CN115044591A

CN115044591A - 水稻OsBRP1基因在调控植物盐胁迫能力和钠元素积累能力中的应用

Info

Publication number: CN115044591A
Application number: CN202210717427.8A
Authority: CN
Inventors: 杨素; 朱诚; 宁鹤; 陈广娜; 吕晨泽; 陈家洛; 陈歆惠
Original assignee: Zhongliang Dahuangshan High Quality Development Research Institute Co ltd
Current assignee: Zhongliang Dahuangshan High Quality Development Research Institute Co ltd
Priority date: 2022-06-23
Filing date: 2022-06-23
Publication date: 2022-09-13

Abstract

本发明提供了一种水稻OsBRP1基因在调控植物盐胁迫能力和钠元素积累能力中的应用，涉及生物技术领域。水稻OsBRP1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，经发明人研究发现，与表达水稻OsBRP1基因的植株相比，敲除水稻OsBRP1基因的植株的盐胁迫能力降低，钠元素积累能力提高，因此，水稻OsBRP1基因能够用于植物盐胁迫能力或钠元素积累能力的调控。

Description

水稻OsBRP1基因在调控植物盐胁迫能力和钠元素积累能力中的应用

技术领域

本发明生物技术领域，尤其是涉及一种水稻OsBRP1基因在调控植物盐胁迫能力和钠元素积累能力中的应用。

背景技术

土壤盐渍化是指在不利的气候、水文、地形和土壤质地等自然条件下，易溶性盐类在土壤中重新分配、过量累积和扩散形成的一种环境地质现象。近些年来，由于高温、干旱、工业污染以及不合理的灌溉等诸多因素，使得土壤盐渍化问题日趋严重。土壤盐渍化不但会造成耕地退化、土地荒漠化，扰乱生态系统；而且严重制约和影响了农业生产和发展。盐渍土按地理位置可以分为内陆盐渍土、滨海盐渍土以及滩涂。根据联合国教科文组织和粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)不完全统计，我国有盐碱地9.9×10⁷hm²，其中有9.3×10⁶hm²在1.2×10⁸hm²耕地红线以内，大面积的盐碱地不能够使用，严重地限制了我国农业生产的发展(王洋，张瑞，刘永昊，等.水稻对盐胁迫的响应及耐盐机理研究进展[J].中国水稻科学，2022,36(02):105-117)。

水稻是世界上最主要的粮食作物之一，也是我国种植面积最大的农作物。盐胁迫是制约其生长和产量的主要逆境之一，水稻栽培面积的20％受到不同程度的盐害威胁(Flowers T J.Improving crop salt tolerance.Journal of Experimental Botany,2004,55(396):307-319.)，严重影响水稻的生长发育和代谢，高浓度的Na⁺可以直接对细胞膜造成伤害，此外Na⁺的间接作用常导致渗透胁迫，使植物根系吸水困难，从而造成水分和营养的亏缺，严重时甚至死亡。

近年来盐胁迫的问题越来越受到人们的重视。对于植物耐盐胁迫机制的研究和耐盐胁迫基因工程方面的已有工作表明：通过生物技术手段，将盐胁迫相关基因导入植物体内获得耐盐胁迫转基因植株，可以改良植物盐胁迫耐性，这种育种方式对于作物的生产和耐盐胁迫种质的筛选具有重要的意义。因此，探索水稻耐盐机制，发掘水稻耐盐基因，培育耐盐水稻品种，对保证我国农业持续发展具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种水稻OsBRP1基因在调控植物盐胁迫能力中的应用，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第二目的在于提供一种水稻OsBRP1基因在调控植物钠元素积累能力中的应用。

本发明的第三目的在于提供植物性状相关的标志物。

本发明的第四目的在于提供一种用于检测植物性状的试剂盒。

本发明的第五目的在于提供一种调控植物性状的方法。

第一方面，本发明提供了一种水稻OsBRP1基因在调控植物盐胁迫能力中的应用；

所述水稻OsBRP1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供了一种水稻OsBRP1基因在调控植物钠元素积累能力中的应用；

所述水稻OsBRP1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为进一步技术方案，所述植物包括水稻。

