CN105906696A - 一个新的棉纤维发育相关基因GhEIN3的鉴定及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个新的棉纤维发育相关基因GhEIN3的鉴定及应用。该基因不含内含子，其cDNA全长序列为2317bp，包括5'端未翻译区193bp，开放阅读框1842bp及3'端未翻译区282bp，编码一个含有613氨基酸的蛋白质，在棉纤维起始发育期优势表达。GhEIN3蛋白具有转录自激活的能力，定位于细胞核中，表明该蛋白是作为转录激活因子起作用的。GhEIN3可以形成同源或者异源二聚体，通过介导JA和GA激素信号来调控棉纤维发育。GhEIN3 RNAi转基因棉花短纤维(短绒)数量显著减少，长纤维(长绒)数量也有所减少，但成熟纤维(长绒)长度显著增加，而过量表达GhEIN3导致棉纤维长度变短，这表明GhEIN3在棉纤维起始及纤维伸长发育过程中发挥重要调控作用。

Description

一个新的棉纤维发育相关基因GhEIN3的鉴定及应用

技术领域：

本发明涉及一个棉花基因，具体是一个棉纤维细胞起始及起始伸长转换调控的EIN3(Ethylene Insensitive 3)转录因子基因GhEIN3的克隆与功能鉴定。

背景技术：

棉花是我国重要的经济作物，与我国2亿农民的收入和1900万纺织工人的就业息息相关。随着纺织工业快速发展和人民生活水平不断提高，纺织工业及其相关产业对棉纤维品质的要求愈来愈高。我国皮棉总产世界第一，单产也居五大产棉国首位，但我国棉花纤维品质差，不能用作一些高附加值高质量纺织产品的生产原料。因此，我国每年需进口优质皮棉100多万吨，造成国产原棉的积压。纤维品质问题已成为制约我国棉花产业可持续发展的主要障碍之一。

棉花遗传改良的最终目标是提高棉花纤维的产量和品质。棉纤维的产量和品质不仅受环境因素的影响，而且受棉纤维相关基因的调控。目前，国内外除了利用常规育种手段外，还逐步运用遗传工程对棉纤维品质进行遗传改良。将优良的农艺性状，特别是纤维品质相关的优良性状引入棉花主栽品种，不仅可提高棉花产量和纤维品质，降低生产成本，而且可减轻对环境的不利影响。而该工作的开展首先依赖于对棉纤维发育相关基因及其调控元件的鉴定。通过克隆纤维强度、细度和长度等品质性状相关的关键功能基因和核心调控元件，分析纤维发育相关基因间的互作、基因的表达调控及表达产物的生物学功能，阐明纤维发育的分子机制，揭示棉纤维品质性状形成的遗传基础，为高效改良纤维品质提供理论依据和基因元件。棉纤维特异性功能基因的克隆与鉴定是进行棉纤维品质改良的分子育种的重要研究内容。据报道，美国、日本、澳大利亚和以色列等国家都已有大量的棉纤维发育相关基因的专利。

