CN112111499B

CN112111499B - 一种对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7、蛋白、表达载体及其应用

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Publication number: CN112111499B
Application number: CN202011178978.9A
Authority: CN
Inventors: 黄小三; 金玉妍; 陈紫龄; 戴雨沁; 张绍铃; 邢才华; 董慧珍; 王春孟; 马明; 郜艳艳; 王亚茹
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-10-29
Filing date: 2020-10-29
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2040-10-29
Also published as: CN112111499A

Abstract

本发明涉及一种对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7、蛋白、表达载体及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明提供了一种对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7，所述转录因子PbMYB7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7能够提高植物对干旱胁迫的敏感度，通过基因敲除，使所述对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7沉默表达，能够有效地提高植物对于非生物逆境的抗性。

Description

一种对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7、蛋白、表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7、蛋白、表达载体及其应用。

背景技术

众所周知，梨作为世界上最常见的水果之一，因其口味甘甜而广受喜爱，我国属于梨属植物的中心发源区，在国内各地各区均有大规模种植和栽培，我国消费人群对梨品质的要求也越来越高。但由于我国气候条件的多变，使梨树经常遭受缺水、高盐、冻害等不良环境条件带来的负面影响。因此，梨属植物抗逆品种的选择和培育，成为时下植物科学家们非常关心的问题。我国培育品种的主要方式可分为以下几类：传统育种技术，芽诱变和基因工程技术，传统育种技术育种花费时效较长，芽诱变目的并不明确，可能出现不稳定情况。因此基因工程育种作为一个先进的技术流行起来，这种方法既可以打破周期太长的桎梏，又能满足育种家们各项需求，采用这一技术对梨品种的抗逆性加以改良，可更快得到梨的抗逆新植株。

干旱是制约植株正常生长的主要条件之一，水资源匮乏使我国种植业面临减产甚至绝产这一严峻问题。而梨树植物的根系分布面积广而深，导致其对水分有更大的需求。在干旱逆境下，植物叶片组织首先发生变化，尤其是幼叶组织，根系的吸水量远不及蒸腾作用消耗的水分，导致植株的水平衡遭到破坏，同时抑制光合作用的进行，致使植物生长发育迟缓，叶片出现萎蔫甚至干枯致死；生物膜系统受到损伤，植物的抗氧化系统和渗透调节系统也会受到影响，使活性氧含量增加，易产生大量有害物质，代谢通路受损，严重时酶反应停滞，细胞死亡情况增加，乙烯等含量的积累加速了植株的衰老。干旱的影响涉及梨树的整个生命周期，因此梨树抗旱品种的选择、培育和改良研究是本发明需要完成的重要的任务，但目前仍缺乏高效的梨树抗旱品种的基因育种方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7、蛋白、表达载体及其应用。本发明所述对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7能够提高植物对干旱胁迫的敏感度，通过基因敲除，使所述对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7沉默表达，能够有效地提高植物对于非生物逆境的抗性。

本发明提供了一种对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7，所述转录因子PbMYB7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述转录因子PbMYB7编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了扩增上述技术方案所述转录因子PbMYB7的引物对，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述技术方案所述转录因子PbMYB7。

本发明还提供了上述技术方案所述转录因子PbMYB7或上述技术方案所述蛋白或上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述重组表达载体在培育对非生物胁迫表现敏感或抗非生物逆境能力强的转基因植物中的应用。

优选的是，所述植物包括双子叶植物或单子叶植物。

优选的是，所述植物包括烟草或梨。

优选的是，所述非生物胁迫包括干旱；所述非生物逆境包括干旱。

本发明还提供了一种培育干旱敏感型转基因植物的方法，包括以下步骤：将转录因子PbMYB7转入目的植物中进行表达，得到干旱敏感型转基因植物，所述转录因子PbMYB7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种培育耐干旱胁迫的转基因植物的方法，包括以下步骤：敲除或抑制植物中转录因子PbMYB7的表达，所述转录因子PbMYB7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7。本发明将所述对非生物胁迫表现敏感转录因子PbMYB7转入到烟草中，所得的超表达转基因植物就表现出干旱敏感性状，可作为干旱指标的指示植物，预警植物的失水；本发明所提供的PbMYB7基因敲除掉或使PbMYB7基因表达量降低，植物就表现出耐旱性状。本发明的基因(转录因子PbMYB7)对培育耐旱新品种，以及植物对干旱耐受性的研究具有重要意义。试验结果表明：PbMYB7的转录水平在植物受到脱水处理后逐渐降低，表明本发明提供对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7在植物抗旱能力中起到重要作用。本发明将所述对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7转入到烟草中，得到的转基因植物中转录因子PbMYB7过量表达，所得的转基因植物与野生株相比能够有效减弱转基因植株的活性氧清除能力，细胞损伤更大，降低了转基因烟草的抗旱性能；同时将其进行基因沉默，所得的转基因植物与野生株相比能够有效增强转基因植株的活性氧清除能力，细胞损伤更小，提高了转基因株系的抗旱能力。

附图说明

图1为本发明提供的流程示意图；

图2为本发明提供的转录因子PbMYB7在脱水胁迫下的表达示意图；其中，A为脱水处理下转录因子PbMYB7的转录相对表达量；B为低温处理下转录因子PbMYB7转录水平的相对表达量；C为盐胁迫下转录因子PbMYB7转录水平的相对表达量；D为脱落酸处理下转录因子PbMYB7转录水平的相对表达量；