第三方面，本发明提供了植物性状相关的标志物，所述标志物选自(a1)：所述的水稻OsBRP1基因；

(a2)：(a1)转录的RNA；

(a3)：(a2)表达的蛋白；

所述性状包括盐胁迫能力或钠元素积累能力中的至少一种。

第四方面，本发明提供了一种用于检测植物性状的试剂盒，所述试剂盒用于检测所述的标志物。

作为进一步技术方案，所述试剂盒包括用于扩增水稻OsBRP1基因的引物对，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

第五方面，本发明提供了一种调控植物性状的方法，包括：表达或者抑制表达所述的水稻OsBRP1基因；

所述性状包括盐胁迫能力或钠元素积累能力中的至少一种。

作为进一步技术方案，表达水稻OsBRP1基因，植物盐胁迫能力提高；

抑制表达水稻OsBRP1基因，植物盐胁迫能力降低。

作为进一步技术方案，表达水稻OsBRP1基因，植物钠元素积累能力降低；

抑制表达水稻OsBRP1基因，植物钠元素积累能力提高。

作为进一步技术方案，所述抑制表达包括基因敲除。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

水稻OsBRP1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示序列，经发明人研究发现，与表达水稻OsBRP1基因的植株相比，敲除水稻OsBRP1基因的植株的盐胁迫能力降低，钠元素积累能力提高，因此，水稻OsBRP1基因能够用于植物盐胁迫能力或钠元素积累能力的调控。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为7天龄水稻幼苗在不同浓度盐胁迫下OsBRP1基因的表达情况；

图2为7天龄水稻幼苗在100mM盐胁迫下OsBRP1基因的表达变化情况；

图3为本发明中植物CRISPR/Cas9基因编辑系统的载体结构示意图；

图4为CRISPR/Cas9-OsBRP1载体构建过程中的凝胶图谱。a.第一轮PCR电泳结果；b.第二轮PCR电泳结果；c.第三轮PCR电泳结果；d.重组质粒菌液PCR扩增电泳图；e.突变体T₀代PCR鉴定电泳图；

