CN102776203A

CN102776203A - 枳抗寒转录因子PtrICE1及其在植物抗寒改良中的应用

Info

Publication number: CN102776203A
Application number: CN2012102582544A
Authority: CN
Inventors: 刘继红; 黄小三; 付行政
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-07-25
Filing date: 2012-07-25
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2032-07-25
Also published as: CN102776203B

Abstract

本发明公开了一种枳抗寒转录因子PtrICE1基因及其在植物抗寒改良中的应用，申请人利用植物基因克隆技术从枳中克隆得到一个新基因PtrICE1，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，其中161-1840bp处为该基因的编码区，包含1680bp的开放阅读框；编码559个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：2所示，等电点为5.27，分子量为61kD。利用农杆菌介导的遗传转化方法转化烟草和柠檬，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PtrICE1基因具有调控抗寒功能。PtrICE1基因的发现，为植物抗非生物逆境分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

Description

枳抗寒转录因子PtrICE1及其在植物抗寒改良中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种从枳(Poncirust rifoliata)中分离、克隆得到一个编码MYC类型的bHLH（basic helix-loop-helix，碱性螺旋-环-螺旋）家族转录因子的基因PtrICE1，还涉及一种枳抗寒转录因子PtrICE1基因在植物抗寒改良中的应用，将该基因转化烟草和柠檬，获得的转基因植株抗寒能力明显提高。

背景技术

自然界中，植物生长在一个开放的环境中，经常会受到恶劣环境如寒冻、高温、干旱、水涝和高盐等逆境的胁迫。低温是植物区域性和季节性的主要生态限制因子，低温冷害是农业生产的一种严重的自然灾害。因此，弄清植物寒冻损伤及其抗寒性机理具有非常重要的理论意义和实践价值。事实上，植物在漫长的演变过程中，已经建立了一套应答逆境胁迫的机制，涉及到植物对逆境信号的感受、逆境信号的传递,以及相应受体对逆境信号的识别与转导等三个阶段，此过程受一个错综复杂的信号通路调控。近年来，国内外在植物抗冻方面开展了大量工作，研究结果表明冷诱导基因在植物抗低温和冷驯化过程中起着重要的作用(Th omashow,1999)。这些冷诱导基因编码的产物可以分为两类，一类是与植物抗寒性的提高直接相关的功能性蛋白，比如一些涉及脂类代谢、糖代谢以及抗氧化的酶，分子伴侣，抗冻蛋白，其它起渗透调节作用的物质；另一类是调控性蛋白，参与寒冷信号传导的调控、抗寒基因表达的调控和抗寒蛋白活性的调节（Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki2007；Lata and Prasad,2011；Qin等,2011）。

大多数冷和干旱响应的基因在它们的启动子里都有一个或多个DRE/CRT顺式作用元件，它的核心序列是CCGAC。一个被称之为CBF/DREB1s的转录因子家族能够结合这个核心元件并能激活或诱导下游干旱或低温响应基因的表达，但是这类转类因子它们自身却是受低温的诱导然后才就进一步诱导含有DRE/CRT作用元件的下游基因的表达。因此，低温胁迫下的基因表达网络是一个级联连锁反应过程。CBFs或DREB1s基因的超表达，可在室温下启动下游基因的表达，并提高转化植物的耐寒能力。由于CBF/DREB1的转录是在将植物置于低温15Min后才开始的，Gilmour等(1998)提出了一种假说：可能在常温的情况下那里已经有一个转录因子，可能识别CBF的启动子并诱导其表达但在常温的情况下是以非活化的状态存在的，Gilmour将这个未知的转录因子称之为ICE1，并假设将植株置于低温的条件下，修饰ICE1或者与其互作的蛋白并允许ICE1结合到CBF的启动子并诱导CBF的表达。HOS1基因编码一种环指泛素E3连接酶,它可以与ICE1蛋白结合并参与调控ICE1的泛素化降解，它是ICE1及其下游目标基因的负调控因子（Dong等，2006).在低温的过程中，SIZ1蛋白起着SUMO E3连接酶的作用，在冷驯化的过程中，SIZ1可以促进SUMO蛋白与ICE1蛋白的赖氨酸（K393）位点结合，从而阻止ICE1的泛素化降解，提高ICE1的稳定性并激活ICE1蛋白（Mi ura等，2007）。拟南芥的转录组分析结果表明，在ICE1功能缺失型突变体中，939个拟南芥冷响应基因中有369个（39.3%）表达水平发生了变化。其中133个编码冷响应转录因子的基因中有52个（39.1%）表达水平发生了变化。另外，ICE1基因是组成型表达，但它的超表达可在低温下增强CBF3的转录表达并提高转基因植株的耐寒能力。因此，ICE1基因在拟南芥的抗寒中起着关键性的调控作用。Lee等（2005）采用基因芯片的方法从整个转录组水平上研究了ICE1在拟南芥耐寒及其在基因表达调控中的作用，ice1突变体影响了一些低温胁迫早期应答基因以及受ABA或生长素调控基因的表达，进一步验证了ICE1在植物低温胁迫应答中起着关键性的核心作用。迄今，ICE1基因已从拟南芥（Chinnusamy等，2003）、芥菜（Wang等，2005）、杨树（Lin等，2007）、小麦（Badawi等，2008）、茶（Wang等，2012）、苹果（Feng等，2012）中分离得到。

