CN108484742B - 杜梨抗寒转录因子PbrMYB5及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杜梨抗寒转录因子PbrMYB5及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明提供的抗寒转录因子PbrMYB5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的抗寒转录因子能够显著提高植物的抗寒能力，能够为植物分子育种提供新的种质资源，为实施绿色农业、现代化农业提供新的遗传资源，有利于降低农业生产风险和实现农业可持续发展。

Description

杜梨抗寒转录因子PbrMYB5及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及杜梨抗寒转录因子PbrMYB5及其应用。

背景技术

梨是我国三大主要水果之一，其产业在国民经济中具有非常重要的经济价值(张绍铃等，2010)。数十年来，我国梨产业得到迅速发展，但其经常遭遇非生物逆境胁迫，尤其是低温冻害。低温不仅限制梨的栽培区域，周期性的低温冷害和冻害也使得梨的产量、品质降低，给梨产业造成巨大的经济损失，严重制约其发展。例如：2002-2003年冬，库尔勒香梨树遭受严重的冻害。全市梨树受冻害面积3866.60hm²，直接损失产值6000万元，间接损失约2亿元(曹佩燕等，2003)。因此，培育梨抗寒新品种将有利于梨产业健康、稳定和可持续发展。但梨育种常遇到以下难题：第一，由于梨是多年生木本植物，具有遗传背景复杂，自交不亲和、童期长等特点，传统的育种方法在梨上的应用非常困难，并且育种周期较长；第二，梨属植物缺乏抗寒性强的种质资源，制约了其抗寒育种的发展。近年来，植物生物技术特别是基因工程的飞速发展，为梨抗寒育种开辟了一条新的途径，而其前提和关键是解析低温应答的调控网络及发掘和鉴定重要的抗逆基因。

植物通过诱导特异基因的表达来适应低温胁迫，低温胁迫应答基因分为功能基因和调控基因两类，前者在细胞内直接发挥保护作用，后者编码调节蛋白，参与胁迫信号转导和表达调控。转录因子(Transcription factor)作为重要的调控基因，与顺式作用元件(cis-acting element)形成复杂的蛋白质-DNA互作复合体，是控制基因表达的主开关。在胁迫信号传递、放大到最终做出响应过程中，转录因子起着关键作用。由于同一个转录因子可以与启动子上具有相同顺式作用元件的多个靶基因结合，超表达转录因子后可以调控下游多个靶基因，从而显著增强对单一胁迫或多个胁迫的抗性。由此可见，转录因子比功能基因在抗逆遗传改良中起到更重要的作用，是抗逆遗传工程的理想基因，能使转基因植物的抗性得到综合改良。目前果树上研究得比较多的转录因子有ICE1、bHLH、ABF、WRKY、NAC、ABF等，但仍缺乏适用于梨的抗寒基因或转录因子。

发明内容

本发明的目的在于提供杜梨抗寒转录因子PbrMYB5及其应用。本发明提供的抗寒转录因子能够显著提高植物中维生素C的含量，提高植物的抗寒能力，能够为植物分子育种提供新的种质资源，为实施绿色农业、现代化农业提供新的遗传资源，有利于降低农业生产风险和实现农业可持续发展。

本发明提供了一种抗寒转录因子PbrMYB5，所述PbrMYB5的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了编码所述转录因子PbrMYB5的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了一种克隆上述技术方案所述基因的引物对，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID MO.4所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的转录因子PbrMYB5在提高植物VC含量中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的转录因子PbrMYB5在植物抗寒中的应用。

优选的是，所述植物包括梨、烟草。

优选的是，编码所述转录因子PbrMYB5的基因通过农杆菌遗传转化方法转入植物中。

本发明提供了杜梨抗寒转录因子PbrMYB5及其应用。本发明提供的抗寒转录因子能够显著提高植物VC含量，从而提高植物的抗寒能力，将本发明所述的基因PbrMYB5导入到烟草进行功能验证，获得的转基因植株抗寒能力明显提高。本发明提供的转录因子PbrMYB5能够为植物抗非生物逆境分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、现代化农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产风险和实现农业可持续发展。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的技术流程示意图；

图2为本发明实施例3提供的PbMYB5基因在低温，脱水和盐胁迫下的表达示意图；

图3为本发明实施例4提供的PbrMYB5基因亚细胞定位结果图；

图4本发明提供的转基因烟草鉴定图，其中，图4-A为本发明实施例5提供的转PbrMYB5基因烟草的阳性鉴定图，图4-B为本发明实施例6提供的转PbrMYB5基因烟草的超表达鉴定图；

