KR101724614B1

KR101724614B1 - 신규 카탈라아제 신호서열 및 이를 이용한 카탈라아제 발현방법

Info

Publication number: KR101724614B1
Application number: KR1020140063977A
Authority: KR
Inventors: 반재구; 김의중; 이동범; 김은영
Original assignee: 주식회사 제노포커스
Priority date: 2014-05-27
Filing date: 2014-05-27
Publication date: 2017-04-19
Also published as: KR20150136729A; CN106459940B; CN106459940A; WO2015182941A1; WO2015182941A9

Abstract

본 발명은 카탈라아제를 대량 발현시키기 위한 신규 신호서열 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신규 리파제 신호서열; 상기 신호서열 및 카탈라아제 유전자를 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물; 및 상기 재조합미생물을 배양하여 카탈라아제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 신호서열을 포함하는 발현벡터를 이용하면 특정 카탈라아제뿐만 아니라 다른 목적단백질의 대량 발현 및 분비를 유도할 수 있어, 특정 카탈라아제 및 다른 목적단백질의 안정적인 대량 생산에 있어 매우 유용하다.

Description

신규 카탈라아제 신호서열 및 이를 이용한 카탈라아제 발현방법{New Catalase Signal Sequences and Expression Method Using The Same}

본 발명은 카탈라아제를 대량 발현시키기 위한 신규 신호서열 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신규 리파제 신호서열; 상기 신호서열 및 카탈라아제 유전자를 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물; 및 상기 재조합미생물을 배양하여 카탈라아제를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

카탈라아제는 과산화수소(H₂O₂)를 산소(O₂)와 물(H₂O)로 전환 시키는 것을 촉진하는 효소이다. 대부분의 카탈라아제 효소는 네 가지 폴리펩티드 서브유닛을 함유하며, 각각은 50,000 내지 60,000 의 분자량을 가지고, 서브유닛 당 한 개의 햄(Heme)을 갖는다(Wasserman and Hultin (1981) Arch. Biochem. Biophys. 212:385-392; Hartig and Ruis (1986) Eur. J. Biochem. 160:487-490).

산업용으로 사용되는 여러 종류의 단백질은 안정성이 널리 알려져 있는 사카로마이세스(Saccharomyces), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus orryzae), 트리코더마 리제이(Trichoderma reesei)를 사용하여 생산하여 왔고, 목적 단백질을 발현 및 분비시키기 위하여 전사 촉진서열인 프로모터(promoter), 분비 신호 서열을 코딩하는 DNA, 목적 단백질의 구조 유전자 및 전사 종결자(transcription terminator)로 구성된 발현 분비 플라스미드 벡터를 사용하여왔다.

아스퍼질러스 나이거에서 목적 단백질을 분비시키기 위해 현재 사용되고 있는 분비 신호서열로는 발현하고자하는 유전자의 자체 신호서열 과 아스퍼질러스 나이거 글루코아밀라제 신호서열이 있고, 강력한 프로모터로는 글루코아밀라제 (glaA)프로모터가 있다.

그러나 지금까지 알려진 신호서열만으로는 원하는 단백질을 대량 발현할 수는 없는 실정이다. 따라서, 상업적으로 중요한 효소인 카탈라아제를 보다 효율적으로 대량 생산할 수 있는 신호서열이 절실히 요구되고 있는 실정이며, 이에 대한 수요는 지속적으로 증가하고 있는 상황이다.

이에, 본 발명자들은 상기 발현의 한계를 극복하기 위하여 유전공학적 방법을 이용하여 카탈라아제를 대량생산하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 카탈라아제를 발현하기 위한 신규한 신호서열을 발굴하고, 상기 신호서열을 이용할 경우 카탈라아제가 대량으로 발현되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 카탈라아제를 대량으로 발현시키기 위한 신규 리파제 신호서열; 상기 신호서열 및 카탈라아제 유전자를 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합미생물을 배양하여 카탈라아제를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 An07g00440 리파제 신호서열 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 변형 리파제 신호서열을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 신호서열을 코딩하는 핵산과 목적단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합미생물을 배양하여 목적단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 생산방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 신호서열을 포함하는 발현벡터를 이용하면 특정 카탈라아제뿐만 아니라 다른 목적단백질의 대량 발현 및 분비를 유도할 수 있어, 특정 카탈라아제 및 다른 목적단백질의 안정적인 대량 생산에 있어 매우 유용하다.