枳是柑橘产业中应用较广泛的一种砧木，极抗寒，是研究木本植物抗寒性及克隆有关抗寒基因克隆问题的理想材料。因此，克隆枳抗寒有关基因是抗寒基因工程的关键和基础。

发明内容

本发明目的在于提供了一种从枳（Poncirus trifoliata）中分离克隆的抗寒转录因子基因，此基因可编码MYC（myelocytomatosis oncogene）类型的bHLH（basic helix-loop-helix，碱性螺旋-环-螺旋）家族转录因子，申请人将此基因命名为PtrICE1，其序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明另一个目的是提供了一种从枳（Poncirus trifoliata）中分离克隆的转录因子基因在植物抗寒改良中的应用，通过农杆菌介导遗传转化方法将该转录因子转化烟草和柠檬，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明克隆的PtrICE1基因具有调控抗寒功能。

为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

申请人利用植物基因克隆技术从枳中克隆得到一个新基因PtrICE1，一种分离的PtrICE1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，其中161-1840bp处为该基因的编码区，包含1680bp的开放阅读框；编码559个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：2所示，等电点为5.27，分子量为61kD。

申请人设计了克隆上述基因PtrICE1的cDNA序列的引物对，其核苷酸序列如下所示：

正向引物：5’-TTGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTG-3’，即SEQ ID NO.3；

反向引物：5’-ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3’，即SEQ ID NO.4。

利用农杆菌介导的遗传转化方法转化烟草和柠檬，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PtrICE1基因具有调控抗寒功能。在本发明的实施例部分，我们阐述了枳PtrICE1转录因子的分离、功能验证和应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1、PtrICE1基因的发现，为植物抗非生物逆境分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

2、通过农杆菌介导遗传转化方法将该转录因子转化烟草和柠檬，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PtrICE1基因具有调控抗寒功能。

附图说明

图1为一种本发明的技术流程示意图。

图2为一种本发明的PtrICE1基因在脱水、低温和盐胁迫下的表达示意图。

其中：图2A是本发明的基因在枳田间苗（未转基因）室温下脱水不同时间点的表达模式；图2B是枳的田间苗（未转基因）在4℃处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明的基因相对表达量；图2C是枳的田间苗（未转基因）在200mM氯化钠处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量。

图3为一种本发明的PtrICE1基因亚细胞定位示意图。

其中：图3A，GFP基因（对照）在明场（图左）、紫外线（UV）光（中）下的成像，右图为二者叠加后的成像；图3B，PtrICE1基因在明场（左）、UV光（中）下的成像，右图为二者叠加后的成像。

图4为一种本发明的PtrICE1基因转录激活鉴定示意图。

其中：图4A是空载体（pGBKT7）在不同培养基上的生长情况；图4B是融合载体PtrICE1基因在不同培养基上的生长情况。

图5A为一种本发明的实施例3的载体构建流程示意图。

图5B为一种pMV载体示意图。

图6为一种本发明的PtrICE1基因转化烟草过程示意图。其中：图6A，叶片共培养；图6B转基因烟草再生愈伤；图6C，转基因烟草再生芽；图6D，抗性芽伸长；图6E和图6F，抗性苗及植株生根。

图7为一种本发明中实施例PtrICE1转化柠檬及植株再生过程示意图。其中图7A是转化后30天的照片；图7B是在筛选培养基上生长60天的材料；图7C是抗性芽在伸长增殖培养基上；图7D是再生芽诱导生根。

图8为一种PtrICE1基因转基因植株的PCR鉴定示意图。

图8A，利用NPTII基因特异引物（上）和基因特异引物（下）PCR鉴定烟草T0代转基因植株。图8B,是采用CaMV35S-PtrICE1特异引物（上）和NPTII基因特异引物（下）对柠檬转基因植株进行PCR鉴定。M：Marker，P：质粒，WT：野生型植株，1-20：转基因株系。

图9为一种PtrICE1基因转基因植株的基因表达量分析示意图。

图9A，烟草转基因植株中外源基因PtrICE1的表达量分析（半定量RT-PCR）。CK为野生型，其作为转基因系。图9B,实时定量PCR分析柠檬不同转基因株系中的PtrICE1基因的表达量。WT：野生型植株，其余编号：转基因株系。

图10为一种本发明中实施例转PtrICE1基因株系（OE22和OE12）及野生型（WT）非转基因植株（WT）低温处理表型和生理指标测定示意图。

其中：图10A是30天大的烟草植株在室温生长和4℃处理2天的表型；图10B是4℃处理2天的植采用NBT（氯化硝基四氮唑蓝）和DAB（二氨基联苯胺）染色，分别指示O2-含量和H2O2含量（染色越深，含量越高）。图10C是4℃处理后的相对电导率分析结果。图11为一种本发明中实施例PtrICE1转基因株系（OE22和OE12）及野生型植株（WT）-6℃处理2.5小时的表型和生理指标测定示意图。

