CN115710588B - 超量表达bna-miR166f在改良油菜收获指数等复杂数量性状中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于油菜改良技术领域，具体涉及超量表达bna‑miR166f在改良油菜收获指数等复杂数量性状中的应用。本发明揭示了bna‑miR166f与油菜收获指数、角果长度、千粒重、籽粒大小等性状密切相关，过表达bna‑miR166f可同时提高油菜角果长度、千粒重、籽粒大小以及收获指数性状。因此，bna‑miR166f超量表达或者调控bna‑miR166f超量表达的物质或方法均可用于实现多个油菜产量相关复杂性状的改良。
Description
技术领域
本发明属于油菜产量改良技术领域，具体涉及超量表达bna-miR166f在改良油菜收获指数等复杂数量性状中的应用。
背景技术
油菜(Brassica napus L.)是我国重要的油料作物之一，每年全国种植面积超过700万公顷，收获的油菜籽为国民提供了一半以上的自产食用植物油，因此，稳定和提升油菜籽的总产量，是我国食用油供给安全的有力保障。近年来，我国油菜单产的增长幅度趋于平缓，表明油菜单产短期内很难有较大突破。
收获指数(harvest index，HI)通常指作物可收获部分占整个地上植株的比重，反映了作物可被收获利用部分的比例，油菜的收获指数平均约为0.21，远低于其他农作物如大麦(HI＝0.50)、玉米(HI＝0.53)、大豆(HI＝0.46)、小麦(HI＝0.45)等，说明油菜的收获指数有较大的提升空间，其遗传改良可以作为提升产量的突破口之一。油菜的收获指数一般指籽粒产量(seed yield，SY)占地上部分生物产量(biomass yield，BY)的比值(HI＝SY/BY)，研究认为，籽粒产量主要由单株角果数(pod number,PN)、每角粒数(seed number persilique,SN)和千粒重(thousand seeds weight,TSW)等要素决定，而生物产量可以分解为茎秆干重(stem dry weight，SDW)和侧枝生物产量(canopy biomass yield，CBY)，侧枝生物产量又由分枝和角果组成。由此可见，油菜的收获指数是一个受环境及多基因联合调控的典型的数量性状，单基因很难大幅调控油菜收获指数等复杂数量性状。
microRNA(miRNA)可同时调控多个靶基因的表达，是复杂数量性状的重要研究目标。目前有关miRNA在植物生长发育调控作用中的报道多集中于拟南芥和水稻等模式植物，在甘蓝型油菜中的报道较少，因此研究miRNA对甘蓝型油菜生长发育过程中的调控作用，尤其是关于miRNA对油菜收获指数等复杂数量性状的研究对油菜的遗传改良育种具有重要意义。基于此，本发明申请人对油菜收获指数性状进行了遗传解析及候选miRNA鉴定，发现bna-miR166f在高低收获指数极端材料中具有显著的差异表达特性，而bna-miR166f对应的靶基因在多个组织部位都具有与bna-miR166f相反的表达趋势。发明人进一步构建了bna-miR166f的超量及干扰表达载体并对油菜进行遗传转化，进而针对bna-miR166f在甘蓝型油菜中的功能进行验证，发现超量表达bna-miR166f可同时调控多个油菜产量相关数量性状，包括收获指数、角果长度、千粒重、籽粒大小等，初步证明了bna-miR166f在改良油菜收获指数等复杂数量性状中发挥了重要作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供超量表达bna-miR166f在改良油菜收获指数等复杂数量性状中的应用，本发明的目的之二在于提供一种提高油菜收获指数性状的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
1.超量表达bna-miR166f在改良油菜收获指数等复杂数量性状中的应用，所述改良油菜收获指数等复杂数量性状为：同时提高角果长度、提高千粒重、提高籽粒大小以及提高收获指数性状。
本发明中优选的，改良油菜为甘蓝型油菜。
2.一种提高油菜收获指数性状的方法，所述方法包括在油菜中超量表达bna-miR166f基因。
