KR102350289B1 - 질소결핍 유도성 프로모터 및 이를 포함하는 유전자 발현 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 질소결핍 유도성 프로모터 및 이를 포함하는 유전자 발현 시스템에 관한 것으로 질소결핍 조건 하에서 유전자의 발현을 간편하게 조절할 수 있으며, 다양한 종류의 생물체에 적용 가능하다.
Description
본 발명은 질소결핍 유도성 프로모터 및 이를 포함하는 유전자 발현 시스템에 관한 것이다.
클로렐라는 녹조류에 속하는 단세포 진핵생물로서 다양한 생장환경에 적응하여 생장하며, 약 6시간만에 네 개의 세포로 분열되는 빠른 생장 특징을 갖는다. 또한 세포 내에 지질 등 풍부한 유용물질들을 합성하고 고영양체이기 때문에 바이오디젤의 원료로 뿐만 아니라 일반적으로 안전하다고 볼 수 있는 물질(GRAS)로서 오랫동안 널리 식용되어 오는 등 여러 장점을 기반으로 상업적으로 이용되고 있다(Kothari et al., 2012; Xue et al., 2016; Wang et al., 2017).
최근에는 항체를 포함한 유용단백질 생산 플랫폼으로써 클로렐라를 이용하여 재조합 단백질을 대량 생산하기 위한 시도가 이루어지고 있다(Koo et al., 2013; Ren et al., 2012; Yang et al., 2016). 클로렐라에서 안정적인 재조합 단백질의 생산 플랫폼 구축을 위해서는 우선적으로 클로렐라의 형질전환 기술 개발이 선행되어야 하며 현재까지 다양한 방법의 기술들이 개발되고 있고(Cha et al., 2012; Kim et al., 2002; Niu et al., 2012; Yang et al., 2015), 본 발명자들은 전기천공법을 이용한 고효율 형질전환체계를 확립한 바 있다(Kumar et al., 2018; 김성룡 2018).
효과적인 형질전환체계 확립과 더불어 특정 발현 조건에서 구동되는 최적의 프로모터의 사용은 고효율의 단백질 생산에 있어 결정적인 요인 중 하나로 꼽힌다. 최적의 프로모터 사용은 또한 단백질 생산 시스템에서 사용되는 비용을 크게 절감하는 경제적인 효과를 가질 수 있다. 수년전에 규조류(diatom)인 Phaeodactylum tricornutum에서 nitrate reductase 유전자의 프로모터로 조절된 단백질 발현 시스템이 보고되었으며(Hempel et al., 2011; Hempel and Maier, 2012), 질산나트륨(NaNO3)이 첨가된 배지에 P. tricornutum를 배양할 경우 nitrate reductase 프로모터의 활성 증가로 인해 이 프로모터에 연결된 재조합 단백질 생산이 증가됨을 보였다. 이렇듯 재조합 단백질 생산 시스템에서 프로모터의 중요성에도 불구하고 유용 미세조류인 클로렐라에서의 연구는 거의 전무하다.
본 발명자들은 질소결핍 조건 하에서 특이적으로 유전자의 발현을 유도하는 유전자 발현조절 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 클로렐라로부터 발굴한 CvNDI1 프로모터가 질소결핍 조건 하에서 목적 유전자의 발현을 강하게 유도함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 질소결핍 유도성 프로모터를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 프로모터를 포함하는 발현벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 발현벡터로 형질전환 된 형질전환체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 형질전환체를 질소결핍 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 외래 유전자의 발현 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 질소결핍 유도성 프로모터에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 질소결핍 유도성 프로모터를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환 된 형질전환체에 관한 것이다.
본 발명자들은 질소결핍 조건 하에서 특이적으로 유전자의 발현을 유도하는 유전자 발현조절 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였고 그 결과, 클로렐라로부터 발굴한 CvNDI1 프로모터가 질소결핍 조건 하에서 목적 유전자의 발현을 강하게 유도함을 규명하였다.
본 발명에서 용어 "프로모터"는 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 외래 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다.
본 발명자들은 클로렐라의 질소결핍 조건에서 발현이 증가된 scaffold를 선발하여 이를 CvNDI1(Chlorella vulgaris Nitrogen Deficiency-Induced 1) 유전자로 명명하고, 상기 유전자의 상류(upstream)에 존재하는 프로모터를 발굴하였다.
