CN105132428A - 一种与植物根系性状相关的ZmLRT基因及其相关生物材料与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与玉米根系性状相关的ZmLRT基因及其相关实验材料与应用。本发明通过正向与反向遗传学相结合的研究策略，筛选并克隆了一个控制玉米苗期根系性状的ZmLRT基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。通过功能预测及鉴定结果表明：ZmLRT基因为miR166的前体之一，在根系中高丰度表达，将ZmLRT基因在拟南芥和玉米中超表达后，可有效抑制侧根的生长发育，为深入探讨玉米根系生长发育的分子调控机理积累了新的数据和资料。

Description

一种与植物根系性状相关的ZmLRT基因及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物根系性状相关的ZmLRT基因及其相关生物材料与应用。

背景技术

根系是指植物全部根的总称，其中由胚根细胞的分裂和伸长所形成的向下垂直生长的根，是植物体上最早出现的根，称为主根，有时也称直根或初生根。大多数裸子植物和双子叶植物的主根继续生长，明显而发达。主根生长达到一定长度，在一定部位上侧向地从内部生出许多支根，称为侧根。

研究表明，植物细胞的许多重要功能基因通过其转录水平的调节控制根系的形态建成和生长发育。在拟南芥中，已经证实许多转录因子基因在根系发育过程中起关键作用。例如ARF、AUX/IAA和HB家族基因参与根系分生组织的形成；NAC1、IAA28和SLR1等基因参与了侧根的发生与形成(Montieletal，2004)。在水稻中，已经克隆并证实bHLH基因家族中的一个成员(OsRHL1)参与根毛发育(Dingetal，2009)、LBD基因家族的ARL1基因控制不定根原基的形成(Liuetal，2005)。最近，玉米中也克隆了一些根系发育关键基因，例如不定根发育基因RTCS(LBD基因家族)和根毛发育基因(RTH1与RTH3)(Hochholdingeretal，2009)。另外，还有许多结构基因，包括编码细胞骨架蛋白的Actin基因，也发现与根系生长发育有重要关系(Gillilandetal，2003)。

植物microRNA(简称miRNA)是一类具有调控作用的、由20～24个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA，其本身不具有开放阅读框(OpenReadingFrame，ORF)，不编码任何蛋白质，但具有序列保守性、表达时序性和组织特异性。在植物中，miRNA通过与其特异结合的靶mRNA相互作用，在植物生长发育、形态建成、器官发育、开花与育性转换、养分平衡、激素分泌、信号转导、非生物胁迫响应以及病原体的反应等多个生物学途径中起重要的作用(Bartel，2004；Sunkaretal，2004；Sunkaretal，2005；Malloryetal，2006；Yaoetal，2007)。miRNA前体序列可以形成茎环结构，且大部分的miRNA基因来源于基因间的区域或者内含子区域(Jones-Rhoadesetal，2006；Reinhartetal，2002)。另外，microRNA是一类基因表达的负调控因子，主要通过在转录后对其介导的靶基因mRNA进行特异性剪切或阻遏靶mRNA的翻译来调节基因的表达(Baumbergeretal，2005；Qietal，2005)。

miR166广泛存在于单子叶植物和双子叶植物中。例如，在拟南芥和水稻中，miR166通过调节其靶基因：同源异型域-亮氨酸拉链蛋白(homeodomain-leucinezipperprotein，HD-Zip)的表达调控其叶、花及根系的生长发育(Emeryetal，2003；Williamsetal，2005；Jungetal，2007；Hiroshietal，2007)。在苜蓿中，过量表达miR166会减少侧根形成(Boualemetal，2008)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的DNA分子为如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交的cDNA分子或基因组DNA分子。

本发明的另一个目的是提供与上述DNA分子相关的生物材料。

本发明提供的上述DNA分子相关的生物材料为下述A1)至A15)中的任一种：

A1)含有上述DNA分子的表达盒；

A2)含有上述DNA分子的重组载体；

A3)含有上述DNA分子的重组微生物；

A4)含有上述DNA分子的转基因植物细胞系；

A5)含有上述DNA分子的转基因植物组织；

A6)含有上述DNA分子的转基因植物器官；

A7)含有A1)所述表达盒的重组载体；

A8)含有A1)所述表达盒的重组微生物；

A9)含有A1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A10)含有A1)所述表达盒的转基因植物组织；