图5为OsBRP1突变体阳性植株突变位点分析；

图6为OsBRP1突变体盐胁迫下的表型变化；

图7为OsBRP1突变体地上地下钠元素含量的测定。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

所述水稻OsBRP1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1所示序列如下：

ATGTCGCAGCCGACGCAGTGCCCCTACTGCCGCGCCTCCGGCCCGGCGCGCTGCGTCACGACGCAGCCGCCGCTCTCCCGCGCCGTCTCCGAGTGCTCCTCCTGCGCCCGCCTCGTCCTCGAGCGCCACCTCCACACCCACCCCTTCTTCCCCCTCCTCCCCTCGCTCCACCCGCTCCCCCTCGTCACCCCCGACCTCGCCGACGCCGCGCCGTCGCCGTCCCCCTCGGCCGCCTCCGCCTCCGGCGACGACGACGACGACGACGACCCCTTCCTCCCGGCCGGCTTCGTCTCCGCCTTCTCGGCCTTCTCCCTCGAGCGCCACCCCGTCCTCGCCCGCTCCGCGTCCGCCTTCTCCGGCCAACTCGCCGAGCTCGAGCGCGCGCTCGCCGTCGAATCCGCGGCCTCCTCCACTCCGGACCCCGCGGGGCCTATGGTCTCCGTCGACAGCCTCCGCGCCTACGTCCAGATCGTGGACGTCGCCTCCATCCTGAGGCTGGACCGGGACATAGCCGACCACGCCTTCGAGCTCTTCAAGGACTGCTCCTCCGCTACGTGCCTCAGGAACCGCAGCGTCGAGGCGCTTGCCACGGCCGCACTCGTGCAGGCCATCCGCGAGGCGCAGGAGCCCAGGACCTTGCAGGTTTGTGCTCGTGCTCGTGCTCGTGCTCGCGATGTGTTCGTTCAAATGCTCTCGTGCAGAGTGAGTCAGGCCTAGCGGCTTATCTCTATGATTCTCGTCTCCAACTAAGTCGGATTCAGGAATAGCCAGACGATTGTAGTCTCTGAAACGGAGATTTCCCCGCAATGCCATTCGCTTCTTACCTGTTTAGATACTGGGAATTTCGGATCTTAGTTACCAACGATTGTTGTCTAGGAAGTTCTGTTGGATGATATGCTCTGCTCCCACTATGTTGCATTGTGGACTATCCATTAGTCAGTAAATTTGTCAAAGCACTACACTCAAATGATGTCACCTTTTTAGTTGAGCTGTTGATTATGTTACTTTTAACTAGTGGGAAATACAATGGAAATTTTATCTAGCTTGATTCATGATATTGGTTGAACACAATAGAAGATTATATATATATTTTCAGATTAGATTTTCTTTCTTTTGATTACCTTTACTTTATGCGGCCTTTCACTGAAGCTATTGTAGATTAGGATAACTTAACCATGTTGAGAATACCTTTTTAACCTGACAAAACCACTGGTCGTTCTTCATAGGTGAAGAGTTGAATCAAATGTTAAGTCAGCTGTGGACTTTGGTATATGTGATATTAAACTACACAATCTATTGGCCTGTCGTATTGATTTAATGTAATGCTACCTTTATCAATTAACACTGATTAAGCATTGTTTTCTTGTGTCCAGGAAATCTCTACTGCTAGCAATCTTCCCCAGAAAGAAATTGGAAAATACATCAAAATACTTGGTGAATCACTGAAACTGAGCCAACCTCTTAACAGCAACTCAATAGCAGTTCATATGCCTCGGTTTTGCAGCCTACTCCAGCTCAATAAATCTGCTCAGGTATCAAAAGAGCTGAAAACCTGAAATACCATGAAAAAAAACTAAGTTATGCTGTTAACATATCACTTGCCAATTCCGCAGGAACTTGCAGCCCATATTGGTGAGGTTGTTGTTAATAAATGCTTCTGCACACGGAGGAATCCCATAAGCATATCAGCTGCAGCTATCTATCTTGCGTGTCAGCTTGAAGACAAGCGGAAAACTCAGGCAGAGATCTGTAAGGTAACAGGCCTTACAGAGGTTACTCTGCGTAAAGTGTATAAAGAACTGTTGGAGAATTGGGATGATTTGCTACCCCCTAACTATACACCAGCTACACCACCAGAGAAAGCTTTCCCAATGACCACCATTTATTCATCGCGCTCATCGTCTGGTAAAGATCTTTATCAAGATAAGCAGTTAGACAGTGCTAAGCTAAAGAGCTCAGAAGCTGCAGAGCCTGATCACATGGTCATTGTAAAAGAGGAGGAAGACAAGAAAATTGGTCCATTTAGTCGACCGAGTGCAAAAACCGAGACCCATGACTTGAATCAAGCAATTTGGACGCCAAATGTCTCTTCAACACCATTCTCTTCATCACCGAAATTGGATCATGACAAGACGGAAACAAGCGTCCGTGGGATAAACCTTAACGAGGCATCCTGCACAATGGATACTGACAGACCAGACATGCCTGTGAAGTCACCCTTTGCTGAGAGGTGGCTAAATGAATCAAAGGTGATCCCTTCTCCCAGTAGGCAGCCTGCACCATGGCAGCTTAAGCAAGGAGCACCATCAGCTGGGTCCTCGTATCATAGTATGCCGTACGGCCTGGACCTTCTGTCACGTGGAAAAAGAAATACTGGAGATGGTGGTGATAAGGAGGGGAGGTGA(SEQ ID NO.1)。

目前为止，尚未有人研究过水稻OsBRP1基因的功能，发明人通过CRSIPR/Cas9基因编辑手段靶向突变了OsBRP1基因，并观察了该突变体在生长发育和生物/非生物胁迫中的功能，结果发现该基因在盐胁迫耐性以及钠元素积累中具有重要作用。本发明为培育盐胁迫抗性增强的水稻品种提供了一条重要途径。在农业生产上栽培盐胁迫抗性增强的水稻，对节能节水、盐碱地的利用、增加粮食产量等具有重要意义。