본 발명의 프로모터는 클로렐라에서 유래한 것으로서, 상기 클로렐라의 CvNDI1 단백질을 코딩하는 유전자의 상류에 존재하는 것을 의미하며, 자연 유래 또는 인위적으로 합성한 염기서열이 모두 상기 프로모터로서 이용될 수 있다.
상기 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 그 하류(downstream) 즉 상기 염기서열의 3' 말단 쪽에 작동가능하게 연결된 외래 단백질을 코딩하는 유전자의 '발현'을 유도 및 향상시킨다. 그러나, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 상기와 같은 유전자의 발현을 유도 및 향상시키는 성질을 갖는 프로모터의 최소 단위일 뿐, 상기 프로모터의 서열이 상기 서열번호 1의 염기서열에 한정되지 아니한다.
본 발명에서 용어 "발현벡터"는 숙주세포에서 목적으로 하는 외래 유전자를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 벡터를 의미한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서와 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.
상기 질소결핍 유도성 프로모터는 발현벡터에 포함되어, 상기 프로모터의 하류에 작동가능하게 연결된 외래 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 질소결핍 의존적으로 조절할 수 있다.
상기 외래 단백질은 생산하고자 하는 단백질을 의미하는 것으로서, 유전자의 염기서열이 알려진 모든 종류의 단백질일 수 있다. 특히, 상기 외래 단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 항체 및 이의 단편 등 일 수 있고, 예를 들어, G-CSF(Granulocyte-Colony Stimulating Factor) 일 수 있다.
상기 발현벡터는 외래 단백질을 코딩하는 유전자가 상기 프로모터에 작동가능하게 삽입될 수 있는 다중클로닝부위(multiple cloning site, MCS)를 더 포함할 수 있다. 상기 다중클로닝부위를 이용하여 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 상기 발현벡터 내로 손쉽게 삽입할 수 있다.
상기 발현벡터에는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선별하기 위한 선별 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 종래 공지된 모든 종류의 선별 마커일 수 있으며, 항생제 내성 유전자 또는 발광 유전자 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 발현벡터는 종래에 알려진 발현벡터에 상기 질소결핍 유도성 프로모터를 도입한 것일 수 있고, 공지의 방법에 의하여 인위적으로 디자인된 재조합 발현벡터일 수 있다. 상기 질소결핍 유도성 프로모터를 도입하여 발현벡터를 제조하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 공지의 방법에 따라 용이하게 실시 가능하다.
상기 발현벡터의 제조를 위한 벡터는 상기 질소결핍 유도성 프로모터를 도입할 수 있는 공지된 다양한 벡터를 사용가능하고, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등 일 수 있다. 특히, 미세조류 또는 식물과 같은 숙주세포 내에서 안정하게 존재하고 카피수가 많은 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 발현벡터는 숙주세포에 도입되어, 상기 숙주세포를 상기 발현벡터로 형질전환 할 수 있다.
상기 형질전환은 종래 공지된 형질전환 기술에 의해 당업자가 용이하게 수행할 수 있고, 상기 형질전환 기술은 Kindle(1990)에 의해 공지된 글라스 비드를 이용한 형질전환법, 칼슘/폴리에틸렌 글리콜법을 이용한 원형질체의 형질전환법, 전기천공법, 미량주사법, 입자 충격 투입법(particle bombardment), 전기충격법(electrophration), 아그로박테리움을 매개로 한 방법, 유전자 총 또는 물리적 도입법 등이 있다. 상기 형질전환 기술은 숙주세포의 종류 및 특성에 맞게 당업자가 적절히 선택하여 수행할 수 있다.
상기 발현벡터를 형질전환시키기 위한 숙주세포는 미세조류 또는 식물인 것이 바람직하고, 예를 들어, 클로렐라일 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 프로모터를 인식할 수 있는 RNA 중합효소를 가진 세포는 모두 사용 가능하다.
상기 발현벡터로 형질전환 된 형질전환체는 미세조류 또는 식물일 수 있다.
상기 미세조류는 클로렐라일 수 있다.
상기 식물은 성숙한 식물 뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 질소결핍 유도성 프로모터에 외래 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환 된 형질전환체에 관한 것이다.