图5为本发明实施例7提供的转PbrMYB5基因株系及野生型(WT)低温处理前后的表型和生理指标测定结果图；

图6为本发明实施例7提供的50天的秋子梨植株采用病毒介导的瞬时沉默(VIGS)PbrMYB5株系(pTRV-1，pTRV-2和pTRV-3)及野生型植株(WT)结果图；

图7为本发明实施例7提供的转PbrMYB5基因烟草和利用病毒介导的VIGS技术瞬时沉默PbrMYB5秋子梨组织化学染色分析H₂O₂和O^2-积累结果图；

图8为本发明实施例7提供的转PbrMYB5基因烟草和该基因瞬时沉默的秋子梨低温处理前后ASA、DHA和ASA/DHA的含量结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种抗寒转录因子PbrMYB5，所述PbrMYB5的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。在本发明中，所述转录因子PbrMYB5从杜梨(Pyrus bretschneideri)中分离，能够编码R2R3型MYB家族转录因子。在本发明中，所述转录因子PbrMYB5包含1047bp的开放阅读框，编码348个氨基酸，等电点为7.13，分子量为37.07KDa。

本发明还提供了编码所述转录因子PbrMYB5的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明提供了一种克隆上述技术方案所述基因的引物对，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID MO.4所示。具体地，如SEQ ID NO.3所示的序列为正向引物1，序列为5’-ATGAGGAACCCATCGCCTTCGTCGA-3’(SEQ ID NO.3)；如SEQ ID NO.4所示的序列为反向引物1，序列为5’-CTCCGTTGGATCATTAACCCTTTGGCG-3’(SEQ ID NO.4)。在本发明中，所述正向引物1和反向引物1能够实现PbrMYB5基因全长的扩增。

本发明优选采用RT-PCR克隆技术对基因PbrMYB5的cDNA全长序列进行扩增。本发明对所述PCR的具体扩增条件没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的常规PCR反应条件即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的转录因子PbrMYB5在提高植物VC含量中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的转录因子PbrMYB5在植物抗寒中的应用。在本发明中，所述植物包括梨、烟草。在本发明中，所述梨优选为秋子梨。

本发明优选采用农杆菌遗传转化方法将基因PbrMYB5转入植物，获得转基因植物。在转基因植物的获得过程中，本发明优选先进行PbrMYB5全长基因的扩增，得到PbrMYB5基因后，本发明进行转化载体的构建，将PbrMYB5基因插入载体，得到转化载体；随后将转化载体导入农杆菌中，本发明采用农杆菌侵染植物的过程具体包括：在添加了卡那霉素50mg/L的LB平板上划线，刮取划线菌斑，加入液体MS基本培养基中，28℃，180转/分钟振荡培养，待菌液浓度达到OD₆₀₀＝0.5时作浸染。当所述被侵染的植物为烟草时，本发明具体取未转基因的烟草叶片，切成0.5cm×0.5cm大小，然后放入制备好的根癌农杆菌菌液中，浸泡5分钟，期间不断振荡。取浸染后的烟草叶片，无菌滤纸吸干上面的的菌液，然后接种于共培养培养基上暗培养3天。用无菌水冲洗3～5次，再转移入添加了100mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素的筛选培养基中。待筛选培养基上的不定芽长到1cm左右时，切下并转入生根培养基上。待生根后的转化苗长大后，用自来水洗净转化苗上的培养基，并栽植于灭菌的营养土中。利用PCR鉴定阳性苗，得到转基因植物。

本发明得到转基因植物后，优选包括对阳性植物进行鉴定的过程，在本发明的阳性植物鉴定过程中，本发明优选采用如SEQ ID NO.5所示的正向引物2，序列为5’-GACGATAACAGCGTCGTCCT-3’(SEQ ID NO.5)和如SEQ ID NO.6所示的反向引物2，序列为5’-CTCTTCAAACCCACCTTTGC-3’(SEQ ID NO.6)进行测序。本发明得到转基因植物后，优选还包括超表达系鉴定过程，在本发明中，所述超表达系鉴定优选采用如SEQ ID NO.7所示的正向引物3，序列为5’-GACGATAACAGCGTCGTCCT-3’(SEQ ID NO.7)和如SEQ ID NO.8所示的反向引物3，序列为5’-CTCTTCAAACCCACCTTTGC-3’(SEQ ID NO.8)进行测序；所述超表达系鉴定用Actin做内参，其扩增引物包括正向引物4：5’-AGCTACATGACGCCATTTCC-3’(SEQ ID NO.9)和反向引物4：5’-CCCTGTAAAGCAGCACCTTC-3’(SEQ ID NO.10)。