도 1은 본 발명의 발현벡터의 모식도이다. A는 외래유전자의 cDNA를 클로닝하여 삽입하였을 때, 프로모터, 신호서열, 외래유전자 및 전자 종결암호 각각의 부분을 자세히 나타낸 모식도이고, B는 An07g00440 리파제 신호서열을 더 포함하는 경우의 모식도이며, C는 An07g00440 리파제 변형 신호서열을 더 포함하는 경우의 모식도이다.
도 2는 실시예 1-2의 발현벡터를 나타낸 것이다. A는 glaA 프로모터와 pdcA 종결인자를 사용하고 자체 신호서열을 포함하는 cDNA를 클로닝 할 수 있는 벡터(pASP503)를 나타내고, B는 glaA 프로모터와 pdcA 종결인자를 사용하고 An07g00440 리파제 신호서열을 포함하는 벡터(pASPW504)를 나타내며, C는 glaA 프로모터와 pdcA 종결인자를 사용하고 An07g00440 리파제 변형 신호서열을 포함하는 벡터(pASPV505)를 나타낸다.
도 3은 실시예 5의 재조합미생물 배양액 분석결과를 나타낸 것으로, A는 재조합미생물 pASPF503PMC의 배양액 분석결과, B는 재조합미생물 pASPW504PMC의 배양액 분석결과, C는 재조합미생물 pASPV505PMC의 배양액 분석결과를 나타낸다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는, 특정 카탈라아제 및 다른 목적단백질을 다량 발현시킬 수 있는 An07g00440 리파제 신호서열 및 변형 리파제 신호서열; 상기 신호서열과 목적단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터; 및 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물을 제조하였다. 그 결과, 제조된 재조합미생물을 배양시켜 카탈라아제를 다량으로 생산할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 목적단백질을 코딩하는 핵산으로 서열번호 6의 페니실륨 마네페이 카탈라아제 유전자를 이용하여, 본 발명의 신규 신호서열을 이용하는 경우 카탈라아제가 다량으로 생산됨을 확인하였다. 그러나, 이는 하나의 예시에 불과한바, 특정 카탈라아제 뿐만 아니라 다른 목적단백질에도 본 발명을 적용할 수 있음은 당업자에게 있어서 자명한 것이다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 An07g00440 리파제 신호서열 및 상기 신호서열을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 An07g00440 리파제 신호서열은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 신호서열을 코딩하는 핵산은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 An07g00440 리파제 신호서열의 2번째 아미노산인 타이로신(tyrosine; T)이 양전하를 띠는 알지닌(arginine; R)으로 치환되고, 3번째 아미노산인 아이소루신(isoleucine; I)이 트립토판(tryptophane; T)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 변형 리파제 신호서열 및 상기 변형 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 변형 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산은 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산 및 목적단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.

본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현 시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호교환적으로 사용된다.

본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백개의 플라스미드벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있도록 하는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation) 할 수 있다.

아울러, 상기 유전자는 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들) 일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.

일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본 발명에 있어서, 상기 목적단백질은 카탈라아제인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 카탈라아제는 서열번호 5의 페니실륨 마네페이(Penicillium marneffei) 카탈라아제 단백질인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 글루코아밀라아제 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 pASPW504PMC 또는 pASPV505PMC인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산과 목적단백질의 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물; 또는 상기 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합미생물이 아스퍼질러스 나이거인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 재조합미생물은 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 이용가능하고, 본 발명의 실시예에서는 아스퍼질러스 나이거를 사용하였으나, 이에 한정되지 않고, 상기 카탈라아제가 충분히 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 종류의 미생물이라도 무방하다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않고, 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 상태에서, 다른 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에 서 복제되어야만 하기 때문이고, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

상기 형질전환된 재조합미생물은 통상적으로 알려진 임의의 형질전환 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 발명의 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

또한, 본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.