在一些优选的实施方式中，所述植物包括但不限于水稻，或者本领域技术人员所熟知的其他作物。

(a2)：(a1)转录的RNA；

(a3)：(a2)表达的蛋白；

所述性状包括盐胁迫能力或钠元素积累能力中的至少一种。

由上述可知，水稻OsBRP1基因和植物的盐胁迫能力或钠元素积累能力相关，因此可以以水稻OsBRP1基因作为标志物表征植物的盐胁迫能力或钠元素积累能力。相应的，所述OsBRP1基因以及转录得到的RNA或者表达得到的蛋白分子也可以作为水稻性状相关的标志物。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒包括用于扩增水稻OsBRP1基因的引物对，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。经发明人实验发现，上述引物能够特异性实现水稻OsBRP1基因的扩增。

引物序列如下：

OsBRP1-F,5’-CCCAGGACCTTGCAGGAAAT-3’(SEQ ID NO.2)；

OsBRP1-R,5’-ACCGAGGCATATGAACTGCT-3’(SEQ ID NO.3)。

所述性状包括盐胁迫能力或钠元素积累能力中的至少一种。

在一些优选的实施方式中，表达水稻OsBRP1基因，植物盐胁迫能力提高；

抑制表达水稻OsBRP1基因，植物盐胁迫能力降低。

在一些优选的实施方式中，表达水稻OsBRP1基因，植物钠元素积累能力降低；

抑制表达水稻OsBRP1基因，植物钠元素积累能力提高。

在一些优选的实施方式中，所述抑制表达包括基因敲除。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1水稻幼苗在盐胁迫下OsBRP1基因的响应情况

(1)水稻幼苗在不同浓度盐胁迫下OsBRP1基因的表达情况

分别用含有0、50、100、150、200mM NaCl的培养液处理七天苗龄的野生型日本晴水稻24h。用Trizol法分别提取RNA，并用DNase去除DNA污染。利用反转录试剂盒合成cDNA，以水稻β-actin基作为内参基因，在荧光定量仪上扩增OsBRP1，PCR反应条件为95℃1min，变性94℃10s，退火55℃16s，延伸72℃15s，45个循序。PCR引物如下：

OsBRP1-F,5’-CCCAGGACCTTGCAGGAAAT-3’(SEQ ID NO.2)；

OsBRP1-R,5’-ACCGAGGCATATGAACTGCT-3’(SEQ ID NO.3)；

β-actin-F,5’-GCCGTCCTCTCTCTGTATGC-3’(SEQ ID NO.4)；

β-actin-R,5’-GGGGACAGTGTGGCTGAC-3’(SEQ ID NO.5)。

随后，用100mM NaCl处理7天苗龄的野生型日本晴水稻，分别在0、3、6、12、24、48、60、72、84h采样，随后采用同样的方法提取RNA、逆转录成cDNA，并进行荧光定量PCR实验。

如图1所示，荧光定量PCR的结果显示OsBRP1的表达量随盐浓度的增加而升高，说明OsBRP1的表达受盐胁迫诱导。如图2所示，没有盐胁迫处理时，野生型日本晴水稻中OsBRP1的相对表达量较低，且随着时间的推移变化幅度不大；盐胁迫处理后，随着时间的推移，OsBRP1的相对表达量相比盐胁迫处理前有不同程度的增加，进一步表明该基因的表达受盐胁迫的诱导，暗示该基因可能在盐胁迫耐性中起着重要作用。

实施例2CRISPR Cas9-OsBRP1基因编辑载体的构建及纯合突变体的筛选

(1)靶位点选择：在充分考虑脱靶效应的前提下，在OsBRP1基因外显子区域设计了两对靶点，SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示核苷酸序列为两对靶点序列。

