CN104031923A - 一个山梨抗寒转录因子PubHLH及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个山梨抗寒转录因子PubHLH及其应用。山梨bHLH类转录因子基因PubHLH，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在SEQ ID NO：1所示序列的409-2043bp处为该基因的编码区；其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。本发明从山梨中克隆到一个新的bHLH基因PubHLH，利用农杆菌介导的遗传转化方法将该基因转化烟草和梨，获得的转基因植株抗寒能力明显提高，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PubHLH基因具有调控抗寒功能。本发明所述的山梨bHLH类转录因子基因PubHLH可在植物抗寒性状改良或构建抗寒转基因植物中应用。

Description

一个山梨抗寒转录因子PubHLH及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一个山梨抗寒转录因子PubHLH及其应用，具体涉及从山梨(Poncirus trifoliata)中克隆得到一个bHLH(basic helix-loop-helix，碱性螺旋-环-螺旋)家族转录因子PubHLH，然后将该基因分别导入到烟草和梨中，获得的转基因植株抗寒性明显提高。

背景技术

植物经常遭受一系列的环境胁迫，包括干旱、高温、低温、盐碱等，其中，低温是影响作物生长发育和产量及限制植物地理分布最为重要的因素之一。在长期的演化的过程中，植物已经形成一套复杂的机制来应对和适应这些非生物逆境。近二十年来，国内外科学家在对植物响应非生物逆境分子机理解析方面已经取得了长足的进步(Qin et al.,2011)。现在清楚的是，植物逆境响应是一个非常复杂的多个信号途径的过程。外界胁迫信号由已知或未知的传感元件识别，激活第二信使(如钙离子，活性氧和肌醇磷酸盐)。之后，由不同的信号元件转导、传达、放大胁迫信号，最终导致一系列的生理和代谢改变。人们在鉴定参与逆境响应答的信号转导元件中已经取得了很大的进步。

前人的研究的表明，在复杂的逆境信号传导途径包括了大量的逆境响应基因，根据基因产物的功能大体上可以分为两类。一类是由直接保护细胞免受损伤的功能蛋白组成，另一类是由在信号转导和基因表达起调控作用的调节蛋白组成(Agarwal et al.,2006；Chinnusamy et al.,2006；Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki2007；Lata and Prasad,2011)。对逆境响应基因的研究不仅能够了解逆境响应机制，而且也使得人们通过转基因创造抗性增强的转基因植物(Wang et al.,2003；Qin et al.,2011；Lata and Prasad,2011)。大量研究表明，通过过量表达功能基因和调控因子能够显著提高植物的抗逆性。但是，功能基因和转录因子在组成性表达的结果可能不同(Agarwal et al.,2006)。与功能基因相比，转录因子在提高植物的抗性功能更强大。一个转录因子的超表达能够激活一系列的靶基因，它们可以会一起来共同应对逆境，而不是一个转入的功能基因起作用。因此，转录因子遗传转化是植物抗性遗传改良的一种 重要途径和手段。