또한, 형질전환방법에는 발현벡터를 이용한 방법 외에도, 숙주세포의 염색체상에 직접 삽입하는 방법도 이용될 수 있다.

일반적으로 전기천공법(electroporaton), 리포펙션, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론, 화학물질 촉진 DNA 유입, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2)침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 이용될 수 있다.

소소노포레이션, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 방법도 핵산의 전달에 사용할 수 있으며, 다른 대표적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland) 및 BTX Molesular Syetem(Holliston, MA)의 방법을 포함한다. 리포펙션 방법은 미국특허 제5,049,386호, 미국특허 제4,946,787호 및 미국특허 제4,897,355호에 명시되어 있으며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있으며, 예를 들어, TRANSFECTAM^TM및 LIPOFECTIN^TM이 있다. 폴리뉴클레오티드의 효과적인 리셉터-인식 리포펙션에 적당한 양이온 또는 중성 지질은 Felgner의 지질을 포함하며 (WO91/17424 및 WO91/16024), 생체 외 도입을 통해 세포로, 생체 내 도입을 통해 표적 조직으로 전달할 수 있다. 면역지질 복합체 등 표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다 (Crystal, Science., 270:404-410, 1995; Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2:291-297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5:382389, 1994; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5:647-654, 1994; Gao et al., Gene Therapy., 2:710-722, 1995; Ahmad et al., Cancer Res., 52:4817-4820, 1992; 미국특허 제4,186,183호; 미국특허 제4,217,344호; 미국특허 제4,235,871호; 미국특허 제4,261,975호; 미국특허 제4,485,054호; 미국특허 제4,501,728호; 미국특허 제4,774,085호; 미국특허 제4,837,028호; 미국특허 제4,946,787호).

본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 재조합미생물을 배양하여 목적단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 생산방법에 관한 것이다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

실시예 1: 발현벡터 pASPW504 및 pASPV505의 제조

1-1 : An07g00440 리파제 신호서열 및 An07g00440 리파제 변형 신호서열의 화학합성

카탈라아제의 아스퍼질러스 나이거 외부로의 분비를 위하여 하기 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 An07g00440 리파제 신호서열과 An07g00440 리파제 변형 신호서열을 화학합성하였다. 상기 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 An07g00440 리파제 신호서열과 An07g00440 리파제 변형 신호서열이 암호화하는 단백질의 아미노산 서열은 각각 하기의 서열번호 1 또는 서열번호 2와 같다.

서열번호 1의 An07g00440 리파제 신호서열은 N-domain 2개 아미노산, H-domain 12개 아미노산, C-domain 5개 아미노산(총 19개의 아미노산)으로 구성된다. 서열번호 2의 An07g00440 리파제 변형 신호서열은 2번째 아미노산인 타이로신을 양전하를 띠는 알지닌 아미노산으로 변형하고, 3번째 아미노산인 아이소루신을 트립토판으로 전환한 신호서열이다.

An07g00440 리파제 신호서열 아미노산 서열(서열번호 1):

myipsvlllaaslfhgata

An07g00440 리파제 변형 신호서열 아미노산 서열(서열번호 2):

mrwpsvlllaaslfhgata

An07g00440 리파제 신호서열 염기서열(서열번호 3):

atgtatatcccctcggtgctgcttctggccgcgagcctgttccatggcgcaacg

An07g00440 리파제 변형 신호서열 염기서열(서열번호 4):

atgcgctggccctcggtgctgcttctggccgcgagcctgttccatggcgcaacggcc

1-2 : 발현벡터 pASPW504 및 pASPV505의 제조

신호서열 염기서열의 양 말단에 제한효소 ClaI과 NaeI의 인식부위를 갖도록 각각 69 bp 크기의 단일 사슬의 올리고뉴클리오티드(oligonucleotide)들을 화학합성하였고, 상기 단일사슬의 올리고뉴클리오티드로부터 이중사슬의 올리고뉴클리오티드를 제조하기 위하여 어닐링(annealing) 반응을 실시하였다. 각각 69 bp 크기의 절편을 회수하였다. 회수된 절편을 pASPF503 벡터에 제한효소 ClaI과 NaeI으로 커팅하고 클로닝하여 각각 pASPW504, pASPV505라 명하였다(도 1 및 2).