经过生物学功能验证，得到的转基因植物具有调控耐寒和提高VC含量的功能。在本发明中，所述生物学功能验证的方法包括：低温处理后观察表型、成活率、电导率、MDA以及AsA、DHA等。

下面结合具体实施例对本发明所述的杜梨抗寒转录因子PbrMYB5及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

本发明的技术流程如图1所示

克隆PbrMYB5基因，对该基因进行亚细胞定位、不同逆境下表达模式分析、并且分别构建超表达载体进行烟草转化和沉默载体进行秋子梨转化后通过分子水平鉴定阳性植株，分别对转基因和野生型的烟草、梨苗进行低温胁迫，观察表型以及从生理水平鉴定转化植株的抗性。

实施例2

杜梨PbrMYB5基因全长cDNA的克隆

以杜梨脱氢抗坏血酸还原酶基因PbrDHAR2启动子中的MYB顺式元件为诱饵，筛选酵母单杂文库，筛选得到基因PbrMYB5的核苷酸序列，将该序列提交至梨基因组数据库进行BLAST，选择得分最高的核苷酸序列，并提交Pfam验证保守蛋白结构域。利用PrimerPremier5.0设计扩增该序列的特异引物对。扩增PbrMYB5全长基因的引物对为：

正向引物1：5’-ATGAGGAACCCATCGCCTTCGTCGA-3’(SEQ IDNO.3)，反向引物1：5’-CTCCGTTGGATCATTAACCCTTTGGCG-3’(SEQID NO.4)；用RT-PCR方法从杜梨上扩出其全长。详细步骤如下：取杜梨RNA 1μg经1U的DNase I 37℃处理30min后立即放入冰上，加入1μL50mM EDTA 65℃处理10min后立即置于冰上。cDNA第一链的合成参照TOYOBO反转录试剂盒的操作手册进行。所得的第一链cDNA用于PbrMYB5基因的扩增。PCR按以下程序完成：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。扩增完成后产生单一条带的PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒按照使用说明提取步骤，回收特异目的条带。回收纯化的溶液与pMD19-T载体进行连接，连接体系中基因与载体的摩尔比为3:1连接。反应总体积是10μL，其中5μLbuffer，4.5μL的PCR纯化的产物，0.5μL载体。16℃连接过夜，采用热击法转化到大肠杆菌感受态DH5α中，以目的基因序列引物进行PCR验证并测序(由上海英潍捷基公司完成)。

测序结果表明，本发明扩增的目的片段长度为1047bp，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，通过序列比对分析，确定该序列是本发明需要的目的基因，将这个基因命为PbrMYB5。

实施例3

不同逆境条件处理下PbrMYB5基因的qRT-PCR分析

为了分析杜梨中PbrMYB5基因对低温，脱水和高盐的响应模式，使用Real-timePCR技术对PbrMYB5基因的表达模式进行分析。采用CTAB法提取RNA，DNA第一链的合成参照TOYOBO反转录试剂盒的操作手册进行。在20μL的反应体系中有：10ul 2×Mix，0.1ul cDNA，5μL引物(以ubiqutin为内参引物，长度为208)，4.9ul水。定量PCR的程序如表1所示：

表1定量PCR程序

图2为PbMYB5基因在低温，脱水和盐胁迫下的表达示意图。其中：图2A是本发明的基因在杜梨实生苗(未转基因)在4度处理下，相应的时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量，从图中可以看出随着处理时间的延长其表达逐渐增加，到24时达到最大值，说明这个基因受低温诱导强烈。图2B是杜梨的实生苗室温下脱水不同时间点的表达模式，从图中可以看出，其受脱水诱导但不是很明显，到达6小时达到最高点是最初的4倍；图2C是杜梨的实生苗在200mM NaCl处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明的基因相对表达量，其受盐的诱导也是十分明显，处理12时达到最高点，随后略有下降，但仍比1小时高3倍。得出的结论是：PbrMYB5对低温和盐均有响应，尤其是在24小时对低温响应强烈，说明PbrMYB5是一个低温响应的候选基因。

实施例4

PbrMYB5基因的亚细胞定位

根据PbrMYB5基因的核苷酸序列和pJIT166-GFP载体图，在基因序列前后分别加入SalI和BamHI酶切位点。将测序结果正确的目的基因提取质粒作为模板，用加入酶切位点的引物扩增，所用PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火1min72℃延伸1min30s，35个循环；72℃延伸10min。基因3′去除了终止密码子TAG，目的是让目的基因后续与GFP融合。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶试剂盒回收目的条带。回收纯化的扩增片段克隆到pMD19-T载体中，转化到大肠杆菌感受态DH5α中。将转化后的菌液用PCR检测，PCR鉴定呈阳性的菌液送去测序，提取测序结果正确菌液和pJIT166-GFP载体的质粒。将两者均用SalI和BamHI进行双酶切，分别纯化回收酶切过后的产物PbrMYB5基因和pJIT166-GFP载体。两者经T4-DNA连接酶连接，16℃过夜，转化大肠杆菌感受态DH5α，将得到的重组载体命名为pJIT166-GFP-MYB5。

