CN111662914A

CN111662914A - 水稻耐盐胁迫基因OsBAG4、编码蛋白及其应用

Info

Publication number: CN111662914A
Application number: CN202010703329.XA
Authority: CN
Inventors: 徐正一; 刘雨同; 南楠; 王婕
Original assignee: Northeast Normal University
Current assignee: Northeastern University China; Northeast Normal University
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2020-09-15

Abstract

本发明提供了水稻耐盐胁迫基因OsBAG4、编码蛋白及其应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了水稻耐盐胁迫基因OsBAG4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还提供了由OsBAG4基因编码的水稻耐盐胁迫的蛋白OsBAG4，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明通过构建含OsBAG4基因的植物表达载体并利用农杆菌介导的方法转化水稻品种日本晴中，经过含有NaCl的营养液进行盐胁迫处理后，测定转基因水稻的表型和测量其存活率；实验结果表明，水稻耐盐胁迫基因OsBAG4可提高水稻对盐胁迫的耐受性。

Description

水稻耐盐胁迫基因OsBAG4、编码蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及水稻耐盐胁迫基因OsBAG4、编码蛋白及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，养活了世界一半以上的人口，水稻的生产对全球粮食安全具有重要的意义。据估计，到2050年粮食的产量需增加约50％才能够满足世界日益增长的人口的需求^[1]。但是，水稻整个生长过程中却经常遭受多种非生物胁迫的不利影响，例如盐渍、干旱、洪涝、低高温胁迫等。其中，盐胁迫是威胁水稻生产的重要非生物胁迫之一。

土壤盐碱化使得耕地面积缩减，也是导致粮食危机的原因之一。据联合国教科文组织和联合国粮农组织的不完全统计，全世界有约9.45亿公顷的土地受盐害的影响，大约占了全球农业用地面积的20％^[2]。中国是盐碱地大国，现有内陆盐碱面积近1亿公顷^[3]，滩涂面积234万公顷，盐碱地面积位居世界第三，主要分布在西北、东北、华北及滨海地区。中国东北地区盐碱土的主要形式是苏打盐碱地，面积高达756万公顷^[3]。其中，吉林省西部12个市县盐碱土面积为160多万公顷^[4]。面对人口数目不断增长，可使用的耕地面积有限，土地的不合理灌溉利用使土壤次生盐渍化现象日益严重和水稻产量很难显著提高等实际生产问题，开发利用好沿海滩涂以及内陆的盐碱地资源是保障耕地面积的有效途径之一^[5]。水稻是中度盐敏感作物^[6]，生长在水环境中，种植水稻可以对土壤的可溶性盐碱起到淋溶的作用^[7-8]。因此，水稻是开发沿海滩涂和盐碱地的首选粮食作物。

通过遗传改良提高水稻耐盐能力是提高水稻种植面积和产量的有效途径之一^[9]。目前在育种上利用的耐盐QTL主要是位于水稻第1号染色体上的qSKC-1和Saltol两个位点^[5]。随着分子生物技术的发展，利用突变体来分离和挖掘耐水稻的盐胁迫基因，并且用于水稻基因工程进行辅助育种和耐碱胁迫改良对有效控制盐胁迫对水稻的危害、提高水稻产量和改良水稻品质具有极其重要的意义。Bcl-2associated athanogene(BAG)是一类在进化上保守的具有多种功能的蛋白(multifunctional protein)，在动物中发现参与肿瘤的发生、细胞凋亡、神经细胞分化和胁迫响应等多种重要的生理过程。水稻中有6个含有保守BAG结构域的蛋白，其中，只有OsBAG4被发现参与抗稻瘟病应答过程中^[10]，而还未见关于OsBAG4提高水稻盐胁迫抗性的报道。

参考文献

[1]庞昀龙.水稻耐盐、抗旱、高产和优质育种材料的选育及遗传剖析[D].北京:中国农业科学院,2017.