本发明中优选的，在油菜中超量表达bna-miR166f基因的方法包括如下：采用Gateway的方法将目标片段先克隆到pENTR-T-TOPO入门载体上，再采用LR反应将目标片段转移到pEarlyGate101载体上；以高收获指数材料YC24叶片的DNA为模板，采用OE_miR166fF和OE_miR166f R引物扩增，回收Bna-miR166f过量表达的片段OE-miR166f，将获得的过表达片段用M13引物检测筛选阳性大肠杆菌克隆菌株，经测序验证正确的菌株提取质粒后LR反应将目的片段转移到pEarlyGate101载体上，采用相应片段的克隆引物检测，筛选阳性菌株后进行测序验证，验证序列完全正确的菌株提取质粒后转化到农杆菌GV3101中，经PCR鉴定和测序验证正确后形成转基因工程菌株，将转基因工程菌进行遗传转化获得过表达bna-miR166f的改良油菜。
本发明中优选的，所述目标片段由如下方法获得：
(1)提取bna-miR166f的茎环序列，将序列中的U替换为T，上游引物OE_miR166f F取茎环5’端序列19bp并在5’端加上CACC四个碱基，下游引物OE_miR166f R为茎环序列3’端20bp序列的反向互补序列；
(2)以高收获指数材料YC24叶片DNA为模板，采用Fast Pfu DNA Polymerase进行扩增，回收130bp左右的目标片段。
本发明中优选的，采用Fast Pfu DNA Polymerase进行扩增的方法如下：
反应试剂为：
反应条件为：短暂离心后在PCR仪上进行如下反应：
本发明中优选的，所述油菜为甘蓝型油菜。
本发明的有益效果在于：
1、本发明对bna-miR166f的功能进行了鉴定，发现bna-miR166f与油菜收获指数、角果长度、千粒重、籽粒大小等复杂数量性状均密切相关，超量表达bna-miR166f可提高油菜角果长度、千粒重、籽粒大小以及收获指数性状。因此，bna-miR166f超量表达或者调控bna-miR166f超量表达的物质或方法均可用于实现油菜产量的改良。
2、本发明提供了超量表达bna-miR166f在增加角果长度、提高千粒重、提高籽粒大小以及提高油菜收获指数性状的用途，为油菜产量的改良提供了新的思路和方法。
3、本发明提供了一种提高油菜收获指数性状的方法，即通过在油菜中超量表达bna-miR166f增加角果长度、提高千粒重，提高籽粒大小，进而提升油菜收获指数，为油菜产量的改良提供了新的思路和方法。
附图说明
图1为bna-miR166前体序列的二级结构；
图2为bna-miR166靶基因HD-ZipⅢ家族在拟南芥、白菜、甘蓝、甘蓝型油菜中的进化分析；表示拟南芥基因，/>表示白菜基因，/>表示甘蓝基因，/>表示甘蓝型油菜基因；
图3(A)为bna-miR166 a,b,c,d,e与其预测靶基因的靶位点分析，(B)为bna-miR166f与其预测靶基因的靶位点分析；
图4为bna-miR166各成员(A)及其预测靶基因(B)在收获指数极端材料不同环境以及不同组织器官中的表达量热图。YC24：高收获指数材料；YC46/52：低收获指数材料；CQ：重庆环境；YN：云南环境；数字0、30代表花后天数；J：茎秆；ZP：主花序角果皮；ZS：主花序籽粒；
图5为bna-miR166f过量表达和mimicry干扰表达载体构建，其中，A:载体构建流程；B:过表达OE-miR166f和干扰表达MIM-miR166f回收片段大小；C:过表达片段OE-miR166f克隆到pENTR-T-TOPO上阳性菌株检测；D:过表达片段OE-miR166f克隆到pEarlyGate101上阳性菌株检测；E:干扰表达片段MIM-miR166f克隆到pENTR-T-TOPO上阳性菌株检测；F:干扰表达片段MIM-miR166f克隆到pEarlyGate101上阳性菌株检测；
图6为超量及干扰表达bna-miR166f转基因油菜中bna-miR166f表达量的qRT-PCR验证；
图7为超量及干扰表达bna-miR166f转基因油菜中bna-miR166f的表达模式分析。数字15、25、35代表花后天数；Le：叶；Fl：花；Bu：蕾；SAM：茎尖生长点；AM：腋芽；P：角果皮；S：籽粒；
图8为超量及干扰表达bna-miR166f转基因油菜株系苗期(A)和花期(B)的表型特征；
图9为超量及干扰表达bna-miR166f转基因油菜成熟期植株(A)、角果(B)和籽粒(C/D)的表型特征。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