采用拟南芥原生质体转化的方法进行亚细胞定位

方法：配置各种试剂的母液，10-15ml酶液，20ml 0.4M甘露醇平衡液等。取4周后未抽台前的叶片，约6-8片，用刀片切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液中。将酶液倒入三角瓶中，封口，放在25℃摇床上，60-70rpm摇4个小时。过100或者200目的筛子，将液体吸到10ml管子中，离心600rpm，10min，25℃。弃上清，加入3mlW5溶液，把原生质体摇起来直至无沉淀。离心600rpm，4min，25℃。弃上清，加入3ml Mamg溶液。离心600rpm，10min，25℃。沉淀原生质体，去上清，加1ml Mamg，然后晃一晃置冰上，冰浴30min。离心600rpm，4min，25℃。收集原生质体，加入500μL-1mLMamg晃起原生质体，恢复至室温后，用细胞计数板在显微镜下计数。分装100μL原生质体到2mL的EP管中，分别加入质粒(调至1μg/μL，加20μg)，然后加入等体积的40％PEG，充分混匀，室温放置20min。加入4mLW5溶液入细胞培养板，缓慢加入1mLW5溶液入原生质与质粒、PEG的混合液，混匀，然后再缓慢加入1mLW5溶液，混匀。然后再将原生质体洗出来缓慢加入到细胞培养板中，再加3mLW5溶液将体积补到9mL，轻轻混匀。25℃暗培养，24-48h。荧光观察之前，600rpm，25℃，离心4min。弃部分上清，终体积控制在150μL左右。随后使用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710,Germany)拍照保存图片。酶解液、MaMg溶液和W5溶液的具体配方如表2、3、4所示。

母液配置

1、100mM MES 100mL 1.95g pH5.7(KOH调)；

2、100mM KCl 100mL 0.7455g；

3、100mM MgCl₂100mL2.03g；

4、100mM CaCl₂100mL 1.47g；

5、1M MgCl₂50mL 10.165g；

6、1M CaCl₂50mL 7.351g

表2酶解液配置

	终浓度
		甘露醇	0.4M甘露醇
cellulose R10	1％cellulose RS
		Macenzyme(离析酶)	0.1％Macenzyme
100mM MES	5mM MES
		果胶酶	0.1％果胶酶
BSA	0.15％BSA
		100mMCaCl<sub>2</sub>	8mMCaCl<sub>2</sub>

表3 MaMg溶液10ml

	终浓度
		甘露醇	0.4/0.6M甘露醇
100mM MgCl<sub>2</sub>	0.1％
		100mM MES	4mM MES

表4 W5溶液(现配现用)

	终浓度
		NaCl(进口)	154mM
CaCl(进口)	125mM
		100mM KCl(进口)	5mM KCl
100mM MES	2mM MES

图3为本发明的PbrMYB5基因亚细胞定位结果图。其中：图3A，GFP基因(对照)在明场(图左)、紫外线(UV)光(图中)下的成像，图(右)为二者叠加后的成像；图3B，PbrMYB5基因在明场(左)、UV光(中)下的成像，图(右)为二者叠加后的成像。通过图3可得该基因定位于细胞核。

实施例5

烟草的遗传转化

1.植物转化载体构建

根据pCAMBIA1302载体的多克隆位点和PbrMYB5基因的编码区序列，按照一般设计引物的原则用primerprimier5.0软件设计出扩增基因整个编码区的上、下游PCR引物(该引物对就是扩增PbrMYB5基因全长序列的引物对)。以PbrMYB5基因的克隆子为模板进行PCR扩增。PCR扩增的退火温度为58℃，PCR反应体系及扩增程序PbrMYB5基因克隆相同。在扩增过后进行双酶切，双酶切体系总体积为20μL，其中：PCR的纯化产物10μL，10×G缓冲液2μL，KpnI及XhoI各1μL，双蒸水6μL。酶切在37℃中进行，酶切过夜后做胶纯化回收。pCA-MBIA1302载体双酶切反应体积为20μL，其中：有pCA-MBIA1302的载体质粒8μL，10×M缓冲液2μL，KpnI及XhoI各1μL，加双蒸水8μL。同样放置于37℃酶切过夜后纯化回收。在连接反应体系中加入PbrMYB5基因与pCA-MBIA1302载体的摩尔比为3:1，反应总体积为10μL。其中含有10×buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，双酶切回收的PbrMYB5基因4ul，双酶切回收pCA-MBIA1302载体产物2μL，双蒸水2μL，在16℃反应14-16h得到连接产物。连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L的卡那霉素的LB固体平板中培养。将筛选出的阳性克隆，调点后摇菌，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序确定没有编码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名为PbrMYB5-pCA-MBIA1302重组载体，应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)将重组载体PbrMYB5-pCA-MBIA1302导入到农杆菌GV3101中。