pASPF503 벡터는 glaA 프로모터와 pdcA 종결 인자를 포함하고 있으며, 하이그로마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제를 포함한다(도 1 및 2). 하이드로마이신 B는 리보좀내의 펩티딜-tRNA에 삽입되어 펩티딜-tRNA의 번역(translation)을 방해한다. 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 효소는 하이그로마이신 B를 불활성화시키므로 재조합미생물을 선별할 수 있다.

실시예 2: 카탈라아제 발현벡터 pASP503PMC, pASPW504PMC 및 pASPV505PMC의 제조

하기 서열번호 5 페니실륨 마네페이 유래 카탈라아제 단백질은 총 734개의 아미노산을 암호화하고 있으며, 19개의 신호서열(언러라인)과 43개의 프리서열 (이탤릭체) 아미노산을 포함한다. PMC(페니실륨 마네페이 카탈라아제) 염기서열의 양 말단에 각각 한효소 ClaI과 NotI의 인식부위를 갖도록 하여, 2205 bp 크기의 하기 서열번호 6의 페니실륨 마네페이 유래 카탈라아제 유전자를 화학합성하여, pGEM-B1 벡터에 클로닝하였다.

페니실륨 마네페이 카탈라아제 단백질(서열번호 5):

mrglyslgtlaglvvaasa acpmltgelpagsvanphhhgkrddskassetetflsefylndndsfltsdvggpiedqhslkagirgstlledfifrqkiqhfdheriperavhargagahgvftsyadwsnitaasflgaagketptfvrfstvagsrgsadtardvhgfatrfyteegnydivgnnipvffiqdailfpdlihavkpqpaneipqaatahdtaydffgqqpstlhtlfwamsghgiprsfrhvdgfgvhtyrfvtdngssklvkfhwtslqgraslvweeaqatagknadymrqdlydsikagrypewelgvqiinesdvlsygfdlldptkilpveevpitplgkmqlnrnplnyfaeteqvmfqpghivrgidftedpllqgrlfsyldtqlnrnggpnfeqipinrprvpihnnnrdgfgqmfiplnqaayspntlnsgspkqanetvgngffttpgrsadghlvratsptfadvwsqpglfynsltateqqfvinglrfelsnvgsedvkrnfitqvnrvnntlatlvataigvpapkpeptyyhknktsnvgtfgtplkkldglrvavlasvndersiaegqalakrlansnvdvvivaeklasnvtatysesdatnfdavivtsgadglfglqtftstsnitlypagrptqimvdafrfgkpvgavgsarsalsavdistnrtgvvigdsvnddfvnqltkdlatfkfldrfavdk

페니실륨 마네페이 카탈라아제 유전자(서열번호 6):

신호서열을 포함한 PMC DNA는 ClaI과 NotI으로 절단하여 실시예 1-1의 pASPF503 벡터에 클로닝하고 pASP503PMC라 명명하였다.

서열번호 6에서 신호서열을 포함하지 않은 PMC DNA는 서열의 5' 말단에 제한효소 인식부위를 갖지 않는 서열번호 7의 PMCVF1 프라이머(gcctgcccaatgctgacaggcg)와 서열의 3' 말단에 단일한 제한효소 NotI 인식부위를 갖는 서열번호 8의 PMCNotR1 프라이머(gcggccgcctatttatccacagcaaagc)를 이용하여 화학합성하였으며, 두 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 2145 bp 절편을 확보 하였다. 확보된 절편은 실시예 1-1의 pASPW504, pASPV505 벡터 NaeI과 NotI제한 효소 사이에 클로닝하였으며, 각각 pASPW504PMC, pASPV505PMC라 명명하였다.