[2]Munns R,Tester M.Mechanisms of salinity tolerance[J].Annu RevPlant Biol,2008,59:651-681.

[3]李彬,王志春,孙志高,等.中国盐碱地资源与可持续利用研究[J].干旱地区农业研究,2005,23(2):154-158.

[4]刘兴土.松嫩平原退化土地整治与农业发展[M].北京:科学出版社,2001.

[5]王才林,张亚东,赵凌,等.耐盐碱水稻研究现状、问题与建议[J].中国稻米,2019,25(1):1-6.

[6]王英,张国民,李景鹏,等.寒地粳稻耐碱研究进展及开发前景[J].作物学报,2016(6):1-8.

[7]凌启鸿.盐碱地种稻有关问题的讨论[J].中国稻米,2018,24(4):1-2.

[8]向镜,张义凯,朱德峰,等.盐碱地耕作和洗盐方式对水稻生长及产量的影响[J].中国稻米,2018,24(4):68-71.

[9]井文,章文华.水稻耐盐基因定位与克隆及品种耐盐性分子标记辅助选择改良研究进展[J].中国水稻科学,2017,31(2):111-123.

[10]You QY,Zhai K,Yang DL,Yang WB,Wu JN,Liu JZ,Pan WB,Wang JJ,Zhu XD,Jian YK,Liu JY,Zhang YY,Deng YW,Li Q,Lou YG,Xie Q,He ZH.An E3 ubiquitinligase-BAG protein module controls plant innate immunity and broad-spectrumdisease resistance[J].Cell Host&Microbe,2016,20:758-769.

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水稻耐盐胁迫基因OsBAG4、编码蛋白及其应用。

本发明提供了一种水稻耐盐胁迫基因OsBAG4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种编码所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种包含所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4的植物表达载体。

优选的，所述植物表达载体中载体的种类包括pCsV1300；

所述OsBAG4插入所述pCsV1300的多克隆位点为XbaI和BamHI之间。

本发明提供了一种用于扩增所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4的引物对，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物对中下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

本发明提供了一种水稻抗盐胁迫的重组细胞，包含所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4或所述植物表达载体。

本发明提供了所述OsBAG4、所述蛋白、所述植物表达载体、所述引物对或所述重组细胞在耐盐转基因水稻的培育或水稻耐盐胁迫中的应用。

本发明提供了一种水稻耐盐胁迫基因OsBAG4，本发明利用农杆菌介导的方法将含有OsBAG4基因的植物表达载体导入水稻日本晴成熟胚诱导的愈伤组织细胞中，用潮霉素筛选抗性愈伤组织，经过分化和生根获得转基因阳性植株。经潮霉素筛选及分子鉴定，获得纯合的T2代水稻转基因植株。将获得的纯合转基因水稻植株在含有100mM NaCl的水稻营养液中盐胁迫处理后进行抗逆性分析，结果表明，OsBAG4过表达的植株对盐胁迫的耐受能力显著高于野生型日本晴。