2.农杆菌介导的烟草遗传转化步骤如下：

根癌农杆菌介导的烟草遗传转化方法，具体操作步骤如下：

(1)烟草种子的消毒灭菌：先用70％乙醇处理烟草种子60s，然后用无菌水洗涤5遍，再用10％次氯酸钠处理6min，最后用无菌水洗涤5遍。将种子接种至萌发培养基M1(表5)上，4℃培养3d，然后移至温度为25度、昼夜比为16/8h的光周期条件下培养30-45d。

(2)根癌农杆菌的培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌(‘PbrMYB-pCA-MBIA1302’重组载体)，在含有50mg·L^-1卡那霉素和15mg·L^-1利福平的LB固体培养基划线培养，28℃培养24h，挑取单菌落相同的固体培养基上二次划线，在28度培养至OD₆₀₀≈0.5。

(3)侵染转化：取出28度暗培养的农杆菌，用刀片把培养基上面的农杆菌刮到MS液体培养基中，放入28度摇床220转/min，摇30分钟使其摇散。把培养30-45天的烟草的叶片切成0.5cm²的小正方形，放入MS液体培养基中，开分光光度计预热，30分钟后拿出摇床菌液，测OD值0.5-0.6之间为宜。用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液，将其置于培养基M2(表5)上25℃暗培养2d。

(4)潮霉素筛选抗性芽：经暗培养2d的烟草子叶外植体，将其继代于筛选培养基M3(表5)上进行潮霉素抗性筛选。

(5)生根诱导与移栽：待抗性芽长至1.5cm左右且有明显的节间，切取抗性芽扦插于培养基M4(表5)中诱导生根。从生根培养基中取出根系生长良好的烟草再生植株，用自来水将其根系冲洗干净，置于灭菌的蛭石中遮荫保湿炼苗，25℃光照培养箱中培养7-10d。抗性植株适应外部环境后，将其转移至营养土中，25℃自然光照生长。

表5烟草遗传转化体系所用的培养基

3.转基因阳性苗的的筛选

按照实施例5上述方法得到烟草再生植株，按如下步骤提取烟草叶片总DNA：取适量的烟草叶片于1.5mL离心管，加液氮充分研磨；加入700μL 65℃预热的DNA提取缓冲液[提取缓冲液组成为：100mM Tris·HCl(pH＝8.0)，1.5M NaCl，50mM EDTA(pH＝8.0)，1％聚乙烯吡咯烷酮，2％十六烷基三乙基溴化铵，4％(体积)β-巯基乙醇]，65℃水浴90min，每15min上下轻轻颠倒混匀；10000rpm离心10min，取上清，加600μL氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻颠倒5min后静置3min；10000rpm离心15min，取上清450μL，加入900μL预冷的无水乙醇和34μL 5MNaCl，轻轻颠倒混匀后，-20℃放置30min；10000rpm离心10min；弃上清，用1mL 75％乙醇洗涤沉淀2次，无菌风吹干，加20μL无菌双蒸水溶解。

阳性植株鉴定步骤如下：用PbrMYB5阳性植株筛选引物(正向引物2和反向引物2，如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示)对上述提取的DNA进行PCR扩增鉴定阳性苗，以水空白和未做侵染转化的烟草叶片DNA作为对照。引物序列、PCR反应程序和反应体系分别如表6、表7和表8所示。水空白和未做侵染转化的烟草叶片DNA不能扩增出目的条带，如图4-A所示能扩增出目的条带的再生烟草植株被初步鉴定为阳性转基因烟草株系。

表6 PbrMYB5阳性植株筛选引物序列信息

表7 PCR反应程序

表8 PCR反应体系

反应组分	用量(μL)
		模板	1
10×缓冲液	2.5
		dNTPs(2.5mM)	2.5
MgCl<sub>2</sub>(25mM)	2.5
		正向引物2(10μM)	0.8
反向引物2(10μM)	0.8
		Taq DNA聚合酶(5U·μL<sup>-1</sup>)	0.2
无菌双蒸水	14.7