A11)含有A1)所述表达盒的转基因植物器官；

A12)含有A2)所述重组载体的重组微生物；

A13)含有A2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A14)含有A2)所述重组载体的转基因植物组织；

A15)含有A2)所述重组载体的转基因植物器官。

本发明还有一个目的是提供上述DNA分子或上述相关生物材料的新用途。

本发明提供了上述DNA分子或上述相关的生物材料在调控植物根系性状中的应用。

上述应用中，所述根系性状为总根长和/或主根长和/或根表面积和/或根体积和/或侧根数。

上述应用中，所述调控植物根系性状为减少总根长和/或减少主根长和/或减少根表面积和/或减少根体积和/或减少侧根数。

本发明还提供了上述DNA分子或上述相关的生物材料在编码miR166中的应用。

本发明还提供了上述DNA分子或上述相关的生物材料在培育总根长减少和/或主根长减少和/或根表面积减少和/或根体积较少和/或侧根数减少的植物中的应用。

本发明的最后一个目的是提供一种培育总根长减少和/或主根长减少和/或根表面积减少和/或根体积较少和/或侧根数减少的转基因植物的方法。

本发明提供的培育总根长减少和/或主根长减少和/或根表面积减少和/或根体积较少和/或侧根数减少的转基因植物的方法包括将上述DNA分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物具有如下1)-5)中至少一种的性质：

1)所述转基因植物的主根长小于所述受体植物；

2)所述转基因植物的总根长小于所述受体植物；

3)所述转基因植物的根表面积小于所述受体植物；

4)所述转基因植物的根体积小于所述受体植物；

5)所述转基因植物的侧根数小于所述受体植物。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为玉米；所述双子叶植物具体为拟南芥。

本发明通过正向与反向遗传学相结合的研究策略，筛选并克隆了一个控制玉米苗期根系性状主效QTL(qLRT5-1)区间内的ZmLRT基因。通过功能预测及鉴定结果表明：ZmLRT基因为miR166的前体之一，在根系中高丰度表达，将ZmLRT基因在拟南芥和玉米中超表达后，可有效抑制侧根的生长发育，为深入探讨玉米根系生长发育的分子调控机理积累了新的数据和资料。

附图说明

图1为利用分子标记umc1019筛选纯合近等基因系的结果。

图2为主效QTLqLRT5-1近等基因系发芽后第6天的苗期形态及根系性状统计结果。图2A为苗期形态；图2B为总根长和侧根数统计结果。其中：*表示差异达到显著水平(p<0.05)；**表示差异达到极显著水平(p<0.01)。

图3为综3和87-1苗期根系特异表达探针组分布。

图4为ZmLRT基因在玉米第5染色体上的定位结果。

图5为ZmLRT基因在综3和87-1基因组DNA上的扩增结果及其基因结构。图5A为用于基因克隆的特异性引物的扩增结果；图5B为候选基因ZmLRT的基因结构；图5C为根据测序结果设计的三对引物在综3、87-1基因组DNA上扩增的结果。其中：M为D2000SizeMarker；Exon、Intron分别为外显子和内含子。

图6为ZmLRT全长序列及其包含成熟miR166的核心序列的二级结构分析。图6A为ZmLRT全长序列的二级结构分析；图6B为包含成熟miR166的核心序列的二级结构分析。红线标注处为成熟microRNA位点。

图7为ZmLRT基因的不同引物在105份自交系(包括综3、87-1)中的扩增结果。图7A为用引物ZmLRT在105份不同自交系基因组DNA中的扩增结果；图7B为用引物ZmLRT-1对图7A中未扩增出目标条带的材料进行扩增的结果。