상기 외래 단백질은 생산하고자 하는 단백질을 의미하는 것으로서, 유전자의 염기서열이 알려진 모든 종류의 단백질일 수 있다. 특히, 상기 외래 단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 항체 및 이의 단편 등 일 수 있고, 예를 들어, G-CSF(Granulocyte-Colony Stimulating Factor) 일 수 있다.
상기 외래 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 질소결핍 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 상기 작동가능하게 연결된다는 것은 상기 외래 유전자의 발현이 상기 질소결핍 유도성 프로모터의 활성에 의해 조절될 수 있도록 연결되는 것을 의미한다. 따라서, 상기 질소결핍 유도성 프로모터에 외래 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결되어 형성되는 상기 유전자 컨스트럭트는 상기 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트가 된다.
상기 유전자 컨스트럭트는 발현벡터에 포함되어, 상기 외래 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 질소결핍 의존적으로 조절할 수 있다.
또한, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 상기 발현벡터는 숙주세포에 도입되어, 상기 숙주세포를 상기 발현벡터로 형질전환할 수 있다. 상기와 같이 형성된 형질전환체는 상기 외래 유전자를 발현시키는데 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환체를 질소결핍 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 외래 유전자의 발현 방법에 관한 것이다.
상기 배양은 상기 형질전환체의 종류 및 특성에 따라 배양 방법, 배양 배지, 배양 조건 등을 달리하여 당업자가 적절히 수행할 수 있다.
상기 배양에 있어서 질소결핍은 질소결핍 배지를 이용하여 유도할 수 있다.
상기 질소결핍에 의해 상기 형질전환체에서 외래 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 유도되며, 상기 유전자는 질소결핍 유도성 프로모터의 활성에 의하여 그 발현이 조절된다.
상기와 같은 유전자 컨스트럭트, 이를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터가 포함된 형질전환체를 이용하여 외래 유전자를 용이하게 발현시킬 수 있다.
본 발명은 질소결핍 유도성 프로모터 및 이를 포함하는 유전자 발현 시스템에 관한 것으로 질소결핍 조건 하에서 유전자의 발현을 간편하게 조절할 수 있으며, 다양한 종류의 생물체에 적용 가능하다.
도 1은 질소결핍 조건에서 클로레라 유전자 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 2a 및 도 2b는 CvNDI1 아미노산 서열에 대한 blast 결과이다.
도 3은 CvNDI1 유전자의 프로모터를 이용하여 구축한 발현벡터를 나타낸다.
도 4a는 도 3의 발현벡터로 형질전환 된 형질전환체에 대하여 도입된 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 4b는 도 3의 발현벡터로 형질전환 된 형질전환체에서 질소결핍 조건에 따른 유전자 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 2a 및 도 2b는 CvNDI1 아미노산 서열에 대한 blast 결과이다.
도 3은 CvNDI1 유전자의 프로모터를 이용하여 구축한 발현벡터를 나타낸다.
도 4a는 도 3의 발현벡터로 형질전환 된 형질전환체에 대하여 도입된 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 4b는 도 3의 발현벡터로 형질전환 된 형질전환체에서 질소결핍 조건에 따른 유전자 발현 변화를 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 질소결핍 유도성 유전자
CvNDI1
의 선발
질소결핍 조건에 있는 극지 클로렐라에서 클로렐라 유전자의 RNA 발현패턴을 조사한 마이크로어레이 데이터를 한국생명공학연구원의 정원중 박사로부터 제공받았다. 이 중 10여개의 유전자를 우선적으로 선발하였으며, 질소결핍 조건에서 이들의 실제 발현 증가 여부를 개별적으로 확인하였다.
질소결핍 조건에서 유전자의 발현이 증가하는지를 확인하기 위해 영양배지에서 배양된 클로렐라를 질소원을 첨가하지 않은 질소결핍 배지로 옮겨 3일간 배양하였다. 질소결핍 배지에서 배양된 클로렐라 시료는 하루 간격으로 채취하였고 (0일부터 3일까지), 채취된 시료로부터 전체 RNA를 추출하였으며 역전사 후 PCR (RT-PCR)로 발현을 확인하였다. 그 결과, 질소결핍 조건에서 발현 증가가 확인된 유전자를 선발하였으며 CvNDI1(Chlorella vulgaris Nitrogen Deficiency-Induced 1)으로 명명하였다(도 1). CvNDI1 유전자의 경우 경우, 정상배지 조건에서도 약하게 발현되는 것으로 나타났으나 질소결핍 후 1일째에 발현은 빠르게 유도되어져 높게 발현되었다. 그러한 높은 발현은 2일째까지 유지되었으나 3일째에 발현량은 절반정도로 감소되었다.