实施例6

转基因烟草植株的超表达分析

转基因烟草植株不同组织中PbrMYB5基因的超表达分析采用qRT-PCR技术，qRT-PCR分析同实施例3，转基因烟草植株叶片的RNA提取与PbrMYB5全长基因合成的方法同实施例2，超表达系鉴定用引物为：正向引物3：5’-GACGATAACAGCGTCGTCCT-3’(SEQ ID NO.7)，反向引物3：5’-CTCTTCAAACCCACCTTTGC-3’(SEQ ID NO.8)；所述鉴定过程用Actin做内对照，其扩增引物核苷酸序列为：正向引物4：5’-AGCTACATGACGCCATTTCC-3’(SEQ ID NO.9)，反向引物4：5’-CCCTGTAAAGCAGCACCTTC-3’(SEQ ID NO.10)。qRT-PCR分析结果表明，转基因植株系中的PbrMYB基因的相对表达量均比野生型高(图4)。两个阳性转基因烟草株系如图4-B所示用于抗性研究。

实施例7

转基因烟草植株的生理鉴定

1.转基因烟草植株的抗寒分析

本发明对转PbrMYB5基因株系及野生型(WT)低温处理前后的表型和生理指标测定。其中:图5是本发明中实施例转PbrMYB5基因株系及野生型(WT)低温处理前后的表型和生理指标测定结果图。其中:图5A是14天大的烟草植株在0度处理2天前后及恢复后的表型；图5B是14天大的烟草植株在0度处理2天恢复三天后的成活率统计，由图可见转基因烟草成活率比转基因高，说明转基因烟草低温胁迫后恢复性更好；图5C是34天大的烟草植株在4度处理2天前后表型；图5D是34天大的烟草植株在4度处理2天后电导率的测定，由图可见转基因烟草低温处理后电导率更低，说明转基因烟草细胞膜受损伤的程度更小；图5E是34天大烟草植株在4度处理2天后丙二醛含量的测定，由图可见转基因烟草低温处理后丙二醛含量更低，说明转基因烟草膜酯过氧化物含量与野生型相比更低，细胞受损更小。

2.利用病毒介导的VIGS技术瞬时沉默秋子梨中PbrMYB5的抗寒评价

图6是本发明中实施例50天的秋子梨植株采用病毒介导的瞬时沉默(VIGS)PbrMYB5株系(pTRV-1，pTRV-2和pTRV-3)及野生型植株(WT)结果图。其中：图6(a)是生长正常生长的盆栽植株(处理前)。图6(b)是0度处理8天的表型。图6c是0度处理4天电导率测定，由图可见PbrMYB5沉默株系在低温处理后与野生型相比，电导率更高，细胞膜受损伤更大。6d是0度处理7天脯氨酸含量的测定，由图可见PbrMYB5沉默株系在低温处理后与野生型相比，脯氨酸含量更低，说明在低温环境中PbrMYB5沉默株系产生的渗透调节物质更少，抗寒性更差。图6e是0度处理4天丙二醛含量的测定图，由图可见PbrMYB5沉默株系在低温处理后与野生型相比产生的膜脂过氧化物更高，细胞受损更严重。

3.组织化学染色分析H₂O₂和O^2-积累

图7为转PbrMYB5基因烟草和利用病毒介导的VIGS技术瞬时沉默PbrMYB5秋子梨组织化学染色分析H₂O₂和O^2-积累结果图。图7，A-B是34天大的烟草植株在4度处理4小时后未转化植株和两个转基因株系活性氧组织化学染色采用二氨基联苯胺(DAB)和硝基四氮唑(NBT)分别对H₂O₂(图6A)和O^2-(图6B)进行染色，图7A和图7B分别说明低温处理后转基因烟草比野生型烟草产生更低含量的H₂O₂和O^2-，转基因烟草在低温胁迫下产生更低ROS，抗氧化能力更强。图7C：为转基因烟草低温胁迫处理后细胞死亡染色，说明低温处理后转基因烟草比野生型烟草细胞死亡数量更少。图7，D-E是50天大的秋子梨植株在0度处理4d后未转化植株和PbrMYB5基因瞬时沉默的秋子梨活性氧组织化学染色采用二氨基联苯胺(DAB)和硝基四氮唑(NBT)分别对H₂O₂(图6D)和O^2-(图6E)进行染色，图7D和图7E分别说明低温处理后PbrMYB5沉默植株比野生型产生更高含量的H₂O₂和O^2-，在低温胁迫下PbrMYB5沉默植株产生更高ROS，抗氧化能力更弱。图7F：为PbrMYB5基因瞬时沉默的秋子梨低温胁迫处理后细胞死亡染色，说明低温处理后PbrMYB5沉默植株比野生型细胞死亡数量更高。