有研究表明，植物激素在棉花纤维起始命运决定中具有重要作用，并可以促进转录因子对纤维细胞分化的调控。例如，北京大学朱玉贤教授课题组鉴定了几个乙烯合成相关基因(ACO1-3)，这几个基因在棉花(徐州142)中的表达大大高于其无绒无絮突变体(fiberless,fl)，且外源添加乙烯促进纤维伸长，而其抑制剂(AVG)则抑制纤维生长，表明乙烯可以促进棉纤维伸长发育。EIN3/EIL1是乙烯信号通路中的关键因子，可以调控大量乙烯相关基因的表达，已有的研究表明EIN3类蛋白参与植物生长发育(如根毛发育，调节衰老)及应对外界环境刺激(如参与免疫应答)等多个过程。在高等植物中EIN3/EILs是一个相对较小的基因家族，研究发现拟南芥、烟草、番茄和水稻中分别具有6个、5个、4个和6个EIN3/EILs类转录因子。1997年，研究者通过筛选拟南芥乙烯不敏感突变体而首次鉴定了EIN3基因(Qi et al.,1997)。在随后的十几年中，对该基因功能研究得越来越深入。研究发现，除了EIN3之外，在拟南芥中还存在5个同源基因(EIL1–EIL5基因)，其中EIL1与EIN3的同源性最高。拟南芥EIN3家族成员之间存在功能冗余，其中EIN3/EIL1发挥主要功能。早期拟南芥EIN3的研究主要集中于其参与乙烯的三种反应和对植物衰老的控制。EIN3/EIL1蛋白能够结合在拟南芥免疫受体FLS2的启动子上来调控免疫应答(Freddy et al.,2010)。通过与HDA6及JAZ等抑制因子的互作来控制根毛的发育(Zhu et al.,2011)。EIN3/EIL1也能够与受低铁诱导的bHLH类转录因子FIT和中介子MED25间的互作来控制铁平衡(稳态)，进而控制植物发育(Lingam et al.,2011；Yan et al.,2014)。EIN3/EIL1通过控制ROS的积累来响应NaCl信号，过量表达EIN3转基因拟南芥植物具有更强的NaCl耐受性(Peng et al.,2014)。研究还发现，EIN3/EIL1还能通过抑制miRNA164的表达来调控几个NAC和ACS基因的表达来控制植物叶片衰老(Zhong et al.,2013；Qiu et al.,2015)。在水稻中，克隆到6个EIL基因(OsEIL1–OsEIL6)，其中OsEIL1和OsEIL2受植物损伤诱导，OsEIL2还受JA诱导，OsEIL1和OsEIL2能够结合在一些受损伤诱导基因的启动子上来调控植物损伤应答，而且过量表达OsEIL1转基因水稻表现为盐敏感(Susumu et al.,2009；Yang et al.,2015)。在番茄中鉴定了3个EIL基因(LeEIL1–LeEIL3)，这些基因都作为正调控因子参与乙烯应答，且存在功能冗余，过量表达LeEIL1能够恢复番茄乙烯不敏感且不成熟突变体的表型(Guo etal.,2004)。在LeEIL1中发现一个磷酸化位点EPR1，研究发现EPR1对于LeEIL1的转录活性是必需的。将EPR1突变后，LeEIL1过量表达植物中乙烯持续应答中断，进一步实验证明EPR1对于LeEIL1形成二聚体来实现对乙烯的早期应答是非常重要的(Li et al.,2012)。黄瓜CsEIN3在各个组织中都有表达，随着花的发育和成熟，CsEIN3的表达量逐渐增高，说明CsEIN3参与花的发育过程(Bie et al.,2013)。在烟草中鉴定了5个NtEILs(NtEIL1–NtEIL5)，过量表达EIL转基因植株雌蕊变长，而EIL RNAi转基因植株雄蕊变短，这说明NtEILs在调控烟草花发育中发挥作用(Tadaharu et al.,2007)。猴桃AdEILs在果实的发育和成熟过程中持续表达，AdEIL2和AdEIL3能够激活成熟相关基因AdACO1和AdXET5(木葡聚糖转移酶基因)表达，促进乙烯的产生(Xue et al.,2010)。在苜蓿中，MtSKL1能够抑制MtEIN3/MtEIL1的表达来增强对冷的耐受(Mingui et al.,2014)。上述研究主要分析了EIN3的功能，但关于其对下游基因调控的精确模型却研究较少。2013年，Chang等用染色质共免疫沉淀结合测序(ChIP-Seq)结合RNA-Seq技术鉴定了1314个拟南芥EIN3结合的直接靶标基因，在这些基因中含有1460个EIN3结合位点，给出拟南芥EIN3结合的保守基序(A/TT/CGAATC/GTT)，结果也发现EIN3的直接靶标中含有多种编码激素调控因子和激素合成的基因，因而Chang等提出：激素间的共调控可以通过EIN3对激素调控因子启动子的结合来发生，EIN3直接调控激素途径的多个水平包括激素信号和合成途径，一些激素信号应答事件发生在乙烯介导的转录调控中。例如，乙烯和JA间的共调控发生在转录水平，研究显示这两种激素具有共同的应答基因(如信号转导相关基因RAP2.6L、ERF1/11、AtERF1/2/5和JAZ1/6)，合成相关基因(ACO2及CYP94C1)，且都受EIN3直接调控(Chang et al.,2013)。综上所述，EIN3/EILs基因对于植物生长发育和外界生物和非生物胁迫都具有非常重要的作用。

