WO2014026333A1 - 植物微小核糖核酸的提取、制备及其应用 - Google Patents

植物微小核糖核酸的提取、制备及其应用 Download PDF

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WO2014026333A1
WO2014026333A1 PCT/CN2012/080151 CN2012080151W WO2014026333A1 WO 2014026333 A1 WO2014026333 A1 WO 2014026333A1 CN 2012080151 W CN2012080151 W CN 2012080151W WO 2014026333 A1 WO2014026333 A1 WO 2014026333A1
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plant
microrna
extract
gene
functional microrna
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张辰宇
张峻峰
曾科
董磊
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北京命码生科科技有限公司
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the invention belongs to the field of biology.
  • the invention relates to methods of extracting plant microRNAs and uses thereof. Background technique
  • MicroRNAs are a class of non-coding single-stranded small RNA molecules of about 19 to 23 nucleotides in length. They are widely found in animal and plant cells and are highly conservative in evolution. MicroRNAs do not fully complement the 3' untranslated sequence of the target messenger RNA (mRNA), thereby inhibiting translation of the corresponding protein. As a powerful regulator of mRNA, microRNAs are closely related to physiological activities, including biological activities such as development, tissue differentiation, apoptosis, and energy metabolism. At the same time, microRNAs are closely related to the occurrence and development of many diseases.
  • mRNA target messenger RNA
  • Patent PCT/CN2010/000677 discloses the regulation of rice roots by MIR164 derived from rice, and proposes the construction of a nucleic acid fragment comprising a MIR164 sequence and transferring it into a rice plant to obtain a transgenic rice having a stronger root than that of ordinary rice.
  • Patent PCT/IB2010/055600 discloses that up-regulation of several micro NAs including MIR156 enhances plant tolerance to environmental stress factors, thereby increasing plant biomass, vigor and current, and existing research is limited to plant microRNAs to plant physiology The regulation of activity, but the regulation of plant microRNA on animal physiological activities and the extraction of plant microRNA remains to be studied. Summary of the invention
  • One of the objects of the present invention is to provide a plant microRNA having a function of regulating a non-plant target gene or a plant extract containing the microRNA, a preparation method and use thereof.
  • Another object of the invention is to provide a method of identifying plant functional microRNAs.
  • the regulation comprises inhibiting (downregulating) expression of a target gene and promoting (upregulating) expression of a target gene.
  • the non-plant target gene comprises a bacterial gene, a viral gene, a Chlamydia gene, Yeast gene, animal gene.
  • the plant comprises: a medicinal plant, a fruit and vegetable plant, an ornamental plant; more preferably: honeysuckle, indigo, grass daqing, horse blue, populus, cowpea, cotton, Chinese cabbage or potato .
  • the plant is honeysuckle, indigo, turfgrass, horse blue or Populus euphratica; more preferably, the plant is honeysuckle.
  • the plant functional microRNA is a microRNA species rich in water-soluble and/or fat-soluble extracts of the plant (eg, top 20 in abundance, more preferably in top 10) Type of microRNA).
  • the plant functional microRNA comprises one or more selected from the group consisting of MIR156h, MIR166f, MIR396a, MIR166a, MIR168a, MI 1440, MIR2910, MIR291 K MIR2915, MIR2916, MIR818d, MIR159e , MIR159c, MIR156j, MIR 1432, MIR166k, MIR 167b, MIR396c, MIR156e, MIR169k, MIR 167c, MIR160d, MIR399a, MIR156d, MIR160e, MIR169n, MI 166K MIR159f, MIR166c, MIR159b, MIR166j, MIR167i, MIR 169c, MIR 164c, MIR167j, MIR167g, MIR 160c, MIR399e, MIR399b, MIR529b, MIR164e, MIR166d, MIR166h, MIR 164b, MIR156
  • the plant extract comprises a water soluble and/or fat soluble extract of the plant.
  • the plant extract comprises extracts of branches, leaves, roots, flowers, fruits and/or stems of the plant.
  • an isolated plant functional microRNA or an extract comprising the plant functional microRNA according to the first aspect of the invention which (a) is used for the preparation of a regulatory non- a composition of a plant target gene; or (b) a medicament for the preparation of a disease associated with a non-plant target gene.
  • the non-plant target gene includes a bacterial gene, a viral gene, a Chlamydia gene, a yeast gene, and an animal gene.
  • the non-plant target gene is a gene of a pathogen (including bacteria, viruses, chlamydia, etc.).
  • the non-plant target gene-related diseases include: tumors (such as liver cancer, lung cancer); acute and chronic infectious diseases (such as viral influenza, viral hepatitis, AIDS, SARS, etc., such as tuberculosis) , bacterial diseases such as bacterial pneumonia, and acute and chronic infectious diseases caused by pathogenic microorganisms; other acute and chronic diseases (such as respiratory diseases, immune system diseases, blood and hematopoietic diseases, circulatory diseases such as cardiovascular and cerebrovascular diseases) , Endocrine system metabolic diseases, digestive diseases, nervous system diseases, urinary system diseases, reproductive system diseases and sports system diseases).
  • tumors such as liver cancer, lung cancer
  • acute and chronic infectious diseases such as viral influenza, viral hepatitis, AIDS, SARS, etc., such as tuberculosis
  • bacterial diseases such as bacterial pneumonia
  • acute and chronic infectious diseases caused by pathogenic microorganisms
  • other acute and chronic diseases such as respiratory diseases, immune system diseases, blood and hematopoietic diseases, circulatory
  • the plant functional microRNA comprises MIR2911. More preferably, the medicament is for the treatment of viral influenza.
  • composition comprising (a) a pharmaceutically acceptable carrier or a food acceptable carrier and (b) the plant functional microRNA of the first aspect of the invention And/or a plant extract containing the plant functional microRNA.
  • composition consists of or consists essentially of components (a) and (b).
  • component (b) is present in an amount of from 0.01 to 99% by weight, based on the total weight of the composition, preferably from 0.1 to 90% by weight, based on the microRNA.
  • the composition comprises a pharmaceutical composition, a food composition or a health care product composition.
  • the method for preparing the composition comprises the steps of: mixing the plant functional microRNA or the plant extract containing the functional microRNA with a pharmaceutically or food acceptable carrier, thereby The composition is formed.
  • the plant functional microRNA is derived from the following plants: a medicinal plant, a fruit and vegetable plant, an ornamental plant, and a non-plant target gene selected from the group consisting of: a bacterial gene, a viral gene, a Chlamydia gene, a yeast Gene, animal gene.
  • the plant functional microRNA is derived from honeysuckle, indigo, turdica, mala, or populus. More preferably, the plant functional microRNA comprises MIR2911.
  • a method for non-therapeutic regulation of non-plant target gene expression in vitro wherein the non-plant target gene comprises a bacterial gene, a viral gene, a Chlamydia gene, a yeast gene, an animal gene, and the method
  • the method comprising the steps of: cultivating the biological material containing the target gene in the presence of the isolated plant functional microRNA of the first aspect of the invention or the extract containing the plant functional microRNA, thereby regulating the non-plant target gene expression.
  • the target gene is a gene of a pathogen (including bacteria, viruses, chlamydia, etc.).
  • the biological material comprises a virus, a cell, a tissue.
  • the plant functional microRNA is derived from the following plants: medicinal plants, fruit and vegetable plants, ornamental plants.
  • the plant functional microRNA is derived from honeysuckle, indigo, turdica, mala, or populus. More preferably, the plant functional microRNA comprises MIR2911.