U3-F,5’-ggcaGCAGGAGGAGCACTCGGAGA-3’(SEQ ID NO.6)；

U3-R,5’-aaacTCTCCGAGTGCTCCTCCTGC-3’(SEQ ID NO.7)；

U6a-F,5’-gccGGCCGGAGGCGCGGCAGTAG-3’(SEQ ID NO.8)；

U6a-R,5’-aaacCTACTGCCGCGCCTCCGGC-3’(SEQ ID NO.9)。

(2)U3+U6a表达盒的构建

将两对靶点引物等比例混合并进行退火形成双链靶点接头，将退火后的双链靶点接头通过边切边连反应体系连接到pYLsgRNA-OsU3、pYLsgRNA-OsU6a载体上，边切边连反应体系为：BsaⅠ1μL、Cutsmart buffer1μL、ATP(10mM)1μL、pYLsgRNA-OsU3(50ng/μL)1μL、pYLsgRNA-OsU6a(50ng/μL)1μL、靶点接头1μL、T4 DNA ligase(NEB)1μL、T4 DNA ligase(NEB)buffer 1μL、ddH₂O 3μL，在37℃下处理5min后，将20℃下5min的反应作为一个循环，进行4个循环。边切边连反应程序为：37℃5min、20℃5s，4个循环。

再通过三轮Overlapping PCR生成U3+U6a的gRNA表达盒。

第一轮PCR反应包括四个反应，U3和U6a载体各两个反应(反应1和反应2)，其中反应1得到启动子与靶点片段，长度约为500bp，反应2得到靶点与gRNA片段，长度约为140bp。PCR反应体系为：边切边连产物1μL、KOD FX 0.2μL、KOD buffer 10μL、dNTP 2μL、ddH₂O 6μL、引物(U-F+gRNA-R)0.4μL，在94℃下以2分钟进行预变性处理，将98℃下变性10秒、60℃退火30秒、68℃延伸20秒的反应作为一个循环，进行29个循环后再以68℃下进行7分钟的补充延伸。PCR引物如下：

U3-F,5’-ggcaGCAGGAGGAGCACTCGGAGA-3’(SEQ ID NO.6)；

U3-R,5’-aaacTCTCCGAGTGCTCCTCCTGC-3’(SEQ ID NO.7)；

U6a-F,5’-gccGGCCGGAGGCGCGGCAGTAG-3’(SEQ ID NO.8)；

U6a-R,5’-aaacCTACTGCCGCGCCTCCGGC-3’(SEQ ID NO.9)；

U-F,5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’(SEQ ID NO.10)；

gRNA-R,5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’(SEQ ID NO.11)。

以上四个反应分别是U-F+U3-R、gRNA-R+U3-F、U-F+U6a-R、gRNA-R+U6a-F。

PCR产物凝胶图谱如图4中的(a)所示，反应1(泳道1、2)和反应2(泳道3、4)的长度分别为500和140bp左右。

第二轮PCR反应包括两个反应，分别将U3和U6a的产物1和产物2连接起来，得到U3表达盒和U6a表达盒。PCR反应体系为：PCR产物1μL(反应1+2产物)、引物5μL(U3：B1’+B2；U6a:B2’+BL)、KOD FX 1μL、KOD buffer 2μL、dNTPs 8μL、ddH₂O 10μL，PCR反应程序为：94℃2min，98℃10s，60℃30s，30个循环，68℃7min。PCR引物如下：

B1’-M,5’-caacgcttctgtttcgcaagGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO.12)；

B2-M,5’-cgagcccaagacactcctctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID NO.13)；

B2’-M,5’-agaggagtgtcttgggctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO.14)；

BL-M,5’-TCGATGTTGACGAAGCGAGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’(SEQ ID NO.15)。

PCR产物凝胶图谱如图4中的(b)所示，第二轮PCR反应的长度为650bp左右(泳道1、2)。

第三轮PCR反应包括一个反应，其作用是将U3表达盒和U6a表达盒连接起来。反应体系和反应程序与第二轮PCR一样，PCR引物如下：

U3’,5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAcaacgcttctgtttcgcaag-3’(SEQ ID NO.16)；