반면에 선별된 나머지 2개 유전자(scaffold 37과 73)는 마이크로어레이 데이터와 달리 질소결핍에 의한 발현 유도성을 관찰할 수 없었다(도 1). 따라서 CvNDI1을 질소결핍 유도성 프로모터 개발을 위한 최종 유전자로 선발하였다.
실시예 2.
CvNDI1
유전자의 동정
선발된 CvNDI1 유전자의 염기서열을 결정하였으며 blast 검색을 통하여 전장 유전자를 예상하였고, 그 아미노산 서열을 추론하였다(서열번호 2).
추론된 CvNDI1 아미노산 서열을 이용해 blast 검색을 한 결과, CvNDI1은 urea carboxylase의 conserved domain을 갖는 것으로 나타났다(도 2a-2b). 또한 도 2a-2b에서와 같이, 녹조류 클로렐라과(Chlorellaceae)에 속하는 Micractinium conductrix 와 Chlorella sorokiniana의 urea carboxylase와 각각 79%와 77%의 상동성을 보여주었다.
일반적으로 질소화합물들의 분해로 생성되는 urea는 동물과 다르게 식물과 미생물에서 질소원으로 이용되며 urea를 질소원으로 이용하기 위한 첫 단계로 urea를 ammonium으로 전환시켜야 하는데 이를 위해 urea carboxylase의 작용이 요구된다(Zhao et al., 2018). 따라서, 그러한 CvNDI1 유전자는 질소결핍 조건에서 세포의 생존을 위해 질소원의 공급을 위한 질소대사에 참여할 것으로 추측되며, 이러한 예측은 도 1에서의 유전자 발현패턴과 일치하는 것으로 판단된다.
실시예 3.
CvNDI1
유전자의 프로모터 클로닝 및 벡터 제작
CvNDI1 유전자의 프로모터 서열은 Chlorella vulgaris 게놈 서열로부터 추출되었으며, 해당 유전자의 프로모터는 번역 시작코돈(AUG)으로부터 상류의 서열 약 1 kb(서열번호 1)를 PCR로 증폭하였다.
증폭된 PCR 산물은 면역증강 단백질인 Granulocyte-Colony Stimulating Factor(G-CSF)의 식물 발현벡터인 pJKS136의 Ramy3D 프로모터와 치환되었으며 그 결과 CvNDI1 하류에 G-CSF가 연결된 벡터를 제작하여 pCvNDI1-CSF로 명명하였다.
실시예 4. 클로렐라의 형질전환 및 질소결핍 조건에서 CvNDI1 프로모터의 기능 확인
선발된 CvNDI1 유전자의 프로모터가 질소결핍 조건에서 G-CSF 유전자를 효과적으로 발현시키는지 조사하기 위하여, 제작된 pSK398를 전기천공법을 이용하여 UTEX395에 도입하였다. Hygromycin으로 선별된 형질전환 라인들 중 2개의 라인으로부터 genomic DNA를 분리하고 이를 이용한 PCR을 통해 이들 라인의 T-DNA의 도입을 확인하였다(도 4a).
선발된 2개의 라인들은 정상배지에서 생장 후 질소결핍 배지로 옮겨 3일간 배양하였고 배양 후 2일과 3일째에 시료를 채취하였다. 채취된 시료로부터 total RNA를 추출하였고 이를 역전사효소 PCR(RT-PCR)을 이용하여 G-CSF의 발현량을 조사한 결과, 질소결핍 처리 후 3일째에 G-CSF의 발현이 가장 높은 것으로 조사되었다(도 4b). 이러한 결과는 본 발명에서 선발된 CvNDI1 유전자의 프로모터가 질소결핍에 의해 실제로 유도된다는 것을 의미한다.