图8为ZmLRT基因的时空表达模式。图8A为ZmLRT的电子表达谱；图8B为ZmLRT在87-1不同组织器官中的表达。

图9为miR166在综3、87-1及杂交种豫玉22以及部分高代重组近交系苗期根系中的表达。其中，“+”代表含有ZmLRT基因，“-”代表不含有ZmLRT基因。

图10为T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系的PCR鉴定及其与野生型的根系表型观察和统计学分析。图10A为T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系的PCR鉴定；图10B为T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系与野生型的根系表型观察；图10C为T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系与野生型根系性状的统计学分析。其中：WT为野生型拟南芥(Columbia)；L2、L5、L18均为T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系；**表示差异达到极显著水平(p<0.01)。

图11为ZmLRT超表达玉米转基因载体构建流程。

图12为T₃代转ZmLRT玉米纯合株系的PCR鉴定。其中：M：D2000SizeMarker；PC：PositiveControl；NC：NegativeControl；L7、L9和L12均为T₃代转ZmLRT玉米纯合株系。

图13为T₃代转ZmLRT玉米纯合株系的苗期根系表型观察及根系性状统计学分析。图13A为根系表型观察；图13B为根系性状统计学分析。其中：L7、L9和L12均为T₃代转ZmLRT玉米纯合株系。*表示差异达到显著水平(p<0.05)；**表示差异达到极显著水平(p<0.01)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的玉米自交系综3是由中国农业大学国家玉米改良中心戴景瑞教授首次通过玉米双交种三系配套法育成，在文献“杨会，王国英，戴景瑞.玉米优良自交系综3、综31的转化研究.农业生物技术学报，2001,9(4):334-337.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

下述实施例中的玉米自交系87-1在文献“刘宗华，王庆东，汤继华，等.优良玉米自交系豫自87-1的血缘及其聚类分析.分子植物育种，2005，3(4):525-530.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

下述实施例中的玉米自交系昌7-2在文献“华福平，申为民，张毅，刘海平，宋志均等.优良玉米自交系昌7-2的特征特性及其利用.河南农业科学,2004,09-0011-03.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

实施例1、ZmLRT基因的获得

一、ZmLRT基因的获得

1、控制根系性状主效QTL(qLRT5-1)近等基因系的构建及表型分析

2005年以强优势杂交组合豫玉22衍生的重组近交系及其亲本自交系综3和87-1为材料，对发芽后第14天的根系性状进行了QTL定位分析，在第5染色体的bin5.05区域鉴定出了控制总根长、体积、表面积和根尖数的重叠的主效QTL，分别解释表型变异的11.63％、12.16％、8.53％和10.87％，且来自亲本自交系综3的等位基因起增效作用(张微，2005)。将这一控制多个根系性状的主效QTL命名为qLRT5-1，该QTL位于标记umc1155和umc1019之间。在此基础上，采用高代回交策略，利用分子标记umc1019进行基因型选择，同时结合表型选择，构建了该主效QTL的3个纯合近等基因系(图1)，分别命名为N143、N146和N151，其中综3为轮回亲本，N143、N146和N151分别由含有87-1位点的重组近交系R19、R185和R248作为供体亲本衍生而来。

在主效QTLqLRT5-1近等基因系构建的基础上，对其根系表型进行了初步分析，结果如图2所示。由图2可以看出，含有87-1位点的近等基因系N143、N146和N151在发芽后第6天的总根长和侧根数目显著低于轮回亲本综3，但是地上部苗期形态存在一定差异，其中，N143和N146明显偏小，而N151与综3之间没有显著差异。表1为综3、N143、N146和N151在发芽后第6天的根系性状的统计结果。以上结果表明，在主效QTLqLRT5-1区间内含有控制根系性状的基因。

表1、主效QTLqLRT5-1近等基因系发芽后第6天的苗期根系性状统计结果

(其中：*表示差异达到显著水平(p<0.05)；**表示差异达到极显著水平(p<0.01))