U6a’,5’-AGCGTGggtctcGaccgACGCGTTCGATGTTGACGAAGCGAGT-3’(SEQ ID NO.17)。

PCR产物凝胶图谱如图4中的(c)所示，第三轮PCR反应的长度为1300bp左右。

(3)CRISPR/Cas9-OsBRP1重组质粒的构建

用Bsa I限制性内切酶分别酶切U3+U6a表达盒产物和pYLCRISPR/Cas9-MH载体，酶切反应体系为：表达盒产物/质粒34μL，Bsa I 2μL、Cutsmart buffer 4μL，并在37℃的水浴环境下进行3h的连续反应。酶切后利用天根通用型DNA纯化回收试剂盒进行纯化。纯化后，16℃过夜连接，过夜连接的反应体系为：表达盒产物8μL、质粒8μL、T4 DNA ligase(NEB)2μL、T4 DNA ligase buffer(NEB)2μL，并在16℃的环境下进行。植物CRISPR/Cas9基因编辑系统的载体结构示意图如图3所示。

(4)阳性克隆的筛选

将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，涂布于含有kana抗性的LB固体培养基中，倒置于37℃培养箱过夜培养。然后挑取单克隆做菌落PCR。菌落PCR的反应体系为：PCRMaster Mix(Takara)10μL、上下引物各0.4μL、单克隆菌落、ddH₂O 9.2μL。菌落PCR反应程序为在95℃下以3min预变性处理，将95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min的反应作为一个循环，进行31个循环再以72℃进行10分钟的补充延伸；然后先电泳鉴定，根据条带的长短初步确定阳性克隆的数量，再利用测序鉴定准确鉴定阳性克隆。PCR反应的引物如下：

SP-ML,5’-GCGCGGTGTCATCTATGTTACTA-3’(SEQ ID NO.18)；

SP-R,5’-CCCGACATAGATGCAATAACTTC-3’(SEQ ID NO.19)。

PCR产物凝胶图谱如图4中的(d)所示，菌液PCR反应的长度为1300bp左右。

(5)转化水稻愈伤组织

将CRISPR/Cas9-OsBRP1重组质粒送去百格基因科技(江苏)有限公司，通过农杆菌介导法进行遗传转化，得到转基因植株。

(6)OsBRP1突变体鉴定及纯合类型分析

利用CTAB法提取转基因植株的DNA，利用鉴定引物对转基因植株的目标片段进行鉴定，确定纯合/杂合状态以及突变类型。PCR反应体系为2×Ex Taq 10μL、引物1μL(上下游引物各0.5μL)、DNA 1μL、ddH₂O补齐至20μL。PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸80s，进行34个循环；72℃延伸10min。PCR反应的引物如下：

OsBRP1-S-F,5’-TCTCCTCTCACAAGGCAACC-3’(SEQ ID NO.20)；

OsBRP1-S-R,5’-GAGGGAGAAGGCCGAGAAG-3’(SEQ ID NO.21)。

PCR产物凝胶图谱如图4中的(e)所示，PCR反应的长度为500～600bp。

将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果用DNAMAN软件进行比对，用Bioedit软件分析峰图。序列对比结果如图5所示，T₀代转基因植株中鉴定出三株纯合移码突变：OsBRP1-6、OsBRP1-24、OsBRP1-50。其中OsBRP1-6缺失58bp、OsBRP1-24缺失53bp、OsBRP1-50插入1bp，缺失了3bp，共缺失2bp。收获T₀代的种子，并在T₁代自交繁种，获得大量纯合体种子(T₂代)。

实施例3OsBRP1突变体表型及生理生化指标分析

(1)OsBRP1突变体表型分析

萌发OsBRP1突变体(两种不同类型，分别为OsBRP1-24和OsBRP1-50)和野生型(wt)日本晴水稻种子，正常培养14天后，移至含有120mM NaCl的营养液中处理五天，然后更换水稻营养液恢复14天，观察OsBRP1的表型变化。盐胁迫后表型如图6所示，发现胁迫5天后，OsBRP1突变体叶片脱水发黄卷曲，野生型并未表现出明显的脱水症状，恢复14天后，OsBRP1突变体难以继续回复生长，野生型日本晴能回复生长。相比于野生型，OsBRP1突变体盐胁迫后植株矮小，植株存活率显著降低，叶片发黄、萎蔫更严重，地上部分和地下部分高度均显著低于野生型，植株的鲜重、干重均也显著低于野生型水稻，表明OsBRP1突变体对盐胁迫更加敏感，说明OsBRP1基因是盐胁迫耐性的正调控因子。