其中：图11A是生长正常生长的盆栽植株（处理前）。图11B是-6℃处理2.5小时后的表型。

图11C是-6℃处理2.5小时的成活率。

图12为一种本发明中实施例PtrICE1转基因柠檬两个转基因系（#21和#17）及野生型植株的抗寒性分析。

其中：图12A是两个转基因系（#21和#17）及野生型植株-6℃处理1.5小时，然后在25℃恢复4天的表型。图12B是两个转基因系（#21和#17）及野生型植株-6℃处理1.5小时后的电率率。图12C是采用台盼蓝和氯化硝基四氮唑（NBT）检测WT、#17和#21植株叶片细胞死亡程度（左图）和超氧阴离子含量（右图）。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1，PtrICE1基因分离克隆及表达分析

以ICE1为关键词搜索柑桔EST数据库（HarvEST:Citrus ver.0.51），得到1个相近序列，通过序列分析软件（ORF Finder）发现基因ICE1缺少5端编码序列，利用5’RACE试剂盒（Clontech,Palo Alto,CA,USA）扩增出一个完整的ORF序列，该序列用Primer Pre mier 5.0设计引物GSP1(GSP，5’-GGCCAGTAACATACCAGTCATCTTCCA-3’)，用RT-PCR方法扩出5’端序列。将扩增的5’端序列及已有的一个ICE1利用软件DNAstar重叠成一条序列。4℃低温处理下从枳叶片抽提RNA及反转录，所得的第一链cDNA用于扩增PtrICE1基因全长。

RNA抽提使用Trizol试剂盒（购自TakaRa，Code:D9108A，按照该试剂盒提供的操作说明书操作），利用抽提的1μg总RNA样品经1U的DNaseI（购自Fermentas公司）室温处理30分钟后，加入1μl EDTA(25mM)，于65℃温育10分钟。第一链cDNA的合成用MBI反转录试剂盒（货号：K1621，购自Fermentas公司，按照试剂盒说明书操作）。

扩增基因PtrICE1引物对为：正向引物：PtrICE1 Forward,5’-TTGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTG-3’；反向引物：PtrICE1 Reverse,5’-ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3’。50μl的反应体系中包括200ng cDNA,1×缓冲液(TransSta rt FastPfu Buffcr),10mM dNTP，1U Taq聚合酶(TransStart FastPfu DNA Polymerase)(前述缓冲液和Taq聚合酶购自TRANS公司)，1.0μM上述引物。PCR反应在ABI9700(Applied Biosystem)扩增仪上按以下程序完成：95℃,1分钟，95℃变性20秒，58℃退火20秒，72℃延伸60秒，40个循环；循环完成后72℃延伸5分钟。产生一条单一PCR条带产物。

产物经1%（g/ml）的琼脂糖凝胶电泳后，用

DNA凝胶回收试剂盒（购自Omega公司，美国）回收特异带，提取步骤参照使用说明。回收纯化的DNA溶液与pMD18-T载体（购自宝生物工程大连有限公司即TaKaRa公司）进行连接反应,按说明书操作。

连接反应体系中插入PtrICE1基因与pMD18-T载体的摩尔比为3:1连接反应总体积是10μl，其中包括5μl的2×缓冲液（购自宝生物工程大连有限公司），4.5μl纯化的PCR产物，0.5μl T载体。16℃过夜连接。取10μl连接产物，采用热击法（参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002）转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序(由上海联合基因公司完成)，测序结果表明，本发明克隆PtrICE1基因全长为1650bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，通过测序、比对确定是本发明需要的目的基因，申请人将这个基因命名为PtrICE1。

PtrICE1基因包括1650bp的编码阅读框，编码549个氨基酸，等电点为5.27，预测的分子量为61kD。BLASTX分析该序列与已知的（所有已发表的文献和数据库）的植物序列高度同源。推导的PtrICE1基因的氨基酸序列与报道的蓖麻(RcICE1,XP_002511101，70%)、杨树（PtICE1,EF405966，74%）、毛果杨（PsICE1,EF405966，72%)、榛（CsICE1）的序列高度同源（69%）。多序列比对结果显示PtrICE1有C末段保守结构域，bHLH-ZIP结构域,和一个SUMO结构域。ExPASy分析表明编码的氨基酸PtrICE1有二个核定位信号(NLS)。SMART预测氨基酸PtrICE1有一个转录激活区域。

为分析PtrICE1基因是否对低温、脱水和盐处理响应，采用实时定量PCR分析该基因在上述处理下的表达。结果表明，，脱水处理（见图2A）和低温（见图2B）盐胁迫处理下该基因表（见图2C）均能诱导该基因表达，表明它是一个逆境应答候选基因。