  • a method for identifying a plant functional microRNA, wherein the plant functional microRNA has a function of regulating a non-plant target gene comprising the steps of:
  • the non-plant target gene comprises a gene in a gene database.
  • the non-plant target gene includes a bacterial gene, a viral gene, a Chlamydia gene, a yeast gene, and an animal gene.
  • the non-plant target gene is a pathogen gene.
  • the plant comprises a medicinal plant, a fruit and vegetable plant.
  • the microRNA species in the top 20 are selected in step (3) for comparison and analysis.
  • a plant microRNA species having a ratio Lm/La ⁇ l 30% is selected and compared in step (3), wherein Lm is a certain The abundance (or level) of a plant microRNA in the extract, and La is the average abundance (or level) of the plant's total microRNA.
  • a plant functional microRNA molecule identified by the method of the fifth aspect of the invention.
  • the microRNA molecule comprises MIR2911.
  • a seventh aspect of the invention there is provided a method of preparing a composition comprising the steps of:
  • the plant functional microRNA molecule is mixed with a pharmaceutically or food acceptable carrier to form a composition.
  • microRNA molecule MIR2911 or an extract comprising MIR2911 for the preparation of a medicament for the treatment of viral influenza.
  • the extract (unconcentrated or concentrated) contains 0.01 to 100 nM (preferably 0.1 to 20 nM) of MIR2911.
  • a method for preventing or treating a disease wherein the disease is a disease associated with a non-plant target gene, the method comprising the steps of: administering to a subject in need thereof the first aspect of the invention An isolated plant functional microRNA or an extract comprising the plant functional microRNA, or a composition according to the third aspect of the invention, thereby preventing or treating the disease, wherein the plant functional microRNA has regulation The function of non-plant target genes.
  • the subject comprises a mammal (e.g., a human).
  • the non-plant target gene includes a bacterial gene, a viral gene, a Chlamydia gene, a yeast gene, and an animal gene.
  • the non-plant target gene is a pathogen gene.
  • Figure 1 shows the results of Solexa sequencing of plant microRNA in honeysuckle aqueous extract.
  • Figure 2A shows the results of Real-time PCR of the expression of honeysuckle microRNA in serum at different time points after oral administration of honeysuckle water extract in mice.
  • the detection time points were 0 h (0 hours), 2 3 ⁇ 42 hours), 4 h (4 hours), and 6 hours (6 hours).
  • Figure 2B shows Real-time PC results of liver and lung expression of honeysuckle microRNAs at different time points after oral administration of honeysuckle water extract in mice.
  • the detection time is 0 3 ⁇ 40 hours), 5 h (5 hours), 10 h (10 hours), 15 hours (15 hours), 20 hours (20 hours), and 25 hours (25 hours).
  • Figure 3 shows the results of sequence analysis of MIR2911 predicted target genes.
  • Mfe indicates the lowest folding free energy of the candidate target gene, and the larger the absolute value of mfe, the higher the matching degree of the candidate target gene with the Peu-MIR2911 sequence.
  • Figure 4 shows the results of luciferase assay for predicting target genes.
  • the predicted genes include the ADV gene, the HPIV gene, the H1N1 gene, and the H5N1 gene.
  • Figure 5A shows the detection of the viral gene ADV5 in MDCK cells using Real-time PC technology.
  • Figure 5B shows the detection of the viral gene H1N1 in MDCK cells using Real-time PC technology.
  • Figure 5C shows the detection of the viral gene H5N1 in MDCK cells using Real-time PC technology.
  • uninfected represents cells not infected with influenza virus
  • infected untreated represents cells infected with influenza virus and not treated with any drug
  • MIR2911 represents infecting influenza virus And cells treated with MI 2911
  • NC represents cells infected with influenza virus and treated with the nonsense sequence RNA of MIR2911
  • Duffy represents influenza virus infection and Tamiflu (Osemide, specific influenza) Cells treated with a viral neuraminidase inhibitor).
  • Figure 6 shows the Real-time PC results of MIR2911 in MIR2911-loaded microparticles secreted by HEK 293T cells transfected with MIR2911.
  • Cellular microparticles secreted by HEK 293T cells not transfected with MIR2911 were used as control MVs.
  • Figure 7A shows the expression level of influenza virus ADV in HEK 293T cells treated with MIR2911-loaded microparticles.
  • Figure 7B shows the expression level of influenza virus H1N1 in HEK 293T cells treated with MIR2911-loaded microparticles.
  • HEK 293T cells treated with cell microparticles not loaded with MIR2911 after infection with influenza virus were used as a negative control.
  • Fig. 8A shows the rapid expression of the cold virus ADV in the lung after the mouse drinking honeysuckle aqueous extract, the honeysuckle aqueous extract + anti-MIR2911 (oral group), and the lung honeysuckle aqueous extract + anti-MIR2911 (the lung filling group). Time PC results.
  • FIG 8B shows mouse drinking honeysuckle aqueous extract, honeysuckle aqueous extract + anti-MIR2911 (oral group), pharyngeal gold Real-time PC results of cold virus H1N1 expression in the lung after silver flower aqueous extract +anti-MIR2911 (infused lung group).
  • Figure 9 shows the Real-time PC results of MIR2911 in human blood after taking the honeysuckle aqueous extract.
  • Detection time is 0 3 ⁇ 40 hours), 1 h (l hour), 2 h (2 hours), 3 h (3 hours), 4 hours (4 hours), 5 hours (5 hours), 6 hours (6 hours) .
  • the present inventors have unexpectedly discovered an isolated plant endogenous microRNA stably contained in a plant extract or a plant extract containing the microRNA, which can be used to regulate the endogenous source in an animal.
  • Expression of a microRNA target gene which in turn is used to regulate physiological and pathological activities in animals. Therefore, it can be used to guide the preparation of drugs or functional foods and the like.
  • the inventors have completed the present invention.
  • osa means rice; “peu” means Populus euphratica.
  • the plant functional microRNA of the present invention is an endogenous microRNA of the plant which is stably present in the water-soluble and/or fat-soluble extract of the plant.
  • the plant functional microRNA is a microRNA species enriched in a water soluble and/or fat soluble extract of the plant (e.g., the top 20 abundance, more preferably the top 10 microRNA species).
  • the microRNAs of the invention include various forms, such as pri-micro NA ⁇ pre-micro NA and microRNA matures.
  • plant-functional microRNAs include, but are not limited to, one or more microRNAs selected from Table 1, particularly one or more selected from the group consisting of MIR156h, MIR166f, MIR396a, MIR166a, MIR168a, MI 1440, MIR2910, MI 291 K MIR2915, MIR2916.
  • the plant comprises a medicinal plant, a fruit and vegetable plant, an ornamental plant; preferably comprises honeysuckle, indigo, grass daqing, horse blue, populus, cowpea, cotton, Chinese cabbage or potato;
  • the plant is honeysuckle, indigo, turfgrass, horse blue or Populus euphratica; optimally, the plant is honeysuckle.
  • Extracts containing the plant functional microRNA of the present invention include water-soluble and/or fat-soluble extracts of plants, such as extracts of branches, leaves, roots, flowers, fruits and/or stems of plants. Extraction method (manufacturing method of plant extract)
  • the method for extracting plant microRNA according to the present invention mainly adopts a solvent extraction method, that is, a solvent is used to extract microRNA from a plant.
  • the solvent comprises water, a hydrophilic solvent, or a combination thereof.
  • the combination includes: adding an appropriate amount of a hydrophilic solvent to water or adding an appropriate amount of water to a hydrophilic solvent.