图3为本发明提供的PbMYB7转化烟草及植株再生过程示意图；其中，A是转化后的照片；B是在筛选培养基上生长30d的材料；C是再生芽诱导生根；D是转基因植株移载土里生长30d的照片；E是利用基因特异引物进行PCR鉴定烟草后T0代转基因植株；M：Marker，+：质粒，-：野生型植株，1-6：转基因株系；F，实时定量PCR分析烟草不同转基因株系中的PbMYB7基因的表达量，其中line1至line5表示5个不同的转基因株系，选取TG2，TG4和TG5为超表达系，为后面的抗旱性评估株系；

图4为本发明提供的转PbMYB7基因烟草株系及野生型(WT)盆栽干旱处理前后的表型和生理指标测定图；其中，A是超表达PbMYB7基因烟草株系与WT株系未干旱胁迫的表型图及荧光叶绿素表型图；B是干旱胁迫10d后的表型图及荧光叶绿素表型图；C是复水7d后的表型图片及荧光叶绿素表型图；D是复水7d后的成活率；E是超表达PbMYB7基因烟草株系与WT株系干旱处理后的Fv/Fm；F是整盆烟草干旱处理后的电导率；G是整盆烟草干旱处理后的MDA含量；

图5为本发明提供的转PbMYB7基因单株烟草干旱胁迫下敏感状态；其中，A是三个转基因超表达株系(OE3，OE6和OE17)和WT干旱处理前表型图；B是干旱处理14d后表型图；C是干旱处理14d后丙二醛的含量；D是干旱处理14d后的电导率；E是干旱处理14d后脯氨酸的含量；

图6为本发明提供的病毒诱导的基因沉默PbMYB7在杜梨中表现出较强的耐旱性；其中，A是杜梨PbMYB7基因沉默株系干旱胁迫前表型；B是干旱胁迫16d后的表型图及荧光叶绿素表型图；

图7为本发明提供的pTRV-PbMYB7杜梨植株对干旱胁迫表现出较强的适应性；其中，A是PbMYB7基因沉默株系干旱胁迫后叶绿素表型图；B是PbMYB7基因沉默株系干旱胁迫后叶绿素含量图；C是干旱胁迫16d后的气孔表型图；D是干旱胁迫16d后的气孔导度；E是两组杜梨植株干旱胁迫后的Fv/Fm；F是干旱胁迫16d后的电导率；G是干旱胁迫16d后的MDA含量；

图8为本发明提供的干旱胁迫后，在PbMYB7转基因烟草和基因沉默PbMYB7梨苗中过氧化氢和超氧阴离子的分析；其中，A是转基因烟草和烟草对照脱水90min后的组织化学染色；B是转基因烟草和烟草对照叶片离体脱水70min后的组织化学染色；C是野生型梨苗和pTRV-PbMYB7沉默植物(pTRV-1，pTRV-2和pTRV-3)干旱16d后的组织化学染色；D是干旱14d后MYB7转基因烟草株系的过氧化氢含量；E是干旱14d后MYB7转基因烟草株系的抗超氧阴离子含量；F是干旱16d后基因沉默PbMYB7梨苗的过氧化氢含量；G是干旱16d后基因沉默PbMYB7梨苗的抗超氧阴离子含量；

图9为本发明提供的干旱胁迫后的三种酶活性分析；A-C是60d苗龄的三个超表达PbMYB7基因烟草株系(OE3，OE6和OE17)和WT干旱处理14d后三种酶活性的分析；其中，A是过氧化氢酶(CAT)含量；B是过氧化物酶(POD)含量；C是超氧化物歧化酶(SOD)的含量测定；D-F是45d苗龄的基因沉默PbMYB7杜梨株系(pTRV-1，pTRV-2和pTRV-3)和对照植株干旱处理16d后三种酶活性的分析；其中D是过氧化氢酶(CAT)含量；E是过氧化物酶(POD)含量；F是超氧化物歧化酶(SOD)的含量测定。

具体实施方式

本发明提供了一种对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7，所述转录因子PbMYB7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ATGGCTGCTCCTAGAAACCCTAATGAAGAACATGCGCTCAGAAAAGGGCCATGGACTCTTGAGGAAGACAATCTGCTTATACATTACATCGCGAACCATGGCGAAGGCCATTGGAACTCTTTAGCAAAATTTGCAGGATTGAAGAGGACCGGAAAAAGCTGCAGATTGAGATGGCTAAATTATTTAAAACCCGACATTAAGCGCGGCAACCTTACTCCGCAAGAACAGCTCTTGATCCTTGAACTCCACTCCAAGTGGGGTAACAGGTGGTCTAAAATTGCGCAGCATTTGCCGGGGAGAACAGACAATGAGATAAAGAACTACTGGAGAACGAGGGTGCAAAAACAGGCGCGCCAACTGAACATCGAGTCGAACAGCGTGCAATTTCTCGACGCAGTTCGGGGTTTCTGGATGCCGATTCTGCTGCAAAAGATGAAGCAATCTTCTTGTTCTTCAACCTTGAGCCCTTCTCAGAACTCTGCATCTCCTTCTCTGTCGCCAAATCACACAGTTCCTTCCGTGCCACTCCCAACTTCTCCACCTGGCAATGTGACAAACATGTTTGACAATTATCACATGAGTGGAACTTCCAATCTTGCCACCGTCCCAAGTAATATTCTTTCGTCGGAATCTCTTATTTCACAGGTGCCGCAAATGGCGGAACAGTCGACGAGTTTATACCCTGCATTTGACCACATTGGATACGGCGGCTTAAGTCCAGATGGCAGTTACTATGTGGACAGCAGTAGCTATGACATGGAGGGTCTCAACCTGGACCCTGTTTCGGGAATGGGCAATTATGACAATTCACAGTTTGATTGCCAGATGGTAGGAAATGATTGGATGTTGGACACCATCACTGACAATTTATGGAACATGGACGGGATGTGA。本发明从杜梨中筛选到一种对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7。本发明提供的抗非生物逆境转录因子PbMYB7在植物干旱胁迫中起负调控作用，在多种非生物逆境对抗中具有重要作用。