실시예 3: 발현벡터를 도입한 재조합미생물의 제조 및 재조합미생물의 선별방법

실시예 2의 발현벡터 pASP503PMC, pASPW504PMC 및 pASPV505PMC를 아스퍼질러스 나이거에 도입하여 형질전환하였다(Tilburn et al., Gene., 26:205-221, 1983). 형질전환을 위하여, 액상 배양한 균사체에 세포벽 분해 효소를 처리하여 프로토플라스트를 만든 후 pASP600s DNA를 유전체에 삽입하였다. 또한, 재조합미생물을 선별하기 위하여, 하이그로마시신이 첨가된 아가 배지에서 선별하여 계대 배양 하였다.

실시예 4: 재조합미생물의 플라스크 배양

실시예 3의 재조합미생물 중에서 하이그로마이신 B에 내성을 가지는 재조합미생물들을 동일한 아가배지에 점 접종하여 1차 계대를 한다. 4일 후 아가완전 배지에 재조합미생물 포자를 골고루 분산시킨 후 30℃에서 포자가 골고루 형성될때까지 5-6일간 배양한다.

5일간 배양한 배양접시로부터 0.1% Tween 80으로 무성포자를 1X10⁶ cell/ml로 수확하여 이 희석액을 1ml 액상 완전배지에 접종한다. 진탕배양기에서 28℃, 200rpm, 4일 동안 배양한다. 배양액을 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 회수한 배양상등액에서 활성을 확인하였다.

실시예 5: 카탈라아제 효소의 활성 측정

1U는 분당 1mole의 과산화수소를 분해하는 효소의 양이다. 50mM 포테슘 포스페이트 버퍼(Potassium phosphate buffer) pH7.0 49.9 ml에 30% 하이드로겐 퍼록시드 (Hydrogen Peroxide) 0.1ml을 첨가하여 기질을 만든다. 발효액 30ul를 첨가하여 255nm에서 흡광도를 측정한다.

그 결과, pASP503PMC, pASPW504PMC, pASPV505PMC 각각을 함유하는 재조합미생물 모두 과산화효소 활성을 나타내었으며, 역가는 pASP503PMC 재조합미생물의 경우 2,300 unit/ml, pASPW504PMC 재조합미생물의 경우 26,000 unit/ml, pASPV505PMC 재조합미생물의 경우 53,000 unit/ml을 나타내었다. 자체 신호서열보다 An07g00440 리파제 신호서열에서 11.3배 높게 발현되었으며, An07g00440 리파제 변형 신호서열에서 2.03배 높게 발현되었다.