  • an auxiliary agent such as a pH adjuster (such as an acid or a base) may be added to the solvent.
  • the extraction can be carried out at any suitable temperature (e.g., normal temperature to reflux temperature of the solvent), and preferably, a dipping method, a percolation method, a boiling method, a reflux extraction method, a continuous extraction method, or the like is employed.
  • a suitable temperature e.g., normal temperature to reflux temperature of the solvent
  • a dipping method, a percolation method, a boiling method, a reflux extraction method, a continuous extraction method, or the like is employed.
  • the plants can be pretreated, for example by comminuting the plants or enzymatically treating them (eg cellulase, Hemicellulase, pectinase, xylanase, neutral protease, papain, glucanase, and xia synthase; etc.; the extracted mixture can also be post-treated, such as after extracting the plant with water
  • a hydrophilic solvent such as ethanol or the like may be added to the extracted mixture to precipitate the mixture by aging.
  • the liquid obtained after the extraction can be used as it is, or it can be subjected to filtration, concentration, drying (e.g., lyophilization) to obtain a solid, and then used.
  • the method for extracting the plant microRNA of the present invention is an aqueous extraction method.
  • test method used may be conventional methods in the art, such as (but not limited to): Solexa sequencing technology, Real-time PCR, RT-PCR, microarray chip, in situ hybridization, Northern Blotting, constant temperature rolling circle amplification, based on total Detection of microRNAs of conjugated polymers, etc.
  • the Solexa sequencing technology method preferably includes the steps of:
  • the adaptor primer is ligated to the 3' and 5' ends of the small RNA molecule
  • Purified DNA was used directly for cluster generation and sequenced using the Illumina Genome Analyzer.
  • the Real-time PC method preferably includes the steps of:
  • the present invention provides a plant functional microRNA identification method, wherein the plant functionality Micro NA has the function of regulating non-plant target genes, including steps:
  • the non-plant target gene comprises a gene in a gene database.
  • the non-plant target gene comprises a bacterial gene, a viral gene, a Chlamydia gene, a yeast gene, an animal gene; or the non-plant target gene is a pathogen gene.
  • the microRNA species in the top 20 are selected in step (3) for comparison and analysis.
  • a plant microRNA species having a ratio Lm/La ⁇ l 30% is selected and compared in step (3), wherein Lm is a certain The abundance (or level) of a plant microRNA in the extract, and La is the average abundance (or level) of the plant's total microRNA.
  • the plant functional microRNA molecule identified by the method includes MIR2911. Use
  • the plant functional microRNA of the present invention or a plant extract comprising the plant functional microRNA has the following applications:
  • the active ingredient of the composition of the invention is the plant functional microRNA or a plant extract comprising the plant functional microRNA.
  • the plant functional microRNA e.g., MI 2911, etc.
  • the plant functional microRNA has the function of regulating non-plant target genes. It can be used to (a) prepare a composition for regulating a non-plant target gene; or (b) to prepare a medicament for treating a disease associated with a non-plant target gene.
  • the regulation comprises inhibiting (down-regulating) expression of a target gene and promoting (upregulating) expression of a target gene.
  • the non-plant target gene comprises a bacterial gene, a viral gene, a Chlamydia gene, a yeast gene, an animal gene; or the non-plant target gene is a gene of a pathogen (including bacteria, virus, chlamydia, etc.) .
  • the non-plant target gene-related diseases include: tumors (such as liver cancer, lung cancer); acute and chronic infectious diseases (such as viral influenza, viral hepatitis, AIDS, SARS, etc., such as tuberculosis) , bacterial diseases such as bacterial pneumonia, and acute and chronic infectious diseases caused by pathogenic microorganisms; other acute and chronic diseases (such as respiratory diseases, immune system diseases, blood and hematopoietic diseases, circulatory diseases such as cardiovascular and cerebrovascular diseases) , endocrine system metabolic diseases, digestive diseases, nervous system diseases, urinary system diseases, reproductive system diseases and sports system diseases). combination
  • composition of the present invention may comprise: (a) a pharmaceutically acceptable carrier or a food acceptable carrier; and (b) an active ingredient.
  • the composition consists of or consists essentially of components (a) and (b).
  • component (b) is present in an amount of from 0.01 to 99% by weight, based on the total weight of the composition, preferably from 0.1 to 90% by weight, based on the microRNA.
  • the method of preparing the composition comprises the steps of: mixing the plant functional microRNA or the plant extract containing the functional microRNA with a pharmaceutically or food acceptable carrier to form the composition.
  • the composition is further illustrated by taking a pharmaceutical composition as an example:
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises an active ingredient in a safe and effective amount and a pharmaceutically acceptable excipient or carrier.
  • safe and effective amount is meant: The amount of active ingredient is sufficient to significantly improve the condition without causing serious side effects.
  • the pharmaceutical composition contains from 1 to 2000 mg of the active ingredient per agent, more preferably from 10 to 200 mg of the active ingredient per agent. Or it may contain 0.01 to 100 micromoles of the active ingredient/agent, preferably 0.1 to 10 micromoles per dose; preferably, the "one dose" is an oral solution.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” means: one or more compatible solid or liquid fillers or gel materials which are suitable for human use and which must be of sufficient purity and of sufficiently low toxicity. By “compatibility” it is meant herein that the components of the composition are compatible with the compounds of the invention and the compounds thereof without significantly reducing the efficacy of the compounds.
  • pharmaceutically acceptable carriers are cellulose and its derivatives (such as sodium carboxymethylcellulose, sodium ethylcellulose, cellulose acetate, etc.), gelatin, talc, solid lubricants (such as stearic acid).
  • magnesium stearate magnesium stearate
  • barium sulfate vegetable oils (such as soybean oil, sesame oil, peanut oil, olive oil, etc.), polyols (such as propylene glycol, glycerin, mannitol, sorbitol, etc.), emulsifiers (such as Tween®), run Wet agents (such as sodium decyl sulfate), colorants, flavoring agents, stabilizers, antioxidants, preservatives, pyrogen-free water, etc.
  • vegetable oils such as soybean oil, sesame oil, peanut oil, olive oil, etc.
  • polyols such as propylene glycol, glycerin, mannitol, sorbitol, etc.
  • emulsifiers such as Tween®
  • run Wet agents such as sodium decyl sulfate
  • colorants such as sodium decyl sulfate
  • flavoring agents such as pepperminophen®
  • the modes of administration of the compositions of the invention include: oral, respiratory, injection, transdermal, mucosal or intraventricular administration.
  • the dosage form of the composition of the present invention comprises: a tablet, a capsule, a powder, a pill, a granule, a syrup, a solution, a suspension, an emulsion, a suspension, a spray, an aerosol, a powder, a volatile liquid , injection, powder injection, topical solution, lotion, pour-off agent, tincture, barb cream, plaster, rubber ointment, ointment, plaster, paste, eye drops, nasal drops, ophthalmic ointment Agent, gargle, sublingual tablet or suppository.
  • the present invention provides a use of a microRNA molecule MIR291 1 or an extract containing MIR2911 for the preparation of a medicament for the treatment of viral influenza.
  • the extract (unconcentrated or concentrated) contains 0.01 to 100 nM (preferably 0.1-20 nM) of MIR2911. 2.
  • the synthetic plant functional microRNA molecule is mixed with a pharmaceutically or food acceptable carrier to form a composition.
  • the non-plant target gene eg, bacterial gene, viral gene, chlamydial gene, yeast gene, animal gene
  • the non-plant target gene is cultured in the presence of the isolated plant functional microRNA of the present invention or an extract containing the plant functional microRNA.
