CN111499708A

CN111499708A - 葡萄VabHLH036基因在提高植物抗寒能力中的应用

Info

Publication number: CN111499708A
Application number: CN202010390712.4A
Authority: CN
Inventors: 辛海平; 李绍华; 孙小明; 王青锋
Original assignee: Wuhan Botanical Garden of CAS
Current assignee: Wuhan Botanical Garden of CAS
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-05-11
Also published as: CN111499708B

Abstract

本发明公开了葡萄VabHLH036基因在提高植物抗寒能力中的应用，所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明主要鉴定了一个参与葡萄低温响应的VabHLH036转录因子，并证实VabHLH036的表达具有增强葡萄抗寒性的功能。本发明为通过提高VabHLH036的表达量来增强葡萄以及其他作物的抗寒能力提供了理论依据。

Description

葡萄VabHLH036基因在提高植物抗寒能力中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及葡萄VabHLH036基因在提高植物抗寒能力中的应用。

背景技术

葡萄(学名：Vitis vinifera L.)为葡萄科葡萄属木质藤本植物，是世界最古老的果树树种之一，也是我国重要的果树作物之一。目前我国栽种的葡萄尤其是酿酒葡萄以欧亚种葡萄为主，其能耐受的冬季最低温度为-15℃左右，而我国北方优质酿酒葡萄产区冬季温度过低，栽培的欧亚种葡萄无法安全越冬，需埋土防寒，大幅增加了生产成本和种植风险。研究表明，转录因子在植物生物及非生物胁迫应答反应中发挥重要作用，通过调控胁迫相关基因的表达，从而提高植物的抗逆性。

bHLH(basic/helix-loop-helix)是在动植物中广泛存在的，含碱性/螺旋环螺旋结构的一类转录因子，它在动植物中都发挥着重要的作用。在拟南芥中，bHLH蛋白家族成员MYC3和MYC4与调节JA的JAZ蛋白家族成员JAZ3和JAZ9以及JAZ1相互作用，并且.MYC基因的组成性表达诱导花青素的积累。(Niu et al.,2011)在水稻和拟南芥中，功能拮抗HLH/bHLH转录因子介导油菜素类固醇的合成，bHLH家族蛋白IBH1与ILI1和PRE1相互作用，调控水稻和拟南芥细胞伸长和植株发育。(Zhang et al.,2009)。除此之外，bHLH转录因子在光敏色素信号转导、细胞命运测定、气孔分化和BR-响应基因表达等方面发挥关键作用。(Bernhardt et al.,2005；Duek and Fankhauser,2005；Serna,2007)。

本发明以山葡萄(V.amurensis)培苗为材料，研究转录因子bHLH036对葡萄抗寒性的影响。我们分别在山葡萄和玫瑰香中克隆了bHLH转录因子bHLH036，对其在低温处理条件下的表达模式进行分析，通过异位表达以及山葡萄的遗传转化研究了VabHLH036的功能并对转基因愈伤进行抗寒性验证。

发明内容

本发明的目的在于提供了葡萄VabHLH036基因或其编码的蛋白质在提高植物抗寒能力中的应用，所述的葡萄VabHLH036基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供了葡萄VabHLH036基因在提高植物表皮细胞壁厚度中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

葡萄VabHLH036基因或其编码的蛋白质在提高植物抗寒能力中的应用，包括利用本领域的常规方式，将葡萄VabHLH036基因在植物中进行过表达，即可获得提高了抗寒能力的转基因植株；所述的葡萄VabHLH036基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

以上所述的应用中，优选的，所述的植物为葡萄或拟南芥；

以上所述的应用中，优选的，所述的葡萄为山葡萄；

以上所述的应用中，优选的，所述的葡萄VabHLH036基因为SEQ ID NO.1所示。

葡萄VabHLH036基因在提高植物表皮细胞壁厚度中的应用，包括利用本领域的常规方式，将葡萄VabHLH036基因在植物中进行过表达，即可获得表皮细胞壁增厚的转基因植株；所述的葡萄VabHLH036基因为编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸；