4.根据Karlheinz等1994年报道的文献进行转PbrMYB5基因烟草和该基因瞬时沉默的秋子梨低温处理前后ASA、DHA和ASA/DHA的含量分析。具体方法如表9所示：

表9 ASA和总ASA的测定

用移液器法测ASA和总ASA方案(AsA+DAsA)

用于植物组织测定

注意：DTT用0.2M磷酸缓冲液溶解(PH7.4)，溶液按所示顺序添加到样品中。

^A混匀并在42度水浴锅中孵育15分钟。

^B混匀并在室温下孵育1分钟。

^c2,2'-联吡啶用70％(v/v)酒精溶解。

^d加入三氯化铁后立即剧烈震荡，否则会出现浑浊。

^e在42℃的水浴中孵育40分钟并用酶标仪(Infinite 2000)在波长525nm处读取吸光度。

图8为转PbrMYB5基因烟草和该基因瞬时沉默的秋子梨低温处理前后ASA、DHA和ASA/DHA的含量结果图。A-B是60天大的烟草植株在4度处理24小时前后野生型和两个转基因株系抗坏血酸(ASA)(图8A)和脱氢抗坏血(DHA)(图8B)含量测定，结果表明在低温处理前转基因烟草ASA、DHA的含量比野生型略高，低温处理后转基因烟草中ASA含量明显上升，与野生型相比差异极显著，说明转PbrMYB5能在低温胁迫时提高ASA含量，提高植物活性氧清除能力。图8C：60天大的烟草植株在4度处理24小时前后未转化植株和两个转基因株系中抗坏血酸/脱氢抗坏血酸(ASA/DHA)比值，在低温处理前转基因烟草ASA/DHA的含量比野生型略高，低温处理后转基因烟草中ASA/DHA含量明显上升，与野生型相比差异极显著，说明转PbrMYB5使植物的抗氧化能力增强。D-E是50天大的秋子梨在0度处理4天后野生型和3个PbrMYB5瞬时沉默的秋子梨中(pTRV-1，pTRV-2和pTRV-3)抗坏血酸(图8D)和脱氢抗坏血酸(图8E)含量测定。由图可见，低温处理后PbrMYB5瞬时沉默的秋子梨中ASA含量比野生型低，说明转沉默PbrMYB5能使秋子梨在低温胁迫时ASA含量更低，活性氧清除更差。图8F：50天大的秋子梨在0度处理4天后未转化植株和3个该基因瞬时沉默的秋子梨(pTRV-1，pTRV-2和pTRV-3)中抗坏血酸/脱氢抗坏血酸比值，由图可见低温处理后PbrMYB5瞬时沉默的秋子梨中ASA/DHA比野生型含量更低，抗氧化能力更差。

5、综合分析表明，分别将PbrMYB5转入烟草和利用病毒介导的VIGS技术瞬时沉默PbrMYB5转入秋子梨中后鉴定其功能，发现以下试验结果：在烟草中转基因PbrMYB5超表达株系与对照野生型相比抗寒能力有了很大提升。转基因烟草的中的过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O^2-)的含量均要比野生型要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小，ASA含量明更高，抗氧化能力更强；在秋子梨中利用病毒介导的VIGS技术瞬时沉默PbrMYB5的株系与对照野生型相比抗寒能力明显下降。pTRV-PbrMYB5转基因秋子梨株系中的过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O^2-)的含量均要比野生型要高，植株体内活性氧残留更高，细胞损伤更大，ASA含量明更低，抗氧化能力更差。这些结果表明，过表达的PbrMYB5基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，而沉默该基因植株的活性氧清除能力下降，说明PbrMYB5能够提高植株的抗寒性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 杜梨抗寒转录因子PbrMYB5及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Asn Pro Ser Pro Ser Ser Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser

1 5 10 15

Ala Lys Met Gln Thr Thr Ile Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala

20 25 30

Ala Gly Val Ala Gly Gly Thr Lys Thr Pro Cys Cys Ala Lys Val Gly

35 40 45

Leu Lys Arg Gly Pro Trp Thr Pro Glu Glu Asp Glu Leu Leu Ala Asn

50 55 60

Tyr Ile Lys Lys Glu Gly Glu Gly Arg Trp Arg Thr Leu Pro Lys Arg

65 70 75 80

Ala Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn

85 90 95

Tyr Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Gly Gln Ile Ala Pro Asp Glu Glu