实施例2，PtrICE1基因亚细胞定位和转录激活分析

由于PtrICE1基因有2个核定位信号，本实施例利用洋葱表皮研究PtrICE1基因的亚细胞定位。利用RT-PCR扩增出PtrICE1基因整个ORF，并在其扩增引物两端加上BamHI和Xhol两个酶切位点。首先将扩增产物装在pMD18-T载体上，从而得到一个PMD18-T_B/X-PtrICE1重组载体。同样将GFP编码整个ORF阅读框装在pMD18-T载体上，并在其两端加上BamHI和KpnI两个酶切位点，从而构建了一个pMD18-T_B/K-GFP。同时用BamHI和KpnI去切pMD18-T_B/X-PtrICE1和pMD18-T_B/K-GFP，回收产物并连接，从而构建了一个重组载体，最后将这个重组载体和pMV载体同时用Xhol和KpnI酶切，回收并连接产物，从而得到pBI121-PtrICE1-GFP重组载体。在确认序列无误后，将pBI121-PtrICE1-GFP重组载体及对照载体（pBI121-GFP）用热击法（参照：萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002）分别转入农杆菌EHA105。

农杆菌侵染洋葱表皮按如下方法进行：

1.划平板，挑单克隆（含有重组质粒的农杆菌）于3ml YEB培养基（含卡那霉素（Km）40μg/ml,利福平（Rif）25mg/L）,28℃震荡培养24小时，至OD₆₀₀约0.6。

2.用手术刀将洋葱内表皮划成1cm²大小，撕下置于报道的MS基本培养基（含3%蔗糖，0.75%琼脂，不含激素）上暗培养24小时。

3.按体积比为1：1000比例，接种50μl农杆菌菌液于50ml YEB（含Km 40μg/ml,Rif 25μg/ml）中，28℃振荡培养12-24小时。

4.4000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。

5.加入50mlYEB培养基（含有10mM MgCl₂）。将洋葱表皮放入菌液中浸泡30分钟。

6.吸干表面菌液，置于MS基本培养基（含3%蔗糖，0.75%琼脂，不含激素）上28℃培养两天。

用Olympus BX61型显微镜观察报告基因（GFP）定位情况。亚细胞定位结果表明：含对照载体的农杆菌转化的洋葱表皮细胞中GFP荧光充满整个细胞（图3A），而含PtrICE1基因载体的农杆菌浸染的洋葱表皮中GFP荧光只在细胞核中（图3B），证明PtrICE1是核定位基因。

利用酵母体系验证本发明基因PtrICE1是否具有转录激活活性。方法如下：

首先将PtrICE1基因构建到pGBKT7的GAL4-DB（购自CLONTECH公司）上，得到融合表达载体，（利用RT-PCR扩增出PtrICE1基因整个ORF，并在其扩增引物两端加上

NcoI和BamHI两个酶切位点。首先将扩增产物装在pMD18-T载体上，从而得到一个PMD18-T_N/B-PtrICE1重组载体。同时用NcoI和BamHI去切PMD18-T_N/B-PtrICE1和pGBKT7，回收产物并连接，从而得到pGBKT7+PtrICE1重组载体）将融合表达载体及空载体（pGBKT7）分别转化酵母菌株AH109（购自CLONTECH公司），然后在不同缺失培养基（SD/-Trp/-His/-Ade）上培养，从而确定本发明的基因是否具有激活功能。

实验结果表明，对照载体转化的酵母细胞在含有3-AT（3-氨基三唑）的培养基上生长完全受到抑制，（图4A）。而当融合载体（有PtrICE1基因）转化酵母细胞后，在所在培养基上均能正常生长，表明PtrICE1确实具有转录激活功能（图4B）。

实施例3，植物转化载体构建

根据pMV载体（植物二元转化载体pBI121切除GUS基因后得到的载体，由华中农业大学园艺林学学院叶志彪教授惠赠，Wang et al.,2011）中的多克隆位点和PtrICE1基因的编码区序列，按照一般设计引物的原则用Primer Premier5.0软件设计出扩增PtrICE1基因整个编码区的上、下游PCR引物（该引物对就是扩增本发明PtrICE1基因cDNA序列的引物对）。其序列如下所示：

Forward primer：5’-TTGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTGG-3’；

Reverse primer：5’-ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3’；

下划线为酶切位点。

以PtrICE1基因的克隆子为模板进行PCR扩增。PCR扩增的退火温度为60℃。PCR反应体系及扩增程序同实施例1。双酶切体系：反应总体积为40μl，其中含有PCR的纯化产物8μl，10×T缓冲液（购自TakaRa自公司）6μl及0.1%（g/ml）BSA 4μl，Kpn I及Sal1各2μl，双蒸水18μl。在37℃酶切过夜后纯化回收。

pMV载体的双酶切体系：反应总体积为40μl，其中含有经过质粒提取获得的pMV载体DNA8μl，10×M缓冲液（购自TakaRa公司）4μl，Kpn I及Xho I各2μl，加双蒸水24μl。于37℃酶切过夜后纯化回收。连接反应体系中插入PtrICE1基因与载体pMV的摩尔比为3:1，反应总体积为10μl，其中含有10×Buffer 1μl，T4DNA连接酶1μl，PtrICE1基因的双酶切回收产物6μl，pMV载体的双酶切回收产物2μl。在16℃反应14-16小时，连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，