  • Biomaterials including viruses, cells, tissues) to achieve in vitro regulation of expression of the non-plant target gene
  • the target gene is a gene of a pathogen (including bacteria, viruses, chlamydia, etc.).
  • the plant functional microRNA is derived from the following plants: a medicinal plant, a fruit and vegetable plant, an ornamental plant; preferably, from honeysuckle, indigo, grass daqing, horse blue or Populus euphratica; more preferably The plant functional microRNA comprises MIR291 1 . Fourth, disease prevention or treatment
  • the isolated plant functional microRNA of the present invention or the extract containing the plant functional microRNA, or the composition of the present invention to a subject in need thereof (such as a mammal or a human), thereby achieving prevention or treatment
  • a disease associated with a non-plant target gene wherein the plant functional microRNA has a function of regulating a non-plant target gene (including a bacterial gene, a viral gene, a Chlamydia gene, a yeast gene, an animal gene).
  • the non-plant target gene is a pathogen gene.
  • the inventors have developed a set of methods for efficient and stable extraction of plant functional microRNAs through a series of studies on the presence of plant functional microRNAs and their entry into animals, delivery pathways and functions.
  • a method for identifying plant functional microRNAs can be used to guide the selective synthesis of plant functional microRNAs, which is beneficial to accelerate the production of the microRNA; and can also be used to guide the screening of plant-rich microRNA-rich medicinal materials. Conducive to the identification of the advantages and disadvantages of herbs. 4.
  • a set of methods to guide the manufacture of functional foods or drugs 4.1 The method utilizes isolated plant functional microRNAs or plant extracts containing plant functional microRNAs or selected functional microRNA-rich plants, available For the manufacture of functional foods or pharmaceutical compositions; 4.2 methods for extracting plant microRNAs and identifying plant functional microRNAs, and performing artificial synthesis of the plant functional microRNAs, and then using synthetic microRNAs for manufacturing functionality Food or medicine.
  • the main advantages of the invention include:
  • microRNA is a regulatable non-plant target gene expression, and has various uses (such as a standard for active ingredients of Chinese herbal medicine, which is useful for guiding the development and manufacture of functional compositions).
  • a composition comprising an isolated plant functional microRNA and/or a plant extract comprising the plant functional microRNA as an active ingredient.
  • the action mechanism of the active ingredient is clear and the effect is remarkable, which is beneficial to the exploration of the scientific mechanism of traditional Chinese medicine, and has simple preparation method and low cost, and is suitable for industrial production.
  • Solexa sequencing technology was used to detect the plant microRNA stably present in the aqueous extract of Honeysuckle prepared by the above procedure, and the amount of Solexa loaded was 10 RNA.
  • the concentration of total microRNA in the unconcentrated aqueous extract was determined to be approximately 1 nM, and the total microRNA concentration in the concentrated aqueous extract was approximately 10 nM.
  • honeysuckle microRNA can enter the animal by feeding and is stable.
  • mice were orally administered with honeysuckle aqueous extract (concentrated water prepared in Example 1), and the honeysuckle microRNA was detected. Expression levels in serum, liver and lung.
  • mice were starved for 12 hours, and then the mice were intragastrically administered with 10 ml/kg of mouse body weight concentrated aqueous extract of honeysuckle, using Real-time PCR at 0 h (0 hours), 2 h (2 hours). , 4 h (4 hours), 6 h (6 hours), etc., to detect the expression level of honeysuckle microRNA MIR2911 in mouse serum, liver and lung.
  • the primer sequence for Real-time PC detection of MIR2911 is:
  • Probe sequence ⁇ Ij TCCCAGCCCGTCCCCCGGCC (SEQ ID NO.: 88).
  • Figure 2A is a Real-time PC result of the expression of honeysuckle microRNA in serum at different time points after oral administration of honeysuckle water extract in mice. It can be seen from the results that the content of MI 2911 in the serum increased significantly after the mice were administered with the aqueous extract of honeysuckle. After 1.5 hours of oral administration of honeysuckle aqueous extract, the serum MIR2911 content reached the highest value, and the serum MIR2911 content decreased to the initial level after 6 hours.
  • FIG. 2B shows Real-time PC results of honeysuckle microRNA expression in liver and lung at different time points after oral administration of honeysuckle water extract in mice. It can be seen from the results that the expression level of MIR2911 in the liver and lung increased after the mice were administered with the aqueous extract of honeysuckle. After 6 hours of oral administration of honeysuckle water extract to mice, the expression of MIR2911 in the liver reached a maximum; after 12 hours of oral administration of honeysuckle aqueous extract, the expression of MIR2911 in the lung reached its maximum value.
  • honeysuckle microRNA can enter the animal through feeding and is stable.
  • Honeysuckle microRNA can regulate physiological and pathological activities
  • honeysuckle microRNA can regulate physiological and pathological activities in animals.
  • Bioinformatics was used to predict multiple target genes in the genome of respiratory infectious virus to match the MIR2911 sequence.
  • the specific results are shown in Figure 3.
  • Figure 3 shows the results of sequence analysis of MIR2911 predicted target genes. Mfe indicates the lowest folding free energy of the candidate target gene, and the larger the absolute value of mfe, the higher the matching degree of the candidate target gene with the Peu-MIR2911 sequence. The results showed that ADV gene, HPIV1 gene, H1N1 gene and H5N1 gene are potential target genes of honeysuckle microRNA.
  • luciferase reacts with the substrate to produce fluorescein, and the activity of the luciferase can be determined by detecting the intensity of the fluorescence
  • Figure 4 shows the results of luciferase assay for predicting target genes.
  • NC i.e., an equal amount of RNA containing the mismatch control sequence of MI 2911
  • the results indicate that most of the predicted target genes bind to mature MIR2911 to form a double-stranded structure. This suggests that MIR2911 can regulate the binding of ADV gene, HPIV gene, H1N1 gene, H5N1 and other genes.
  • MDCK cells were cultured in a 24-well cell culture plate.
  • MIR2911 (20 pmol/10 6 cells) was transfected into MDCK cells (MIR2911 group) by commercial transfection reagent lipofectamine2000, and the nonsense RNA of MIR2911 was transfected into MDCK cells at the same dose as control (NC). And at the same time set up a positive drug (Tuffy).
  • the cells were infected with H1N1, H5N1 and adenovirus ADV at a multiplicity of infection (MOI) of 0.001.
  • the specific steps for detecting the viral gene are as follows: After the cells are digested and collected, the cells are repeatedly washed three times with PBS buffer, and total RNA is extracted with a protein denaturation reagent, and then the content of the viral marker PB1 mRNA is identified by a real-time PC method, and The standard curve was compared to calculate the virus content.
  • Figure 5A shows the Real-Time PC technology for detecting the amount of the viral gene ADV in MDCK cells.
  • Figure 5B shows Real-Time PC technology for detection of viral gene H1N1 in MDCK cells.
  • Figure 5C shows the Real-Time PC technology for detecting the amount of the viral gene H5N1 in MDCK cells.
  • MIR2911 significantly inhibited and blocked ADV5, H1N1 and H5N1.
  • Example 4 Honeysuckle microRNA enters other cells through intestinal epithelial cells, Caco-2 cell microparticles (MVs), and plays a regulatory role in other cells.
  • MVs Caco-2 cell microparticles
  • the honeysuckle microRNA can be encapsulated into the animal body through the microparticles of the intestinal epithelial cell Caco-2 cells, and is transported by the cell microparticles into other cells, thereby affecting the physiological and pathological conditions of other cells, such as suppressing the cold virus.