本发明还提供了上述技术方案所述转录因子PbMYB7编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：MAAPRNPNEEHALRKGPWTLEEDNLLIHYIANHGEGHWNSLAKFAGLKRTGKSCRLRWLNYLKPDIKRGNLTPQEQLLILELHSKWGNRWSKIAQHLPGRTDNEIKNYWRTRVQKQARQLNIESNSVQFLDAVRGFWMPILLQKMKQSSCSSTLSPSQNSASPSLSPNHTVPSVPLPTSPPGNVTNMFDNYHMSGTSNLATVPSNILSSESLISQVPQMAEQSTSLYPAFDHIGYGGLSPDGSYYVDSSSYDMEGLNLDPVSGMGNYDNSQFDCQMVGNDWMLDTITDNLWNMDG。本发明所述蛋白属于核蛋白。

本发明还提供了扩增上述技术方案所述转录因子PbMYB7的引物对，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’-ACTGGAGAACGAGGGTGC-3’，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.4所示：5’-ATTACTTGGGACGGTGGC-3’。

本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述技术方案所述转录因子PbMYB7。本发明对所述重组表达载体的构建方法没有特殊限定，采用常规方法，以表达载体为基础，在表达载体的多克隆位点插入上述技术方案所述对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7，即可构建得到。

本发明还提供了上述技术方案所述转录因子PbMYB7或上述技术方案所述蛋白或上述技术方案所述引物对或上述技术方案所述重组表达载体在培育对非生物胁迫表现敏感或抗非生物逆境能力强的转基因植物中的应用。在本发明中，所述植物包括双子叶植物或单子叶植物。在本发明中，所述植物包括烟草或梨，所述梨更优选为杜梨。在本发明中，所述非生物胁迫包括干旱；所述非生物逆境包括干旱。

本发明还提供了一种培育干旱敏感型转基因植物的方法，包括以下步骤：将转录因子PbMYB7转入目的植物中进行表达，得到干旱敏感型转基因植物，所述转录因子PbMYB7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明优选通过上述技术方案所述重组表达载体，将转录因子PbMYB7转入目的植物中。在本发明中，所述植物包括双子叶植物或单子叶植物。在本发明中，所述植物优选为烟草。具体的，本发明优选通过构建PbMYB7基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将PbMYB7基因导入植株中。

本发明还提供了一种培育耐干旱胁迫的转基因植物的方法，包括以下步骤：敲除或抑制植物中转录因子PbMYB7的表达，所述转录因子PbMYB7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述方法能够得到耐干旱胁迫性高于敲除或抑制前植物的转基因植物。在本发明中，所述植物包括双子叶植物或单子叶植物。在本发明中，所述植物优选为梨，更优选为杜梨。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7、蛋白、表达载体及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

PbMYB7基因克隆及超表达载体构建

1、RNA提取

研究材料杜梨种植在南京农业大学梨工程中心，其苗龄为60d。挑选生长势健壮的杜梨幼苗，随机称取0.1g样品，迅速用液氮进行速冻。RNA的提取采用索来宝公司的总RNA提取试剂盒，具体方法如下：

(1)样品处理：取新鲜或－80℃冻存0.1g组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀，得到匀浆样品；

(2)将处理后的样品在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；

(3)向室温放置后的匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3到5min，得到混悬液；

(4)将混悬液在2到8℃、12000rpm的条件下离心10min，RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀，得到上清液；

(5)吸附柱前处理：在吸附柱中加入500μL洗柱液，室温放置2min，2到8℃，12000rpm离心2min，弃废液；

(6)第4步收集的上清液中加入200μL无水乙醇混匀，加入吸附柱并静置2min，12000rpm离心2min，弃废液；

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心2min，弃废液；

(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液，2到8℃，12000rpm离心2min，弃废液；

(9)12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置数min将吸附柱中残余的漂洗液去除；

(10)将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50到100μL的RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm室温离心2min即得到杜梨RNA。

将提取到的杜梨RNA立即于－80℃超低温冰箱中保存以备用。取1～2μL杜梨RNA用于琼脂糖凝胶电泳，用Nano-drop仪进行检测，检测其浓度为300ng/μL。