在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序确定没有读码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名为pMV-PtrICE1重组载体，应用冻融法（参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年）将重组载体pMV-ICE1导入到农杆菌EHA105中。真核表达载体pMV-PtrICE1构建流程见图5A所示，其中pMV载体图见5B。

实施例4，烟草的遗传转化

应用冻融法（参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年）将重组载体pMV-PtrICE1导入到根癌农杆菌EHA105中，根癌农杆菌介导的烟草遗传转化步骤如下：

1.农杆菌EHA105培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L的LB平板上划线，刮取划线菌斑，加入液体MS基本培养基中，28℃180转/分钟振荡培养，待菌液浓度达到OD₆₀₀=0.3~0.8时作浸染。

2.浸染：取未转基因的烟草叶片，切成0.5cm×0.5cm大小，然后放入制备好的根癌农杆菌菌液中，浸泡8~10分钟,期间不断振荡。

3.共培养：取浸染后的烟草叶片，无菌滤纸吸干上面的的菌液，然后接种于共培养培养基上（叶背面向下），25℃暗培养3天。

4.筛选培养：经共培养3天后的烟草叶片，用500mg/L浓度的头孢霉素溶液洗一遍，然后无菌水冲洗3~5次，再转移入添加了100mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的筛选培养基中。

5.生根培养：待筛选培养基上的不定芽长到1cm左右时，切下并转入添加了100mg/ L Km和500mg/L Cef的生根培养基上。

6.烟草苗转入土培：待生根后的转化苗长满培养瓶，由生根培养基中取出，用自来水洗净转化苗上的培养基，并栽植于灭菌的营养土中。烟草转化过程见图6。

烟草转化苗所用培养基见表1。

表1烟草转化苗所用培养基配方

7.阳性转基因烟草初步确定

按照上述方法得到转PtrICE1烟草抗性芽，提取DNA。方法如下：

设计引物NPTII和基因特异引物（引物见表2）进行PCR扩增鉴定阳性苗。鉴定为可能的阳性植株移栽后独立收获种子（T1代种子），4℃春化处理3天,取0.1g在1.5ml的离心管中，先用70%（V/V）酒精浸泡种子20秒,接着用灭菌双蒸水洗一次，再加入1ml2.5%NaClO（V/V）表面消毒7分钟，充分振荡，弃去NaClO后用灭菌双蒸水洗3次，最后用接种针将灭好的种子播于50mg/l具有卡那霉素（Km）MS基本培养基的上，结果表明本发明获得的抗性苗在抗性平板上能正常生长，为绿色，而非抗性苗则黄化死去。成活的植株移栽再收获T1代种子，T2代种子用于播种及抗性分析。

实施例5，柠檬的遗传转化

1、取柠檬种子，用1mol/L的NaOH浸泡15分钟后洗净，再在超净工作台上用2%（体积比）的次氯酸钠浸泡灭菌15-20min，无菌水洗涤3次再在无菌条件下剥去种皮，接种于MT固体培养基上，暗培养3-4周再光照培养3-5d用于转化。

2、农杆菌在含有卡那霉素50mg/L的固体LB培养基上划线，28℃暗培养两天；挑取单菌落接种在新的加有卡那霉素的LB平板上，28℃暗培养2-3天；用手术刀刮下已长好的农杆菌，接种在不加抗生素的液MT培养基中，同时加20mg/L(100uM)AS，28℃200r/min振荡培养2h（同时在这段时间准备切上胚轴）；用分光光度计测量菌液的OD₆₀₀值，用MT液体培养基调整OD₆₀₀值到0.6-0.8进行侵染。

3、取实生苗上胚轴，于超净工作台斜切成1-1.5cm长茎段，切好的茎段暂时放于灭菌的空三角瓶中（加少量水保湿），待农杆菌菌液制备完成后用于转化。

4、将切好的外植体浸泡在已制备好的农杆菌菌液里，侵染20min，中间摇动几次。侵染完后用无菌吸水纸吸干外植体表面菌液，再接种到共培养基上21-23℃暗处共培养3天。

5、共培养3天后，用无菌水洗3-5次，再用无菌吸水纸吸干表面的农杆菌，转到加有卡那霉素50mg/L及头孢霉素400mg/L的筛选培养基上，25℃暗培养4周后再转到光照条件下培养。在筛选培养基上长出抗性芽，当抗性芽>0.5cm时，再转到伸长培养基上促其伸长。待芽有1.5cm长时，切下并转入生根培养基诱导生根，柠檬转化过程见图7。