  • the cells were cultured for 24 or 48 hours and used for Real-time PCR analysis.
  • MIR2911 has been encapsulated by microparticles released from Caco-2 cells: RNA in the microparticles was extracted, and the content of MIR2911 was determined by absolute quantitative real-time PC technology.
  • Figure 6 shows the results of Real-time PCR in cell microparticles secreted by HEK 293T cells after treatment with cell microparticles secreted by MIR2911-loaded Caco-2 cells.
  • cell microparticles secreted by HEK 293T cells treated with cell microparticles (control MV) secreted by Caco-2 cells carrying MIR2911 were used.
  • MIR2911 was significantly increased in HEK 293T cells after treatment with MIR2911-containing microparticles as compared with the control.
  • honeysuckle microRNA can be encapsulated into the animal body through Caco-2 secreting cell microparticles and delivered to other cells.
  • HEK 293T cells infected with influenza virus ADV or H1N1 were treated with cell microparticles carrying MIR2911 (prepared by differential centrifugation in Section 4.2 of this example). The specific steps are:
  • Example 4.4 The microparticles obtained in the portion of Example 4.4 were added to the cell culture medium, and the amount of the microparticles was 0.1 pmol of MI 2911/10 6 cells.
  • Virus infection After 24 hours, the virus content was detected by Real-time PC.
  • Real-time PC method was used to detect the content of influenza virus ADV or H1N1 in HEK 293T cells. The specific steps are as described in Example 3.
  • Figure 7A shows the expression level of influenza virus ADV in HEK 293T cells treated with MIR2911-loaded microparticles.
  • Fig. 7B shows the expression level of influenza virus H1N1 in HEK 293T cells treated with MIR2911-loaded cell microparticles.
  • Fig. 7A and Fig. 7B are HEK 293T cells (blank control) which were left untreated after infection with influenza virus, and HEK 293T cells treated with microparticles (negative control) not loaded with MIR2911 as a control.
  • influenza virus ADV and H1N1 were significantly decreased in HEK 293T cells treated with MIR2911-containing microparticles.
  • the results showed that MIR2911 significantly inhibited influenza virus ADV and H1N1.
  • honeysuckle microRNA can be introduced into an animal by oral or the like, and is transported into other cells by cell microparticles and functions in the cell, such as suppressing a cold virus. It can be seen that the honeysuckle microRNA can enter the animal tissues and organs through oral and other means, and regulate the physiological and pathological conditions of the animal.
  • Example 5 Honeysuckle microRNA can significantly inhibit cold virus in animals
  • mice were allowed to drink the unconcentrated honeysuckle aqueous extract (prepared in Example 1). After 3 days, the ADV or H1N1 virus was inoculated, and the unconcentrated honeysuckle aqueous extract was continued for 3 days, and then the virus of the mouse lung was detected by real-time PC. content. The results showed that the honeysuckle soup had a strong inhibitory effect on the proliferation of ADV and H1H1 viruses.
  • honeysuckle microRNA MI 2911 that is used to verify the viral inhibition.
  • the following control group is used:
  • mice were given a honeysuckle soup containing anti-MIR2911 (amount equivalent to the amount of MIR2911), including: honeysuckle aqueous extract + anti-MIR2911 (oral group) and honeysuckle aqueous extract + anti-MIR2911 (administered lung group) ; anti-MIR2911 is an antisense nucleic acid of MIR2911, which is completely complementary to MIR2911.
  • mice are irrigated with lungs.
  • the specific steps are:
  • mice were allowed to drink an equal volume of pure water with honeysuckle soup as a blank control group. Then, the real-time PC method was used to detect the levels of ADV or H1N1 in the lungs of each group.
  • Real-time PC detects the primer sequence of the cold virus ADV as follows: Forward primer sequence: 5,-CAAAGACTTCTCATCGGTTGC-3, (SEQ ID NO.: 89);
  • Reverse primer sequence 5, -AATGCAACACTCGGTTCACA-3, (SEQ ID NO.: 90); Probe sequence: TCAGGC CCC CTCAAAGCCGA (SEQ ID NO.: 91).
  • Real-time PC detects the cold virus HlNl primer sequence is as follows:
  • Figure 8A shows the cold virus ADV expressed in the lung after drinking honeysuckle water extract, honeysuckle water extract + anti-MIR2911 (oral group), and lung honeysuckle water extract + anti-MIR2911 (infused lung group). -time PC results.
  • mice fed the same volume of water as a blank control after drinking honeysuckle aqueous extract, ADV expression in the lungs of mice significantly decreased, indicating that honeysuckle microRNA inhibited the expression of the cold virus ADV.
  • the expression of ADV in the lungs of mice was increased after drinking honeysuckle aqueous extract +anti-MIR2911, indicating that anti-MIR2911 disrupted the inhibitory effect of MIR2911 on the influenza virus ADV.
  • honeysuckle microRNAs have a direct antiviral effect.
  • Fig. 8B shows the cold virus H1N1 expressed in the lung after drinking honeysuckle water extract, honeysuckle water extract + anti-MIR2911 (oral group), and lung honeysuckle water extract + anti-MIR2911 (infused lung group). -time PCR result.
  • honeysuckle microRNA is absorbed by the body through the digestive tract and enters the circulatory system.
  • the dried honeysuckle is boiled for 30 minutes to make 1000 ml of water extract.
  • the content of MIR2911 in the aqueous extract is about 0.4 n mol/L.
  • recruit 20 healthy volunteers each taking 1000 ml of water extract, at 0 h (0 hours), lh (l hours), 2 h (2 hours), 3 h (3 hours), 4 h
  • the blood of the volunteers was collected (4 hours), 5 h (5 hours), 6 hours (6 hours), and the content of MIR2911 was detected by Real-time PCR.
  • the specific steps of the Real-time PC experiment were as described in Example 2.
  • Figure 9 shows the results of Real-time PCR of MIR2911 in human blood after taking the honeysuckle aqueous extract. It can be seen from the results that the content of MIR2911 in human blood is significantly increased after taking the honeysuckle water extract. After taking the honeysuckle water extract for 1.5 hours, the content of MIR2911 in human blood reached the maximum, and human blood after 3 hours. The content of MIR2911 in the liquid dropped to the original level.
  • This example demonstrates that the active ingredient that inhibits the human cold virus is honeysuckle microRNA, but not others.
  • 15 viral influenza patients carrying ADV virus, 15 viral influenza patients carrying H1N1 virus, and then the above-mentioned viral influenza patients were divided into 6 groups of 5 people each, and groups 1-3 were viruses carrying ADV virus.
  • Groups 4-6 are viral influenza patients carrying the H1N1 virus:
  • Group 1 1000 mL of honeysuckle water extract (prepared in Example 6) was taken.
  • Group 2 Take the honeysuckle water extract 1 OOOmL + anti-MIR2911 (the amount is equivalent to the amount of MIR2911); wherein anti-MIR2911 is an antisense nucleic acid of MIR2911, which is completely complementary to MIR2911.
  • Group 3 Take an equal volume of pure water with the water extract.
  • Group 5 Take the honeysuckle water extract 1 OOOmL + anti-MIR2911 (the amount is equivalent to the amount of MIR2911); wherein anti-MIR2911 is the antisense nucleic acid of MIR2911, completely intermingled with MIR2911.
  • Group 6 Take an equal volume of pure water with the water extract.
  • Real-time PC was used to detect the content of the cold virus ADV or H1N1 in human blood. The specific steps are as described in Example 5.