2、基因扩增

取1μg杜梨RNA经1U的DNase I 37℃处理30min后立即放入冰上，加入1μL 50mMEDTA，65℃水浴10min后立即置于冰上。cDNA第一链的合成参照TOYOBO反转录试剂盒操作手册进行，将提取得到的杜梨RNA反转录为cDNA。所得的第一链cDNA用于PbMYB7基因的扩增。

所述PCR扩增体系为：1μL模板cDNA、5μL PCRbuffer、1μL dNTP Mix(10mmol/L)、正向引物和反向引物各1μL、0.5μL Taq DNA聚合酶(5U)和10.5μL无核酶水。

PCR按以下程序完成：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。

3、超表达载体构建

凝胶回收选用AxyPrep DNA试剂盒对扩增产物进行回收。然后把纯化的DNA片段和中间载体(pEASY，TransGen,北京)进行连接，采用热击法将连接产物转化到大肠杆菌感受态DH5α中，采用北京全式金生物技术有限公司生产的大肠感受态，以目的基因序列引物进行PCR验证并测序(由南京诺唯赞生物科技集团完成)。超表达载体双酶切体系见表1，连接体系见表2。

表1双酶切体系

表2连接体系

将测序结果正确的大肠杆菌，用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂(Axygen，USA)盒提取质粒，质粒命名为PMV-PbMYB7。将构建好的测序正确的PMV-PbMYB7重组载体采用冻融法转入农杆菌感受态细胞(GV3101)备用。

实施例2

不同逆境条件处理下转录因子PbMYB7的qRT-PCR分析

为了分析杜梨中PbMYB7基因对脱水(图2中的A)、低温(图2中的B)、盐(图2中的C)和脱落酸(图2中的D)的响应模式，使用Real-time PCR技术对PbMYB7基因的表达模式进行分析。

采用试剂盒法提取RNA(RNA提取方法参照实施例1)。cDNA第一链的合成参照北京全式金生物技术有限公司的TOYOBO反转录试剂盒的操作手册进行。

定量PCR检测时，在20μL的反应体系中有：10μL 2×Mix，0.1μL cDNA，5μL引物(以ubiqutin为内参引物，长度为208bp)，4.9μL水。

定量PCR的程序如表3所示。

表3定量PCR程序

处理过程如下：

从基质中挖出完整的杜梨幼苗，用蒸馏水将根部清洗干净，使用洁净的滤纸吸干多余水分，以保持幼苗根的完整性，将其放入装有蒸馏水的洁净培养瓶中，置于25℃培养室中预培养24小时。将预培养后的杜梨幼苗分别进行脱水、低温、盐和脱落酸(ABA)处理。每个因素处理时，最少选用20株梨苗，采集叶片的方法为随机混合采样，采完样品后，标记，并快速放入液氮中进行速冻，所采样品均保存在-80℃超低温冰箱。

脱水处理：将杜梨幼苗根部水吸干后，置于洁净的滤纸上分别进行脱水处理，取样时间分别为0h、1h、1.5h、6h、9h、12h、24h；

低温处理：将预培养后的杜梨材料同组培瓶一起直接放入4℃培养室内进行低温处理，取样时间分别是0h、1h、6h、12h、24h、48h；

盐处理：将预培养后的杜梨幼苗放入200mM/L的氯化钠溶液中，取样时间分别为0h、2h、6h、8h、12h、24h；盐采用南京于寿德生物科技有限公司购买的固体氯化钠颗粒，规格：AR500g，相对分子量为58.44。

ABA处理：将预培养后的杜梨幼苗放入200uM的ABA溶液中，取样时间分别为0h、1h、6h、12h、24h、48h。

为确定PbMYB7基因在逆境胁迫中的应答程度，选用荧光定量PCR检测其表达情况。如图2中的A所示，脱水处理可诱导PbMYB7基因的表达，其表达量随处理时间的延后而下降，说明PbMYB7基因对脱水应答较敏感；4℃低温处理植株时(图2中的B)，表达量呈现高-低-高趋势，说明PbMYB7基因对低温的响应并不强烈；NaCl处理植株时(图2中的C)，在8h迅速增高至峰值，12h后迅速下降，说明PbMYB7基因对盐胁迫响应强烈；ABA处理后PbMYB7基因的表达量随时间的延后而逐步降低，表明ABA诱导PbMYB7基因的表达(图2中的D)。

可以看出，本发明所述的PbMYB7基因可以在多种非生物胁迫中发挥作用，对于提高植物抗旱能力、抗盐能力以及脱落酸敏感性有显著影响。

实施例3

烟草的遗传转化及阳性鉴定

(1)菌株准备：从-80℃取出保存好的转入过PMV-PbMYB7载体的农杆菌，用枪头吸取少量农杆菌液，置于不含抗生素的MS液体培养基中，28℃，220rpm培养至OD₆₀₀值到0.6～0.8以备侵染用；

(2)外植体准备：选取长势良好的无菌烟草，取最大的2～3片叶片，去掉主脉及叶边缘，切成0.5cm²左右的方块，放入无菌且加有少量MS液体培养基的三角瓶中，供侵染用；

(3)侵染及共培养：将第一步中培养好的菌液倒入装有外植体的三角瓶中，侵染10min，侵染过程中不断轻摇。侵染后，用灭菌的滤纸吸干外植体带有的菌液，叶背面向下，放于铺有无菌滤纸的共生培养基(MS+2.25mg/L6-BA+0.3mg/LNAA)上，侵染后的烟草叶片如图3中的A所示，后将其在培养室中暗培养2～3d；