需要说明的是，本发明中未详细说明的实验方法均为现有技术，如本发明中将转基因工程菌进行遗传转化，获得转基因油菜的方法等。本发明中使用的高HI材料YC24由西南大学从自然群体2012-2013年度及2013-2014年度在重庆和云南种植的320份甘蓝型油菜资源中筛选而来，其收获指数性状高于中双11常规品种。
1、实验材料
1.1拟南芥遗传转化受体哥伦比亚野生型、油菜遗传转化受体中双11、高收获指数材料YC24(SWU47)为重庆市西南大学油菜工程中心保存和提供，其余试剂及试剂盒如下表1：
表1实验试剂和试剂盒
1.2实验中克隆、RT-qPCR检测、转基因阳性检测等引物见表2，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表2实验中克隆、RT-qPCR检测、转基因阳性检测等引物
2、bna-miR166及其靶基因的生物信息学分析
2.1 bna-miR166基因家族分析
整理bna-miR166家族的前体序列和成熟序列；通过UNAFold网(http://www.unafold.org/)预测bna-miR166前体序列的二级结构，以系统默认参数运行；采用BLAST将bna-miR166的前体序列对甘蓝型油菜数参考基因组“Darmor_bzh”v4.1上，确定各个bna-miR166前体基因序列在基因组中的位置。
在miRBase中搜索查询bna-miR166家族，共获得6个bna-miR166成员：bna-miR166a、bna-miR166b、bna-miR166c、bna-miR166d、bna-miR166e和bna-miR166f(表3)，这6个miRNA对应着6个前体序列与2个成熟miRNA，这2个成熟的miRNA序列长度相同，碱基数均为21nt，仅有一个位点的差异。6个bna-miR166前体序列不规则的分布在甘蓝型油菜基因组的6条染色体上，其中bna-miR166a位于染色体A04上；bna-miR166b位于染色体C07上；bna-miR166c位于染色体A06上；bna-miR166d位于染色体C09上；bna-miR166e位于染色体C06上；bna-miR166f位于染色体C05上(表3)。
表3 bna-miR166基因家族成熟序列及其染色体定位
通过mfold网站预测这6个bna-miR166前体序列的二级结构，并将其可视化，绘制成图(图1)，这些前体序列的长度相似，碱基数在118～135nt，均能折叠为稳定的发卡结构，并且bna-miR166的前体序列的茎环结构较为多样，总体上可以分为两类：其中类型Ⅰ具有长臂、属于典型茎环结构，包括pre-MIR166c、pre-MIR166d、pre-MIR166e和pre-MIR166f；类型Ⅱ则为类型Ⅰ的变体，具有复杂多变的茎环结构，包括pre-MIR166a和pre-MIR166b。
2.2 bna-miR166家族的靶基因预测
使用在线靶位点分析软件psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)预测分析bna-miR166的靶基因，并对bna-miR166作用于靶基因的靶定位点进行可视化图片绘制。
psRNATarget预测分析显示bna-miR166的靶基因共243个，合并相同基因，在期望值≤2.0的条件下获得10个bna-miR166的靶基因(表4)。值得注意的是，bna-miR166a、bna-miR166b、bna-miR166c、bna-miR166d、bna-miR166e的成熟序列完全相同，而bna-miR166f与bna-miR166家族其他成员的成熟序列具有一个位点的差异，靶基因预测结果中发现，bna-miR166a、b、c、d、e预测到的10个靶基因与bna-miR166f所预测到的10个靶基因完全相同，并且靶定位点也完全一致，所有靶基因的注释也均为剪切，体现了bna-miR166家族具有一定的保守性。bna-miR166的10个靶基因不规则的分布于ChrA02、ChrA04、ChrC05、ChrA09、ChrC09_random、ChrA10、ChrC06、ChrA06、ChrC04和ChrA05这10条染色体上(表4)。
表4 bna-miR166家族成员的靶基因预测
2.3 bna-miR166靶基因HD-ZIPⅢ家族鉴定
