CN111961672A - 水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15的克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高水稻对耐受盐胁迫基因OsDnaJ15，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；一种植物表达载体，它插入了所述的水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15；所述的水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15在提高水稻对盐胁迫耐受能力方面的应用。本发明通过农杆菌介导的转化方法，将OsDnaJ15过表达载体成功转化水稻，获得了纯合的T2代转基因水稻植株；发现在盐胁迫条件下，OsDnaJ15过表达植株OsDnaJ15OX‑1、OsDnaJ15OX‑2和OsDnaJ15OX‑3的存活率显著高于野生型Kitaake的存活率，说明水稻中的基因OsDnaJ15能够提高水稻对盐胁迫的耐受性。

Description

水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15的克隆及应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学与植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15的克隆及应用。

背景技术

土地盐渍化严重制约农业可持续发展。盐胁迫被认为是主要的非生物胁迫之一，对作物的生长和发育以及作物的产量和产品质量均产生重大不利影响。全世界范围内有超过 9亿公顷的盐渍土地，中国盐碱地分布在东北、华北、西北及海滨地区在内的17个省区，影响耕地的盐碱总面积超过5亿亩，其中具有农业发展潜力的盐碱地占耕地总面积的10%以上。水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，养活了世界一半以上的人口，水稻的生产对全球粮食安全具有重要的意义。在实际农业生产过程中，盐胁迫导致剑叶光合作用下降以及穗中积累的离子毒害导致减产高达11%。面对人口数目不断增长，可使用的耕地面积有限，土地的不合理灌溉利用使土壤次生盐渍化现象日益严重和水稻产量很难显著提高等实际生产问题，开发利用好沿海滩涂以及内陆的盐碱地资源是保障耕地面积的有效途径之一。水稻是中度盐敏感作物，生长在水环境中，种植水稻可以对土壤的可溶性盐碱起到淋溶的作用。因此，水稻是开发沿海滩涂和盐碱地的首选粮食作物。

通过遗传改良提高水稻耐盐能力是提高水稻种植面积和产量的有效途径之一。目前在育种上利用的耐盐QTL主要是位于水稻第1号染色体上的qSKC-1和Saltol两个位点。随着分子生物技术的发展，利用突变体来分离和挖掘水稻的耐盐胁迫基因，并且用于水稻基因工程进行辅助育种和耐盐胁迫改良对有效控制盐胁迫对水稻的危害、提高水稻产量和改良水稻品质具有极其重要的意义。DnaJ蛋白家族（也称为J蛋白或Hsp40）是一类保守的辅分子伴侣蛋白家族，典型结构为约70个氨基酸的、高度保守的J结构域或类J结构域，在植物中，DnaJ蛋白家族参与逆境胁迫应答反应、开花及生殖过程。过去30多年来，在植物非生物胁迫条件下，对DnaJ蛋白的研究大部分都聚焦在DnaJ与Hsp70稳定结合后调控植物体内活性氧（ROS）的含量以及蛋白稳定性从而应对热胁迫的研究。并且，这些研究大部分是在模式植物拟南芥上进行的，但还未见利用基因OsDnaJ15提高水稻抗盐性的报道。

发明内容

本发明目的是为解决土壤次生盐渍化现象日益严重、水稻产量很难显著提高的问题，而提供一种水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15的克隆及应用。

一种水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

一种植物表达载体，它插入了所述的水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15。

所述的水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15在提高水稻对盐胁迫耐受能力方面的应用。

本发明提供了一种水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示；一种植物表达载体，它插入了所述的水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15；所述的水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15在提高水稻对盐胁迫耐受能力方面的应用。本发明通过农杆菌介导的转化方法，将OsDnaJ15过表达载体成功转化水稻，获得了纯合的T2代转基因水稻植株；发现在盐胁迫条件下，OsDnaJ15过表达植株OsDnaJ15OX-1、OsDnaJ15OX-2和OsDnaJ15OX-3的存活率显著高于野生型Kitaake的存活率，说明水稻中的基因OsDnaJ15能够提高水稻对盐胁迫的耐受性。