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Abstract

本发明公开了一种植物微小核糖核酸的提取、制备及其应用。具体地，本发明公开了一种分离的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物及其用途，所述的植物功能性microRNA是来源于某一植物的内源性microRNA且存在于所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中，而且所述植物功能性microRNA具有调控非植物靶基因的功能。

Description

植物微小核糖核酸的提取、 制备及其应用
技术领域
本发明属于生物领域。 具体地， 本发明涉及提取植物 microRNA的方法及其应用。 背景技术
微小核糖核酸（microRNA、 mi NA或 miR)是一类长约 19至 23个核苷酸的非编 码单链小核糖核酸分子。它们广泛存在于动植物细胞中，在进化上高度保守。 MicroRNA 通过识别靶信使 RNA (mRNA) 的 3' 端非翻译序列， 与之不完全互补， 从而抑制相应 蛋白质的翻译。 作为 mRNA强有力的调节因子， microRNA与生理活动密切相关， 涉 及生物个体发育、 组织分化、 细胞调亡及能量代谢等生命活动； 同时， microRNA也与 许多疾病的发生和发展存在紧密联系。
目前， 对植物 microRNA研究都集中在 microRNA对植物本身的调控作用， 包括 对植物生长发育、 信号转导和逆境胁迫活动的作用。 对研究成果的应用则集中于对植 物物种的改良， 如调节农作物在其食用部分对营养元素的表达。
专利 PCT/CN2010/000677公开了源自水稻的 MIR164对植株根系的调控作用， 提 出构建包括 MIR164序列的核酸片段， 并将其转入水稻植株， 从而获得根系比普通水 稻强大的转基因水稻。 专利 PCT/IB2010/055600 公开了上调包括 MIR156 的若干 micro NAs可提高植物对环境胁迫因素的耐受能力， 进而提高植物的生物质、 活力和 目前， 现有的研究仅限于植物 microRNA对植物本身生理活动的调控作用， 但植 物 microRNA对动物的生理活动的调控作用以及对植物 microRNA 的提取还有待研究。 发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有调控非植物靶基因的功能的植物 microRNA或 含有所述 microRNA 的植物提提取物及其制法和用途。
本发明的另一目的是提供一种鉴定植物功能性 microRNA的方法。
在本发明第一方面中， 提供了一种分离的植物功能性 microRNA或含所述植物功 能性 microRNA的提取物， 所述的植物功能性 microRNA是来源于某一植物的内源性 microRNA 且存在于所述植物的水溶性和 /或脂溶性的提取物中， 而且所述植物功能性 microRNA具有调控非植物靶基因的功能。
在另一优选例中， 所述的调控包括抑制 (下调)靶基因的表达、 促进 (上调)靶基因的 表达。
在另一优选例中， 所述的非植物靶基因包括细菌基因、 病毒基因、 衣原体基因、 酵母基因、 动物基因。
在另一优选例中， 所述的植物包括： 药用植物、 果蔬植物、 观赏植物； 更佳地包 括： 金银花、 菘蓝、 草大青、 马蓝、 胡杨、 豇豆、 棉花、 大白菜或马铃薯。
优选地， 所述植物为金银花、 菘蓝、 草大青、 马蓝或胡杨； 更优选地， 所述植物 为金银花。
在另一优选例中， 所述的植物功能性 microRNA是所述植物的水溶性和 /或脂溶性 的提取物中富含的 microRNA种类 (如丰度列前 20位， 更佳地前 10位的 microRNA种 类)。
在另一优选例中， 所述的植物功能性 microRNA 包括选自下组的一种或多种： MIR156h、 MIR166f、 MIR396a、 MIR166a、 MIR168a、 MI 1440, MIR2910、 MIR291 K MIR2915、 MIR2916、 MIR818d、 MIR159e、 MIR159c、 MIR156j、 MIR 1432, MIR166k、 MIR 167b, MIR396c、 MIR156e、 MIR169k、 MIR 167c, MIR160d、 MIR399a、 MIR156d、 MIR160e、 MIR169n、 MI 166K MIR159f、 MIR166c、 MIR159b、 MIR166j、 MIR167i、 MIR 169c, MIR 164c, MIR167j、 MIR167g、 MIR 160c, MIR399e、 MIR399b、 MIR529b、 MIR164e、 MIR166d、 MIR166h、 MIR 164b, MIR156f、 MIR 164a, MI 169K MIR166m、 MIR164f、 MIR156k、 MIR166g、 MIR166b、 MIR 160b, MIR166e、 MIR159d、 MIR818e、 MIR 172a, MIR156b、 MIR399g、 MIR 169b, MIR399f、 MIR167a、 MIR394、 MIR156a、 MIR166i、 MIR167f、 MIR319a、 MIR156g、 MIR166n、 MIR399c、 MIR160a、 MIR159a.l、 MIR 156c, MIR319b、 MIR169o、 MIR167h、 MIR156i、 MIR167d、 MIR169a、 MIR172d、 MIR818b、 MIR164d、 MIR167e、 MIR396b、 MIR2914(表 1)。
在另一优选例中， 所述的植物提取物包括植物的水溶性和 /或脂溶性的提取物。 在另一优选例中， 所述的植物提取物包括植物的枝、 叶、 根、 花、 果和 /或茎的提 取物。
在本发明第二方面中， 提供了一种如本发明第一方面所述的分离的植物功能性 microRNA或含所述植物功能性 microRNA的提取物的用途， 它 (a)用于制备调控非植 物靶基因的组合物； 或 (b) 用于制备治疗非植物靶基因相关疾病的药物。
在另一优选例中， 所述非植物靶基因包括细菌基因、 病毒基因、 衣原体基因、 酵 母基因、 动物基因。
在另一优选例中， 所述的非植物靶基因是病原体 (包括细菌、病毒、衣原体等)的基 因。
在另一优选例中， 所述非植物靶基因相关疾病包括： 肿瘤 (如肝癌、 肺癌)； 急慢性 传染病 (如病毒性流感、 病毒性肝炎、 艾滋病、 SARS等的病毒性疾病， 如结核、 细菌 性肺炎等的细菌性疾病， 以及病原微生物导致的急慢性传染病)； 其它急慢性疾病 (如呼 吸系统疾病、 免疫系统疾病、 血液与造血系统疾病、 如心脑血管疾病的循环系统疾病、 内分泌系统代谢性疾病、 消化系统疾病、 神经系统疾病、 泌尿系统疾病、 生殖系统疾 病和运动系统疾病)。
在另一优选例中， 所述的植物功能性 microRNA包括 MIR2911。 更佳地， 所述的 药物用于治疗病毒性感冒。
在本发明第三方面中， 提供了一种组合物， 其包含 (a) 药学上可接受的载体或食品 学上可接受的载体以及 (b) 本发明第一方面所述的植物功能性 microRNA和 /或含所述 植物功能性 microRNA的植物提取物。
在另一优选例中， 所述的组合物由或基本上由组分 (a)和 (b)构成。
在另一优选例中， 组分 (b)的含量为组合物总重量 0.01-99wt%， 较佳地 0.1-90wt% (按 microRNA计）。