附图说明

图1为本发明提供的遗传转化载体pCsV1300的结构示意图；

图2为转基因水稻植株与野生型日本晴中水稻耐盐胁迫相关基因OsBAG4表达量检测结果示意图；

图3为转基因水稻植株与野生型日本晴盐胁迫处理后的表型结果图；

图4为转基因水稻植株与野生型日本晴盐胁迫处理后的存活率统计图。

具体实施方式

本发明提供了一种水稻耐盐胁迫基因OsBAG4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为789bp的开放阅读框(ORF)(ATGATGAGCGGCGTTGGAGGAGGCAGATCGGGCGGGAGGGACGCGGAGGGCGAGTGGGAGGTCCGGCCTGGCGGGATGCTGGTGCAGCGCAGGGACGGCGACACGGGTCCGGCCGTCAGGCTCAGGGTCTCCCACGGCGCCTCCTTCCGCGACGTCGCCGTGCCGGCGCACTCCACCTTCGGTGAATTGAAGGGGGTCCTTACCCAGGCAACTGGCGTAGAGCCTGAAAGGCAGAGGCTCTTCTTCCGTGGGAAGGAGAAGAGTGACAATGAGTTCCTGCATACAGCTGGGGTCAAGGATGGAGCAAAACTTCTTCTACTTGAGAAGCCTGCCCCTGCCAATGTAGAGCAGAGGGCCGAGCCAGTAATTATGGATGAGAGCATGATGAAGGCTTGTGAGGCTGTTGGCCGTGTAAGAGCTGAAGTTGACAGACTCTCTGCCAAGGTATGTGATTTGGAGAAGAGTGTGTTTGCAGGGAGAAAGATTGAGGATAAAGATTTTGTTGTCTTGACGGAGCTTCTTATGATGGAGCTGCTGAAACTTGATGGCATAGAGGCAGAGGGAGAAGCAAGGGCACAAAGGAAGGCTGAGGTACGCCGTGTCCAAGGTCTTGTGGAGACGTTGGATAAGCTGAAGGCAAGAAATGCCAATCCCTTCAGCGATCAAAACAAATCTGTTTCAGTGACAACGCAGTGGGAGACGTTCGACAATGGCATGGGCAGCTTGAATGCACCCCCACCACGGGTTTCTTCCACACAAATAAACACCGACTGGGAGCAATTCGACTAG)，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。

本发明提供了一种编码所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所(MMSGVGGGRSGGRDAEGEWEVRPGGMLVQRRDGDTGPAVRLRVSHGASFRDVAVPAHSTFGELKGVLTQATGVEPERQRLFFRGKEKSDNEFLHTAGVKDGAKLLLLEKPAPANVEQRAEPVIMDESMMKACEAVGRVRAEVDRLSAKVCDLEKSVFAGRKIEDKDFVVLTELLMMELLKLDGIEAEGEARAQRKAEVRRVQGLVETLDKLKARNANPFSDQNKSVSVTT QWETFDNGMGSLNAPPPRVS STQINTDWEQ FD)。所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4编码的蛋白含有BAG结构域，由262个氨基酸组成。

本发明提供了一种包含所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4的植物表达载体。所述植物表达载体中载体的种类优选包括pCsV1300；所述OsBAG4插入所述pCsV1300的多克隆位点为XbaI和BamHI之间(植物表达载体结构示意图见图1)。所述植物表达载体的制备方法，优选将XbaI和BamHI进行酶切载体，得到线性化的载体进行纯化回收，将回收的DNA片段连接到遗传转化载体pCsV1300的限制性内切酶酶切位点，将重组载体转化大肠杆菌、提取质粒进行PCR和酶切验证。

本发明提供了一种用于扩增所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4的引物对，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(OsBAG4-XbaI-F：5'-gctctagaatgatgagcggcgttgga-3')；所述引物对中下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(OsBAG4-BamHI-R：5'-cgggatccgtcgaattgctcccagtcg-3')。本发明对所述引物对的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的方法获得即可，例如通过基因合成公司人工合成。

本发明提供了一种水稻耐盐胁迫的重组细胞，包含所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4或所述植物表达载体。所述重组细胞中的细胞包括真核细胞和原核细胞，所述真核细胞包括水稻细胞，所述原核细胞包括大肠杆菌。所述重组细胞的制备方法，优选将所述植物表达载体导入细胞中，所述导入的方法根据细胞种类的不同而有所差异，所述细胞为原核细胞时优选采用转化方法，所述细胞为真核细胞，优选利用农杆菌介导法进行转化。

在本发明中，所述耐盐转基因水稻的培育或水稻抗盐胁迫的方法，优选将所述OsBAG4插入载体中，构建得到所述植物表达载体，筛选检验后将阳性植物表达载体导入水稻细胞中，经过阳性筛选、培育，得到的水稻植株为转基因水稻。经过qPCR验证，与野生型相比，3株独立的OsBAG4过表达植株(OsBAG4OX-1、OsBAG4OX-2和OsBAG4OX-3)中OsBAG4的表达水平增加约60倍以上。