以上所述的应用中，优选的，所述的植物为葡萄或拟南芥。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明主要鉴定了一个参与葡萄低温响应的VabHLH036转录因子。在拟南芥和葡萄中证实VabHLH036的表达具有增强葡萄抗寒性的功能，该功能可能通过增加植物表皮细胞壁的厚度达到。本发明为通过提高VabHLH036的表达量来增强葡萄以及其他作物的抗寒能力提供了理论依据。

附图说明

图1低温处理条件下VabHLH036在“山葡萄”和“玫瑰香”中的表达模式。

图2VabHLH036在冷处理下的核转移定位结果；

其中，A为35S::VabHLH036-GFP在正常条件下的定位；B为35S::VabHLH036-GFP在冷处理后的定位。

图3过表达VabHLH036明显提高了转基因拟南芥抗寒性。

图4过表达VabHLH036葡萄愈伤的抗寒性鉴定。

图5过表达VabHLH036葡萄愈伤的木质素含量。

具体实施方式

下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：

葡萄VabHLH036基因在提高葡萄抗寒能力中的应用：

1.实验材料和方法

1.1实验材料与处理

本研究所选用的实验材料为实验室保存的山葡萄和玫瑰香的组培苗。组培苗生长于含有1/2MS+IAA的固体培养基的三角锥形瓶中。放置在温度为26℃的恒温光照培养箱中，光周期为16h光照/8h黑暗。

选取生长六周的山葡萄和玫瑰香的组培苗，进行低温处理。处理温度为4℃，分别在低温处理后0、2、4、8、24和48h取样，每个时间点三个生物学重复。取样部位为幼嫩的叶片，取完样迅速放入液氮中，置于-80℃超低温冰箱保存备用。

本研究选用的拟南芥种子为哥伦比亚生态型拟南芥种子。

以上种子可以从北京华越洋生物科技有限公司购买。

1.2 bHLH036基因克隆及序列分析

分别克隆Va中的bHLH036的ORF区。我们通过NCBI里面黑比诺的基因组序列设计引物(ORF-F：ATGGGATTTGGGAAGAGAGAGG(SEQ ID NO.3)、ORF-R：TTAGAATGCCCAAGTTTCAGGA 3'(SEQ ID NO.4).通过PCR去扩增Va中的bHLH036的ORF区。通过DNAMAN对测序的得到的Va中的bHLH036的ORF区(SEQ ID NO.1所示)进行核酸和蛋白质序列(SEQ ID NO.2所示)分析。

1.3实时荧光定量PCR分析bHLH036的表达模式

用超低温保存的山葡萄和玫瑰香叶片材料，用RNA提取试剂盒(北京天恩泽)参照试剂盒说明书提取总RNA。用RQ1 RNase-Free DNase I(Promega)对提出来的总RNA中的DNA进行消化，得到纯化后的总RNA。以纯化后的葡萄总RNA为模板，利用SuperScript III反转录酶(Invitrogen公司)合成cDNA。将获得的cDNA按照1:10加ddH2O稀释备用，建立荧光定量PCR反应体系(2×SYBR Green I Master Mix(Roche):5μL；Forward and reverse primermix(2μM):1μL；cDNA:1μL；ddH2O:3μL)。实验仪器使用ABI公司的StepOne Plus荧光定量PCR仪，反应条件使用标准模式。以肌动蛋白基因(β-actin；GenBank accession NO.：EC969944)和苹果酸脱氢酶基因(MDH；GenBank accession NO.：EC921711)做内参(Sun etal,2015)，引物序列为bH5-F：TGTGCTTATTGCTCAGGTCGG(SEQ ID NO.5)bH5-R:GAATGCCCAAGTTTCAGGATG(SEQ ID NO.6)每个样本做3次生物学重复和3次技术重复。进行数据分析时，使用Lin-RegPCR软件对Ct值进行矫正并计算荧光定量PCR的效率(Ruijter etal,2009)，使用Biogazelle qbase PLUS计算基因的相对表达量及标准差(Hellemans etal,2007)

1.4拟南芥原生质体转化以及bHLH036的亚细胞定位以构建的Va bHLH036的ORF(Open Reading Frame)区的载体质粒为模板，通过引物

b5F-XbaⅠ:GCTCTAGAATGGGATTTGGGAAGAGAGAG(SEQ ID NO.9)

b5R-BamHⅠ:CGGGATCCTAGAATGCCCAAGTTTCAGGA(SEQ ID NO.10)