常用培养基配方：

LB固体培养基：蛋白胨10g/l+酵母提取物5g/l+NaCl 10g/l+琼脂15g/l

柠檬生芽及伸长培养基：MT+BA1.0mg/l+琼脂7.5g/l+蔗糖35g/l（pH为5.8）

柠檬生根培养基：1/2MT+IBA0.1mg/l+NAA0.5mg/l+活性炭0.5g/l+琼脂7.5g/l+蔗糖35g/l（pH为5.8）

实施例6，转基因植株的分子鉴定

1、烟草和柠檬叶片DNA提取

取适量的叶片放入1.5mL离心管中，加液氮，充分研磨后；加入700μl65℃预热的DNA提取缓冲液十六烷基三乙基溴化铵（简称CTAB，配方：100mM Tris-HCl(pH8.0)，1.5M NaCl，50mM EDTA(pH8.0)溶液加1%聚乙烯吡咯烷酮，2%（体积比）CTAB，65℃水浴充分溶解备用，用前在65℃水浴预热后，加入1-4%（体积比）巯基乙醇，混匀，65℃温浴60-90分钟,隔15分钟取出上下轻轻颠倒混匀；10000g，离心10分钟；取上清，加600μl氯仿，颠倒混匀静置3分钟；10000g，离心15分钟；取上清450μl，加入900μl预冷无水乙醇，420μl 5M NaCl，混匀后，冰冻30分钟，10000g，离心10分钟；弃上清后，用1ml 75%的乙醇，洗涤3次后，加适量双蒸水溶解。

2、阳性转基因植株PCR检测

采用引物NPTII和基因特异引物对烟草DNA进行PCR扩增。引物序列、反应程序及体系分别见表2、表3和表4。采用特异引物进行PCR鉴定。烟草转基因植株鉴定见图8A，柠檬转基因植株鉴定见图8B。

表2引物序列信息

表3PCR反应程序

表4PCR反应体系

成分	用量(μl)
		模板	1
10×PCR缓冲液	2.5
		dNTP Mix（2.0mmol/L）	2.5
MgCl2（25mmol/L）	1.5
		正向引物（10μmol/L）	0.5
反向引物（10μmol/L）	0.5
		Taq DNA聚合酶（5U/μL）	0.2
无核酶水	16.3

柠檬基因特异性引物及反应条件同转基因烟草。

3、转基因植株的超表达分析

转基因烟草外源基因表达量采用半定量RT-PCR进行超表达分析，转基因株系叶片RNA提取、cDNA合成方法同实施例1，所用引物为基因特异引物：正向引物5’-CCTGGATTCAAGTCCATGCT-3’；反向引物5’-CCAAGGTTTGGTGGAAATGT-3’，用Tubulin做内对照，引物序列为：正向引物5'-TACATAAACGTCACTCTCGATCAC-3'；反向引物5'-TCCAGGACAAGGAGGGTAT-3'。反应程序为94℃时3分钟，94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，30个循环；循环完成后72℃延伸10分钟。

转基因柠檬外源基因表达量采用实时定量PCR分析。转基因柠檬分析用actin作为内对照，引物序列为：正向引物5'-CATCCCTCAGCACCTTCC-3'；反向引物5'-CCAACCTTAGCACTTCTCC-3'，基因特异性引物及反应条件同转基因烟草。

表达分析结果表明，在转基因株系中的PtrICE1基因表达均比野生型高（图9A、图9B），分别选取烟草（E22和C12，分别写作OE-22和OE-12）和柠檬两个转基因株（#17和#21）系用于抗性研究。

实施例7，烟草转基因植株的抗性评价

同批收的烟草未转化植株（WT）和转PtrICE1超表达纯系（OE-12、OE-22），将WT、OE-22和OE-12在MS生长培养基上生长30后移栽到盆中生长7天后，正常生长的植株没有差别，但在4度处理2天后，WT植株均出现萎蔫，而OE-22和OE-12植株生长仍然正常，表明转基因植株的抗寒能力明显比野生型强（图10A），为比较WT及两个转基因株系（OE-22和OE-12）活性氧积累情况，分别采用二氨基联苯胺（DAB）和氮蓝四唑（NBT）进行组织化学染色，根据染色的深浅及程度分析H₂O₂及O₂ ^-积累（染色越深，表明含量越高）。结果表明，4度处理2天后，转基因植株中DAB和NBT染色均明显低于WT（图10B）；，表明转基因植株在抗寒处理后积累的活性氧显著低于未转化植株。电导率比较也表明，4度处理2天后，WT的电导率明显高于两个转基因系（图10C）。

将生长时间更长的烟草植株先放在4度驯化8个小时，再在-6度处理2.5时，结果发现OE-22和OE-12下部叶片部分呈水渍状，而WT几乎全部呈水渍状（图11A，图11B），在25度恢复天后统计成活率，结果表明，两个转基因系的成活率明显高于野生型（图11C），上述研究表明转PtrICE1基因的烟草植株抗寒能力比未转化植株（WT）明显增强。实施例8，柠檬转基因植株的抗寒性评价

本研究选取了#7和#21两个超表达株系用于抗寒性评价。将WT、#21株系-6°C低温处理1.5小时，再在25°C恢复4天后发现，WT植株在恢复4天后出现明显的叶片枯萎、白化甚至死亡，而#21转基因系在恢复后能正常存活，只有极少数植株叶片表现低程度损伤（图12A）；对#17转基因系和WT植株同样进行-6°C低温处理发现，WT植株在恢复4天后几乎全部死亡，而#17转基因株系仍有约50%的存活率（图12A）。