(4)筛选培养：共培养后的全部外植体收集放入无菌的三角瓶中，加入含400mg/LCef的无菌水清洗2～3次，然后再用无菌水清洗2～3次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面的水，置于筛选培养基(MS+400mg/L Cef+100mg/L Km+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA)上培养，如图3中的B所示为在筛选培养基上生长30d的材料。

(5)生根培养：将长至1-2cm的抗性芽切下来，置于MS+400mg/L培养基中生根培养如图3中的C所示。

上述培养基中均含有3.0％蔗糖和0.8％琼脂，且pH值调至5.9～6.0。培养基高温高压灭菌后，待其冷却至60℃以下时，加入已过滤灭菌的抗生素，分装备用。

当抗性芽生根后，将其从生根培养基中取出并栽植于已灭菌的营养土中，如图3中的D所示，并取少量叶片进行DNA提取，DNA提取步骤如下：

(1)取3～4片幼嫩叶片放进2.0mL离心管中，管内加入2粒氧化锆珠，放入加了一勺液氮的冰盒内，剧烈摇晃7-8min，肉眼识别呈粉末状即可。然后加入450μL 37℃预温的DNA提取缓冲液十六烷基三乙基溴化铵(简称CTAB)提取液配制方法见表4；

(2)60℃温水浴30～40min，期间颠倒混匀一次；冷却后加400μL氯仿，颠倒混匀，10000rpm离心10min；

(3)转移上清至新的1.5mL离心管内；加等体积异丙醇，混匀后高速离心10min；

(4)小心弃掉上清，加700μL 70％的无水乙醇清洗管内沉淀，清洗过后倒掉无水乙醇，空管离心1min，可用白色10μL枪头吸去多余无水乙醇，等待干燥；

(5)每管加入20-30μLddH₂O溶解DNA，溶解好的DNA保存-20℃冰箱。

浓度检测，每个样品取1μL，于NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo，USA)测量，其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.8～2.0范围内时，DNA纯度较高。同时也通过凝胶电泳检测。

表4 CTAB提取液配方

利用鉴定引物，通过PCR从64株转基因T0代大叶烟草苗中，鉴定获得了21株阳性苗(结果见图3中的E)。提取移栽成活的21株转基因阳性苗的RNA，通过跑胶检测其结构完整，利用Nanodrop测定其浓度后(浓度均在200～600ng/μL)，将RNA总量调整为3μg后进行反转录成cDNA，再用烟草的Ubiqutin作为内参进行扩增。

Ubiqutin引物核苷酸序列为：

Ubiqutin正向引物：5’-AGCTACATGACGCCATTTCC-3’(SEQ ID NO.5)；

Ubiqutin反向引物：5’-CCCTGTAAAGCAGCACCTTC-3’(SEQ ID NO.6)；

用Ubiqutin扩增出来的条带亮度均一致，说明反转录的cDNA浓度相同，后再用PbMYB7特异引物作为模板扩增目的条带，PbMYB7引物核苷酸序列为：

PbMYB7正向引物：5’-ACTGGAGAACGAGGGTGC-3’(SEQ ID NO.3)；

PbMYB7反向引物：5’-ATTACTTGGGACGGTGGC-3’(SEQ ID NO.4)。

如图3中的F所示，根据PbMYB7特异引物扩增出来的目的条带的亮度大小，可以判断PbMYB7基因在阳性转基因烟草中的表达量，选择其中亮度高的Line2，Line4和Line5，即表达量高的三个超表达株系命名OE3，OE6和OE17作为单独的转基因株系，然后分别作为收种子的母本植株。

实施例4

PbMYB7抗旱性分析

为了验证超表达PbMYB7基因烟草与干旱胁迫之间的关系，将对照系和转基因系进行短时间的干旱胁迫和长期的干旱逆境处理，把已收获种子三个的PbMYB7转基因烟草株系(OE3，OE6和OE17)种子以及未转化的野生型种子消毒后，种在50mg/L Hyg MS培养基和无抗性的培养基中生长，之后移栽入营养钵中(蛭石:营养土＝1:1)进行培养。取每个系20d大的整盆幼苗放在室温下干旱处理20d后，观察其表型，并分别测其组织中过氧化氢含量，抗超氧阴离子含量以及丙二醛含量，从而分析其细胞中活性氧的残留量。

H₂O₂含量的测定：(1)使用南京建成公司的试剂盒，操作步骤如表5所示。盖上盖，涡旋仪震荡混匀，于室温，3000～3500rpm/min，离心5min，准确吸取0.20mL各管反应液，用移液枪准确地加入到新的96孔酶标板中，使用酶标仪于波长405nm，光径1cm处，测定各孔吸光度值。(2)组织中H2O2含量(mmol/gprot＝(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值*标准品浓度(163mmol/L)/待测样本蛋白浓度(gprot/L)；

抗超氧阴离子自由基活性的测定：(1)使用南京建成公司的试剂盒，操作步骤如表6所示。操作完成后用涡旋仪震荡混匀，于室温下静置反应10min，用移液枪吸取200μL各管反应液，将其加入到洁净的96孔酶标板中，于波长550nm处，用酶标仪测定各孔吸光度值。(2)组织中抗超氧阴离子活力单位(U/gprot)＝(对照OD值-测定OD值)/(对照OD值-标准OD值)*标准品浓度(0.15mg/ml)*1000ml/待测样本蛋白浓度(gprot/L)