SDS PAGE 분석 결과 PMC 카탈라아제 분자량은 75.9 kD 크기이나 글라이코실레이션(Glysosylation)되어 실제 크기는 100 kD임을 확인하였다. 이로써, 본 발명의 An07g00440 리파제 신호서열 및 An07g00440 리파제 변형 신호서열에 의해, 재조합 유전자가 아스퍼질러스 나이거 외부로 분비됨을 확인할 수 있었다 (도 3).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Genofocus, Inc. <120> New Catalase Signal Sequences and Expression Method Using The Same <130> P14-B175 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 1 Met Tyr Ile Pro Ser Val Leu Leu Leu Ala Ala Ser Leu Phe His Gly 1 5 10 15 Ala Thr Ala <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 2 Met Arg Trp Pro Ser Val Leu Leu Leu Ala Ala Ser Leu Phe His Gly 1 5 10 15 Ala Thr Ala <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 3 atgtatatcc cctcggtgct gcttctggcc gcgagcctgt tccatggcgc aacg 54 <210> 4 <211> 57 <212> DNA <213> Aspergillus niger <400> 4 atgcgctggc cctcggtgct gcttctggcc gcgagcctgt tccatggcgc aacggcc 57 <210> 5 <211> 734 <212> PRT <213> Penicillium marneffei <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(19) <400> 5 Met Arg Gly Leu Tyr Ser Leu Gly Thr Leu Ala Gly Leu Val Val Ala 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Cys Pro Met Leu Thr Gly Glu Leu Pro Ala Gly Ser 20 25 30 Val Ala Asn Pro His His His Gly Lys Arg Asp Asp Ser Lys Ala Ser 35 40 45 Ser Glu Thr Glu Thr Phe Leu Ser Glu Phe Tyr Leu Asn Asp Asn Asp 50 55 60 Ser Phe Leu Thr Ser Asp Val Gly Gly Pro Ile Glu Asp Gln His Ser 65 70 75 80 Leu Lys Ala Gly Ile Arg Gly Ser Thr Leu Leu Glu Asp Phe Ile Phe 85 90 95 Arg Gln Lys Ile Gln His Phe Asp His Glu Arg Ile Pro Glu Arg Ala 100 105 110 Val His Ala Arg Gly Ala Gly Ala His Gly Val Phe Thr Ser Tyr Ala 115 120 125 Asp Trp Ser Asn Ile Thr Ala Ala Ser Phe Leu Gly Ala Ala Gly Lys 130 135 140 Glu Thr Pro Thr Phe Val Arg Phe Ser Thr Val Ala Gly Ser Arg Gly 145 150 155 160 Ser Ala Asp Thr Ala Arg Asp Val His Gly Phe Ala Thr Arg Phe Tyr 165 170 175 Thr Glu Glu Gly Asn Tyr Asp Ile Val Gly Asn Asn Ile Pro Val Phe 180 185 190 Phe Ile Gln Asp Ala Ile Leu Phe Pro Asp Leu Ile His Ala Val Lys 195 200 205 Pro Gln Pro Ala Asn Glu Ile Pro Gln Ala Ala Thr Ala His Asp Thr 210 215 220 Ala Tyr Asp Phe Phe Gly Gln Gln Pro Ser Thr Leu His Thr Leu Phe 225 230 235 240 Trp Ala Met Ser Gly His Gly Ile Pro Arg Ser Phe Arg His Val Asp 245 250 255 Gly Phe Gly Val His Thr Tyr Arg Phe Val Thr Asp Asn Gly Ser Ser 260 265 270 Lys Leu Val Lys Phe His Trp Thr Ser Leu Gln Gly Arg Ala Ser Leu 275 280 285 Val Trp Glu Glu Ala Gln Ala Thr Ala Gly Lys Asn Ala Asp Tyr Met 290 295 300 Arg Gln Asp Leu Tyr Asp Ser Ile Lys Ala Gly Arg Tyr Pro Glu Trp 305 310 315 320 Glu Leu Gly Val Gln Ile Ile Asn Glu Ser Asp Val Leu Ser Tyr Gly 325 330 335 Phe Asp Leu Leu Asp Pro Thr Lys Ile Leu Pro Val Glu Glu Val Pro 340 345 350 Ile Thr Pro Leu Gly Lys Met Gln Leu Asn Arg Asn Pro Leu Asn Tyr 355 360 365 Phe Ala Glu Thr Glu Gln Val Met Phe Gln Pro Gly His Ile Val Arg 370 375 380 Gly Ile Asp Phe Thr Glu Asp Pro Leu Leu Gln Gly Arg Leu Phe Ser 385 390 395 400 Tyr Leu Asp Thr Gln Leu Asn Arg Asn Gly Gly Pro Asn Phe Glu Gln 405 410 415 Ile Pro Ile Asn Arg Pro Arg Val Pro Ile His Asn Asn Asn Arg Asp 420 425 430 Gly Phe Gly Gln Met Phe Ile Pro Leu Asn Gln Ala Ala Tyr Ser Pro 435 440 445 Asn Thr Leu Asn Ser Gly Ser Pro Lys Gln Ala Asn Glu Thr Val Gly 450 455 460 Asn Gly Phe Phe Thr Thr Pro Gly Arg Ser Ala Asp Gly His Leu Val 465 470 475 480 Arg Ala Thr Ser Pro Thr Phe Ala Asp Val Trp Ser Gln Pro Gly Leu 485 490 495 Phe Tyr Asn Ser Leu Thr Ala Thr Glu Gln Gln Phe Val Ile Asn Gly 500 505 510 Leu Arg Phe Glu Leu Ser Asn Val Gly Ser Glu Asp Val Lys Arg Asn 515 520 525 Phe Ile Thr Gln Val Asn Arg Val Asn Asn Thr Leu Ala Thr Leu Val 530 535 540 Ala Thr Ala Ile Gly Val Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Thr Tyr Tyr 545 550 555 560 His Lys Asn Lys Thr Ser Asn