附图说明

图1 遗传转化载体pCsV1300的结构示意图；

图2 转基因水稻植株与野生型Kitaake中水稻耐盐胁迫相关基因OsDnaJ15 表达量检测结果示意图；

图3 转基因水稻植株与野生型Kitaake盐胁迫处理后的表型示意图；

图4 转基因水稻植株与野生型Kitaake盐胁迫处理后的存活率统计示意图。

具体实施方式

实施例1 水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15的克隆

前期研究发现：利用水稻基因激活标签突变体库（activation-tagging pool；Oryza sativa L. var Kitaake背景）进行盐胁迫筛选，从中筛选到了一个对盐胁迫敏感的突变体L16，其存活率显著低于野生型Kitaake。通过交错式热不对称 PCR（thermal asymmetricinterlaced polymerase train reaction，简称TAIL-PCR）的方法，确定了T-DNA插入到基因OsDnaJ15（OsKitaake01g184800）的第1个内含子中，通过RT-PCR的方法没有检测到OsDnaJ15的转录本，说明T-DNA的插入影响了OsDnaJ15的正常转录，因此，L16是OsDnaJ15的缺失性突变体，由于OsDnaJ15的突变导致L16对盐胁迫耐受性下降，说明OsDnaJ15在水稻盐胁迫应答过程中起到积极的作用。在数据库Phytozome 12（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中，我们查找到OsDnaJ15基因全长cDNA序列；OsDnaJ15基因开放阅读框（ORF）核苷酸序列长度为1212 bp，编码一种由403个氨基酸组成的蛋白。

1、RNA的提取

利用TRIzol Reagent（Invitrogen, USA）提取水稻叶片的总RNA。

1）将水稻品种水稻Kitaake（Oryza sativa L. var Kitaake）于人工气候室（200μM photons m^-2s^-1光强；14 h/10 h光周期；25℃温度；60%相对湿度），培养至三叶一心期，取水稻叶片，放入装有2粒磁珠的2 ml管中，置于液氮中；

2）使用组织破碎仪进行磨样，磨样所需的适配器需放入液氮中提前进行预冷，将装有样品的管子装入适配器中，上机，频率为1400 rpm/s，磨样时间一般为90 s，将样品磨至粉末；

3）向样品管中加入1ml TRIzol Reagent提取液，使用涡旋仪将样品和提取液迅速混匀；

4）将裂解液放置15-25℃条件下10 min，以保证样品被充分裂解，同时用磁铁将磁珠吸出；

5）移至台式高速离心机，12,000 ×g 4℃离心10 min；

6）吸取上清液至新的1.5 ml管中，每个样品中加入0.2 ml的氯仿；盖紧盖子，使用涡旋仪充分震荡每个样品30 s，15-25℃静置2-15 min；

7）在2-8℃条件下，12,000×g离心15 min；

8）离心后会产生3个分层，将最上层无色液体转移到新的离心管中；

9）每个样品中加入500 ml的异丙醇，上下颠倒，充分混匀。在15-25℃放置5-10 min，使RNA充分沉淀；

10）在2-8℃条件下，12,000×g离心10 min，去除上清；

11）加入1 ml用DEPC水配制的75%乙醇，上下颠倒充分漂洗RNA沉淀；

12）在2-8℃条件下，7500×g离心5 min，去除上清；

13）在2-8℃条件下，7500×g离心短暂离心，用枪将多余的乙醇吸走，在空气中干燥5-10 min（不能太干，否则不易溶解）；

14）加入30 μl DEPC处理水，将RNA充分溶解；

15）用NanoDrop2000测定各样品浓度，A260/A280值在2.0-2.2为合格。取2 μl RNA进行琼脂糖凝胶电泳进行检测；样品保存于-80℃超低温冰箱，待用。

2、cDNA的合成

取2 μg RNA 进行反转录，使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix反转录试剂盒（TransGen Biotech, China），将RNA反转录为cDNA。

cDNA合成反应体系如下表1：

将上述液体轻轻混匀，简单离心。反应条件为42℃ 30 min，85℃ 5 s终止反应，用NanoDrop 2000测定cDNA浓度。

3、OsDnaJ15基因cDNA全长的获得

根据OsDnaJ15在数据库中的cDNA序列，利用Primer5.0软件，设计可以扩增全长ORF的一对特异性引物（OsDnaJ15-F/OsDnaJ15-R），为了方便下一步载体的构建，在引物5’端添加限制性内切酶酶切位点，得到用于下一步PCR扩增水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15所用的一对引物（OsDnaJ15-Xba