(2)OsBRP1突变体在盐胁迫下的钠元素含量变化情况

萌发OsBRP1突变体(两种不同类型，分别为OsBRP1-24和OsBRP1-50)和野生型(wt)日本晴水稻种子，正常培养14天后，移至含有120mM NaCl的营养液中处理24h，分别取突变体和野生型水稻的地上和地下部分装入信封，在105℃下杀青2h，66℃烘干至恒重，磨样机磨成粉末，称重后将样品装入硝化管中，加入6mL硝酸，放入微波消解仪中，设置程序，消解完毕后，放入赶酸仪设置温度150℃，赶酸2h，最后用3％HNO₃定容。利用标准液分别配置0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L的钠元素标准液，按照浓度梯度由高到低分别进行原子吸收仪的火焰法测定获得对应的消光值，以消光值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。绘制好标准曲线后，利用火焰法检测样品的吸光值，每个处理设置三次生物学重复，每个生物学重复检测三次，在标准曲线上查出对应的钠元素浓度，钠元素的含量计算公式为测定的钠元素浓度*体积*稀释倍数/样品质量。

测定结果如图7显示，OsBRP1突变体地上部分钠含量相较于野生型增长27.89％，地下部分钠含量增长了9％，且地上部分钠积累量则显著高于地下部分。这个结果表明OsBRP1基因在调控钠元素的积累，缓解盐胁迫中起到重要作用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中量大黄山高质量发展研究院有限公司