在本发明中，所述转基因水稻经过耐盐性测试，结果表明，与野生型日本晴相比，OsBAG4过表达植株对盐胁迫的耐受性增强，其存活率显著的高于野生型日本晴。

下面结合实施例对本发明提供的一种水稻耐盐胁迫基因OsBAG4、编码蛋白及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

水稻耐盐胁迫基因OsBAG4的克隆方法

在通过对CRISPR/Cas9水稻突变体库(Oryza sativa L.varNipponbare背景)筛选对盐胁迫敏感的突变体过程中，发现了一个对盐胁迫敏感的突变体L3，其存活率显著低于野生型日本晴。通过DNA测序，发现该材料中距离OsBAG4(LOC_Os01g61500)基因起始密码子的第52位G被删除，导致第187位产生终止密码子，因此，我们认为L3是OsBAG4的缺失性突变体，由于OsBAG4的突变导致L3对盐胁迫耐受性下降，说明OsBAG4在水稻盐胁迫应答过程中起到积极的作用。在数据库Phytozome 12(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中，查找到OsBAG4基因全长cDNA序列。OsBAG4基因开放阅读框(ORF)核苷酸序列长度为789bp，编码一种由262个氨基酸组成的蛋白。

1.RNA的提取

利用TRIzol reagent(Invitrogen,USA)提取水稻叶片的总RNA。

(1)取生长至三叶一心期的水稻品种日本晴的叶片，放入装有2粒钢珠的2ml管中，置于液氮中。

(2)使用组织破碎仪进行磨样，磨样所需适配器需放入液氮中提前进行预冷，将装有样品的管子装入适配器中，上机，频率为1400rpm/s，磨样时间一般为90s，将样品磨至粉末。

(3)向样品管中加入1ml TRIzol reagent提取液，使用涡旋仪将样品和提取液迅速混匀。

(4)将裂解液放置15～25℃条件下10min，以保证样品被充分裂解，同时用磁铁将磁珠吸出。

(5)移至台式高速离心机，12,000×g 4℃离心10min。

(6)吸取上清液至新的1.5ml管中，每个样品中加入0.2ml的氯仿。盖紧盖子，使用涡旋仪充分震荡每个样品30s，15-25℃静置2～15min。

(7)在2～8℃条件下，12,000×g离心15min。

(8)离心后会产生3个分层，将最上层无色液体转移到新的离心管中。

(9)每个样品中加入500ml的异丙醇，上下颠倒，充分混匀。在15～25℃放置5～10min，使RNA充分沉淀。

(10)在2-8℃条件下，12,000×g离心10min，去除上清。

(11)加入1ml用DEPC水配制的75％乙醇，上下颠倒充分漂洗RNA沉淀，去除上清。

(12)在2～8℃条件下，7500×g离心5min，去除上清。

(13)在2～8℃条件下，7500×g离心短暂离心，用枪将多余的乙醇吸走，在空气中干燥5～10min(不能太干，否则不易溶解)。

(14)加入30μl DEPC处理水，将RNA充分溶解。

(15)用NanoDrop2000测定各样品浓度，A₂₆₀/A₂₈₀值在2.0～2.2为合格。取2μl RNA进行琼脂糖凝胶电泳进行检测。样品保存于-80℃超低温冰箱，待用。

2.cDNA的合成

取2μg RNA进行反转录，使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix反转录试剂盒(TransGen Biotech,China)，将RNA反转录为cDNA。cDNA合成反应体系如下表1。