进行PCR扩增后通过双酶切将载体PBI-EGFP与Va bHLH036的ORF区连接，得到拟南芥原生质体转化载体。选取生长3-4周的拟南芥叶片分离纯化原生质体。利用PEG介导法进行拟南芥原生质体的转化。利用Leica TCS SP8激光共聚焦三维扫描仪观察烟草叶片表皮中的绿色GFP荧光。GFP绿色荧光的激发波长为488nm，发射波长为507nm。

1.5过表达拟南芥产生

以构建的Va bHLH036的ORF区的载体质粒为模板，通过引物

b5F-KpnⅠ:GGTACCATGGGATTTGGGAAGAGAGAG(SEQ ID NO.7)

b5R-XbaⅠ:TCTAGATTAGAATGCCCAAGTTTCAGGA(SEQ ID NO.8)进行PCR扩增后通过双酶切将Va bHLH036的ORF与载体p1301s连接起来，得到拟南芥过表达载体pCAMBIA1301s。用花浸法转化拟南芥。用潮霉素(50mg L-l)筛选出阳性转化植株，用实时荧光定量PCR进行验证。选取3个bHLH036表达量较高的T3纯合转基因株系bHLH036-OE1、bHLH036-OE2、bHLH036-OE3进行进一步分析。

1.6过表达拟南芥的胁迫处理

取三周苗龄的野生型拟南芥和过表达的拟南芥，我们对它们进行抗寒性试验。将长势一致的拟南芥放在低温光照培养箱中，4℃处理2h，-1℃冷驯8h，-3℃、-5℃、-7℃，-9℃，-11℃各处理2h，之后将拟南芥放在4℃暗培养12h后，放在正常条件下培养三天后观察拟南芥的生长状况，并统计存活率。每次实验进行三次生物学重复。

1.7过表达山葡萄的愈伤的产生

以构建的Va bHLH036的ORF区的载体质粒为模板，通过引物b5F-KpnⅠ、b5R-Xhol构建山葡萄过表达载体。选取5-6周的山葡萄的生长健壮的叶柄，切成3-5cm的小段后，浸染农杆菌，在B5X培养基共培养两天后，使用灭菌蒸馏水清洗，转移至新的B5Xcck培养基上。25℃黑暗条件下培养。每组三个重复。待长出愈伤，对其进行分子检测。

1.8转基因山葡萄愈伤的冰点测定

选取阳性并且表达量高的愈伤株系，将其切成黄豆大小平铺在B5X(CCK)固体培养基上，每个培养皿放九块，25℃黑暗条件下培养15d后测定冰点。将对照野生型愈伤和过表达愈伤放于PVC板上的电热模块中，设定温度为30min内降至4℃，保持1h；以2℃/h降至-16℃，保持1h；最后在45min内回复4℃。测定并统计数据。每组三个生物学重复。

1.9木质素含量测定

以正常条件下生长的过表达山葡萄愈伤为材料，以空载作对照，采用滴定法测定木质素含量，并计算结果。每个样品做三次重复。

2.结果

2.1低温处理条件下VabHLH036在山葡萄中的表达上调

实时荧光定量PCR结果表明，在低温处理条件下，山葡萄中的bHLH036转录因子的表达水平整体趋势表现上调。VabHLH036的相对表达量在低温处理后24h达到最高。相对于冷处理0h，VabHLH036的表达量上调约9.3倍。表明在山葡萄品种中，bHLH036受到低温胁迫的诱导。

2.2在冷刺激下，VabHLH036转移到细胞核中发挥作用

大多数膜结合转录因子的核转移对于其发挥作用有重要意义。在本发明中，VabHLH036对于低温胁迫有明显响应，因此我们对正常条件下和低温处理条件下的VabHLH036的定位进行了研究。我们构建了在CaMV35S启动子驱动下VabHLH036与GFP融合表达的载体。用GFP空载作为对照，将载体转化到拟南芥原生质体进行瞬时表达。结果如图2。在25℃培养的原生质体中，VabHLH036定位于细胞质中(图2中A)。而当我们将原生质体培养条件从25℃转移至4℃处理24h后，重新观察VabHLH036的定位。结果如图2中B所示，冷处理后，VabHLH036全部定位于细胞核中。