从TAIR数据库(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)中下载5个AtHD-ZIPⅢ的蛋白序列，分别是AT1G30490/AtHB9(PHV)、AT2G34710/AtHB14(PHB)、AT1G52150/AtHB15(CNA)、AT4G32880/AtHB8和AT5G60690/IFL1(REV)，并以此序列通过BLASTp比对到BRAD数据库(BRAD,http://brassicadb.org/brad/index.php)，E-value阈值设定为≤e-20，最终鉴定到36个BnaHD-ZipⅢs、17个BraHD-ZipⅢs、13个BolHD-ZipⅢs同源成员。使用MEGA7.0软件进行多重序列比对，采用邻接法(neighbour-joining,NJ)构建HD-ZIPⅢ系统进化树，bootstrap值设定为1000。如图2可见，与AT5G60690同源的BnaA02g06170D、BnaC09g54340D、BnaA10g13520D、BnaA06g18550D，与AT2G34710同源的BnaA04g20300D、BnaC04g10480D、BnaA05g09120D，与AT1G30490同源的BnaC05g23470D和BnaA09g26050D，与AT1G52150同源的BnaC06g05240D为bna-miR166f的靶基因，而AT4G32880成员同源的Bna-HD-ZipⅢs家族成员不是bna-miR166f的靶基因。
对bna-miR166家族所预测到的10个靶基因与bna-miR166家族成员识别的靶定位点及靶序列作图(图3)，可见bna-miR166家族与其靶基因的靶序列并不是完全互补，并且靶向序列在靶基因中的位置也是不规则的，其中靶基因BnaA04g20300D、BnaC05g23470D、BnaA09g26050D、BnaC04g10480D和BnaA05g09120D同bna-miR166f的靶定位点完全一致，而这5个靶基因均与AT2G34710序列相似度较高，可能由同一基因进化而来。
2.4 bna-miR166及其靶基因的表达模式分析
分析bna-miR166家族不同成员及其预测靶基因在收获指数极端材料不同环境及不同组织器官中的RNA-seq和sRNA-seq结果，发现bna-miR166f在收获指数极端材料中具有显著的时空表达特异性，但bna-miR166a/b/c/d/e在收获指数极端材料的不同环境及组织器官中均不具有明显的差异表达特性(图4A)。其预测靶基因BnaA04g20300D、BnaC05g23470D、BnaA09g26050D、BnaC04g10480D和BnaA05g09120D表达模式基本接近：在角果皮中表达量较低，而在种子中表达量较高，而另外5个靶基因在各个组织部位中的表达量均较高(图4B)。bna-miR166f与BnaA02g06170D、BnaA04g20300D、BnaA05g09120D、BnaA06g18550D、BnaA09g26050D、BnaA10g13520D、BnaC04g10480D、BnaC05g23470D、BnaC06g05240D在高、低收获指数材料中的多个组织部位的表达量呈明显的负调控关系，如bna-miR166f与BnaC05g23470D、BnaC06g05240D在不同收获指数材料盛花期茎秆(0J)中的表达量呈明显的负相关，bna-miR166f与BnaA02g06170D，BnaA09g26050D在高、低收获指数材料籽粒中的表达差异趋势相反(图4)。
3、bna-miR166f超量及mimicry干扰表达载体的构建
采用Gateway的方法将目标片段先克隆到pENTR-T-TOPO入门载体上，再采用LR反应将目标片段转移到pEarlyGate101载体上(图5A)。以高收获指数材料YC24叶片的DNA为模板，采用OE_miR166f F和OE_miR166f R引物扩增，回收Bna-miR166f过量表达的片段OE-miR166f；采用拟南芥叶片RNA反转录获得的cDNA为模板，扩增回收获得引入携带bna-miR166f突变碱基的mimicry干扰片段MIM-miR166f(图5B)，过量表达和干扰表达片段与预计片段长度相符，进行后续实验。