表1 cDNA合成反应体

将上述液体轻轻混匀，简单离心。反应条件为42℃30min，85℃5s终止反应，用NanoDrop2000测定cDNA浓度。

3.OsBAG4基因cDNA全长的获得

根据OsBAG4在数据库中的cDNA序列，利用Primer5.0软件，设计可以扩增全长ORF的一对特异性引物(OsBAG4-F/OsBAG4-R)，为了方便下一步载体的构建，在引物5’端添加限制性内切酶酶切位点，得到用于下一步PCR扩增获得水稻耐盐胁迫基因OsBAG4所用的一对引物(OsBAG4-XbaI-F/OsBAG4-BamHI-R)。以反转录的cDNA为模板，成功获得预期大小的cDNA全长。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min，本步骤循环32次；72℃后延伸10min。

OsBAG4-XbaI-F：5'-gctctagaATGATGAGCGGCGTTGGA-3'(SEQ ID NO.3)；

OsBAG4-BamHI-R：5'-cgggatccGTCGAATTGCTCCCAGTCG-3'(SEQ ID NO.4)。

反应结束后，进行电泳，产物回收，将回收的片段连入载体pMD18-T，转化大肠杆菌，挑取单克隆进行测序，获得有完整阅读框、无错配、无移码的cDNA全长，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2

水稻耐盐胁迫基因OsBAG4超量表达载体的构建

(1)用XbaI和BamHI双酶切双元载体pCsV1300，跑胶回收大片段(载体)。

(2)用XbaI和BamHI双酶切实施例1中得到的包含有水稻耐盐胁迫基因OsBAG4的T载体，消化后跑胶回收包含有水稻耐盐胁迫基因OsBAG4的DNA片段(基因)。

(3)把回收的载体与基因进行连接。

(4)转化大肠杆菌感受态、挑取单克隆进行PCR检测。

(5)对于检测为阳性的单克隆过夜培养，提取质粒进行酶切验证。

实施例3

农杆菌介导的水稻遗传转化体系与鉴定(具体参见如下文献：崔莹,蔡朝霞,林拥军,陈浩.(2018).农杆菌介导水稻快速转化.Bio-101:e1010176.)

(1)选取成熟饱满的水稻品种日本晴种子，去壳；75％酒精消毒1～2min，倒去酒精；用灭菌蒸馏水冲洗2次；加入0.15％的升汞(含有0.1％的吐温20)浸泡15～18min，其间摇动数次；倒掉升汞，用灭菌蒸馏水冲洗5次。将消过毒的种子接入诱导愈伤培养基，32℃光照培养5～10d。

(2)将实施例2得到的含有水稻耐盐胁迫基因OsBAG4表达载体转化到农杆菌中。在侵染的前2d，取农杆菌在含50mg/l kanamycin的LB培养基上划线，置于28℃培养。

(3)侵染前，将活化的农杆菌刮入悬浮培养基中，28℃，180rpm震荡培养3～3.5h，然后用悬浮培养基调节菌液浓度至OD₆₀₀＝0.1～0.2。将诱导5～10d愈伤组织放入农杆菌悬浮液中，侵染1.5～10min。倒掉菌液，用灭菌滤纸吸干愈伤表面的菌液。愈伤表面覆盖灭菌滤纸，超净台吹干30min。吹干后将愈伤转入表面覆盖有一层灭菌滤纸的共培养培养基，先20℃暗培养过夜，然后转入25℃培养箱继续暗培养2d。

(4)共培养完成后，将愈伤组织用镊子转移到空的灭菌容器中。用灭菌蒸馏水反复清洗愈伤7～8次，其中前面3次可快速清洗，后面3～4次清洗时每次浸泡3～5min。最后用含有500mg/l羧苄青霉素(Carbenicillin，Cn)的灭菌蒸馏水浸泡愈伤30min。倒掉Cn溶液，用灭菌滤纸尽量吸干愈伤表面的水分，愈伤表面覆盖一层灭菌滤纸，超净台吹干1h。