100 105 110

Asp Leu Ile Leu Arg Leu His Arg Leu Leu Ser Lys Lys Leu Ile Asn

115 120 125

Gln Gly Ile Asp Pro Arg Thr His Lys Pro Leu Asn Pro Asp His His

130 135 140

Ser Ala Ala Asp Asp Ala Asp Leu Asp Asn Thr Asn Lys Ser Thr Ala

145 150 155 160

Val Ala Ser Ser Ser Lys Ala Asn Asp Arg Phe Ser Asn Pro Asn Pro

165 170 175

Ser Pro Pro Ser Asp Arg Leu Val His Lys Glu Gly Asp Pro Asn Asn

180 185 190

Ser Arg Asn Gly Gly Asn Ile Ala Ile Asp Asp His Asp Gln Gly Thr

195 200 205

Ile Val His Gly Tyr Ala Asn Met Ile Thr Ser Ile Asn Asn Pro Asp

210 215 220

Ala Ser Ser Ser Ala Thr Ala Thr Gly Thr Leu Ser Leu Arg Ser Asn

225 230 235 240

Asn Ser His Gly Gly Val Leu Leu Gly Gly Gly Gly Asn Glu Glu Asp

245 250 255

Asp Asp Ile Asn Cys Cys Ala Asp Asp Val Phe Ser Ser Phe Leu Asn

260 265 270

Ser Leu Ile Asn Glu Asp Pro Phe His Gly Gln His Gln Leu Gln Gln

275 280 285

Val Leu Gln Asn Gly Asn Val Ser Ala His Ala Ala Ala Ala Gly Ser

290 295 300

Glu Asn Leu Pro Leu Ile Thr Met Thr Gly Ala Ser Thr Thr Ala Pro

305 310 315 320

Ser Thr Phe Gly Trp Glu Ser Ala Val Leu Met Ser Ser Ala Phe Ile

325 330 335

His Asn Asp Arg Gln Arg Val Asn Asp Pro Thr Glu

340 345

<210> 2

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaggaacc catcgccttc gtcgaaagca gcagcagcag cagcaagtgc taagatgcaa 60

acgacgataa cagcgtcgtc ctcgtcgagc aaggcggctg gggttgctgg agggaccaag 120

acgccgtgtt gcgcaaaggt gggtttgaag agagggccgt ggactcccga agaggacgag 180

ctgctggcaa attacatcaa gaaagaaggg gagggacggt ggcggaccct tcccaagcgg 240

gctgggttgc tccgctgcgg taagagctgc cgcctccgct ggatgaacta tctccgccct 300

tccgtaaagc gcggccagat cgcccccgat gaagaagatc tcatccttcg cctccatcgc 360

cttctgagca agaagctgat aaaccaaggc atagatccca gaacccacaa gcctctcaat 420

ccagatcatc actctgctgc tgatgatgct gacctggaca acacaaacaa atcaactgct 480

gttgcttctt cttccaaagc caatgatcgg ttctcaaacc ctaaccctag tcccccttct 540

gatcgtcttg tccataaaga aggggatcca aataacagcc gtaatggtgg aaacatcgca 600

attgatgatc atgatcaggg cactatagtc catggctatg caaatatgat cacgtccatc 660

aacaatcccg atgcttcttc ttcggccacg gcaacgggta ctttgagttt gaggagcaac 720

aacagccacg gtggagtact acttggggga ggaggaaatg aagaggacga cgacatcaac 780

tgttgtgcgg acgacgtctt ctcttcgttt ctgaattcgt tgatcaatga ggatccattt 840

catggacaac accaattgca acaagtactg cagaatggga atgtgagtgc acacgcagct 900

gctgctggtt ccgagaacct ccctttgatt actatgactg gtgctagtac tacggcgcca 960

tcaacatttg gctgggagtc tgctgtgctc atgtcttctg ctttcatcca taatgatcgc 1020

caaagggtta atgatccaac ggagtag 1047

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaggaacc catcgccttc gtcga 25

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctccgttgga tcattaaccc tttggcg 27

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacgataaca gcgtcgtcct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcttcaaac ccacctttgc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacgataaca gcgtcgtcct 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcttcaaac ccacctttgc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agctacatga cgccatttcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccctgtaaag cagcaccttc 20

Claims (5)

1.转录因子PbrMYB5在提高植物VC含量中的应用，所述转录因子PbrMYB5的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.转录因子PbrMYB5在植物抗寒中的应用，所述转录因子PbrMYB5的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物包括梨、烟草。

4.转录因子PbrMYB5的基因在提高植物VC含量中的应用，所述转录因子PbrMYB5的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.转录因子PbrMYB5的基因在植物抗寒中的应用，所述转录因子PbrMYB5的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

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