在另一优选例中， 所述组合物包括药物组合物、 食品组合物或保健品组合物。 在另一优选例中， 所述组合物的制备方法包括步骤： 将所述的植物功能性 microRNA或含所述功能性 microRNA的植物提取物与药学上或食品学上可接受的载体 混合， 从而形成所述的组合物。
在另一优选例中， 所述的植物功能性 microRNA来自以下植物： 药用植物、 果蔬 植物、 观赏植物， 并且调控选自下组的非植物靶基因： 细菌基因、 病毒基因、 衣原体 基因、 酵母基因、 动物基因。
在另一优选例中， 所述的植物功能性 microRNA来自金银花、 菘蓝、 草大青、 马 蓝或胡杨。 更佳地， 植物功能性 microRNA包括 MIR2911。
在本发明第四方面中， 提供了一种体外非治疗性调控非植物靶基因表达的方法， 其中， 非植物靶基因包括细菌基因、 病毒基因、 衣原体基因、 酵母基因、 动物基因， 所述方法包括步骤： 在本发明第一方面所述的分离的植物功能性 microRNA或含所述 植物功能性 microRNA的提取物存在下， 培养含所述靶基因的生物材料， 从而调控所 述非植物靶基因的表达。
在另一优选例中， 所述的靶基因是病原体 (包括细菌、 病毒、 衣原体等)的基因。 在另一优选例中， 所述的生物材料包括病毒、 细胞、 组织。
在另一优选例中， 所述的植物功能性 microRNA来自以下植物： 药用植物、 果蔬 植物、 观赏植物。
在另一优选例中， 所述的植物功能性 microRNA来自金银花、 菘蓝、 草大青、 马 蓝或胡杨。 更佳地， 植物功能性 microRNA包括 MIR2911。
在本发明第五方面中， 提供了一种植物功能性 microRNA 的鉴定方法， 其中所述 植物功能性 microRNA具有调控非植物靶基因的功能， 所述方法包括步骤：
(1)提供某一植物的提取物；
(2)检测所述提取物中植物内源性 microRNA的种类或水平； (3)将被检测到的植物 microRNA的序列与非植物靶基因进行比对和分析，从而鉴 定出具有调控非植物靶基因的功能的植物功能性 microRNA。
在另一优选例中， 所述的非植物靶基因包括基因数据库中的基因。
在另一优选例中， 所述非植物靶基因包括细菌基因、 病毒基因、 衣原体基因、 酵 母基因、 动物基因。
在另一优选例中， 所述的非植物靶基因是病原体基因。
在另一优选例中， 所述的植物包括药用植物， 果蔬植物。
在另一优选例中， 在步骤 (3)中挑选提取物中丰度列前 20 位 (更佳地前 10 位)的 microRNA种类进行比对和分析。
在另一优选例中，在步骤 (3)中挑选比值 Lm/La≥l 30% (较佳地≥150%；更佳地≥200%) 的植物 microRNA种类进行对比和分析， 其中 Lm为某一植物 microRNA在提取物中 的丰度 (或水平)， La为所述植物总 microRNA的平均丰度 (或水平)。
在本发明第六方面中， 提供了一种由本发明第五方面所述的方法所鉴定出的植物 功能性 microRNA分子。
在另一优选例中， 所述 microRNA分子包括 MIR2911。
在本发明第七方面中， 提供了一种制备组合物的方法， 包括步骤：
人工合成本发明第六方面所述的植物功能性 microRNA分子； 以及
将所述的植物功能性 microRNA分子与药学上或食品学上可接受的载体混合， 从 而形成组合物。
在本发明第八方面中，提供了一种 microRNA分子 MIR2911或含 MIR2911的提取 物的用途， 用于制备治疗病毒性感冒的药物。
在另一优选例中，所述的提取物 (未浓缩或浓缩)中含 0.01-lOOnM (较佳地 0.1-20nM) 的 MIR2911。
在本发明第九方面中， 提供了一种预防或治疗疾病的方法， 其中所述疾病是与非 植物靶基因相关的疾病， 所述方法包括步骤： 给需要的对象施用本发明第一方面所述 分离的植物功能性 microRNA或含所述植物功能性 microRNA的提取物、 或本发明第 三方面所述的组合物， 从而预防或治疗所述的疾病，其中所述的植物功能性 microRNA 具有调控非植物靶基因的功能。
在另一优选例中， 所述的对象包括哺乳动物 (如人)。
在另一优选例中， 所述的非植物靶基因包括细菌基因、 病毒基因、 衣原体基因、 酵母基因、 动物基因。
在另一优选例中， 所述的非植物靶基因是病原体基因。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例)中具体 描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在此不再 累述。 附图说明
图 1显示植物 microRNA在金银花水提液中 Solexa测序结果。
图 2A是小鼠灌胃金银花水提液后，金银花 microRNA在不同时间点血清中表达量 的 Real-time PCR结果。 检测时间点为 0 h(0小时)、 2 ¾2小时)、 4 h(4小时)、 6 h(6小 时)。
图 2B是小鼠灌胃金银花水提液后，金银花 microRNA在不同时间点肝脏和肺中表 达量的 Real-time PC 结果。 检测时间点为 0 ¾0小时)、 5 h(5小时)、 10 h(10小时)、 15 h(15小时)、 20 h(20小时)、 25 h(25小时）。
图 3显示 MIR2911预测靶基因的序列分析结果。 mfe表示候选靶基因的最低折叠 自由能， mfe绝对值越大， 候选靶基因与 Peu-MIR2911序列匹配度越高。
图 4显示荧光素酶检测预测靶基因的结果。预测基因包括 ADV基因、 HPIV基因、 H1N1基因、 H5N1基因。
图 5A是利用 Real-time PC 技术检测病毒基因 ADV5在 MDCK细胞中的含量。 图 5B是利用 Real-time PC 技术检测病毒基因 H1N1在 MDCK细胞中的含量。 图 5C是利用 Real-time PC 技术检测病毒基因 H5N1在 MDCK细胞中的含量。 图 5A、 图 5B和图 5C中， "未感染"代表未侵染流感病毒的细胞； "感染未处理" 代表侵染流感病毒且未用任何药物处理的细胞； "MIR2911 "代表侵染流感病毒且用 MI 2911处理的细胞； "NC"代表侵染流感病毒且用 MIR2911的无义序列 RNA处理的 细胞； "达菲"代表侵染流感病毒且用达菲 (奧塞米韦， 特异性流感病毒神经氨酸酶抑制 药)处理的细胞。
图 6显示 MIR2911在转染 MIR2911的 HEK 293T细胞分泌的载有 MIR2911的细 胞微粒子中的 Real-time PC 结果。 以未转染 MIR2911的 HEK 293T细胞分泌的细胞 微粒子作为对照 MV。
图 7A是流感病毒 ADV在载有 MIR2911的细胞微粒子处理的 HEK 293T细胞中的 表达量。
图 7B是流感病毒 H1N1在载有 MIR2911的细胞微粒子处理的 HEK 293T细胞中 的表达量。
图 7A和图 7B 中， 以感染流感病毒后不作处理作为空白对照和未载有 MIR2911 的细胞微粒子处理的 HEK 293T细胞作为阴性对照。
图 8A显示小鼠饮用金银花水提液、金银花水提液 +anti-MIR2911(口服组)、灌肺金 银花水提液 +anti-MIR2911(灌肺组)后，感冒病毒 ADV在肺表达的 Real-time PC 结果。
