Val Met Lys Asp Lys Asp Tyr 225 230 235 240 Thr Gly Ala Ile Leu Asp Lys Ser Arg Tyr Asn Met Asp Gln Glu Ala 245 250 255 Phe Ile Ile Ile Asp Thr Glu Asp His Ser Trp Arg Ser Glu Ala Gly 260 265 270 His Ile Ala Thr Asp Ala Asp Leu Ala Asp Ser Asp Lys Asn Lys Met 275 280 285 Tyr Val Asp Trp Ile Arg Val Tyr Lys Pro Thr Gly Gly Ser Thr Thr 290 295 300 Pro Pro Thr Gly Asp Ile Thr Pro Pro Ser Gly Tyr Thr Asn Leu Gln 305 310 315 320 Leu Ala His Ser Asn Arg Cys Val Asp Val Ile Asn Gly Ala Leu Trp 325 330 335 Asn Gly Ser Thr Tyr Gln Gln Tyr Ser Cys Asn Thr Gly Asn Asn Asn 340 345 350 Gln Arg Phe Lys Phe Thr Lys Ile Ala Asn Asn Gln Tyr Ser Ile Asn 355 360 365 Ala Lys Val Ser Gln Leu Cys Met Glu Leu Ala Ser Gly Ser Ser Ala 370 375 380 Asn Gly Ala Lys Val Gln Gln Trp Ile Cys Asn His Ala Asn Ser Asn 385 390 395 400 Gln Thr Trp Ser Leu Glu Asp Lys Gly Ser Asn Thr Phe Glu Ile Arg 405 410 415 Asn Lys Gln Ser Gly Lys Cys Leu Glu Val Ala Asn Ser Ser Asn Ala 420 425 430 Asn Gly Gly Gln Ile Arg Gln Trp Ala Cys Thr Gly Ala Thr Asn Gln 435 440 445 Arg Phe Lys Phe Leu 450 <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AgaB34 N-terminal 23 ea amino acids <400> 3 Met Lys Gly Phe Thr Lys His Ser Ile Leu Met Ala Cys Ser Ile Gly 1 5 10 15 Leu Ala Ile Asn Ala Thr Ala 20 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASP-Agar_F_Nde I <400> 4 aaacatatga aaggattcac caaacattc 29 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Agar_R_Xho I <400> 5 aaactcgagc aatttgaagc gctgg 25 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Agar_F_Nde I <400> 6 gaagaacata tggctgattg ggataacatc cc 32 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET23b_F <400> 7 ggatcgagat ctcgatcccg c 21 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASP-R_Nco I_EcoR I <400> 8 aaagaattcc atggcagcag ctgttgcatt tattgc 36 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASP-GFP_F_Nco I <400> 9 gaagaaccat ggtgagcaag ggcgag 26 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP_F_Nde I <400> 10 gaacatatgg tgagcaaggg cgag 24 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP_R_Xho I <400> 11 gaagaactcg agatctgagt ccgga 25 <210> 12 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide encoding polynucleotide <400> 12 atgaaaggat tcaccaaaca ttcaatctta atggcgtgca gtattggctt agcaataaat 60 gcaacagct 69

Claims

서열번호 3으로 기재되는 폴리펩티드로 구성되는 대장균에서 외래 단백질의 세포밖 분비 효율 향상을 위한 신호서열 펩티드.
제 1항에 있어서, 서열번호 3으로 기재되는 폴리펩티드는 베타-아가레이즈 AgaB34(Gene bank 등록번호 EU200967; nts 서열번호 1, aa 서열번호 2)의 N-말단 23개 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 신호서열 펩티드.
제 1항에 있어서, 상기 외래단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청, 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질인 것을 특징으로 하는 신호서열 펩티드.
제 1항의 신호서열 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제 4항에 있어서, 서열번호 12로 기재되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오 티드.
제 1항의 신호서열 펩티드의 C-말단에 연결된 외래단백질로 구성되는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 대장균에서 상기 외래 단백질의 세포밖 분비 효율 향상을 위한 유전자 컨스트럭트.
제 6항에 있어서, 신호서열 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 연결된 외래유전자의 삽입을 위한 제한효소 부위를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 컨스트럭트.
제 6항에 있어서, 신호서열 펩티드와 외래유전자 사이에, 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 컨스트럭트.
제 8항에 있어서, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 또는 퓨린(Furin) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용되는 것을 특징으로 하는 유전자 컨스트럭트.
제 6항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터.
제 10항의 발현벡터가 형질도입된 형질전환체.
제 11항의 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 대장균에서 외래 단백질의 세포밖 분비 효율이 향상된 재조합 단백질의 제조방법.
제 12항의 제조방법에 의하여 제조된 재조합 단백질.
1) 제 1항의 신호서열 펩티드; 단백질 절단효소 인식부위; 및 외래단백질을 순차적으로 포함하는 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유 전자 컨스트럭트가 작동 가능하게 연결된 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 단계 1)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하는 단계;

4) 단계 3)의 배양액으로부터 상기 재조합 단백질을 분리하는 단계; 및,

5) 단계 4)의 분리된 재조합 단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 또는 퓨린(Furin) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용되는 것을 특징으로 하는 원래 형태의 외래단백질의 제조방법.