虽然EIN3基因家族的研究已经取得了较大的进展，但关于该类基因在棉纤维细胞起始及伸长发育中的作用，尚缺乏研究报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一个新的棉纤维起始和伸长发育相关的EIN3类基因(GhEIN3)，分析揭示该基因的功能，探索其对纤维发育调控的分子机制，进而应用该基因改良棉纤维品质。

在最近的研究中，我们在棉花中分离克隆了一个EIN3家族的基因，测序分析发现该基因不含内含子，进而分离了该基因的cDNA全长序列。通过BLASTP，我们发现该基因编码的蛋白序列与拟南芥中EIN3和EIL1同源性很高，因而将其命名为GhEIN3。该基因包含1842bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个613氨基酸的蛋白，分子量69.40KD。GhEIN3蛋白的N端含有一个保守的EIN3超家族结构域，与拟南芥AtEIN3和AtEIL1蛋白同源性分别为64％和64.5％。已有研究表明AtEIN3在拟南芥根毛发育中起作用，而拟南芥根毛和棉纤维都属于表皮毛，它们在发育中具有类似性，这暗示GhEIN3可能在棉纤维发育中起作用。

利用实时定量RT-PCR技术对GhEIN3在棉花组织和纤维中的表达进行了分析。结果如图1所示，图1表明：GhEIN3在棉花各组织中都有不同程度的表达，在茎中表达量较高，在胚珠和纤维也有表达，且在开花后3天的胚珠(这个阶段为棉纤维发育起始和纤维伸长转换的特异阶段)中达到最高值，暗示该基因可能对棉纤维细胞起始分化及伸长发育有一定的作用。

进一步研究表明，GhEIN3具有转录自激活活性；GhEIN3定位于细胞核内，表明GhEIN3是作为转录激活因子起作用的。

酵母双杂交结果表明，GhEIN3可以自身发生相互作用，它也可与GhEIL1/3，以及GhGL3、GhGAI1和GhJAZs等蛋白相互作用，推测GhEIN3可能形成同源或异源二聚体发挥转录激活作用，参与JA、GA等信号调控而在棉纤维起始和伸长发育中发挥作用。

为了研究GhEIN3基因的功能，构建了该基因的过量表达载体，转化拟南芥，获得GhEIN3过量表达转基因拟南芥植株。与野生型相比，过量表达GhEIN3拟南芥植株显示出对乙烯较为敏感。这表明该基因可能具有拟南芥EIN3相似的功能，暗示GhEIN3在棉花纤维中也可能响应乙烯信号。

为了进一步明晰GhEIN3基因的功能，分别构建了该基因过量表达载体和RNAi载体，转化棉花，获得过量表达RDL1::GhEIN3转基因棉花株系和35S::GhEIN3RNAi转基因棉花株系。观察分析了GhEIN3RNAi转基因棉花后代株系(T1和T2代)的表型，结果表明，与野生型相比，GhEIN3RNAi转基因棉纤维数量有所减少，特别是短绒显著减少，但种子变大，长绒纤维长度显著增加。而RDL1::EIN3过量表达的转基因棉花纤维长度短于野生型。上述结果表明，GhEIN3基因在棉纤维长绒和短绒的起始和伸长发育中发挥调控作用。

本发明的优点：

1.提供了一个新的棉纤维起始和伸长发育相关的GhEIN3基因的全长cDNA序列。该基因不含内含子，在棉纤维发育早期表达，表明GhEIN3可能涉及到棉纤维起始和伸长发育的调控。可以作为一种潜在的基因资源应用于棉纤维品质和产量的改良提高。