植物基因组拥有大量的转录因子；例如，拟南芥中有多于1500个转录因子，占它的基因组将近6％(Riechmann et al.,2000)，其中bHLH(basic helix-loop-helix，碱性螺旋-环-螺旋)类转录因子是调控网络中重要的成员，该家族蛋白具有bHLH域，HLH区域位于bHLH模体的C端，由约60个氨基酸组成的两个功能明显不同bHLH模体组成。HLH模体参与同型二聚体或异质二聚体的形成是由于α-螺旋的相互作用。碱性区域位于bHLH模体的N端，含有大约15个碱性氨基酸，它决定着DNA和蛋白互作的特异性(Buck and Atchley,2003；Toledo-Ortiz et al.,2003；Li et al.,2006)。bHLH转录因子在真核生物中广泛分布，如在拟南芥和水稻中分别有147和167个基因(Li et al.,2006；Toledo-Ortiz et al.,2003)。在动物中，bHLH家族成员的功能已经被广泛研究，但在植物中的研究相对较少。自第一个植物bHLH蛋白(Lc)在玉米中被报道(Ludwig et al.,1989)以来，在一些植物中鉴定了部分bHLH转录因子。已经表明，植物bHLH蛋白在不同的生物学过程起转录调控作用，包括皮毛或根毛发育(Bernhardt et al.,2003；Tominaga-Wada et al.,2012；Karas et al.,2009)、叶绿体发育(Monte et al.,2004)，类黄酮生物碱和花青素合成(Nesi et al.,2000；Yamada et al.,2011)。一些bHLH蛋白，诸如PIF3(光敏色素相互作用因子3)、PIF4及HFR1参与光诱导的信号转导(Ni et al.,1998；Huq and Quail,2002；Fairchild et al.,2000)。然而，植物bHLH转录因子在环境胁迫应答方面却不多。其它与胁迫应答有关的bHLH转录因子包括AtbHLH38、AtbHLH39、FIT，它们能被缺铁所诱导，AtbHLH38、AtbHLH39的过量表达能增强植物对铁或镉的吸收(Yuan et al.,2008；Lignam et al.,2011；Wu et al.,2012)，表明它们在重金属毒害应答中起作用。此外，水稻的一个bHLH基因也被发现参与干旱胁迫应答(Seo et al.,2011)。可见，虽然鉴定bHLH基因比较容易，但是预测不同物种中bHLH基因的功能需要花费大量的创造性劳动。

山梨是梨产业中应用较广泛的一种砧木，极抗寒，是研究木本植物抗寒性及克隆有关抗寒基因的理想材料。因此，克隆山梨抗寒有关基因是抗寒基因工程的关键和基础。

发明内容

本发明目的是提供一种从极抗寒的山梨(Pyrus ussuriensis)中克隆出的一个bHLH类转录因子PubHLH。

本发明的另一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种山梨bHLH类转录因子基因PubHLH，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在SEQ ID NO：1所示序列的409-2043bp处为该基因的编码区；其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，它包含1635bp的开放阅读框，编码544个氨基酸，等电点为5.8，预测的分子量为58.9kD。

克隆上述的基因PubHLH的cDNA序列的引物对，其核苷酸序列如下所示：

正向引物：5’-TTGCTGCCATGCTGCCGAGGCTGAACGGTGGTG-3’(SEQ ID NO：3)；

反向引物：5’-GGGGTACCCTACACCATGCCATGGAACCCG-3’(SEQ ID NO：4)。

含有本发明所述基因PubHLH的重组表达载体，优选以pCAMBIA1302为出发载体。

含有本发明所述的山梨bHLH类转录因子基因PubHLH的宿主菌。

本发明所述的山梨bHLH类转录因子基因PubHLH在植物抗寒性状改良或构建抗寒转基因植物中的应用。

本发明所述的山梨bHLH类转录因子基因PubHLH编码的蛋白在植物抗寒性状改良或构建抗寒转基因植物中的应用。

本发明所述的重组表达载体在植物抗寒性状改良或构建抗寒转基因植物中的应用。

有益效果：本发明从山梨中克隆到一个新的bHLH基因PubHLH，利用农杆菌介导的遗传转化方法将该基因转化烟草和梨，获得的转基因植株抗寒能力明显提高，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PubHLH基因具有调控抗寒功能。本发明为植物抗非生物逆境分子设计育种提供了新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

附图说明

图1是本发明的技术流程图。

图2是本发明的PubHLH基因在低温胁迫切(4℃处理)下的表达。横坐标为相应时间点取样，纵坐标为采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量。

图3是本发明的PubHLH基因亚细胞定位。其中：图3A，GFP基因(对照)在明场(图左)、紫外线(UV)光(右)上的成像；图3B，PubHLH基因在明场(左)、UV光(右)下的成像。