Val Gly Thr Phe Gly Thr Pro Leu Lys 565 570 575 Lys Leu Asp Gly Leu Arg Val Ala Val Leu Ala Ser Val Asn Asp Glu 580 585 590 Arg Ser Ile Ala Glu Gly Gln Ala Leu Ala Lys Arg Leu Ala Asn Ser 595 600 605 Asn Val Asp Val Val Ile Val Ala Glu Lys Leu Ala Ser Asn Val Thr 610 615 620 Ala Thr Tyr Ser Glu Ser Asp Ala Thr Asn Phe Asp Ala Val Ile Val 625 630 635 640 Thr Ser Gly Ala Asp Gly Leu Phe Gly Leu Gln Thr Phe Thr Ser Thr 645 650 655 Ser Asn Ile Thr Leu Tyr Pro Ala Gly Arg Pro Thr Gln Ile Met Val 660 665 670 Asp Ala Phe Arg Phe Gly Lys Pro Val Gly Ala Val Gly Ser Ala Arg 675 680 685 Ser Ala Leu Ser Ala Val Asp Ile Ser Thr Asn Arg Thr Gly Val Val 690 695 700 Ile Gly Asp Ser Val Asn Asp Asp Phe Val Asn Gln Leu Thr Lys Asp 705 710 715 720 Leu Ala Thr Phe Lys Phe Leu Asp Arg Phe Ala Val Asp Lys 725 730 <210> 6 <211> 2205 <212> DNA <213> Penicillium marneffei <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(49) <223> signal sequence <400> 6 atgcgaggat tatactccct cggaactttg gccggtctcg ttgtagctgc ttcggctgcc 60 tgcccaatgc tgacaggcga gctcccagcg ggcagtgttg cgaaccctca tcaccacgga 120 aagcgtgacg actccaaggc ttcctctgaa acagaaacgt ttctatccga gttttacctc 180 aacgacaatg attccttcct tacctccgat gtaggcggtc caattgagga tcaacacagc 240 ttgaaggctg gcatccgtgg gtcaacactc ttggaagatt tcatcttccg tcagaagatc 300 cagcattttg atcatgagcg tataccggaa cgcgccgtgc atgctcgagg tgcaggcgct 360 catggtgtat tcacctcata tgccgactgg tccaacatca ctgctgcctc attcttagga 420 gctgccggaa aggaaacgcc cacttttgtt cgcttctcga ctgttgcagg cagccgcgga 480 agtgctgata ccgctcgcga cgttcacggt ttcgctactc ggttctatac tgaggaagga 540 aattacgaca tcgttggaaa caacatcccc gtcttcttca tccaagatgc catcttattc 600 ccagatctca tccatgctgt caagccacag ccagccaatg aaatcccaca ggctgctact 660 gcacacgaca ctgcatatga cttctttggc caacagccga gcaccttgca tacccttttc 720 tgggcaatgt caggtcacgg tatcccacgg tctttccgtc acgttgatgg gttcggtgtt 780 cacacctatc ggtttgtgac tgacaatggt tcctccaagc tggtcaaatt ccactggaca 840 tctctacagg gccgagccag tcttgtctgg gaggaggctc aagctactgc cggcaagaat 900 gccgactata tgagacagga tttgtacgat agtatcaaag ctggccgtta tccggagtgg 960 gagctcggtg tgcaaattat caatgagtcg gatgttctaa gctacggatt cgacctcttg 1020 gatccaacca agattcttcc agtcgaagaa gttccaatca ctccgctggg aaaaatgcaa 1080 ctcaaccgta atcctttgaa ttattttgcc gagaccgagc aagtcatgtt ccaacccggt 1140 cacattgttc gtggtatcga tttcactgag gatcctctcc tccaaggtcg tctattttca 1200 tacctcgaca ctcaattgaa tcgcaatggt ggtcccaact ttgaacaaat tccgatcaac 1260 cgtccccgtg ttcctattca caataataac cgcgacggat ttggccaaat gtttatccca 1320 ctaaaccaag cagcatactc ccccaacacc ttaaacagcg gctctccaaa acaggcaaac 1380 gaaactgtcg gaaatggctt tttcacaacc ccggggcgtt cggcagatgg acaccttgtt 1440 cgtgccacta gcccaacatt tgcagacgtg tggtctcagc ctggtttgtt ctataattca 1500 ttgacagcca ccgagcagca gttcgtgatc aatggtttgc ggttcgagtt gtccaatgta 1560 ggaagtgagg acgttaaaag aaacttcatt actcaggtca accgtgtgaa caacacgctg 1620 gcgacgcttg tggctacagc aattggagtc cccgctccaa aacctgagcc aacatactac 1680 cacaagaaca agacgtctaa tgttggaaca tttggtaccc cattgaagaa gcttgacggt 1740 ctcagagtcg ctgtccttgc ttcagtgaac gatgaacgca gtattgccga gggacaagca 1800 ttagcaaaac gtctggcaaa ttctaacgtg gacgtcgtca ttgtcgccga gaaacttgcg 1860 tcaaatgtga cggctaccta ctccgagtca gacgcaacaa actttgacgc ggttatcgtg 1920 acttcgggag ctgatggtct cttcggactt cagactttca caagcacatc taacataact 1980 ctttaccccg caggccgtcc tactcagatt atggtcgatg cttttcgatt cggcaagcca 2040 gtaggagcgg tgggcagcgc caggtcagcc ttgtcagcgg tggatatcag cactaatcgc 2100 actggtgtgg ttattggcga ttccgtcaat gacgactttg tcaaccagct aacgaaggac 2160 ctagcaacat tcaagttcct ggatcgcttt gctgtggata aatag 2205 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMCVF1 primer <400> 7 gcctgcccaa tgctgacagg cg 22 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMCNotR1 primer <400> 8 gcggccgcct atttatccac agcaaagc 28