-F/OsDnaJ15-BamH

-R）；以反转录的cDNA为模板，成功获得预期大小的cDNA全长。PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸1.5min，本步骤循环32次；72℃后延伸10 min。

OsDnaJ15-Xba

-F：5’-gctctagaATGGCGTCGTCGG-3’

OsDnaJ15-BamH

-R：5’-cgggatccCTTGTCAGACCTATTAAGATT-3’；

反应结束后，进行电泳，产物回收，将回收的片段连入载体pMD18-T，转化大肠杆菌，挑取单克隆进行测序，获得有完整阅读框、无错配、无移码的cDNA全长，其核苷酸序列如SEQID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2 水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15超量表达载体的构建

1）用Xba

和BamH

双酶切双元载体pCsV1300，跑胶回收大片段（载体）；

2）用Xba

和BamH

双酶切实施例1中得到的包含有水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15 的T载体，消化后跑胶回收包含有水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15的DNA片段（基因）；

3）把回收的载体与基因进行连接；

4）转化大肠杆菌感受态、挑取单克隆进行PCR检测；

5）对于检测为阳性的单克隆过夜培养，提取质粒进行酶切验证；

实施例3 农杆菌介导的水稻遗传转化体系与鉴定

1）选取成熟饱满的水稻品种Kitaake种子，去壳；75%酒精消毒1~2 min，倒去酒精；用灭菌蒸馏水冲洗2次；加入0.15%的升汞（含有0.1%的吐温20）浸泡15~18 min，其间摇动数次；倒掉升汞，用灭菌蒸馏水冲洗5次。将消过毒的种子接入诱导愈伤培养基，32℃光照培养5~10 d；

2）将实施例2得到的含有水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15表达载体转化到农杆菌中。在侵染的前2 d，取农杆菌在含50 mg/l kanamycin的LB培养基上划线，置于28℃培养；

3）侵染前，将活化的农杆菌刮入悬浮培养基中，28℃，180 rpm震荡培养3~3.5 h，然后用悬浮培养基调节菌液浓度至OD₆₀₀=0.1~0.2。将诱导5~10 d的愈伤组织放入农杆菌悬浮液中，侵染1.5-10 min。倒掉菌液，用灭菌滤纸吸干愈伤表面的菌液。愈伤表面覆盖灭菌滤纸，超净台吹30 min，直到吹干。吹干后将愈伤转入表面覆盖有一层灭菌滤纸的共培养培养基，先20℃暗培养过夜，然后转入25℃培养箱继续暗培养2 d；

4）共培养完成后，将愈伤组织用镊子转移到空的灭菌容器中。用灭菌蒸馏水反复清洗愈伤7~8次，其中前面3次可快速清洗，后面3~4次清洗时每次浸泡3~5 min。最后用含有500mg/l 羧苄青霉素（Carbenicillin，Cn）的灭菌蒸馏水浸泡愈伤30 min。倒掉Cn溶液，用灭菌滤纸尽量吸干愈伤表面的水分，愈伤表面覆盖一层灭菌滤纸，超净台吹1 h；

5）将经过清菌后的愈伤摆放到含有潮霉素的筛选培养基上32℃，光照培养14 d；

6）筛选14 d后，将抗性愈伤转入分化培养基，28℃培养 (光周期为14 h光照/10 h黑暗)；

7）待抗性愈伤在分化培养基上形成3~4 cm高的再生苗时，将其转入生根培养基培养，至形成完整的转基因水稻植株。转基因水稻的自交后代，可以采用潮霉素进行纯合转基因植株的筛选。