2.3过表达拟南芥在低温处理后可以提高拟南芥的存活率。

以3-4周苗龄大小的野生型拟南芥和获得的3个T3纯合转基因株系bHLH036-OE1、bHLH036-OE2、bHLH036-OE3进行抗寒性试验。结果表明，过表达拟南芥耐寒性明显高于野生型的拟南芥。冷处理后，成活率统计结果显示，bHLH036-OE1、bHLH036-OE2、bHLH036-OE3的存活率明显高于野生型，分别为85％、89％、82％(图3中B).结果说明，VabHLH036在植物应对寒冷胁迫时发挥重要作用。

2.4过表达的山葡萄的愈伤的抗寒性显著增加

为了验证VabHLH036在葡萄应对低温胁迫中的作用，我们通过农杆菌侵染对山葡萄叶柄进行遗传转化，获得转基因的山葡萄愈伤。对获得的转基因愈伤利用实时荧光定量PCR进行验证。结果表明，转入空载的愈伤中，VabHLH036的表达量显著低于过表达VabHLH036的山葡萄愈伤(图4中A)。bHLH036-OE1、bHLH036-OE2、bHLH036-OE3的山葡萄愈伤VabHLH036的表达量分别是空载的820倍，2000倍和2000倍，说明VabHLH036在山葡萄愈伤中过量表达。

利用植物组织低温下放热的原理，我们通过测定过表达的VabHLH036和空载愈伤的冰点值(LTE)对转基因山葡萄愈伤的抗寒性进行鉴定。我们测定了4℃处理24h后的愈伤的冰点值。结果如图4B，三个过表达株系的冰点值分别为-7.3℃、-7.4℃、-8.2℃摄氏度，显著低于空载愈伤的冰点值-6℃。以上结果表明，过表达VabHLH036会提高山葡萄愈伤的抗寒性。

2.5过表达的山葡萄的愈伤的木质素含量升高

为了研究VabHLH036通过哪种方式增加山葡萄的抗寒性，我们以空载作为对照，检测了转基因山葡萄过表达愈伤和空载愈伤的木质素含量。

采用滴定法测定木质素含量。

参考文献：熊素敏，左秀凤，朱永义.稻壳中纤维素半纤维素和木质素的测定.检测分析，2005，8:40-41.

3.主要实验仪器

梅特勒ML204型万分之一天平

4.实验步骤

4.1样品提取

将试样粉碎后过30目筛，取0.1～0.2g于离心管中，加入10ml质量分数1％醋酸溶液，摇匀离心；将沉淀用质量分数1％醋酸5ml洗一次，然后加3～4ml乙醇和乙醚混合(体积比1:1)，浸泡3min，弃去上清液，共浸洗3次。将离心管中的沉淀在沸水浴中蒸干，然后向沉淀中加入质量分数为72％的硫酸3ml，用玻璃棒搅匀，室温下静置16h，使全部纤维素溶解，然后向试管中加入10ml蒸馏水，用玻璃棒搅匀，置沸水浴5min，冷却后加5ml蒸馏水和0.5ml质量分数为10％的氯化钡溶液，摇匀，离心。沉淀用蒸馏水洗2次，宰相冲洗过的木质素沉淀中加入10ml质量分数为10％的硫酸和0.1mol/L的重铬酸钾溶液，将试管放入沸水浴中15min，并不时搅拌。冷却后将试管中所有的物质转入烧杯作滴定用，并用15～20ml蒸馏水洗涤残余部分。然后向烧杯中加入5ml质量分数为20％的KI溶液和1ml质量分数为0.5％淀粉液，用0.2mol/L硫代硫酸钠滴定。注：单独滴定加入10ml质量分数为10％的硫酸和0.1mol/L的重铬酸钾溶液作为空白样。

4.2结果计算木质素含量(％)＝K×(a-b)/(n×48)