2.GhEIN3蛋白定位于细胞核中，具有转录激活活性，表明GhEIN3蛋白作为转录激活因子起作用。

3.GhEIN3蛋白能够与同类蛋白GhEIL1/3相互作用，也能与JA受体GhJAZ蛋白、GA信号蛋白GhGAI1等蛋白相互作用，表明GhEIN3可能通过形成同源或异源二聚体并与植物激素JA和GA相关蛋白等重要蛋白互作来控制棉纤维起始和伸长发育。

4.与野生型纤维相比，GhEIN3RNAi转基因棉纤维数量有所减少，但种子变大，纤维长度增长，而GhEIN3过量表达的转基因棉花纤维长度有所变短，这表明GhEIN3基因在棉纤维细胞起始和伸长发育中发挥调控作用。

本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但不限制本发明的范围。

附图说明：

图1荧光定量RT-PCR分析GhEIN3在棉花组织和纤维中的表达；

图2 GhEIN3蛋白的亚细胞定位和转录自激活分析；

图3酵母双杂交分析GhEIN3蛋白与其他蛋白之间的相互作用；DDO为SD–Leu/–Trp培养基(二缺培养基)，QDO为SD–Ade/–His/–Leu/–Trp培养基(四缺培养基)；

图4过量表达GhEIN3转基因拟南芥幼苗的表型分析；WT，野生型；EIN3OE，GhEIN3转基因拟南芥株系；ein3-1，拟南芥EIN3缺失突变体；

图5 GhEIN3转基因棉花成熟纤维表型分析；WT野生型，Ri L1-3和Ri L7-1为GhEIN3RNAi转基因棉花；OE L2-1为过量表达GhEIN3转基因棉花。

具体实施方式：

一个棉花EIN3家族新基因GhEIN3全长序列的克隆、鉴定和功能分析。

1. GhEIN3基因及cDNA序列的分离克隆

从棉纤维cDNA文库中分离了10,000多个棉花cDNAs，通过生物信息学分析，鉴定了一个GhEIN3基因的全长cDNA序列，序列如SEQ.ID.No.1所示，基因编码区为第(从194–2035bp，下划线表示为5’-未翻译区193bp(5’-UTR,从1–193bp)和3’-未翻译区282bp(3’-UTR,从2036–2317bp)；该基因包含1842bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个613氨基酸的蛋白，如SEQ.ID.No.2所示，该基因分子量69.40KD。GhEIN3蛋白的N端含有一个保守的EIN3超家族结构域，与拟南芥AtEIN3和AtEIL1蛋白同源性分别为64％和64.5％。以GhEIN3开放阅读框序列设计引物GhEIN3OEup和GhEIN3OEdn，利用PCR技术在棉花基因组中扩增克隆了该基因全长序列。比较分析该基因DNA序列及cDNA序列后发现，该基因不含内含子，其DNA序列与cDNA序列在开放阅读框部分并无差别。

2.实时荧光定量RT-PCR分析GhEIN3基因的表达

利用RNA提取试剂盒(Qiagin)提取纯化棉花不同组织和纤维的总RNA。实时荧光定量RT-PCR研究基因的表达按照Li XB,Fan XP,Wang XL,Cai L,Yang WC,2005.The CottonACTIN1gene is functionally expressed in fibers and participates in fiberelongation.Plant Cell 17:859–875进行。首先，将棉花不同组织(根、下胚轴、子叶、叶子、花瓣、花药、开花后不同发育天数的胚珠和纤维等)的总RNA(2μg/样)用反转录酶(M-MLVRNase H^-Reverse Transcriptase,Promega)反转录成cDNA；然后，以cDNA为模板，用基因特异的引物(GhEIN3qRT-F和GhEIN3qRT-R)和Real-time PCR Master Mix(TOYOBO,Japan)进行定量PCR反应。棉花GhUBI1基因作为RT-PCR反应的内标，引物为GhUBI qRT-F和R，目标基因每一个循环的扩增都被SYBR-Green荧光检测，计算目标基因的表达水平相对值。每一实验重复3次，统计分析实验结果(见图1)。图1表明：GhEIN3在棉花各组织中都有不同程度的表达，在茎中表达量较高，在胚珠和纤维也有表达，且在开花后3天的胚珠(这个阶段为棉纤维发育起始和纤维伸长转换的特异阶段)中达到最高值，暗示该基因可能对棉纤维细胞起始分化及伸长发育有一定的作用。