实施例4 T2代纯合转基因水稻中OsDnaJ15表达水平检测

取生长至三叶一心期的野生型Kitaake和转基因水稻植株的叶片，提取RNA用于基因相对表达量的分析。利用Real-time PCR 仪（ABI, USA）进行RT-qPCR。RNA提取与cDNA的合成同实施例1。之后将cDNA稀释10倍，按照试剂盒THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix Without Rox（TOYOBO, Japan）说明进行RT-qPCR。通过Primer Express 3.0设计RT-qPCR所用的引物，以OsACT1为内参基因，所用引物如下：

qRT-OsDnaJ15-F：5’-AGGAGATCAAGTCCGCCTACC-3’

qRT-OsDnaJ15-R：5’-AGAGTTCTGATGCTTCTGGGTTA-3’

OsACT1-F：5’-CTCCCCCATGCTATCCTTCG-3’

OsACT1-R：5’-TGAATGAGTAACCACGCTCCG-3’

RT-qPCR的结果显示，与野生型相比，3个独立的OsDnaJ15过表达植株（OsDnaJ15OX-1、OsDnaJ15OX-2和OsDnaJ15OX-3）中OsDnaJ15的表达水平增加约20倍以上（如图2所示）。

实施例5 OsDnaJ15过表达植株的耐盐性测试

将生长至三叶一心期的野生型Kitaake和纯合的OsDnaJ15过表达转基因植株（OsDnaJ15OX-1、OsDnaJ15OX-2和OsDnaJ15OX-3）移至含有100 mM NaCl的营养液中，处理6d后观察表型及统计存活率，发现与野生型Kitaake相比，OsDnaJ15过表达植株对盐胁迫的耐受性增强，其存活率显著的高于野生型Kitaake（如图3~4）。

根据上述实施例，通过前期对activation-tagging pool进行盐胁迫筛选过程中，得到一个在盐胁迫应答过程中扮演重要角色的基因OsDnaJ15；本发明通过农杆菌介导的转化方法，将OsDnaJ15过表达载体成功转化水稻，获得了纯合的T2代转基因水稻植株；我们发现在盐胁迫下，OsDnaJ15过表达植株OsDnaJ15OX-1、OsDnaJ15OX-2和OsDnaJ15OX-3的存活率显著高于野生型Kitaake的存活率。上述结果说明水稻基因OsDnaJ15能够提高水稻对盐胁迫的耐受性。

序列表

<110> 东北师范大学

<120> 水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15的克隆及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1212

<212> DNA

<213> 水稻(KitaakeOryza sativa L. var Kitaake)

<400> 1

atggcgtcgt cggggaagat ggaggggccg tcggcgccgg cgatgcggcg ggacccgtac 60

gaggtgctct ccgtgccaag ggactcctcc gaccaggaga tcaagtccgc ctaccgcaag 120

ctcgcgctca agtatcaccc tgacaagaat gctagtaacc cagaagcatc agaactcttc 180

aaagaggttg catattcata tagtatcttg tcagatcctg agaaacggag gcaatatgat 240

actgctggtt ttgaggcatt ggagaatgaa ggaatggata tggaaattga cttatctaat 300

cttggaactg tgaacacaat gtttgctgca cttttcagca agctcggtgt tccaatcaag 360

accacagtat ctcctaatgt tcttgaagaa gctatgagtg gaacagttac agtgagacct 420

ctcccagttg gatcatcagc aacgggaaag gttgacaagc aaagtgctca tttttatggt 480

gtaacaataa gtgaagaaca agctcagtca ggcattgtag tcagagtcac ctcagccgca 540

caaagtaaat ttaagctgct tttctttgaa caagaaatta atggaggtta tggactagct 600

cttcaggaag atagtcagaa gactggtaag gtgacatctg caggcatgta tttcttgcat 660

tttcaagtgt atcgtatgga ttcaacagtg aatgcgttgg caatggccaa ggatcctgag 720

gctgcattct ttaaaaggtt ggaaggtctc cagccgtgcg aagtgtcggc tctcaaatct 780

ggaactcata tatttgctgt atacggtgat aattttttca agccagctag ctatacaatt 840

gaagcaatgt gtgcaaagag ttacgaagac acaacacaga ggctaaagga aatagagtct 900

aaaattctag agaagagaaa tgatttgcgc caatttgaaa ctgagtacag aaaagcttta 960

gcgcggtttc aagaagtgac caacagatac acccaagaaa aagaagcggt tgatgatatg 1020

ctgagagaaa gggatgacat ccactcctcc ttcacgaccg aacgaactat ggtgaactct 1080

gttggagctg gtagcagcag tagtagatac cccactgaga gtcccgagaa tggtaacata 1140

gatggtaaag ataaatcaag taaaaagaag tggttcaatt tgaatcttaa taggtctgac 1200

aagaaagctt ga 1212

<210> 2

<211> 403

<212> PRT

<213> 水稻(KitaakeOryza sativa L. var Kitaake)