式中：

48——1mol C11H12O4相当于硫代硫酸钠的当量数；

K——硫代硫酸钠浓度，mol/L；

a——空白滴定所耗硫代硫酸钠体。

结果发现，过表达愈伤中木质素含量显著高于空载愈伤(图5)，约为空载愈伤的2倍。我们认为，VbHLH036可能通过增加植物表皮细胞壁厚度去抵抗低温胁迫。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 中国科学院武汉植物园

<120> 葡萄VabHLH036基因在提高植物抗寒能力中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggatttg ggaagagaga ggacaacatg gagtctacca gccattcttc ttcggtttcc 60

aaggctgaga gaaagattgt ggagaaaaac agaagaaatc tcatgaagaa cctctactcc 120

aagctcaact ccctcctccc agatcaatcc tccaaggaag cccaatcaat ccctgatcaa 180

gtggatgaag ctgtaagcta cataaaatcc ctgcagggaa acctggagaa actcaaggag 240

aagaaagaga gcttaatggg cagcagaaaa aggccgcata catgcagtac taccagtgtt 300

ggagaaactt caacagctag cttgaggtca ccagtaatgg agattcggga aatgggctct 360

aatttacagg tgacactggt gactgggctg gaagatcagt ccgtattcta tgacattatt 420

ggcatactcc atgaagaaaa tgctgaggtc ttgagtgcaa gtttttcagt tgttgggaat 480

tcagctttcc atgtgcttat tgctcaggtt ggggattcta ccttcagttt tggaacaaag 540

tggatatgtg atagactcaa caagtttgtc catggatcta caagtgaaga agaactacaa 600

ccagagttgt gggactttga gtttcatcct gaaacttggg cattctaa 648

<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Phe Gly Lys Arg Glu Asp Asn Met Glu Ser Thr Ser His Ser

1 5 10 15

Ser Ser Val Ser Lys Ala Glu Arg Lys Ile Val Glu Lys Asn Arg Arg

20 25 30

Asn Leu Met Lys Asn Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Ser Leu Leu Pro Asp

35 40 45

Gln Ser Ser Lys Glu Ala Gln Ser Ile Pro Asp Gln Val Asp Glu Ala

50 55 60

Val Ser Tyr Ile Lys Ser Leu Gln Gly Asn Leu Glu Lys Leu Lys Glu

65 70 75 80

Lys Lys Glu Ser Leu Met Gly Ser Arg Lys Arg Pro His Thr Cys Ser

85 90 95

Thr Thr Ser Val Gly Glu Thr Ser Thr Ala Ser Leu Arg Ser Pro Val

100 105 110

Met Glu Ile Arg Glu Met Gly Ser Asn Leu Gln Val Thr Leu Val Thr

115 120 125

Gly Leu Glu Asp Gln Ser Val Phe Tyr Asp Ile Ile Gly Ile Leu His

130 135 140

Glu Glu Asn Ala Glu Val Leu Ser Ala Ser Phe Ser Val Val Gly Asn

145 150 155 160

Ser Ala Phe His Val Leu Ile Ala Gln Val Gly Asp Ser Thr Phe Ser

165 170 175

Phe Gly Thr Lys Trp Ile Cys Asp Arg Leu Asn Lys Phe Val His Gly

180 185 190

Ser Thr Ser Glu Glu Glu Leu Gln Pro Glu Leu Trp Asp Phe Glu Phe

195 200 205

His Pro Glu Thr Trp Ala Phe

210 215

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggatttg ggaagagaga gg 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttagaatgcc caagtttcag ga 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtgcttatt gctcaggtcg g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaatgcccaa gtttcaggat g 21

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtaccatgg gatttgggaa gagagag 27

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctagattag aatgcccaag tttcagga 28

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctctagaat gggatttggg aagagagag 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgggatccta gaatgcccaa gtttcagga 29

Claims

1.SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列在提高植物抗寒能力中的应用。

2.SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列在提高植物表皮细胞壁厚度中的应用。

3.根据权利要求1或权利要求2中的应用，其特征在于：是通过提高SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列在植物中的表达量得到。

4.根据权利要求1或权利要求2中的应用，其特征在于：所述植物为葡萄或拟南芥。

5.根据权利要求1或权利要求2中的应用，其特征在于：所述的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示。