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Comprising The Same
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Ala Glu Glu Ser Val Cys Leu Gly Ala Ser Pro Lys Glu Tyr Leu Asn
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Ala Gly Lys Leu Ile Glu Val Ala Lys Ser Thr Gly Cys Asp Ala Val
65 70 75 80
Phe Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Thr Asp Phe Ala Ala Leu
85 90 95
Cys Glu Glu Asn Gly Ile Ala Phe Ile Gly Pro Thr Ala Asp Thr Met
100 105 110
Arg Met Phe Ala Gln Lys His Thr Ala Arg Glu Leu Ala Glu Lys Ala
115 120 125
Glu Val Pro Val Leu Ala Gly Ser Pro Leu Leu Ser Ser Asp Glu Glu
130 135 140
Ala Leu Glu Tyr Ala Lys Gln Val Gly Leu Pro Val Leu Leu Lys Ala
145 150 155 160
Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ile Gly Ile His Ile Cys Arg Thr Glu Glu
165 170 175
Glu Val Val Thr Asn Tyr Ala Ser Ala Ser Arg Gln Gly Ala Ala Ala
180 185 190
Phe Gly Asp Ala Gly Val Phe Val Glu Lys Tyr Val Gln Arg Ala Arg
195 200 205
His Ile Glu Val Gln Ile Phe Gly Asp Gly Lys Gly Asn Val Val Thr
210 215 220
Phe Pro Glu Arg Glu Cys Ser Ile Gln Arg Arg His Gln Lys Ile Leu
225 230 235 240
Glu Glu Thr Pro Ser Pro Phe Val Gln Ser Pro Leu Arg Ala Glu Leu
245 250 255
Gln Gly Ala Ala Leu Arg Leu Gly Gln Ile Ala Lys Tyr Arg Ser Ala
260 265 270
Gly Thr Val Glu Phe Ile Val Asp Asp Glu Thr Gly Lys Phe Tyr Phe
275 280 285
Leu Glu Val Asn Cys Arg Leu Gln Val Glu His Gly Ile Thr Glu Met
290 295 300
Ile Thr Gly Val Asp Leu Val Ala Trp Gln Leu Gln Gln Gln Gly Ala
305 310 315 320
Lys Gly Ser Asp Leu Pro Ser Asp Leu Ala Ala Phe Thr Pro Thr Ile
325 330 335
Asn Gly Ala Ala Ile Glu Val Arg Ile Cys Ala Glu Asp Pro Ala His
340 345 350
Asn Tyr Arg Pro Cys Thr Gly Val Leu Gly Leu Val Ala Trp Pro Gln
355 360 365
Gln Val Glu Thr Arg Val Asp Thr Trp Val Glu Thr Gly Val Glu Val
370 375 380
Ser Ala Tyr Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Lys Leu Met Val His Ser Pro
385 390 395 400
Glu Gly Arg Pro Thr Ala Ile Ala Lys Leu Arg Gln Ala Leu Glu Glu
405 410 415
Thr Gln Val Trp Arg Arg Val Ala Gly Thr Val Val Gly Cys Ser Trp
420 425 430
Gly Trp Leu Leu Ala Ala Pro Asp Ala Thr Val Val Thr His Asn Cys
435 440 445
Asn Gly Trp Ala Leu Gln Leu His Gly Gly Thr Pro Leu Gln Cys His
450 455 460
Ser Lys Arg Glu Leu Pro Ala Pro Ser His Cys Leu Leu Val Leu Tyr
465 470 475 480
Cys Leu Cys Cys Thr Ala Lys Leu Thr Thr Arg Pro Ala Ala Val Arg
485 490 495
Asn Ala Cys Phe Pro Pro Tyr Lys Gln Leu Lys Gly Val Cys Ser Asn
500 505 510
Leu Glu Phe Leu Arg Val Ile Ala Ala Asp Pro Arg Tyr Pro Ala Gly
515 520 525
Asp Thr Thr Thr Lys Phe Val Glu Gly Val Asp Tyr Ala Pro His Ala
530 535 540
Val Glu Val Val Asp Ala Gly Leu Gln Thr Thr Val Gln Asp Tyr Pro
545 550 555 560
Gly Arg Val Ala Leu Trp Ser Val Gly Val Pro Pro Ser Gly Pro Met
565 570 575
Asp Asp Phe Ser His Arg Leu Ala Asn Ala Leu Val Gly Asn Asp Asp
580 585 590