将获得的过表达片段和干扰表达片段克隆到pENTR-T-TOPO入门载体上，用M13引物检测筛选阳性大肠杆菌克隆菌株(图5C，E)，经测序验证正确的菌株提取质粒后LR反应将目的片段转移到pEarlyGate101载体上，采用相应片段的克隆引物检测(图5D，F)，筛选阳性菌株后进行测序验证，验证序列完全正确的菌株提取质粒后转化到农杆菌GV3101中，经PCR鉴定和测序验证正确后形成转基因工程菌株。
3.1 bna-miR166f过表达载体构建的具体方法如下：
(1)提取bna-miR166f的茎环序列，将序列中的U替换为T，上游引物OE_miR166f F取茎环5’端序列19bp并在5’端加上CACC四个碱基，下游引物OE_miR166f R为茎环序列3’端20bp序列的反向互补序列。
(2)以高收获指数材料YC24叶片DNA为模板，采用Fast Pfu DNA Polymerase(北京全式金生物技术有限公司)进行扩增，试剂添加如下：
短暂离心后在PCR仪上进行如下反应：
回收130bp左右的目标片段。
(3)回收片段连接到pENTR-T-TOPO上，操作步骤如下：在碎冰上操作，于PCR反应管中加入回收目标片段50-100ng，加入pENTR-T-TOPO缓冲液1μl，用ddH2O补齐至5μl，轻柔混匀后取2.5μl加入pENTR-T-TOPO载体0.5μl，室温反应15min后转化大肠杆菌感受态细胞Trans 5α，涂在含Kan抗性的LB固体培养板上培养，挑取单克隆采用含有Kan抗性的液体LB液体培养基于37℃、250rpm培养6-8h，采用M13引物PCR鉴定阳性菌株后送华大基因测序验证，测序结果与参考序列比对，保存序列完全正确的菌株。
(4)提取测序正确的阳性克隆菌株的质粒，采用Gateway LR ClonaseTM EnzymeMix试剂盒进行表达载体构建，冰上操作，取阳性克隆菌株质粒50ng，加入pEarleyGate101载体1μl，加入5×LR ClonaseTM II enzyme Mix 1μl，加入ddH2O补齐至5μl，轻柔混匀后16℃过夜连接，产物转化大肠杆菌感受态，涂板后选单克隆，采用克隆引物进行PCR鉴定，获得阳性重组克隆。
(5)提取阳性重组克隆大肠杆菌菌株质粒，转化GV3101农杆菌中，形成转基因工程菌，具体操作步骤如下：-80℃保存的GV3101感受态细胞置于碎冰中缓慢解冻，50μl感受态细胞中加入5μl阳性重组克隆菌株质粒轻弹混匀；冰浴15min后放液氮中冷激2min，再迅速转移到37℃水浴锅中热激90sec后冰上放置5min；加入600μl平衡至室温的YEB(不含抗生素)，于28℃200rpm复苏3h；取适量菌液涂布于添加抗生素链霉素(Str,25mg/L)、利福平(Rif,20mg/L)和卡那霉素(Kan,50mg/L)的LB固体平板上，28℃倒置培养48h；挑选单克隆于YEB液体培养基中(含Str 25mg/L、Rif 20mg/L、Kan 50mg/L)于28℃280rpm震荡培养48h；对菌液进行PCR检测，选阳性克隆菌株测序，序列正确的菌株为转基因工程菌株，加入50％甘油于-80℃保存。
3.2 bna-miR166f mimicry干扰表达载体构建的具体方法如下：
以AtIPS1(At3G09922)基因为骨架，在AtIPS1编码区的中间未知引入bna-miR166f的互补序列，互补序列第12、13、14碱基位置引入突变碱基，在植物体内反转录携带突变位点bna-miR166f互补序列的AtIPS1后，转录本可以正常招募bna-miR166f，但是二者结合域的中心位置多出了3个核苷酸的插入突起，导致bna-miR166f与AtIPS1结合，但并能对AtIPS1进行降解，这样具有错配碱基的AtIPS1转录产物可以占据bna-miR166f，而降低了bna-miR166f与靶基因结合的机会，从而抑制bna-miR166f发挥作用。