(5)将经过清菌后的愈伤摆放到含有潮霉素的筛选培养基上32℃，光照培养14d。

(6)筛选14d后，将抗性愈伤转入分化培养基，28℃培养(光周期为14h光照/10h黑暗)。

(7)待抗性愈伤在分化培养基上形成3～4cm高的再生苗时，将其转入生根培养基培养，至形成完整的转基因水稻植株。转基因水稻的自交后代，可以采用潮霉素进行纯合转基因植株的筛选。

实施例4

T2代纯合转基因水稻中OsBAG4表达水平检测

取生长至三叶一心期的野生型日本晴和转基因水稻植株的叶片，提取RNA用于基因相对表达量的分析。利用Real-time PCR仪(ABI,USA)进行RT-qPCR。RNA提取与cDNA的合成同实施例1。之后将cDNA稀释10倍，按照试剂盒THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix WithoutRox(TOYOBO,Japan)说明进行RT-qPCR。通过Primer Express 3.0设计RT-qPCR所用的引物，以OsGAPDH为内参基因，所用引物如下：

qRT-OsBAG4-F：5'-caatggcatgggcagctt-3'(SEQ ID NO.5)；

qRT-OsBAG4-R：5'-agtcggtgtttatttgtgtggaaga-3'(SEQ ID NO.6)；

OsGAPDH-F：5'-ctgagaataaaacgtggacggtg-3'(SEQ ID NO.7)；

OsGAPDH-R：5'-tccatatcatcagcatcgttacaac-3'(SEQ ID NO.8)。

RT-qPCR的反应条件：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火1min，本步骤40个循环。根据公式2^-△△Ct计算。其中△Ct＝(Ct_目的基因-Ct_内参基因)，△△Ct＝(△Ct_样本-△Ct_对照)。Ct为荧光阈值。结果显示，与野生型相比，3个独立的OsBAG4过表达植株(OsBAG4OX-1、OsBAG4OX-2和OsBAG4OX-3)中OsBAG4的表达水平增加约60倍以上(如图2所示)。

实施例5

OsBAG4过表达植株的耐盐性测试

将生长至三叶一心期的野生型日本晴和纯合的OsBAG4过表达转基因植株(OsBAG4OX-1、OsBAG4OX-2和OsBAG4OX-3)转移至含有100mM NaCl的营养液中，处理5d后观察表型及统计存活率.

结果表明，与野生型日本晴相比，OsBAG4过表达植株对盐胁迫的耐受性增强，其存活率显著的高于野生型日本晴(如图3～图4)。

根据上述技术，本发明通过本实验室前期对利用CRISPR/Cas9技术制备的水稻突变体库进行盐胁迫筛选过程中，得到一个在盐胁迫应答过程中扮演重要角色的基因OsBAG4。通过农杆菌介导的转化方法，将OsBAG4过表达载体成功转化水稻品种日本晴，获得了纯合的T2代转基因植株。我们发现在盐胁迫下，OsBAG4过表达植株OsBAG4OX-1、OsBAG4OX-2和OsBAG4OX-3的存活率显著高于野生型日本晴的存活率。上述结果说明水稻中的基因OsBAG4能够提高水稻对盐胁迫的耐受性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 东北师范大学

<120> 水稻耐盐胁迫基因OsBAG4、编码蛋白及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgagcg gcgttggagg aggcagatcg ggcgggaggg acgcggaggg cgagtgggag 60