图4是本发明的PubHLH基因转录激活鉴定。图4pDEST^TM32是空载体转化的酵母在不同培养基上的生长情况；pDEST^TM32-PubHLH是融合载体转化的酵母在不同培养基上的生长情况。

图5是PMV质粒图谱

图6为一种PubHLH基因转基因植株的PCR鉴定示意图。利用PubHLH基因特异引物进行PCR鉴定烟草后T0代转基因植株。M：Marker，P：质粒pMV-PubHLH，WT：野生型植株，4、5、9、13：转基因株系。

图7为烟草转基因植株中外源基因PubHLH的表达量分析(半定量RT-PCR)。WT为野生型，其它作为转基因系。

图8是本发明中实施例转PubHLH基因株系(#4和#9)及野生型(WT)非转基因植株(WT)低温处理表型和成活率统计。其中：图8A是30天大的烟草植株在室温生长和0℃处理2天的表型；图8B是30天大的烟草植株在室温生长和0℃处理2天的成活离统计。

具体实施方式

以下结合具体实施对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1PubHLH基因克隆及表达分析

4℃低温处理下从山梨叶片抽提RNA并反转录，所得的第一链cDNA用于扩增PubHLH基因全长。扩增基因PubHLH引物对为：正向引物：PubHLH Forward,5’-TTGCTGCCATGCTGCCGAGGCTGAACGGTGGTG-3’(SEQ ID NO：3)；反向引物：PubHLH Reverse,5’-GGGGTACCCTACACCATGCCATGGAACCCG-3’(SEQ ID NO：4)。50μl的反应体系中包括100ng cDNA,1×缓冲液(TransStart FastPfu Buffer),10mM dNTP,1U Taq聚合酶(TransStart FastPfu DNA Polymerase)(前述缓冲液和Taq聚合酶购自TRANS公司)，1.0μM上述引物。PCR反应在Roche480(Applied Biosystem)扩增仪上按以下程序完成：95℃,1分钟，95℃变性20秒，58℃退火20秒，72℃延伸60秒，40个循环；循环完成后72℃延伸5分钟。产生一条单一PCR条带产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用E.Z.N.DNA凝胶回收试剂盒(购自Omega公司，美国)回收特异带，提取步骤参照使用说明。回收纯化的DNA溶液与pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)进行连接反应,按说明书操作,连接反应体系中插入PubHLH基因与pMD18-T载体的摩尔比为3:1连接反应总体积是10μl，其中包括5μl的2×缓冲液(购自宝生物工程大连有限公司)，4.5μl纯化的PCR产物，0.5μl T载体。16℃过夜连接。取10μl连接产物，采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取3个克隆测序(由南京金斯瑞科技有限公司完成)，测序结果表明，本发明克隆PubHLH基因全长为1650bp，通过测序、比对确定是本发明需要的目的基因，序列如SEQ ID NO：1所示，将这个基因命名为PubHLH，它包括1635bp的编码阅读框，编码544个氨基酸，等电点为5.8，预测的分子量为58.9kD。BLASTX分析该序列与已知的bHLH(所有已发表的文献和数据库)序列同源。推导的PubHLH基因的氨基酸序列与报道的苹果(MdbHLH,ABS50251)的序列虽然同源性达91％,但是苹果MdbHLH这个基因的功能与抗寒没有关系，其主要功能是控制苹果的色素。多序列比对结果显示PubHLH有C末段保守结构域，bHLH-ZIP结构域,和一个SUMO结构域。ExPASy分析表明编码的氨基酸PubHLH有二个核定位信号(NLS)。SMART预测氨基酸PubHLH有1转录激活区域。

为分析PubHLH基因是否对响应低温处理，采用实时定量PCR(正向引物PubHLH-F2：5’-CCCTTGAGTCCTTC-3’(SEQ ID NO：5)；反向引物PubHLH-R2：5’-CCCATCTCCCTCTT-3’(SEQ ID NO：6))分析该基因在4℃处理0～48小时下的表达。结果表明4℃低温(见图2)处理能诱导该基因表达，表明它是一个低温应答候选基因。