采用嵌套PCR设计，先用AtIPS1基因CDS 5’端设计引物，上游引物为AtIPS1基因CDS起始部位20bp的序列(AtIPS1-F)，该引物序列5’端加CACC碱基方便Gateway克隆，下游引物为3’端包括19bp的AtIPS1基因CDS序列(MIM166f-R)，引物5’端引物携带突变位点的bna-miR166f的互补序列，用AtIPS1-F和MIM166f-R搭配，以拟南芥DNA为模板PCR扩增后回收扩增的AtIPS1基因CDS前半段片段；再用AtIPS1基因CDS后半段设计引物，上游引物MIM166f-F，5’端引入携带突变位点的bna-miR166f的序列，引物3’端为21bp的AtIPS1基因CDS序列，下游引物AtIPS1-R为AtIPS1基因CDS末尾片段21bp的反向互补序列，用MIM166f-F和AtIPS1-R搭配并以拟南芥DNA为模板PCR扩增后回收扩增的AtIPS1基因CDS后半段片段；将回收得到的前、后半段产物等摩尔数混合做模板，以AtIPS1-F和AtIPS1-R引物扩增，获得引入了携带突变位点的bna-miR166f序列的AtIPS1基因序列，回收片段后采用与过表达载体一致的方法构建以pEarleyGate101载体为骨架的转基因载体，转化到农杆菌GV3101中形成工程菌，加入50％甘油于-80℃保存。
4、油菜中超量和干扰表达bna-miR166f的功能研究
4.1油菜中超量和干扰表达bna-miR166f转基因阳性株系的筛选和鉴定
将超量和干扰表达bna-miR166f的工程菌转化中双11(武汉伯远生物技术公司完成)。将转基因幼苗移至1/4的Hoagland营养液培养，5天后更换为1/2的Hoagland营养液，继续培养10天后更好为1倍的Hoagland营养液，每周更换一次营养液至长出4-5片叶时移栽到装满腐殖土的花盆中，6片叶时在叶片上涂抹500mg/L浓度的Basta溶液，7-10天后观察叶片出现黄化、死亡的为阴性单株，叶片生长正常的为阳性单株。提取阳性单株叶片的DNA后采用载体上携带的除草剂抗性基因引物(Bar-F+Bar-R)，以及载体上35S启动子序列上的引物F35SND分别与过表达和干扰表达插入片段特异引物搭配进行PCR鉴定，筛选2对引物同时检测为阳性的单株。同时提取阳性单株叶片RNA，反转录后采用qRT-PCR检测bna-miR166f的表达量，选取与对照表达差异显著的超量和干扰表达单株套袋自交收种。播种阳性单株自交种，3-4片真叶时用Basta复筛，种植长势正常、无黄化苗的阳性单株幼苗形成株系，直至筛选到纯合阳性株系。
纯合阳性株系自交种采用育苗基质育苗，3-4片真叶时用Basta复筛，选长势正常、无黄化的幼苗按行距40cm，株距25cm种植，正常田间水肥管理。对转基因植株株系整个生育期的表型性状进行考种调查，如生育期、开花期、株高、一次有效分枝高度、一次有效分枝数、二次有效分枝数、单株角果数、主花序长、主花序角果数、成熟期角果长度、每角粒数、千粒重、含油量、硫代葡萄糖苷、芥酸含量、蛋白质含量等指标，每个株系至少调查5个单株，其中油菜种子含油量等品质指标采用FOSS NIRSystem近红外分析仪(美国)测量。
本研究共获得2个超量表达及2个干扰表达bna-miR166f的纯合株系。苗期叶片基因表达量检测发现，OE-1和OE-2株系中bna-miR166f的表达量至少高于野生型“ZS11”3倍以上，而干扰表达株系MIM-1、MIM-2中bna-miR166f的表达量显著低于野生型ZS11(图6)。
4.2转基因油菜纯合株系bna-miR166f表达模式分析
为进一步明确bna-miR166f的表达模式，对超量和干扰表达株系(分别混合2个株系样品)中bna-miR166f的表达量进行检测：苗期采集每个株系叶片(Le)和茎尖生长点(SAM)；蕾苔期采集蕾(Bu)、腋芽(AM)；盛花期采集花(Fl)；于花后15d采集主序角果，冰上分离角果皮(15P)和籽粒(15S)，花后25d采集角果皮(25P)和籽粒(25S)，花后35d采集角果皮(35P)和籽粒(35S)，花后45d采集角果皮(45P)和籽粒(45S)。提取总RNA后反转录，采用RT-qPCR检测bna-miR166f表达量。发现bna-miR166f的表达量在过表达植株的多个组织部位显著高于对照，干扰表达植株的多个组织部位显著低于对照，但在不同的组织部位bna-miR166f被超量或干扰表达的程度不同(图7)，表明本研究获得的转基因后代株系基本达到了bna-miR166f的表达操作目的。
4.3油菜中超量和干扰表达bna-miR166f的表型鉴定及统计学分析
对超量和干扰表达bna-miR166f转基因油菜进行表型观察及统计，发现苗期过表达株系与对照差异不显著，但干扰株系长势较差(图8A)；花期过表达株系株高略高于中双11且长势较为旺盛，干扰株系营养体长势显著较差，过表达和干扰表达阳性株系与中双11的开花期无明显差异(图8B)。成熟期过表达株系的长势显著强于中双11，而干扰表达株系弱于中双11(图9A)；转基因株系角果性状与野生型中双11相比变化最为明显，过表达株系角果变长(图9B)，籽粒变大、饱满度较好(图9C/D)，而干扰表达株系角果变短、籽粒变小、瘪粒数增加(图9B-D)。