2、主效QTL(qLRT5-1)区间内候选基因的筛选和染色体定位

为了筛选位于主效QTL(qLRT5-1)区间内的候选基因，对前期建立的玉米自交系综3和87-1苗期根系的转录组表达谱进行数据筛选，鉴定出了1658个差异表达倍数在2倍以上的基因，约占芯片探针总数(17734个)的9.4％，其中仅有99个基因为综3和87-1特异表达基因，数目分别为42个和57个(图3)。在此基础上，将上述99个特异表达基因，利用玉米自交系B73的基因组序列，采用生物信息学方法，分别进行了电子定位，其中73个为基因组信息已知的单拷贝基因，25个基因在玉米基因组中以非单拷贝形式存在，此外，还有一个探针组(Zm.5804.1.A1_a_at)对应的基因无法确定其染色体位置。因此设计了该基因的特异性引物，利用综3和87-1衍生的重组近交系，对其进行了分子标记定位，最终定位于玉米第5染色体上bin5.05区域，位于根系主效QTL(qLRT5-1)区间内，即分子标记umc1155和umc1019之间(图4)。因此，推测该基因可能为根系主效QTLqLRT5-1的候选基因，将其命名为ZmLRT基因，对其进行克隆测序，结果表明：ZmLRT基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

二、ZmLRT基因的分析

1、ZmLRT基因的序列分析

首先将上述步骤一获得的ZmLRT基因序列与基因组序列进行比对，发现该基因组序列区域包括4个外显子和3个内含子(图5B)，其中cDNA区域核苷酸同源性为100％。为了分析ZmLRT基因可能编码的蛋白及其功能，在GenBank数据库中进行了BlastX同源序列比对分析发现，仅在玉米中比对到一个推测的未知功能蛋白，且仅含有73个氨基酸，而在其他物种中没有类似的同源蛋白，据此认为该基因还可能为一个长片段非编码RNA，于是将克隆测序获得的ZmLRT基因的序列在国际microRNA文库miRBase(http://www.mirbase.org/search.shtml)中进行比对，发现其含有成熟的miR166位点。随后利用Mfold软件对ZmLRT基因中包含成熟miR166的核心序列进行了二级结构预测，发现该转录本具有较低的自由能，能够形成典型的microRNA发夹结构，说明该基因为miR166的前体基因之一(图6)。

2、ZmLRT基因的等位变异筛选

在基因组序列分析的基础上，设计了多对PCR引物(表2)，以自交系综3和87-1基因组DNA为模板进行扩增，结果综3中均没有相应的扩增产物(图5C)，说明自交系综3中可能缺失了ZmLRT基因。

表2、ZmLRT候选基因不同区段的特异性引物

以包括综3、87-1在内的105份自交系(表3)的基因组DNA为模板，利用候选基因ZmLRT的特异性引物(ZmLRT-F和ZmLRT-R)进行等位变异鉴定。结果表明，除了综3外，只有9份材料中未能检测目标条带(如图7A中箭头所指)。随后利用另一对特异性引物(ZmLRT-1-F和ZmLRT-1-R)对上述9份自交系材料及综3、87-1进行PCR扩增，发现其中只有除综3外的2份材料(编号分别为30和47)未检出目标条带(图7B)。据此推测在自交系综3中ZmLRT基因的等位变异形式是非常稀有的。

表3、用于候选基因ZmLRT等位变异鉴定的玉米自交系材料

3、ZmLRT基因的时空表达模式分析

(1)为获得ZmLRT基因在玉米中的时空表达模式，在ZmLRT基因序列的基础上，根据公共数据库中不同cDNA文库中测序获得的该基因的数目进行电子表达谱分析，分析结果如图8A所示，从图中可以看出，ZmLRT基因在根系中高丰度表达。

(2)在ZmLRT基因序列3’端设计了片段大小为224bp的基因特异性引物ZmLRT-RT-F和ZmLRT-RT-R，以玉米自交系87-1发芽后水培8天的苗期根系和叶片、拔节期的叶鞘、节和节间、小花分化期的雄穗和雌穗及抽穗后的雌穗花丝和苞叶的基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR方法，对ZmLRT基因表达的组织特异性进行检测。实时荧光定量PCR引物为：