3. GhEIN3蛋白转录自激活分析

构建pGBKT7-GhEIN3载体(所用引物为GhEIN3BD up和dn)，以pGBKT7空载体为阴性对照，pGBKT7-53+pGADT7为阳性对照，分别转化到酵母菌株AH109和Y187中，并经PCR检测阳性克隆。将含有阴性对照(pGBKT7)、阳性对照(pGBKT7-53+pGADT7)或pGBKT7-GhEIN3载体的AH109菌株分别培养在SD/-Trp平板上生长，然后再分别划线于SD/-Trp/-His/-Ade平板，如果在SD/-Trp/-His/-Ade平板上能生长，则说明诱饵蛋白具有自激活效应；若不能生长，则说明诱饵蛋白不具有自激活效应；结果表明，阳性对照和GhEIN3转化细胞能够在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上生长，而阴性对照不能生长，表明GhEIN3具有自激活活性(结果见图2D)。同时，将在SD/-Trp平板上生长的Y187阳性转化子进行显色反应，检测LacZ报告基因是否被激活表达。具体的操作步骤如下：在培养皿中用5mL Z buffer/X-gal溶液浸湿透一张无菌滤纸，挑取新鲜培养的酵母单菌落至另一张无菌滤纸上并于液氮中冷冻15秒后，置于室温融化。小心将带酵母的滤纸放到浸湿的滤纸上，盖上盖子置于30℃培养箱中，8小时内菌落出现蓝色的为阳性，表明诱饵蛋白具有自激活效应；否则，该菌落为阴性，则说明该诱饵蛋白不具有自激活效应。结果见图2E，结果表明：GhEIN3蛋白具有自激活活性。

4. GhEIN3蛋白亚细胞定位分析

将GhEIN3基因编码区序列去除终止密码子后与eGFP序列融合，构建pBI121-GhEIN3:eGFP融合表达载体(所用引物为GhEIN3GFP-up和dn)，通过电转化法将该载体转入农杆菌GV3101细胞中，再通过农杆菌介导的本氏烟草注射法转化4–6片叶龄的本氏烟草幼苗的叶片，弱光培养3天，剥取本氏烟草叶片表皮细胞，置于共聚焦显微镜下观察烟草叶表皮细胞的GFP荧光(见图2A-C)。A.烟草叶片细胞的GFP荧光图像；B.同一烟草叶片表皮的明视野图像；C.GFP荧光图像和明视野图像重合在一起。结果表明：GhEIN3定位于细胞核内，表明GhEIN3是作为转录激活因子起作用的。

5.过量表达GhEIN3转基因拟南芥植株参与乙烯信号调控的分析

ACC(乙烯前体)处理方法如下：分别将GhEIN3转基因拟南芥三个不同的株系及野生型和ein3突变体种子铺于含有5–10μM ACC的MS培养基上，于4℃冰箱中放置两天后，再放入培养箱垂直暗培养，以MS培养基中不加入ACC作为对照。培养5天后，统计幼苗的下胚轴长度，每个株系不少于30颗幼苗。实验重复3次。结果见图4，结果表明：拟南芥幼苗在黑暗培养条件下生长7天，与野生型及突变体相比，过量表达GhEIN3转基因拟南芥幼苗在添加乙烯前体ACC的MS培养基上表现出对植物激素乙烯更敏感。这表明该基因可能具有拟南芥EIN3相似的功能，暗示GhEIN3在棉花纤维中也可能响应乙烯信号。