MDA含量的测定：(1)使用南京建成公司的试剂盒，操作步骤如表7所示。操作完成后，于涡旋仪震荡混匀，在95℃以上沸水浴20min，反应完成后，取出，用流水冲洗冷却至室温，准确吸取各管0.25mL反应液转移至新的96孔酶标板中，使用酶标仪在520nm下测定各孔吸光度值(计算时要减去空板读数)。(2)MDA含量(nmol/g)＝(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值*标准品浓度(10nmol/ml)/样本浓度(g/ml)，注：样本浓度＝植物组织重(g)/所加提取液的量(ml)

表5 H₂O₂含量的测定操作步骤

表6抗O^2-活力测定操作步骤

表7 MDA含量的测定操作步骤

在转基因烟草株系中，较高的电导率和低成活率表明他们可能比WT抗ROS的能力更弱。那么通过鉴定植株中ROS的积累量便成为必要。将材料在室温下干旱处理后，观察其表型、取样，并分别测其组织中过氧化氢含量﹑抗超氧阴离子含量以及丙二醛含量，从而分析其细胞中活性氧的残留量。

经过在干旱胁迫条件下，对三个转基因烟草超表达株系和WT的初步检验发现，三个转基因超表达株系对干旱胁迫的忍耐能力较野生型烟草低，也说明了3个转基因超表达系对干旱表现更为敏感。本实验挑选60d苗龄，长势一致的健壮转基因超表达株系与WT进行对比，先移栽入0.7×0.7cm²黑色花盆中恢复7d后，拍照记录(图5中的A)，然后干旱胁迫处理，处理14d后，其表型明显(图5中的B)，采集叶片样品，用以测定电导率、丙二醛含量以及脯氨酸含量。

通过大叶烟草单株苗进行干旱处理的表型图可以看出，受到干旱胁迫后，三个转基因超表达株系(OE3，OE6和OE17)对干旱表现更为敏感，根据整理出的数据可以显示出，在干旱处理14d后，WT的MDA含量(图5中的C)显著地低于三个转基因超表达株系(OE3，OE6和OE17)，WT丙二醛含量是三个转基因系2倍多，说明了三个转基因超表达株系叶片细胞内累积的的氧化物质丙二醛在受到干旱胁迫后明显升高；其电导率显著地高于WT(图5中的D)，是WT的3倍多；并且数据表明三个转基因超表达株系(OE3，OE6和OE17)的脯氨酸含量(图5中的E)与野生烟草WT有较明显的差异。

通过整盆烟草植株干旱胁迫后的表型和数据显示，在干旱处理10d之后，三个转基因超表达株系(OE3，OE6和OE17)的叶片比WT的萎蔫程度更厉害(图4中的A-B)；三个转基因超表达系(OE3，OE6和OE17)的光合效率相较于野生型大叶烟草(WT)的而言更低(图4中的C)；三个转基因超表达系(OE3，OE6和OE17)的植株成活率和植株的光合效率(Fv/Fm)均呈明显下降趋势(图4中的D-E)；而三个转基因超表达株系的电导率及MDA含量是WT的2倍多(图4中的F-G)；日光培养室复水7d后，三个转基因超表达系(OE3，OE6和OE17)比WT成活率更低(图4中的D)，生长势更弱。说明同等条件胁迫下，转基因超表达株系的健康状态更弱，其恢复能力也更差。

实施例5

转录因子PbMYB7在提高杜梨抗旱性中的应用

1、瞬时转化转录因子PbMYB7的杜梨株系的制备，具体方法如下：选取在人工气候室中生长5周左右的杜梨(Pyrus ussuriensis)用于农杆菌侵染。

(1)于LB培养基(50mg/L卡那霉素+100mg/L利福平+50mg/L庆大霉素)划线培养带有目的质粒的GV3101农杆菌，挑取农杆菌克隆于5mL LB培养基中28℃培养过夜。

(2)测定农杆菌菌液OD600值之后，3000rpm离心10min收集菌液，弃上清。用乙酰丁香酮(acetosyringone)溶液[10mM MES(pH 5.6)+10mM MgCl 2+200uM acetosyringone]悬浮，调整至OD₆₀₀为0.8～1.0，室温静置3h。

(3)将含有目的质粒的农杆菌用于杜梨叶片的注射。

(4)用1ml注射器(去掉针头)，在梨叶片背面注射，每株杜梨苗选择三片叶子注射即可，标记好注射过的叶片。

(5)将注射过的梨植株在室温下避光2～3d后放回人工气候室培养，观察瞬时转化的结果。

2、PbMYB7基因沉默杜梨干旱胁迫下的抗性分析

为了进一步验证PbMYB7基因具有负调控植物生长的作用，采用经过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)，以此抑制杜梨中的PbMYB7的表达，从而增强植株的抗旱功能。