gtccggcctg gcgggatgct ggtgcagcgc agggacggcg acacgggtcc ggccgtcagg 120

ctcagggtct cccacggcgc ctccttccgc gacgtcgccg tgccggcgca ctccaccttc 180

ggtgaattga agggggtcct tacccaggca actggcgtag agcctgaaag gcagaggctc 240

ttcttccgtg ggaaggagaa gagtgacaat gagttcctgc atacagctgg ggtcaaggat 300

ggagcaaaac ttcttctact tgagaagcct gcccctgcca atgtagagca gagggccgag 360

ccagtaatta tggatgagag catgatgaag gcttgtgagg ctgttggccg tgtaagagct 420

gaagttgaca gactctctgc caaggtatgt gatttggaga agagtgtgtt tgcagggaga 480

aagattgagg ataaagattt tgttgtcttg acggagcttc ttatgatgga gctgctgaaa 540

cttgatggca tagaggcaga gggagaagca agggcacaaa ggaaggctga ggtacgccgt 600

gtccaaggtc ttgtggagac gttggataag ctgaaggcaa gaaatgccaa tcccttcagc 660

gatcaaaaca aatctgtttc agtgacaacg cagtgggaga cgttcgacaa tggcatgggc 720

agcttgaatg cacccccacc acgggtttct tccacacaaa taaacaccga ctgggagcaa 780

ttcgactag 789

<210> 2

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Met Ser Gly Val Gly Gly Gly Arg Ser Gly Gly Arg Asp Ala Glu

1 5 10 15

Gly Glu Trp Glu Val Arg Pro Gly Gly Met Leu Val Gln Arg Arg Asp

20 25 30

Gly Asp Thr Gly Pro Ala Val Arg Leu Arg Val Ser His Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Arg Asp Val Ala Val Pro Ala His Ser Thr Phe Gly Glu Leu Lys

50 55 60

Gly Val Leu Thr Gln Ala Thr Gly Val Glu Pro Glu Arg Gln Arg Leu

65 70 75 80

Phe Phe Arg Gly Lys Glu Lys Ser Asp Asn Glu Phe Leu His Thr Ala

85 90 95

Gly Val Lys Asp Gly Ala Lys Leu Leu Leu Leu Glu Lys Pro Ala Pro

100 105 110

Ala Asn Val Glu Gln Arg Ala Glu Pro Val Ile Met Asp Glu Ser Met

115 120 125

Met Lys Ala Cys Glu Ala Val Gly Arg Val Arg Ala Glu Val Asp Arg

130 135 140

Leu Ser Ala Lys Val Cys Asp Leu Glu Lys Ser Val Phe Ala Gly Arg

145 150 155 160

Lys Ile Glu Asp Lys Asp Phe Val Val Leu Thr Glu Leu Leu Met Met

165 170 175

Glu Leu Leu Lys Leu Asp Gly Ile Glu Ala Glu Gly Glu Ala Arg Ala

180 185 190

Gln Arg Lys Ala Glu Val Arg Arg Val Gln Gly Leu Val Glu Thr Leu

195 200 205

Asp Lys Leu Lys Ala Arg Asn Ala Asn Pro Phe Ser Asp Gln Asn Lys

210 215 220

Ser Val Ser Val Thr Thr Gln Trp Glu Thr Phe Asp Asn Gly Met Gly

225 230 235 240

Ser Leu Asn Ala Pro Pro Pro Arg Val Ser Ser Thr Gln Ile Asn Thr

245 250 255

Asp Trp Glu Gln Phe Asp

260

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctctagaat gatgagcggc gttgga 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggatccgt cgaattgctc ccagtcg 27

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caatggcatg ggcagctt 18

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtcggtgtt tatttgtgtg gaaga 25

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgagaataa aacgtggacg gtg 23

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccatatcat cagcatcgtt acaac 25

Claims

1.一种水稻耐盐胁迫基因OsBAG4，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种包含权利要求1所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4的植物表达载体。

4.根据权利要求3所述植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体中载体的种类包括pCsV1300；

所述OsBAG4插入所述pCsV1300的多克隆位点为XbaI和BamHI之间。

5.一种用于扩增权利要求1所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4的引物对，其特征在于，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述引物对中下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.一种水稻耐盐胁迫的重组细胞，其特征在于，包含权利要求1所述水稻耐盐胁迫基因OsBAG4或权利要求3或4所述植物表达载体。

7.权利要求1所述OsBAG4、权利要求2所述蛋白、权利要求3或4所述植物表达载体、权利要求5所述引物对或权利要求6所述重组细胞在耐盐转基因水稻的培育或水稻耐盐胁迫中的应用。