为进一步验证转PtrICE1基因柠檬的抗寒能力，测定了低温处理后WT和两个转基因株系（#21和#17）的电导率，以及采用台盼蓝（Trypan blue）和氯化硝基四氮唑（NBT）组织化学染色法分别检测了叶片中细胞死亡及超氧阴离子含量。结果表明，-6°C低温处理1.5小时后，#21和#17转基因株系相对电导率均显著低于WT（图12B）。台盼蓝染色表明 WT叶片中蓝色深度明显高于#17和#21转基因株系，其中#17株系只有少数部位染上蓝色（图12C），说明转基因株系的细胞死亡程度轻。NBT染色表明转基因植株超氧阴离子的积累比WT轻（图12C）。上述结果表明柠檬转PtrICE1基因植株的抗寒能力比未转化植株（WT）明显增强。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 枳抗寒转录因子PtrICE1基因及其在植物抗寒改良中的应用

<130> 枳抗寒转录因子PtrICE1基因及其在植物抗寒改良中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2016

<212> DNA

<213> Poncirus trifoliata

<400> 1

ctctctctgc atctgctgag ctgctgattc aataaaaagc atttgccctt ttccatctgc 60

aacgtcctct tcactctttt ttaactctcc cttttctcaa caaactattt gcacttgttt 120

gtttctcgag aaaacagaac acccacaaag agaaaacaag atgctttcta gactaaacgg 180

tgtggtctgg atggacggga aagaagagga aggctcagct gcgtgggcca gaaacaacat 240

aaacaacaac agcagcaaca gcatcaacaa caattgcaac actaacaaca tgagctgcag 300

taacaacaac gacaacaaca atggtgtcat agagaatgaa gaagaaatgg gttcacttcc 360

tggattcaag tccatgcttg aagtggaaga tgactggtat gttactggta atactagttt 420

aaataaccat caagatatta catttccacc aaaccttggt gacccaacaa ctgataatct 480

gttgcttaac gctgtggatt cttcatcttc ttgttcacca tcttcctctg ttttcaacaa 540

ctttgatgca tctcaagttc actacttttt gcctcaaaaa aactcctttt cttcattcat 600

gaatgttgtg tccaacaaca actctttaga gcatggcttt gatttgggtg aaatggggtt 660

tcttgacaca caagcaactc atgctttgaa tagggggaat ggtgggattt tgaatggttt 720

caatgatttg agtgccaata atcagatgaa tgctactaat ttatgttctg gtccgcaatt 780

tggaactaac cgtacgcttc aattcccgga aaatggtagc agtagtttcg cgggttttcg 840

gggtttagat gagaataatg ggaattctct gtttttgaat aggtctaagt tgttgaggcc 900

acttgaaact ttcccttcga cgggagcaca acccactctt ttccaaaaaa gagctgcttt 960

gaggaaaaat ttaggtggta atgaggccag tttaggggtt ttaggtacac aaaatagcca 1020

acttttgagt gggattgaga gtgataaagg taagaaagaa ctgactgaag ataatgagaa 1080

aaagaggaaa ttgagtatta gtgatgattt ggaggatgtg agtgttgatg ggtcgggtct 1140

caactatgat tctgatgatt ttttagaaaa taataaggtg gaggaaatgg gtaaaaatgg 1200

tggtagtatc tccaatgcaa ttagcactat cactggtgga gatcagaagg gcaagaagaa 1260

gggtttgcca gcgaagaatc tgatggcgga gaggagacgc aggaagaagc tcaatgatag 1320

gctctacatg ttgcggtcgg ttgttccaaa gattagcaaa atggataggg cttcaatttt 1380

gggggatgca attgagtatt tgaaggaact tctccaaagg atcaatgacc tccacaatga 1440

attggagtca acccctcctg gttcagcatt gactccttcc acaagcttct atcctttgac 1500

accgactcca cctgccttgc acagccgtat caaggatgaa ctttgcccca gctcactgcc 1560

aagcccaaat ggccaacctg caagggttga ggtcagggtg agggaaggaa gagccgtgaa 1620

tatccacatg ttttgcagcc gtagaccagg tcttttgctc tccacgatga gggcattgga 1680

taatcttgga ctagatatcc agcaagctgt catcagttgt ttcaatggct ttgccatgga 1740

tgttttccga gccgagcaat gcaaggaagg ccaggacgtt catccggagc aaatcaaggc 1800

ggtactcttg gattcagccg gcttccatgg catgatgtag ttttcttcaa tttctccaag 1860

ttaaaaagcg atagcagtag tcatctgttc catttccccc tgcctgccac cgccttcaag 1920

ctacatttaa cttggcagtc ttttaaagtt gtaggttgcc ttaaaatagc tagaaatgca 1980

ttttatagtt atgcccttcg aggagccgaa cattgt 2016

<210> 2

<211> 559

<212> PRT

<213> Poncirus trifoliata

<400> 2

Met Leu Ser Arg Leu Asn Gly Val Val Trp Met Asp Gly Lys Glu Glu

1 5 10 15

Glu Gly Ser Ala Ala Trp Ala Arg Asn Asn Ile Asn Asn Asn Ser Ser