选取45d苗龄的转基因沉默株系和用空载转化的野生型杜梨共12株，分为两组进行干旱胁迫处理，从而判断出PbMYB7沉默基因在干旱胁迫下的耐旱能力。实验结果显示，在干旱胁迫前，两组植株长势并无明显差别(图6中的A)；但在干旱胁迫16d后，相对于使用空载体转化的对照植物(WT)而言，转基因沉默株系(pTRV-1，pTRV-2和pTRV-3)对干旱的忍耐能力更强(图6中的B)；通过干旱胁迫后的荧光叶绿素表型图亦能看出，pTRV-PbMYB7植物胁迫后受到的伤害更小。

通过整理得到的数据结果可以表明，转基因沉默株系在干旱胁迫后对干旱的抵抗能力显著提高。通过叶绿素和荧光叶绿素的测定，可以发现，转基因沉默株系(pTRV-1，pTRV-2和pTRV-3)受干旱胁迫后，其叶绿素表型颜色呈深绿色，而对照植株(WT)呈浅绿色(图7中的A)；通过95％浓度的无水乙醇研磨后的叶绿素含量和荧光叶绿素成像仪测定数据呈相同的趋势，即转基因沉默株系(pTRV-1，pTRV-2和pTRV-3)的含量均比WT高(图7中的B，E)；为观察转基因沉默植物和对照植株(WT)保水性的高低，将两组植株干旱胁迫后的叶片气孔置于显微镜下观察，结果显示，WT植株气孔的开合度显著地大于基因沉默PbMYB7杜梨株系，说明了对比下的转基因沉默株系叶片的自我保护能力更强(图7中的C-D)；而转基因沉默株系的电导率显著低于对照植物(图7中的F)；干旱处理16d后，野生型植物(WT)相较于转基因沉默杜梨株系显现出更高的丙二醛(MDA)含量，是基因沉默株系的3倍多(图7中的G)。

3、组织中活性氧残留量测定与分析

(1)转基因烟草的ROS含量分析

对转基因烟草和基因沉默杜梨进行DAB(二氨基联苯胺)和NBT(硝基蓝四唑)染色，用以表现植物叶片脱水和干旱胁迫后的活性氧(H₂O₂和O^2-)的剩余情况。结果显示，超表达PbMYB7基因烟草系(OE3，OE6和OE17)的颜色均比WT深(图8中的A)；在另一组试验中，选取30d苗龄的超表达PbMYB7基因烟草系(OE3，OE6和OE17)与野生型烟草植株的叶片进行离体脱水70min，发现野生型烟草叶片仅有轻微染色，而转基因株系叶片大面积被染上色(图8中的B)。

为了验证染色结果的可靠性，采用试剂盒法对干旱处理14d后的超表达PbMYB7基因烟草系(OE3，OE6和OE17)和野生型烟草进行检测，以测定其过氧化氢含量与抗超氧阴离子含量。结果显示，转基因烟草系中过氧化氢的含量约为WT的一倍；因此可以推断出，在干旱胁迫下，超表达PbMYB7基因烟草系细胞组织中的氧化产物(H₂O₂)在增加，致使细胞组织受到更加严重的损害(图8中的D)；而超表达PbMYB7基因烟草系中的抗超氧阴离子含量明显比WT低，这也进一步说明其植株体内的有毒氧化物不能及时消除，导致植株易受到更大程度的伤害(图8中的E)；转基因株系在干旱条件下积累较多的活性氧，使植株的抵抗能力显著下降。

(2)基因沉默杜梨的ROS含量分析

对基因沉默PbMYB7杜梨植物(pTRV-1，pTRV-2和pTRV-3)和注射空载的对照梨苗(WT)染色和ROS测定后，其结果与烟草相反。主要表现为染色后WT呈较深的颜色(图8中的C)；基因沉默PbMYB7杜梨株系的过氧化氢的累积量显著下降，降低了其组织内有毒物质的积累(图8中的F)；其抗超氧阴离子含量呈显著上升趋势，表明其对有毒氧化产物的清除能力增强(图8中的G)；进一步验证了MYB7基因在干旱胁迫下的植物组织中呈下调作用，致使植株受到严重损害。

4、转基因烟草和基因沉默杜梨抗氧化酶的测定

抗氧化酶在活性氧的清除中起不可忽视的作用，本发明对在干旱处理条件下的野生型和转基因株系中三种重要酶(超氧化物歧化酶，过氧化氢酶和过氧化物酶)的活性进行测定。

干旱胁迫14d后，三个超表达PbMYB7基因烟草株系(OE3，OE6和OE17)的CAT酶活性低于WT近一倍(图9中的A)；三个超表达PbMYB7基因超表达烟草株系(OE3，OE6和OE17)的POD酶活性低于WT 2.5倍左右(图9中的B)；三个超表达PbMYB7基因超表达烟草株系(OE3，OE6和OE17)的SOD酶活性低于WT 3倍多(图9中的C)。得出在干旱胁迫条件下，超表达PbMYB7基因烟草株系(OE3，OE6和OE17)与WT烟草植株相比，其三种酶活性有显著地下降趋势。