ZmLRT-RT-F：5’-GTGCATGCAGTAAGTACAAGCA-3’；

ZmLRT-RT-R：5’-ACTTCACCGGTTGCAGTTG-3’。

结果如图8B所示：ZmLRT在苗期根系中的表达显著高于苗期叶片、小花分化期的雄穗、雌穗及抽穗后的雌穗花丝，而在拔节期的叶鞘、节和节间及抽穗后的雌穗苞叶中均未检测到表达。这表明ZmLRT基因可能在根系的发育过程中起重要作用。

(3)由于ZmLRT基因为miR166的前体，并且在综3中缺失，继续采用Northern杂交方法，对miR166在杂交种豫玉22及其衍生的部分高代重组近交系以及亲本综3、87-1苗期根系中的表达进行了初步分析。具体步骤如下：

1)电泳分离smallRNAs并转移至杂交膜

A、用15％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离不同分子量的RNA，250V恒压预电泳30min；

B、取不少于30g的总RNA加等体积LoadingBuffer，65℃温浴10min后立即冰浴5min待点样；

C、预电泳结束的PAGE胶孔中会留有大量尿素，冲孔点样后250V恒压电泳2-3h，待溴酚蓝电泳至凝胶长度2/3时停止；

D、切胶后用EtBr进行染色，通过检测5SrRNA和tRNA亮度，确定RNA上样量是否一致；

E、用Bio-Rad公司MiniTrans-Blot转印仪200mA横定电流转印1.5h，将PAGE胶中的RNA转至杂交膜；

F、将带有RNA的杂交膜紫外交联90秒，置于80℃烘干1h，保存于4℃备用。

2)Northern杂交验证

A、预杂交

将步骤1)获得的杂交膜置于杂交管中，加入7mlChurch缓冲液，于分子杂交炉37℃过夜预杂交；

B、探针标记和杂交

取0.5ml微量离心管，分别加入以下成分：10×T4PolyNucleotiedeKinasebuffer2μl、OligoProbe(20μM)1μl、T4PolyNucleotiedeKinase1μl、γ-³²P-ATP(10μCi/μl)5μl、ddH₂O加至20μl，混匀后短暂离心。

C、将离心管置于37℃恒温孵育60min，65℃加热5min后迅速冰浴，5min后加入杂交管中，37℃杂交大于20h；

3)洗膜和压片

A、50℃预热洗膜液，洗膜也在50℃分子杂交炉中完成；

B、2×WashingBuffer(2×SSC,0.2％SDS)，洗涤10min；

C、1×WashingBuffer(1×SSC,0.1％SDS)，洗涤两次，每次5min；

D、取出杂交膜，用保鲜膜包裹后于暗室内将其与X光片一起置于X光片夹中，视杂交信号强弱置于-80℃放射自显影1-3天。

4)X光片的显影和定影

A、在三个托盘中分别盛放自来水、显影液和定影液；

B、在暗室中将X光片从X光片夹中取出，迅速放入显影液中，室温显影3-6min，待目标条带显影清晰后拿出，在自来水中漂洗1-2秒；

C、迅速放入定影液中，定影1min后取出，在自来水中漂洗后晾干。

结果如图9所示：miR166在玉米自交系87-1及含有ZmLRT基因重组近交系R67中的表达丰度均高于玉米自交系综3及不含有ZmLRT基因的重组近交系R65、R147和R153。

实施例2、转ZmLRT拟南芥的获得及功能验证

一、转ZmLRT拟南芥的获得

1、超表达载体p35S::ZmLRT的构建

将序列1所示的DNA分子插入pCAMBIASuper1300载体(上海北诺生物科技有限公司，产品目录号：addgene0595)的XbaI和KpnI酶切位点间，且保持pCAMBIASuper1300载体的其它序列不变，得到ZmLRT基因的超表达载体p35S::ZmLRT。