对成熟期bna-miR166f转基因株系与对照植株的农艺性状进行统计学分析，发现过表达、干扰表达株系的主花序长、一次有效分枝数、二次有效分枝数等与中双11相比均无显著差异；主花序角果、侧枝生物产量、籽粒产量等性状在过表达株系与中双11之间无显著差异，而在干扰表达株系显著低于中双11；单株角果数除干扰表达株系MIM-1与中双11相比显著降低外，其余株系与中双11均无差异；茎秆干重、生物产量除MIM-2显著低于中双11外，其余株系与中双11相比无显著差异；过表达株系的收获指数与中双11相比有升高趋势，而干扰表达株系与中双11相比有降低趋势，这些性状在不同株系上与对照中双11间的差异程度有所不同(表5)。
对成熟期bna-miR166f转基因株系与对照植株角果性状的统计分析发现，过表达株系角果长度显著长于中双11，而干扰表达株系显著短于中双11；过表达株系的籽粒略大于对照，而干扰株系的籽粒显著小于中双11；过表达株系的千粒重显著高于中双11，而干扰表达株系与中双11无显著差异；过表达株系的每角粒数高于中双11，但未达到显著水平，而干扰表达株系与中双11无显著差异(图9表5)。
表5 bna-miR166f过表达和干扰表达油菜株系表型统计
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综合bna-miR166f过表达和干扰表达转基因油菜的表型可见，过表达bna-miR166f主要通过调控油菜的角果性状(角果长度、千粒重、籽粒大小)进而对收获指数有显著的提高作用，有望在改良油菜收获指数和产量等复杂数量性状中发挥重要作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.超量表达bna-miR166f在改良油菜收获指数等复杂数量性状中的应用，其特征在于，所述改良油菜收获指数等复杂数量性状为：同时提高角果长度、提高千粒重和提高籽粒大小。
2.根据权利要求1所述的超量表达bna-miR166f在改良油菜收获指数等复杂数量性状中的应用，其特征在于，改良油菜为甘蓝型油菜。
3.一种提高油菜收获指数性状的方法，其特征在于，所述方法包括在油菜中超量表达bna-miR166f基因。
4.根据权利要求3所述的提高油菜收获指数性状的方法，其特征在于，在油菜中超量表达bna-miR166f基因的方法包括如下：采用Gateway的方法将目标片段先克隆到pENTR-T-TOPO入门载体上，再采用LR反应将bna-miR166f目标片段转移到pEarlyGate101载体上，以高收获指数材料YC24叶片的DNA为模板，采用OE_miR166f F和OE_miR166fR引物扩增，回收bna-miR166f过量表达的片段OE-miR166f，将获得的过表达片段用M13引物检测筛选阳性大肠杆菌克隆菌株，经测序验证正确的菌株提取质粒后LR反应将目的片段转移到pEarlyGate101载体上，采用相应片段的克隆引物检测，筛选阳性菌株后进行测序验证，验证序列完全正确的菌株提取质粒后转化到农杆菌GV3101中，经PCR鉴定和测序验证正确后形成转基因工程菌株，将转基因工程菌进行遗传转化获得过表达bna-miR166f的改良油菜。
5.根据权利要求4所述的提高油菜收获指数性状的方法，其特征在于，所述目标片段由如下方法获得：
(1)提取bna-miR166f的茎环序列，将序列中的U替换为T，上游引物OE_miR166f F取茎环5’端序列19bp并在5’端加上CACC四个碱基，下游引物OE_miR166f R为茎环序列3’端20bp序列的反向互补序列；
(2)以高收获指数材料YC24叶片DNA为模板，采用Fast Pfu DNA Polymerase进行扩增，回收130bp左右的目标片段。
6.根据权利要求5所述的提高油菜收获性状的方法，其特征在于，采用Fast Pfu DNAPolymerase进行扩增的方法如下：
反应试剂为：
反应条件为：短暂离心后在PCR仪上进行如下反应：
7.权利要求3-6中任一项所述的提高油菜收获指数性状的方法，其特征在于，所述油菜为甘蓝型油菜。
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