干旱胁迫16d后，基因沉默PbMYB7杜梨植物(pTRV-1，pTRV-2和pTRV-3)的CAT酶活性显著地高于注射空载的WT植株的酶活性，其CAT酶活性是WT的2～3倍(图9中的D)；基因沉默PbMYB7杜梨株系的POD酶活性与对照杜梨植株存在十分明显的差异(图9中的E)；基因沉默PbMYB7杜梨株系的SOD酶活性显著地高于WT植株，约是WT植株的2倍(图9中的F)。得出，基因沉默PbMYB7杜梨株系(pTRV-1，pTRV-2和pTRV-3)在进行干旱胁迫后，其三种酶的活性均高于对照植株，说明PbMYB7基因沉默下的杜梨植株增强了其植物组织内酶的活性，进而减轻了由缺水胁迫而引起的植株损害。

由上述实施例可知，本发明提供的转录因子PbMYB7参与了植物非生物胁迫中干旱胁迫的研究，并起着重要的负调控作用，在育种研究过程中可利用一切手段使其沉默，从而提高其抗逆水平。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种对非生物胁迫表现敏感的转录因子PbMYB7、蛋白、表达载体及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctgctc ctagaaaccc taatgaagaa catgcgctca gaaaagggcc atggactctt 60

gaggaagaca atctgcttat acattacatc gcgaaccatg gcgaaggcca ttggaactct 120

ttagcaaaat ttgcaggatt gaagaggacc ggaaaaagct gcagattgag atggctaaat 180

tatttaaaac ccgacattaa gcgcggcaac cttactccgc aagaacagct cttgatcctt 240

gaactccact ccaagtgggg taacaggtgg tctaaaattg cgcagcattt gccggggaga 300

acagacaatg agataaagaa ctactggaga acgagggtgc aaaaacaggc gcgccaactg 360

aacatcgagt cgaacagcgt gcaatttctc gacgcagttc ggggtttctg gatgccgatt 420

ctgctgcaaa agatgaagca atcttcttgt tcttcaacct tgagcccttc tcagaactct 480

gcatctcctt ctctgtcgcc aaatcacaca gttccttccg tgccactccc aacttctcca 540

cctggcaatg tgacaaacat gtttgacaat tatcacatga gtggaacttc caatcttgcc 600

accgtcccaa gtaatattct ttcgtcggaa tctcttattt cacaggtgcc gcaaatggcg 660

gaacagtcga cgagtttata ccctgcattt gaccacattg gatacggcgg cttaagtcca 720

gatggcagtt actatgtgga cagcagtagc tatgacatgg agggtctcaa cctggaccct 780

gtttcgggaa tgggcaatta tgacaattca cagtttgatt gccagatggt aggaaatgat 840

tggatgttgg acaccatcac tgacaattta tggaacatgg acgggatgtg a 891

<210> 2

<211> 295

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ala Pro Arg Asn Pro Asn Glu Glu His Ala Leu Arg Lys Gly

1 5 10 15

Pro Trp Thr Leu Glu Glu Asp Asn Leu Leu Ile His Tyr Ile Ala Asn

20 25 30

His Gly Glu Gly His Trp Asn Ser Leu Ala Lys Phe Ala Gly Leu Lys

35 40 45

Arg Thr Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Lys Pro

50 55 60

Asp Ile Lys Arg Gly Asn Leu Thr Pro Gln Glu Gln Leu Leu Ile Leu

65 70 75 80

Glu Leu His Ser Lys Trp Gly Asn Arg Trp Ser Lys Ile Ala Gln His

85 90 95

Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Arg Thr Arg

100 105 110

Val Gln Lys Gln Ala Arg Gln Leu Asn Ile Glu Ser Asn Ser Val Gln

115 120 125

Phe Leu Asp Ala Val Arg Gly Phe Trp Met Pro Ile Leu Leu Gln Lys

130 135 140

Met Lys Gln Ser Ser Cys Ser Ser Thr Leu Ser Pro Ser Gln Asn Ser

145 150 155 160

Ala Ser Pro Ser Leu Ser Pro Asn His Thr Val Pro Ser Val Pro Leu

165 170 175

Pro Thr Ser Pro Pro Gly Asn Val Thr Asn Met Phe Asp Asn Tyr His

180 185 190

Met Ser Gly Thr Ser Asn Leu Ala Thr Val Pro Ser Asn Ile Leu Ser

195 200 205

Ser Glu Ser Leu Ile Ser Gln Val Pro Gln Met Ala Glu Gln Ser Thr

210 215 220

Ser Leu Tyr Pro Ala Phe Asp His Ile Gly Tyr Gly Gly Leu Ser Pro

225 230 235 240

Asp Gly Ser Tyr Tyr Val Asp Ser Ser Ser Tyr Asp Met Glu Gly Leu

245 250 255

Asn Leu Asp Pro Val Ser Gly Met Gly Asn Tyr Asp Asn Ser Gln Phe

260 265 270

Asp Cys Gln Met Val Gly Asn Asp Trp Met Leu Asp Thr Ile Thr Asp

275 280 285

Asn Leu Trp Asn Met Asp Gly

290 295

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actggagaac gagggtgc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attacttggg acggtggc 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agctacatga cgccatttcc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccctgtaaag cagcaccttc 20

Claims

1.一种培育干旱敏感型转基因植物的方法，包括以下步骤：将转录因子PbMYB7转入目的植物中进行表达，得到干旱敏感型转基因植物，所述转录因子PbMYB7的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种培育耐干旱胁迫的转基因植物的方法，包括以下步骤：敲除或抑制植物中转录因子PbMYB7的表达，所述转录因子PbMYB7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。