2、农杆菌感受态细胞的制备

1)挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于3mlYEB液体培养基(25mg/L的庆大和100μg/ml利福平)中，28℃振荡培养过夜；

2)取过夜培养菌液500μl接种于50mlYEB(25mg/L庆大和100μg/ml利福平)液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5；

3)5,000rpm离心5min，收集菌体，并用10ml0.15mmol/lNaCl悬浮农杆菌细胞，5,000rpm离心5min；

4)加入1ml预冷的20mmol/lCaCl₂悬浮细胞，得到农杆菌感受态细胞，冰浴，24h内使用，或分装成每管200μl，液氮中速冻1min，置-80℃保存备用。

3、农杆菌转化和鉴定

1)取200μl步骤2制备的农杆菌感受态细胞，冰上缓慢融化；

2)加入1μg的步骤1制备的超表达载体p35S::ZmLRT，冰上30min；

3)液氮中速冻1min，37℃水浴5min，28℃水浴2min；

4)加入1mlYEB培养基，28℃恢复培养4h；

5)4,000rpm离心5min，弃上清900μl；

6)将剩余液体涂布于含有50μg/ml卡那的YEB平板上，28℃培养约2-3天；

7)挑取单菌落，接种于YEB液体培养液(含有50μg/ml卡那、25mg/L的庆大和100μg/ml利福平)中，28℃振荡培养过夜；

8)小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板，进行PCR扩增(引物为ZmLRT–F:5’-AAGGAGGAAGCTTTCTTACTTTGA-3’；ZmLRT-R:5’-ATTCTAGCTTAGCACTCTAGGGCTTT-3’)和酶切鉴定，得到含有p35S::ZmLRT的农杆菌GV3101。

4、拟南芥转化(蘸花法)和转ZmLRT拟南芥纯系的获得

1)将步骤3制备的含有p35S::ZmLRT的农杆菌GV3101(北京博迈德基因技术有限公司，产品目录号:CC3201)接种于10mlYEB培养基(含有100mg/L利福平、25mg/L庆大和100mg/L卡那)中过夜预培养(28℃，200rpm)，进行菌液活化，得到活化后的菌液；

2)将步骤1)获得的活化后的菌液转移至500ml含相同抗生素的YEB培养基中扩大培养3h，5000g离心15min，收集菌体并重悬于转化缓冲液，并将菌液终浓度调制OD₆₀₀＝0.8，得到扩大培养后的菌液；

3)向扩大培养后的菌液中加入表面活性剂Silvet(表面活性剂Silvet在扩大培养后的菌液中的质量分数为0.05％)，得到待侵染的菌液，将其置于平皿中；将野生型拟南芥(哥伦比亚型)的花苔浸入待侵染的菌液中；蘸花1min后取出，用充满气的保鲜袋包住侧放于托盘中，暗培养24h后恢复光照培养，精细管理直至结实，收获成熟T₀代种子；

4)将步骤3)获得的T₀代种子用0.5％次氯酸钠溶液(包括0.5％次氯酸钠和0.01％Triton-X100)消毒15min，然后用无菌水清洗6次。用灭菌的滴管或枪头将消毒后的种子点播在MS选择培养板(30mg/L潮霉素)上；

5)4℃下春化3天后，移入光照培养箱中(22℃恒温，24h光照，光强30-40μmol.m^-2s^-1)。10天后挑选转化体，转化体表现为真叶生长健康颜色呈深绿色，根伸长至培养基中。将转化体幼苗转入土壤，培植移入土壤中的植株至收获T₁代种子；

6)同样方法种植T₁代种子，在筛选培养基上观察，并根据成活/死亡比例筛选统计上符合3:1分离规律的株系。然后种植到土壤中，每个株系至少种植30棵，待成熟后单株收获，得到T₂种子。同样方法种植T₂代种子，每个T₁代株系后代至少种植200棵，待10天后观察，选择没有死亡的T₂纯系，培植移入土壤中，收获得到T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系。并对其进行分子鉴定。具体步骤如下：