Ala Ala Ala Ala Leu Glu Ile Thr Leu Thr Gly Pro Thr Leu Thr Phe
595 600 605
Leu Ala Glu Thr Val Val Ala Val Cys Gly Ala Glu Ala Pro Val Thr
610 615 620
Leu Asp Gly Ala Glu Val Pro Met Trp Gln Ser Phe Leu Val Lys Arg
625 630 635 640
Gly Gln Thr Val His Val Gly Ala Thr Ser Gly Gly Ser Arg Ala Tyr
645 650 655
Leu Ala Met Ala Gly Gly Leu Asp Val Pro Asp Tyr Leu Gly Ser Lys
660 665 670
Ser Thr Phe Pro Gly Ala Val Met Gly Gly His Gln Gly Arg Ala Leu
675 680 685
Arg Pro Gly Asp Leu Leu Pro Met Gly Ala Ala Asp Leu Ser Ser Leu
690 695 700
Ala Val Gly Ala Ser Val Pro Leu Asp Trp Arg Pro Gln Phe Cys Ser
705 710 715 720
Gly Val Gln Asp Trp Val Val Gly Val Leu Pro Gly Pro Gln Ala Asp
725 730 735
Pro Asp Tyr Phe Thr Pro Glu Asp Ile Gln Thr Leu Phe Ser Thr Pro
740 745 750
Tyr Lys Ile His His Asn Ser Asn Arg Leu Gly Ile Arg Met Glu Gly
755 760 765
Pro Arg Pro Lys Phe Ala Arg Leu Asp Gly Gly Glu Gly Gly Ser His
770 775 780
Pro Ser Asn Val His Asp His Val Tyr Ala Ile Gly Ala Leu Asn Phe
785 790 795 800
Thr Gly Asp Met Pro Ile Cys Leu Met Val Asp Gly Pro Ser Leu Gly
805 810 815
Gly Phe Val Cys Pro Ala Thr Ile Thr Thr Thr Glu Leu Trp Lys Met
820 825 830
Gly Gln Val Arg Pro Gly Asp Ala Val Gln Phe Lys Lys Leu Ser Ile
835 840 845
Glu Glu Ala Tyr Thr Glu Arg Leu Thr Val Asp Asn Gln Val Ala Leu
850 855 860
Leu Cys Gln Val Ala Arg Gly Ala Lys Ser Ala Gln Ala Ala Glu Ala
865 870 875 880
Glu Ala Glu Ala Phe Gln Val Thr Val Pro Glu Thr Pro Pro Thr Ser
885 890 895
Ala Val Leu Arg Val Val Pro Ala Gly Ala Ser His Pro Gly Ala Gln
900 905 910
Val Arg Leu Ala Gly Asp Arg Tyr Val Phe Leu Glu Tyr Gly Pro Met
915 920 925
Glu Leu Asp Ile Gly Leu Arg Val Arg Val His Glu Ile Glu His Tyr
930 935 940
Leu Ala Glu Lys Lys Ile Asp Gly Leu Ile Glu Thr Ser Pro Gly Val
945 950 955 960
Arg Ser Val Met Ile Glu Tyr Asp Gln Arg Arg Leu Pro Leu Ala Lys
965 970 975
Leu Leu Gln Ile Ile Asp Glu Gly Glu Gln Asn Met Arg Pro Ala Asp
980 985 990
Asn Val Thr Leu Pro His Arg Ile Ile His Leu Pro Leu Ala Phe Asn
995 1000 1005
Asp Lys Trp Thr Asn Glu Ala Ile Ser Arg Tyr Met Arg Ser Val Arg
1010 1015 1020
Ser Glu Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Asn Val Glu Phe Val Ala Ala Asn
1025 1030 1035 1040
Asn Gly Leu Glu Gly Asp Pro Ile Glu Ala Val Arg Lys Val Leu Phe
1045 1050 1055
Glu Ala Ser Tyr Met Val Leu Gly Leu Gly Asp Val Tyr Leu Gly Ala
1060 1065 1070
Pro Cys Ala Val Pro Val Asp Pro Arg His Arg Leu Val Val Pro Lys
1075 1080 1085
Tyr Asn Pro Ala Arg Thr Ser Thr Pro Glu Gly Ser Val Gly Ile Gly
1090 1095 1100
Gly Ala Tyr Met Cys Ile Tyr Pro Met Thr Ser Pro Gly Gly Tyr Gln
1105 1110 1115 1120
Leu Val Gly Arg Thr Leu Pro Ile Trp Asn Pro Phe Thr Arg Thr Gly
1125 1130 1135
Pro Phe Gln Pro Gly Lys Pro Trp Leu Leu Arg Asn Phe Asp Gln Val
1140 1145 1150
Arg Tyr Tyr Glu Val Ser Glu Asp Glu Leu Glu Val Leu Arg Ala Asp
1155 1160 1165
Phe Arg Asn Gly Arg Leu Glu Ile Arg Ile Glu Glu Ala Ser Phe Asp