<400> 2

Met Ala Ser Ser Gly Lys Met Glu Gly Pro Ser Ala Pro Ala Met Arg

1 5 10 15

Arg Asp Pro Tyr Glu Val Leu Ser Val Pro Arg Asp Ser Ser Asp Gln

20 25 30

Glu Ile Lys Ser Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Tyr His Pro Asp

35 40 45

Lys Asn Ala Ser Asn Pro Glu Ala Ser Glu Leu Phe Lys Glu Val Ala

50 55 60

Tyr Ser Tyr Ser Ile Leu Ser Asp Pro Glu Lys Arg Arg Gln Tyr Asp

65 70 75 80

Thr Ala Gly Phe Glu Ala Leu Glu Asn Glu Gly Met Asp Met Glu Ile

85 90 95

Asp Leu Ser Asn Leu Gly Thr Val Asn Thr Met Phe Ala Ala Leu Phe

100 105 110

Ser Lys Leu Gly Val Pro Ile Lys Thr Thr Val Ser Pro Asn Val Leu

115 120 125

Glu Glu Ala Met Ser Gly Thr Val Thr Val Arg Pro Leu Pro Val Gly

130 135 140

Ser Ser Ala Thr Gly Lys Val Asp Lys Gln Ser Ala His Phe Tyr Gly

145 150 155 160

Val Thr Ile Ser Glu Glu Gln Ala Gln Ser Gly Ile Val Val Arg Val

165 170 175

Thr Ser Ala Ala Gln Ser Lys Phe Lys Leu Leu Phe Phe Glu Gln Glu

180 185 190

Ile Asn Gly Gly Tyr Gly Leu Ala Leu Gln Glu Asp Ser Gln Lys Thr

195 200 205

Gly Lys Val Thr Ser Ala Gly Met Tyr Phe Leu His Phe Gln Val Tyr

210 215 220

Arg Met Asp Ser Thr Val Asn Ala Leu Ala Met Ala Lys Asp Pro Glu

225 230 235 240

Ala Ala Phe Phe Lys Arg Leu Glu Gly Leu Gln Pro Cys Glu Val Ser

245 250 255

Ala Leu Lys Ser Gly Thr His Ile Phe Ala Val Tyr Gly Asp Asn Phe

260 265 270

Phe Lys Pro Ala Ser Tyr Thr Ile Glu Ala Met Cys Ala Lys Ser Tyr

275 280 285

Glu Asp Thr Thr Gln Arg Leu Lys Glu Ile Glu Ser Lys Ile Leu Glu

290 295 300

Lys Arg Asn Asp Leu Arg Gln Phe Glu Thr Glu Tyr Arg Lys Ala Leu

305 310 315 320

Ala Arg Phe Gln Glu Val Thr Asn Arg Tyr Thr Gln Glu Lys Glu Ala

325 330 335

Val Asp Asp Met Leu Arg Glu Arg Asp Asp Ile His Ser Ser Phe Thr

340 345 350

Thr Glu Arg Thr Met Val Asn Ser Val Gly Ala Gly Ser Ser Ser Ser

355 360 365

Arg Tyr Pro Thr Glu Ser Pro Glu Asn Gly Asn Ile Asp Gly Lys Asp

370 375 380

Lys Ser Ser Lys Lys Lys Trp Phe Asn Leu Asn Leu Asn Arg Ser Asp

385 390 395 400

Lys Lys Ala

Claims (3)

1.一种水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.一种植物表达载体，它插入了权利要求1所述的水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15。

3.如权利要求1所述的水稻耐盐胁迫基因OsDnaJ15在提高水稻盐胁迫耐受能力方面的应用。

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