提取T₃代转ZmLRT拟南芥植株叶片的基因组DNA，以其为模板，以基因特异性引物ZmLRT-F和ZmLRT-R(以Actin引物为对照)(图10A上对照是Actin，其引物是AtActinF：5’-CGAGGGCTGTGTTTCCAAGT-3’，AtAcintR：5’-TGTCCCATTCCAACCATCACT-3’)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。含有大小为2517bp的目的条带的T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系植株即为T₃代阳性转ZmLRT拟南芥纯合株系植株。

结果如图10A所示：T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系L2、L5、L9、L18、L25、L28均含有大小为2517bp的目的片段，而野生型拟南芥无大小为2517bp的目的条带。选取T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系L2、L5、L18进一步用于下述的功能验证试验。

二、转ZmLRT拟南芥的功能验证

随机选取发芽后15天的T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系L2、L5、L18和野生型拟南芥(WT)各10株，对各拟南芥植株的侧根数目和主根长进行统计分析。

结果如图10所示：在发芽后15天时，野生型的侧根数为11.89±1.97，而T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系L2、L5、L18的侧根数分别为4.0±0.96、6.28±1.74和6.40±1.34，比野生型减少达50％左右，T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系L2、L5、L18的侧根数目比野生型均明显减少；T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系L2和T₃代转ZmLRT拟南芥纯合株系L5的主根长有所变短。说明ZmLRT基因可以调控植物的侧根数和主根长。

实施例3、转ZmLRT玉米的获得及其功能验证

一、转ZmLRT玉米的获得

1、表达载体pCAMBIA3300-Pubi::ZmLRT的构建(图11)

1)将序列1所示的ZmLRT基因片段两端通过PCR方法加上用于定向插入的酶切位点，用BamHI和KpnI进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段；

2)用BamHI和KpnI对pCAMBIA1300载体(优宝生物，产品目录号：VT1387)进行双酶切，与步骤1)获得的目的片段进行连接，获得pCAMBIA1300-pUBI::ZmLRT中间载体；

3)用EcoRI和HindIII对步骤2)获得的pCAMBIA1300-pUBI::ZmLRT中间载体进行双酶切，回收得到大小为4.7kb的带有Ubiquitin启动子的基因片段，其核苷酸序列如序列表中序列2所示；

4)用EcoRI和HindIII对pCAMBIA3300载体(优宝生物，产品目录号：VT1385)进行双酶切，回收大小为8.5kb的载体大片段；

5)将步骤3)回收的带有Ubiquitin启动子的基因片段和步骤4)回收的载体大片段连接，获得表达载体pCAMBIA3300-Pubi::ZmLRT，并对其进行测序。

测序结果表明：表达载体pCAMBIA3300-Pubi::ZmLRT为将序列2所示的DNA片段插入到pCAMBIA3300载体的EcoRI和HindIII酶切位点间，且保持pCAMBIA3300载体其他序列不变得到的载体。

2、重组菌的获得

将步骤1的表达载体pCAMBIA3300-Pubi::ZmLRT转入农杆菌LBA4404感受态细胞(北京博迈德基因技术有限公司，产品目录号：CC2901)，得到重组菌。

3、玉米遗传转化及转基因纯系筛选

采用苗端转化法，以昌7-2为受体材料，用步骤2获得的重组菌对玉米芽尖进行遗传转化，得到芽尖转化后的玉米。当芽尖转化后的玉米长到三叶期时喷施除草剂Basta进行筛选，得到阳性苗，将获得的阳性苗移栽大田，培养，得到转基因株系。并对其进行PCR鉴定(鉴定转基因株系所用的引物为：Bar-F：5’-CCATCGRCAACCACTACATCGAG-3’；Bar-R：5’-CTAAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’)，将鉴定得到的阳性植株(标记为T₀代)进行严格自交并收获，种子标记为T₁代，来自同一株T₀代的转基因后代为一个株系；每个株系随机选取其中部分种子种植，并对幼苗进行PCR检测，将筛选到的阳性植株进行严格自交并收获，种子标记为T₂代；同样的方法获得T₃代转ZmLRT玉米纯合株系。