1170 1175 1180
Val His Glu Tyr Asn Gln Phe Leu Lys Ser Val Ala Gly Glu Tyr Glu
1185 1190 1195 1200
Glu Leu Arg Gln Arg Gln Arg Lys Ala Met Ala Glu Gln Met Ala Ile
1205 1210 1215
Asp Ala Glu Met Leu Gln Lys Met Asp Ala Ala His Arg Ser Gly Leu
1220 1225 1230
Ala His Ala Gln Ser Ser Val Met Arg Val Ala Met Gly Glu Asn Asp
1235 1240 1245
Ser Asp Pro Tyr Asp Gly Gln Pro Gly Thr Ala Val Thr Ala Ala Val
1250 1255 1260
Thr Gly Thr Val Trp Glu Ile Lys Val Glu Leu Gly Thr Ala Val Lys
1265 1270 1275 1280
Ala Gly Asp Thr Leu Val Val Leu Glu Ala Met Lys Met Glu Tyr Ala
1285 1290 1295
Val Thr Ala Pro Cys Asp Gly Ile Leu Lys His Val Cys Val Gln Gln
1300 1305 1310
Ala Asp Met Val Gln Gln Gly Ser Pro Leu Cys Leu Val Ala
1315 1320 1325
Claims (5)
- 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 질소결핍 유도성 프로모터.
- 제 1 항의 질소결핍 유도성 프로모터를 포함하는 발현벡터.
- 제 2 항에 있어서, 상기 발현벡터는 외래 단백질을 코딩하는 유전자가 상기 프로모터에 작동가능하게 삽입될 수 있는 다중클로닝부위(multiple cloning site, MCS)를 더 포함하는 것인, 발현벡터.
- 제 2 항의 발현벡터로 형질전환 된 형질전환체.
- 제 4 항의 형질전환체를 질소결핍 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 외래 유전자의 발현 방법.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020190052993A KR102350289B1 (ko) | 2019-05-07 | 2019-05-07 | 질소결핍 유도성 프로모터 및 이를 포함하는 유전자 발현 시스템 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020190052993A KR102350289B1 (ko) | 2019-05-07 | 2019-05-07 | 질소결핍 유도성 프로모터 및 이를 포함하는 유전자 발현 시스템 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20200128891A KR20200128891A (ko) | 2020-11-17 |
KR102350289B1 true KR102350289B1 (ko) | 2022-01-12 |
Family
ID=73642268
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020190052993A KR102350289B1 (ko) | 2019-05-07 | 2019-05-07 | 질소결핍 유도성 프로모터 및 이를 포함하는 유전자 발현 시스템 |
Country Status (1)
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KR (1) | KR102350289B1 (ko) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003040379A2 (en) | 2001-11-06 | 2003-05-15 | The University Of British Columbia | Modulating urea degradation in wine yeast |
KR101719101B1 (ko) | 2016-06-30 | 2017-03-23 | 경희대학교 산학협력단 | 뿌리털 특이적 프로모터 및 이의 용도 |
-
2019
- 2019-05-07 KR KR1020190052993A patent/KR102350289B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003040379A2 (en) | 2001-11-06 | 2003-05-15 | The University Of British Columbia | Modulating urea degradation in wine yeast |
KR101719101B1 (ko) | 2016-06-30 | 2017-03-23 | 경희대학교 산학협력단 | 뿌리털 특이적 프로모터 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
BMC RESEARCH NOTES 2013, 6:482 [HTTP://WWW.BIOMEDCENTRAL.COM/1756_0500/6/482] |
GENBANK: PSC69627.1 |
THE PLANT CELL, VOL. 30, P. 925_945, APRIL 2018 [DOI/10.1105/TPC.17.00810] |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20200128891A (ko) | 2020-11-17 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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E701 | Decision to grant or registration of patent right |