实施例2PubHLH基因亚细胞定位、转录激活分析

由于PubHLH基因有1个核定位信号(NLS)，本发明利用洋葱表皮来研究PubHLH基因的亚细胞定位。利用RT-PCR扩增出PubHLH基因整个ORF阅读框，并在其扩增引物两端分别加上NcoI和SpeI两个酶切位点。其扩增引物为(正向引物PubHLH-F1：5’-CCATGGATGCTGCCGAGGCTGAACGGTGGTG-3’(SEQ ID NO：11)；反向引物PubHLH-R1：5’-GGACTAGTCACCATGCCATGGAACCCGAT CAA-3’(SEQ ID NO：12)，首先将扩增产物进行酶切。同时用NcoI和SpeI双酶切pCAMBIA1302，回收产物并连接，从而得到pCAMBIA1302-PubHLH-GFP重组载体，并将其转入农杆菌EHA105。农杆菌侵染洋葱表皮按如下方法进行：(1)划平板，挑单克隆(含有重组质粒的农杆菌)于3毫升YEB培养基(含卡那霉素40μg/ml，利福平25mg/L)，28℃震荡培养24小时，至OD₆₀₀约0.6。(2)用手术刀将洋葱内表皮划成1cm²大小，撕下置于MS基本培养基(含3％蔗糖，0.75％琼脂，不含激素)上暗培养24小时。(3)按体积比为1：1000比例，接种50μl农杆菌菌液于50毫升YEB(含卡那霉素40μg/ml，利福平25μg/ml)中，28℃振荡培养12-24小时。(4)4000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。(5)加入50毫升YEB培养基(含有10mM MgCl₂)，将洋葱表皮放入菌液中浸泡30分钟。(6)吸干表面菌液，置于MS基本培养基(含3％蔗糖，0.75％琼脂，不含激素)上28℃暗培养两天。用Olympus BX71型显微镜观察报告基因定位情况，结果表明，对照载体转化时整个细胞中均有荧光(图3A)，而重组载体转化的细胞中荧光只能在核中检测到(图3B)，说明PubHLH是一个核定位蛋白。

实施例3植物转化超表达载体构建

根据pMV载体(专利申请号201210258254.4)的多克隆位点和PubHLH基因的编码区序列上的酶切位点分析，选择Xhol和KpnI作为内切酶。首先将以PubHLH基因的克隆子为模板进行PCR扩增(扩增引物对正向引物：PubHLH Forward,5’-TTGCTGCCATGCTGCCGAGGCTGAACGGTGGTG-3’(SEQ ID NO：3)；反向引物：PubHLH Reverse,5’-GGGGTACCCTACACCATGCCATGGAACCCG-3’(SEQ ID NO：4)，接后将PCR产物连同pMV载体一起在在37℃下进行酶切，酶切3-4h后纯化回收。连接反应体系中PubHLH基因与载体pMV比率为3：1，反应总体积 为10μl，10×T4连接缓冲液1μl，T4连接酶1μl，16℃连接13-16小时。连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有100mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选，挑单克隆PCR检测呈阳性后抽提质粒进行酶切，测序确定序列无误后，即pMV-PubHLH重组载体构建成功。应用冻融法将重组载体导入到根癌农杆菌GV3103中并保菌。

实施例4烟草遗传转化

根癌农杆菌介导的烟草遗传转化步骤如下：

1.根癌农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L的LB平板上划线，刮取划线菌斑，加入液体MS基本培养基中，28℃180转/分钟振荡培养，待菌液浓度达到OD₆₀₀＝0.5时作浸染。