T₃代转ZmLRT玉米纯合株系的PCR鉴定结果如图12所示。图中可以看出T₃代转ZmLRT玉米纯合株系L7、L9、L12均含有目的条带(439bp)，而野生型玉米无大小为439bp的目的条带(PC)。选取T₃代转ZmLRT玉米纯合株系L7、L9和L12进一步用于下述的功能验证试验。

二、转ZmLRT玉米的功能验证

取T₃代转ZmLRT玉米纯合株系L7、L9、L12和野生型玉米(昌7-2)的种子各30粒置于培养皿中，28℃浸泡48h后，采用水培的方法种植于培养室(通气状况良好，相对湿度：40％-60％，昼夜温度：25℃/22℃，光照条件：16h光照/8h黑暗)，在发芽后第4、6、8天进行取材，每个材料取3个独立的生物学重复，每个重复将5株根系混合取样。根系性状的测定利用Frahm等(2003)改良的方法以及WinRHIZO(RegentInstruments，Quebec，Canada)软件进行分析，测定的根系具体性状为总根长、侧根数、根表面积和根体积。经t测验分析不同转基因株系与野生型之间的差异显著性。

结果如图13和表4所示：T₃代转ZmLRT玉米纯合株系L7、L9、L12的总根长在发芽后第4、6和8天都略短于野生型，T₃代转ZmLRT玉米纯合株系L12的总根长在第4天时最短，仅为野生型的50％左右。T₃代转ZmLRT玉米纯合株系L7、L9、L12与野生型的侧根数在发芽后第4天时差异不明显(L12除外)，而在第6和8天时显著少于野生型。从表4可以看出，与野生型相比，T₃代转ZmLRT玉米纯合株系L7、L9、L12的根表面积和根体积在发芽后第4、6和8天也分别有不同程度的降低。

表4、以昌7-2为受体的T₃代转ZmLRT玉米苗期根系性状统计结果

其中：*表示差异达到显著水平(p<0.05)；**表示差异达到极显著水平(p<0.01)

Claims (8)

1.一种DNA分子，为如下1)或2)或3)：

1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交的cDNA分子或基因组DNA分子。

2.与权利要求1所述的DNA分子相关的生物材料，为下述A1)至A15)中的任一种：

A1)含有权利要求1所述的DNA分子的表达盒；

A2)含有权利要求1所述的DNA分子的重组载体；

A3)含有权利要求1所述的DNA分子的重组微生物；

A4)含有权利要求1所述的DNA分子的转基因植物细胞系；

A5)含有权利要求1所述的DNA分子的转基因植物组织；

A6)含有权利要求1所述的DNA分子的转基因植物器官；

A7)含有A1)所述表达盒的重组载体；

A8)含有A1)所述表达盒的重组微生物；

A9)含有A1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A10)含有A1)所述表达盒的转基因植物组织；

A11)含有A1)所述表达盒的转基因植物器官；

A12)含有A2)所述重组载体的重组微生物；

A13)含有A2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A14)含有A2)所述重组载体的转基因植物组织；

A15)含有A2)所述重组载体的转基因植物器官。

3.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2所述的相关生物材料在调控植物根系性状中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述根系性状为总根长和/或主根长和/或根表面积和/或根体积和/或侧根数。

5.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2所述的相关生物材料在编码miR166中的应用。

6.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2所述的相关生物材料在培育总根长减少和/或主根长减少和/或根表面积减少和/或根体积较少和/或侧根数减少的植物中的应用。

7.一种培育总根长减少和/或主根长减少和/或根表面积减少和/或根体积较少和/或侧根数减少的转基因植物的方法，包括将权利要求1所述的DNA分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物具有如下1)-5)中至少一种的性质：

1)所述转基因植物的主根长小于所述受体植物；

2)所述转基因植物的总根长小于所述受体植物；

3)所述转基因植物的根表面积小于所述受体植物；

4)所述转基因植物的根体积小于所述受体植物；

5)所述转基因植物的侧根数小于所述受体植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。