20 25 30

Asn Ser Ile Asn Asn Asn Cys Asn Thr Asn Asn Met Ser Cys Ser Asn

35 40 45

Asn Asn Asp Asn Asn Asn Gly Val Ile Glu Asn Glu Glu Glu Met Gly

50 55 60

Ser Leu Pro Gly Phe Lys Ser Met Leu Glu Val Glu Asp Asp Trp Tyr

65 70 75 80

Val Thr Gly Asn Thr Ser Leu Asn Asn His Gln Asp Ile Thr Phe Pro

85 90 95

Pro Asn Leu Gly Asp Pro Thr Thr Asp Asn Leu Leu Leu Asn Ala Val

100 105 110

Asp Ser Ser Ser Ser Cys Ser Pro Ser Ser Ser Val Phe Asn Asn Phe

115 120 125

Asp Ala Ser Gln Val His Tyr Phe Leu Pro Gln Lys Asn Ser Phe Ser

130 135 140

Ser Phe Met Asn Val Val Ser Asn Asn Asn Ser Leu Glu His Gly Phe

145 150 155 160

Asp Leu Gly Glu Met Gly Phe Leu Asp Thr Gln Ala Thr His Ala Leu

165 170 175

Asn Arg Gly Asn Gly Gly Ile Leu Asn Gly Phe Asn Asp Leu Ser Ala

180 185 190

Asn Asn Gln Met Asn Ala Thr Asn Leu Cys Ser Gly Pro Gln Phe Gly

195 200 205

Thr Asn Arg Thr Leu Gln Phe Pro Glu Asn Gly Ser Ser Ser Phe Ala

210 215 220

Gly Phe Arg Gly Leu Asp Glu Asn Asn Gly Asn Ser Leu Phe Leu Asn

225 230 235 240

Arg Ser Lys Leu Leu Arg Pro Leu Glu Thr Phe Pro Ser Thr Gly Ala

245 250 255

Gln Pro Thr Leu Phe Gln Lys Arg Ala Ala Leu Arg Lys Asn Leu Gly

260 265 270

Gly Asn Glu Ala Ser Leu Gly Val Leu Gly Thr Gln Asn Ser Gln Leu

275 280 285

Leu Ser Gly Ile Glu Ser Asp Lys Gly Lys Lys Glu Leu Thr Glu Asp

290 295 300

Asn Glu Lys Lys Arg Lys Leu Ser Ile Ser Asp Asp Leu Glu Asp Val

305 310 315 320

Ser Val Asp Gly Ser Gly Leu Asn Tyr Asp Ser Asp Asp Phe Leu Glu

325 330 335

Asn Asn Lys Val Glu Glu Met Gly Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ser Asn

340 345 350

Ala Ile Ser Thr Ile Thr Gly Gly Asp Gln Lys Gly Lys Lys Lys Gly

355 360 365

Leu Pro Ala Lys Asn Leu Met Ala Glu Arg Arg Arg Arg Lys Lys Leu

370 375 380

Asn Asp Arg Leu Tyr Met Leu Arg Ser Val Val Pro Lys Ile Ser Lys

385 390 395 400

Met Asp Arg Ala Ser Ile Leu Gly Asp Ala Ile Glu Tyr Leu Lys Glu

405 410 415

Leu Leu Gln Arg Ile Asn Asp Leu His Asn Glu Leu Glu Ser Thr Pro

420 425 430

Pro Gly Ser Ala Leu Thr Pro Ser Thr Ser Phe Tyr Pro Leu Thr Pro

435 440 445

Thr Pro Pro Ala Leu His Ser Arg Ile Lys Asp Glu Leu Cys Pro Ser

450 455 460

Ser Leu Pro Ser Pro Asn Gly Gln Pro Ala Arg Val Glu Val Arg Val

465 470 475 480

Arg Glu Gly Arg Ala Val Asn Ile His Met Phe Cys Ser Arg Arg Pro

485 490 495

Gly Leu Leu Leu Ser Thr Met Arg Ala Leu Asp Asn Leu Gly Leu Asp

500 505 510

Ile Gln Gln Ala Val Ile Ser Cys Phe Asn Gly Phe Ala Met Asp Val

515 520 525

Phe Arg Ala Glu Gln Cys Lys Glu Gly Gln Asp Val His Pro Glu Gln

530 535 540

Ile Lys Ala Val Leu Leu Asp Ser Ala Gly Phe His Gly Met Met

545 550 555

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Poncirus trifoliata

<400> 3

ttgtcgacct ctctgcatct gctgagctgc tg 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Poncirus trifoliata

<400> 4

atggtaccac aatgttcggc tcctcgaagg gc 32

Claims

1.一种分离的基因，其特征在于：PtrICE1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种分离的基因，其特征在于：所述基因的正向引物为：5’- TTGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTG-3’；反向引物为：5’- ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3’。

3.权利要求1所述基因在植物抗寒改良中的应用。