2.浸染：取未转基因的烟草叶片，切成0.5cm×0.5cm大小，然后放入制备好的根癌农杆菌菌液中，浸泡5分钟,期间不断振荡。

3.共培养：取浸染后的烟草叶片，无菌滤纸吸干上面的的菌液，然后接种于共培养培养基上暗培养3天。

4.筛选培养：经共培养3天后的烟草叶片，用无菌水冲洗3～5次，再转移入添加了100mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素的筛选培养基中。

5.生根培养：待筛选培养基上的不定芽长到1cm左右时，切下并转入添加了100mg/L Km和500mg/L Cef的生根培养基上。

6.烟草苗转入土培：待生根后的转化苗长满培养瓶，由生根培养基中取出，用自来水洗净转化苗上的培养基，并栽植于灭菌的营养土中。

实施例5梨遗传转化

根癌农杆菌介导的梨遗传转化步骤如下：

1.根癌农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L的LB平板上划线，刮取划线菌斑，加入液体MS基本培养基中，28℃180转/分钟振荡培养，待菌液浓度达到OD₆₀₀＝0.8时作浸染。

2.浸染：选取试管苗健康幼嫩的叶片，用无菌刀片垂直于叶片中脉横切2～4个伤口，然后放入制备好的根癌农杆菌菌液中，浸泡5～10分钟,期间不断振荡。

3.共培养：取浸染后的梨叶片，无菌滤纸吸干上面的的菌液，然后接种于共培 养培养基上暗培养3天，叶片背面朝下接种于不定芽诱导培养基上，暗培养温度25±2℃；所述的共培养培养基为：NN69+TDZ1.0～3.0mg/L+IBA0.2～0.5mg/L+蔗糖30～50g/L+琼脂5.0～6.5g/L,PH值为5.8；

4.筛选培养：经共培养3天后的梨叶片，用无菌水冲洗3～5次，再转移入添加了100mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素的筛选培养基中。所用的筛选培养基为：NN69+TDZ1.0～3.0mg/L+IBA0.2～0.5mg/L+蔗糖30～50g/L+琼脂5.0～6.5g/L+100mg/L卡那霉素+400mg/L头孢霉素,PH值为5.8；

5.生根培养：待筛选培养基上的不定芽长到1cm左右时，切下并转入添加了100mg/L Km和500mg/L Cef的生根培养基上。所述的生根培养基为：1/2MS+IBA0.6mg/L+蔗糖60g/L+琼脂6g/L，培养基pH值为5.8。

实施例6转基因植株的分子鉴定

1、叶片DNA提取

取适量的叶片放入1.5mL离心管中，加液氮，充分研磨后；加入700μl65℃预热的DNA提取缓冲液十六烷基三乙基溴化铵(简称CTAB，配方：100mM Tris-HCl(pH8.0)，1.5M NaCl，50mM EDTA(pH8.0)溶液加1％聚乙烯吡咯烷酮，2％(体积)CTAB，65℃水浴充分溶解备用，用前在65℃水浴预热后，加入1-4％(体积)巯基乙醇，混匀)，65℃温浴60-90分钟,隔15分钟取出上下轻轻颠倒混匀；10000g，离心10分钟；取上清，加600μl氯仿，颠倒混匀静置3分钟；10000g，离心15分钟；取上清450μl，加入900μl预冷无水乙醇，420μl5M NaCl，混匀后，冰冻30分钟，10000g，离心10分钟；弃上清后，用l ml75％的乙醇，洗涤3次后，加适量双蒸水溶解。