<120> 水稻OsBRP1基因在调控植物盐胁迫能力和钠元素积累能力中的应用

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2405

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

atgtcgcagc cgacgcagtg cccctactgc cgcgcctccg gcccggcgcg ctgcgtcacg 60

acgcagccgc cgctctcccg cgccgtctcc gagtgctcct cctgcgcccg cctcgtcctc 120

gagcgccacc tccacaccca ccccttcttc cccctcctcc cctcgctcca cccgctcccc 180

ctcgtcaccc ccgacctcgc cgacgccgcg ccgtcgccgt ccccctcggc cgcctccgcc 240

tccggcgacg acgacgacga cgacgacccc ttcctcccgg ccggcttcgt ctccgccttc 300

tcggccttct ccctcgagcg ccaccccgtc ctcgcccgct ccgcgtccgc cttctccggc 360

caactcgccg agctcgagcg cgcgctcgcc gtcgaatccg cggcctcctc cactccggac 420

cccgcggggc ctatggtctc cgtcgacagc ctccgcgcct acgtccagat cgtggacgtc 480

gcctccatcc tgaggctgga ccgggacata gccgaccacg ccttcgagct cttcaaggac 540

tgctcctccg ctacgtgcct caggaaccgc agcgtcgagg cgcttgccac ggccgcactc 600

gtgcaggcca tccgcgaggc gcaggagccc aggaccttgc aggtttgtgc tcgtgctcgt 660

gctcgtgctc gcgatgtgtt cgttcaaatg ctctcgtgca gagtgagtca ggcctagcgg 720

cttatctcta tgattctcgt ctccaactaa gtcggattca ggaatagcca gacgattgta 780

gtctctgaaa cggagatttc cccgcaatgc cattcgcttc ttacctgttt agatactggg 840

aatttcggat cttagttacc aacgattgtt gtctaggaag ttctgttgga tgatatgctc 900

tgctcccact atgttgcatt gtggactatc cattagtcag taaatttgtc aaagcactac 960

actcaaatga tgtcaccttt ttagttgagc tgttgattat gttactttta actagtggga 1020

aatacaatgg aaattttatc tagcttgatt catgatattg gttgaacaca atagaagatt 1080

atatatatat tttcagatta gattttcttt cttttgatta cctttacttt atgcggcctt 1140

tcactgaagc tattgtagat taggataact taaccatgtt gagaatacct ttttaacctg 1200

acaaaaccac tggtcgttct tcataggtga agagttgaat caaatgttaa gtcagctgtg 1260

gactttggta tatgtgatat taaactacac aatctattgg cctgtcgtat tgatttaatg 1320

taatgctacc tttatcaatt aacactgatt aagcattgtt ttcttgtgtc caggaaatct 1380

ctactgctag caatcttccc cagaaagaaa ttggaaaata catcaaaata cttggtgaat 1440

cactgaaact gagccaacct cttaacagca actcaatagc agttcatatg cctcggtttt 1500

gcagcctact ccagctcaat aaatctgctc aggtatcaaa agagctgaaa acctgaaata 1560

ccatgaaaaa aaactaagtt atgctgttaa catatcactt gccaattccg caggaacttg 1620

cagcccatat tggtgaggtt gttgttaata aatgcttctg cacacggagg aatcccataa 1680

gcatatcagc tgcagctatc tatcttgcgt gtcagcttga agacaagcgg aaaactcagg 1740

cagagatctg taaggtaaca ggccttacag aggttactct gcgtaaagtg tataaagaac 1800

tgttggagaa ttgggatgat ttgctacccc ctaactatac accagctaca ccaccagaga 1860

aagctttccc aatgaccacc atttattcat cgcgctcatc gtctggtaaa gatctttatc 1920

aagataagca gttagacagt gctaagctaa agagctcaga agctgcagag cctgatcaca 1980

tggtcattgt aaaagaggag gaagacaaga aaattggtcc atttagtcga ccgagtgcaa 2040

aaaccgagac ccatgacttg aatcaagcaa tttggacgcc aaatgtctct tcaacaccat 2100

tctcttcatc accgaaattg gatcatgaca agacggaaac aagcgtccgt gggataaacc 2160

ttaacgaggc atcctgcaca atggatactg acagaccaga catgcctgtg aagtcaccct 2220

ttgctgagag gtggctaaat gaatcaaagg tgatcccttc tcccagtagg cagcctgcac 2280

catggcagct taagcaagga gcaccatcag ctgggtcctc gtatcatagt atgccgtacg 2340

gcctggacct tctgtcacgt ggaaaaagaa atactggaga tggtggtgat aaggagggga 2400

ggtga 2405

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccaggacct tgcaggaaat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accgaggcat atgaactgct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccgtcctct ctctgtatgc 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggggacagtg tggctgac 18

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggcagcagga ggagcactcg gaga 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaactctccg agtgctcctc ctgc 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gccggccgga ggcgcggcag tag 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaacctactg ccgcgcctcc ggc 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caacgcttct gtttcgcaag gtggaatcgg cagcaaagg 39

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgagcccaag acactcctct ggtccatcca ctccaagctc 40

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agaggagtgt cttgggctcg cactggaatc ggcagcaaag g 41

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcgatgttga cgaagcgagt ccatccactc caagctcttg 40

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttcagaggtc tctctcgact acaacgcttc tgtttcgcaa g 41

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agcgtgggtc tcgaccgacg cgttcgatgt tgacgaagcg agt 43

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcgcggtgtc atctatgtta cta 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cccgacatag atgcaataac ttc 23

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tctcctctca caaggcaacc 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gagggagaag gccgagaag 19

Claims

1.水稻OsBRP1基因在调控植物盐胁迫能力中的应用；

所述水稻OsBRP1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.水稻OsBRP1基因在调控植物钠元素积累能力中的应用；

所述水稻OsBRP1基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻。

4.植物性状相关的标志物，其特征在于，所述标志物选自(a1)：权利要求1或2中所述的水稻OsBRP1基因；

(a2)：(a1)转录的RNA；

(a3)：(a2)表达的蛋白；

所述性状包括盐胁迫能力或钠元素积累能力中的至少一种。

5.用于检测植物性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测权利要求4所述的标志物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增水稻OsBRP1基因的引物对，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

7.一种调控植物性状的方法，其特征在于，包括：表达或者抑制表达权利要求1或2中所述的水稻OsBRP1基因；

所述性状包括盐胁迫能力或钠元素积累能力中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，表达水稻OsBRP1基因，植物盐胁迫能力提高；

抑制表达水稻OsBRP1基因，植物盐胁迫能力降低。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，表达水稻OsBRP1基因，植物钠元素积累能力降低；

抑制表达水稻OsBRP1基因，植物钠元素积累能力提高。

10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，所述抑制表达包括基因敲除。