6.酵母双杂交实验

酵母双杂交方法如下：构建BD-GhEIN3(197-500AA)、BD-GhEIL1(197-500AA)和BD-GhEIL3(198-486AA)载体和AD-GhJAZ1/11，AD-GhGAI1，AD-GhGL3和AD-GhGL3载体，按照Clontech公司“Yeastmaker^TM Yeast Transformation System 2User Manual”的方法制备酵母感受态细胞和进行酵母共转化，在共转化过程中，将待检测的两种载体同时转入酵母Y2Hgold菌株的感受态细胞(转化后的酵母溶于0.9％NaCl)，将转化后的Y2Hgold酵母分别取10μl点在酵母二缺培养基(DDO)、酵母四缺培养基(QDO)培养基上。若两种载体成功转化则在DDO培养基上能生长良好，若基因编码的两种蛋白间能相互作用，则转化后的酵母能在QDO能生长，反之则不能生长。结果如图3所示，在DDO培养基中所有转化组合都能生长，代表酵母转化是成功的，而在QDO培养基中，BD-GhEIN3(197-500AA)与AD-GhEIN3、AD-GhEIL1/3、AD-GhJAZ1/11、AD-GhGL3和AD-GhGAI1共转化能生长，表明GhEIN3可以自身发生相互作用，它也可与GhEIL1/2/3，以及GhGL3、GhGAI1和GhJAZs等蛋白相互作用，推测GhEIN3可能形成同源或异源二聚体发挥转录激活作用，参与JA、GA等信号调控而在棉纤维起始和伸长发育中发挥作用。

7. GhEIN3功能分析

构建35S::GhEIN3的RNA干涉(RNAi)和RDL1::GhEIN3过量表达载体(RNAi载体构建所用引物为GhEIN3RNAi L1up和dn、GhEIN3RNAi L2up和dn、TUA intron-up和dn，用上述3对引物分别进行PCR扩增特定DNA片段，再利用连接酶将3个DNA片段逐一构建到pBI121载体中；过量表达载体所用引物为GhEIN3OEup和dn)，转化棉花，分别获得56株GhEIN3RNAi转基因棉花株系和27株过量表达GhEIN3转基因棉花植株。采用高盐低渗法提取棉花基因组DNA。以所提取的棉花DNA为模板，GhEIN3RNAi转基因棉花用GhEIN3RNAi L1up和TUA intron-dn作为上下游引物进行PCR检测，而RDL1启动子驱动GhEIN3过量表达转基因棉花用RDL1-up和GhEIN3OEdn作为上下游引物进行PCR检测，鉴定转基因棉花阳性植株。转基因棉花植株在温室或大田中生长发育成熟，收获棉花种子和纤维，分析棉纤维细胞起始分化情况，测量成熟纤维长度，分别见A-C图。

A.与野生型(WT)相比，GhEIN3RNAi转基因棉花(Ri L1-3和Ri L7-1)中纤维短绒数量显著减少，种子变大；而过量表达GhEIN3转基因棉花(OE L2-1)纤维短绒没有明显变化。B.GhEIN3转基因棉纤维长度的比较。C.成熟纤维长度统计分析。与野生型相比，过量表达GhEIN3转基因棉纤维变短，而GhEIN3RNAi转基因棉纤维长度增加。上述结果表明GhEIN3基因在棉纤维长绒和短绒的起始和伸长发育中发挥调控作用。*.表示转基因株系与野生型之间纤维长度存在显著性差异，**.纤维长度存在极显著性差异。结果表明GhEIN3蛋白在棉纤维长绒和短绒的起始和伸长发育中都发挥一定的调控作用。

上述所用引物见下表：

表1.载体构建和PCR分析所用的引物序列

Claims (2)

1.棉花GhEIN3基因的cDNA序列，其特征在于：序列如SEQ.ID.No.1所示，基因编码区为第第194–2035bp；5’-未翻译区193bp，从1–193bp；3’-未翻译区282bp，从2036–2317bp。

2.棉花GhEIN3基因编码的蛋白质，其特征在于：序列如SEQ.ID.No.2所示。