2、半定量RT-PCR检测PubHLH基因的超表达

本研究采用半定量RT-PCR分析转基因梨及烟草植株中外源基因PubHLH的表达量，转基因株系叶片RNA提取使用Trizol试剂盒，其步骤如下：1、研钵预冷。研钵用0.5MNaOH浸泡10min，再用灭菌DEPC洗3-4次，加液氮预冷(铝箔放冰上预冷冷藏叶片)；2、称重0.1g叶片于1.5ml离心管，液氮研磨后，加1ml Trizol混匀(裂解cell并保护RNA)。3、4℃10000-12000g，离心15min，取上清，加200μL氯仿，用力摇15s孵育2min，4℃10000-12000g，离心15min。4、取上清，加500μL异丙醇，孵育10min。4℃ 12000g，离心10min。配75％的酒精。5、弃上清，加1ml75％的酒精(用灭菌DEPC水配)轻摇。4℃7200g，5min离心。6、弃上清，风干，沉淀用30-50μL DEPC水溶解，-80℃保存。7、取1-2μL检测RNA的浓度和质量。将RNA反转录成cDNA其方法同第二章，半定量所用引物为PubHLH基因特异引物(正向引物PubHLH-F2：5’-CCCTTGAGTCCTTC-3’(SEQ ID NO：5)；反向引物PubHLH-R2：5’-CCCATCTCCCTCTT-3’(SEQ ID NO：6))，反应程序为94℃时3分钟，94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，30个循环；循环完成后72℃延伸10分钟。转基因烟草外源基因表达量采用半定量PCR分析，转基因烟草分析用Tubulin做内参，引物序列为：正向引物Tubulin-F：5'-TCCAGGACAAGGAGGGTAT-3(SEQ ID NO：7)'；反向引物Tubulin-R：5'-CATCAACAACAGGCAACCTAG-3'(SEQ ID NO：8)。梨Actin正向引物Actin-F1：5'-CAATGTGCCTGCCATGTATG-3(SEQ ID NO：9)'；反向引物Actin-R1：5'-CCAGCAGCTTCCATTCCAAT-3'(SEQ ID NO：10)。结果表明，在转基因株系中的PubHLH基因表达均比野生型高，分别选取烟草(#4和#9)两个超表达系用于抗性研究。梨中有5个系的表达水平比野生型明显增强，其中两个系用于抗寒性评价。

实施例7转基因植株的抗性评价

同批收的烟草未转化植株(WT)和转PubHLH超表达纯系(#4、#9)将WT、#4和#9在MS生长培养基上生长30后移栽到盆中生长7天后，正常生长的植株没有差别，但在0℃处理2天后，WT植株均出现萎蔫，而#4和#9植株生长仍然正常，表明转基因植株的抗寒能力明显比野生型强(图8A)，统计成活率，结果表明，两个转基因系的成活率明显高于野生型(图8B)，上述研究表明转PubHLH基因的烟草植株抗寒能力比未转化植株(WT)明显增强。

为了评估PubHLH转基因梨超表达对低温的抗性，正常生长情况下，对照及超表达系形态没有明显的差异，在0℃处理48小时后，发现野生型比转基因系萎蔫更严重且呈水渍状；25℃恢复生长5天，转基因的两个系恢复快而对照不能恢复正常生长变成枯黄，且顶芽已经死亡。上述研究结果表明，转基因系的抗寒能力比野生型强。

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Claims (9)

1.一种山梨bHLH类转录因子基因PubHLH，其特征在于核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，其中第409-2043bp处为该基因的编码区。

2.权利要求1所述的山梨bHLH类转录因子编码的蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.用于扩增权利要求1所述的山梨bHLH类转录因子基因cDNA的引物对，其特征在于正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。

4.含有权利要求1所述基因PubHLH的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于以pMV为出发载体。

6.含有权利要求1所述的山梨bHLH类转录因子基因PubHLH的宿主菌。

7.权利要求1所述的山梨bHLH类转录因子基因PubHLH在植物抗寒性状改良或构建抗寒转基因植物中的应用。

8.权利要求2所述的山梨bHLH类转录因子基因PubHLH编码的蛋白在植物抗寒性状改良或构建抗寒转基因植物中的应用。

9.权利要求4所述的重组表达载体在植物抗寒性状改良或构建抗寒转基因植物中的应用。