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 An07g00440 리파제 신호서열 펩타이드.
제1항에 있어서, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래인 것을 특징으로 하는 An07g00440 리파제 신호서열 펩타이드.
제1항의 An07g00440 리파제 신호서열 펩타이드를 코딩하는 핵산.
제3항에 있어서, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산.
제1항의 An07g00440 리파제 신호서열 펩타이드의 2번째 아미노산인 타이로신(tyrosine; Y)이 양전하를 띠는 알지닌(arginine; R)으로 치환되고, 3번째 아미노산인 아이소루신(isoleucine; I)이 트립토판(tryptophane; W)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 변형 리파제 신호서열 펩타이드.
제5항의 변형 리파제 신호서열 펩타이드를 코딩하는 핵산.
제6항에 있어서, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산.
제1항 또는 제5항의 리파제 신호서열 펩타이드를 코딩하는 핵산 및 카탈라아제의 유전자를 포함하는 발현벡터.
삭제
제8항에 있어서, 상기 카탈라아제는 서열번호 5의 페니실륨 마네페이(Penicillium marneffei) 카탈라아제 단백질인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제8항에 있어서, 글루코아밀라아제 프로모터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
삭제
제1항 또는 제5항의 리파제 신호서열을 코딩하는 핵산과 카탈라아제의 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물.
제8항의 발현벡터가 도입되어 있는 재조합미생물.
제14항에 있어서, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)인 것을 특징으로 하는 재조합미생물.
다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 카탈라아제의 제조방법:
(a) 제13항의 재조합미생물을 배양하여 카탈라아제를 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 카탈라아제를 회수하는 단계.
다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 카탈라아제의 제조방법:
(a) 제14항의 재조합미생물을 배양하여 카탈라아제를 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 카탈라아제를 회수하는 단계.