图 8B显示小鼠饮用金银花水提液、金银花水提液 +anti-MIR2911(口服组)、灌肺金 银花水提液 +anti-MIR2911(灌肺组)后，感冒病毒 H1N1在肺表达的 Real-time PC 结果。 图 9显示服用金银花水提液后， 人血液中 MIR2911的 Real-time PC 结果。
检测时间点为 0 ¾0小时)、 1 h(l小时)、 2 h(2小时)、 3 h(3小时)、 4 h(4小时)、 5 h(5 小时)、 6 h(6小时）。 具体实施方式
本发明人通过长期而深入的研究， 意外地发现一种稳定存在于植物提取物中的可 分离的植物内源性 microRNA或含有所述 microRNA的植物提取物， 可用于调控动物 体内所述内源性 microRNA靶基因的表达， 进而用于调控动物的生理病理活动。 因此， 可用于指导制备药物或功能性食物等。 在此基础上， 发明人完成了本发明。
如本文所用， "osa"表示水稻； "peu"表示胡杨。
分离的植物功能性 microRNA
本发明所述的植物功能性 microRNA为所述植物内源性的 microRNA,可稳定存在 于该植物的水溶性和 /或脂溶性的提取物中。 优选为所述的植物功能性 microRNA是所 述植物的水溶性和 /或脂溶性的提取物中富含的 microRNA种类 (如丰度列前 20位， 更 佳地前 10 位的 microRNA种类)。 此外， 本发明的 microRNA包括各种形式， 例如 pri-micro NA^ pre-micro NA以及 microRNA成熟体。
所述植物功能性 microRNA 的例子包括 (但并不限于)选自表 1 的一种或多种 microRNA, 尤其是选自下组的一种或多种： MIR156h、 MIR166f、 MIR396a、 MIR166a、 MIR168a、 MI 1440, MIR2910、 MI 291 K MIR2915、 MIR2916。
在另一优选例中， 所述的植物包括药用植物、 果蔬植物、 观赏植物； 较佳地包括 金银花、 菘蓝、 草大青、 马蓝、 胡杨、 豇豆、 棉花、 大白菜或马铃薯； 更佳地， 所述 植物为金银花、 菘蓝、 草大青、 马蓝或胡杨； 最佳地， 所述植物为金银花。
本发明所述含所述植物功能性 microRNA的提取物包括植物的水溶性和 /或脂溶性 的提取物， 例如植物的枝、 叶、 根、 花、 果和 /或茎的提取物。 提取方法 (植物提取物的制法）
本发明所述的植物 microRNA 的提取方法主要采用溶剂提取法， 即采用溶剂从植 物中提取其 microRNA。 其中， 所述的溶剂包括水、 亲水性溶剂、 或其组合。 所述组合 包括： 在水中添加适量的亲水性溶剂或在亲水性溶剂中添加适量的水。 应理解， 溶剂 中还可添加适量的辅助试剂， 如 pH调节剂 (如酸或碱)等。
提取可以在任何适宜的温度 (如常温〜溶剂回流的温度)下进行， 优选采用浸渍法、 渗漉法、 煎煮法、 回流提取法、 连续提取法等。
在提取过程中，可对植物进行预处理，例如将植物粉碎或进行酶处理 (如纤维素酶、 半纤维素酶、 果胶酶、 木聚糖酶、 中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 葡聚糖酶、 以及夏合酶) 等； 也可对提取的混合物进行后处理， 如将植物用水进行提取后， 可在提取后的混合 物中加入亲水性溶剂 (如乙醇等)， 使得混合物经陈化沉淀。
提取后得到的液体物可直接使用， 也可进行过滤、浓缩、干燥 (如冻干)等处理后制 得固体物， 然后再使用。
优选地， 本发明所述的植物 microRNA的提取方法为水提法。
例如包括步骤： 取适量金银花， 粉碎后， 在一定温度 (如室温〜回流)下， 将金银花 粉末置于水浴中， 加热若干次 (如 1〜5次)， 每次保温一段时间 (如 0.1〜10小时)， 收集 液体， 备用。
或包括步骤： 取适量金银花， 粉碎后， 在一定温度 (如室温〜回流)下， 将金银花粉 末置于水浴中， 加热若干次 (如 1〜5次)， 每次保温一段时间 (如 0.1〜10小时)， 将提取 液浓缩至一定体积后， 加入适量乙醇， 沉淀出大部分的粘液质， 过滤， 收集滤液， 备 用。 检测
对植物进行提取后， 收集植物提取物， 检测提取物中植物 microRNA的种类及其 含量。 所用的测试方法可以是本领域常规方法， 例如 (但不限于)： Solexa测序技术， Real-time PCR、 RT-PCR、 微阵列芯片、 原位杂交、 Northern Blotting、 恒温滚环扩增、 基于共轭聚合物的 microRNA检测等。
所述 Solexa测序技术方法， 优选包括步骤：
收集金银花组织或汤药样本；
通过 Trizol试剂提取样本总 RNA;
进行 PAGE电泳回收 17-27nt RNA分子；
将接头引物（adaptor primer) 酶联在小 RNA分子的 3'与 5 '端；
纯化的 DNA直接用于集群生成， 利用 Illumina Genome Analyzer进行测序分析。
Real-time PC 方法， 优选包括步骤：
提取样本中总 RNA， 通过 RNA逆转录反应得到 cDNA样品；
用植物 microRNA设计引物；
加入 TaqMan探针或者荧光染料进行 PCR反应；
检测样本中植物 microRNA的量的变化。 鉴定
本发明提供了一种植物功能性 microRNA 鉴定方法， 其中所述植物功能性 micro NA具有调控非植物靶基因的功能， 包括步骤：
(1)提供某一植物 (包括药用植物， 果蔬植物)的提取物；
(2)检测所述提取物中植物内源性 microRNA的种类或水平；
(3)将被检测到的植物 microRNA的序列与非植物靶基因进行比对和分析，从而鉴 定出具有调控非植物靶基因的功能的植物功能性 microRNA。
在另一优选例中， 所述的非植物靶基因包括基因数据库中的基因。 优选地， 所述 非植物靶基因包括细菌基因、 病毒基因、 衣原体基因、 酵母基因、 动物基因； 或所述 的非植物靶基因是病原体基因。
在另一优选例中， 在步骤 (3)中挑选提取物中丰度列前 20 位 (更佳地前 10 位)的 microRNA种类进行比对和分析。
在另一优选例中，在步骤 (3)中挑选比值 Lm/La≥l 30% (较佳地≥150%；更佳地≥200%) 的植物 microRNA种类进行对比和分析， 其中 Lm为某一植物 microRNA在提取物中 的丰度 (或水平)， La为所述植物总 microRNA的平均丰度 (或水平)。
由所述方法鉴定出的植物功能性 microRNA分子包括 MIR2911。 用途
本发明所述植物功能性 microRNA或包含所述植物功能性 microRNA的植物提取 物具有如下多个应用：
一、 指导功能性组合物的开发或制造
本发明所述组合物的活性成分为所述植物功能性 microRNA或包含所述植物功能 性 microRNA的植物提取物。其中，所述的植物功能性 microRNA (如 MI 2911等)具有 调控非植物靶基因的功能。 可用于 (a) 制备调控非植物靶基因的组合物； 或 (b) 制备治 疗非植物靶基因相关疾病的药物。其中， 所述的调控包括抑制 (下调)靶基因的表达、促 进 (上调)靶基因的表达。
在另一优选例中， 所述非植物靶基因包括细菌基因、 病毒基因、 衣原体基因、 酵 母基因、 动物基因； 或所述的非植物靶基因是病原体 (包括细菌、 病毒、 衣原体等)的基 因。
在另一优选例中， 所述非植物靶基因相关疾病包括： 肿瘤 (如肝癌、 肺癌)； 急慢性 传染病 (如病毒性流感、 病毒性肝炎、 艾滋病、 SARS等的病毒性疾病， 如结核、 细菌 性肺炎等的细菌性疾病， 以及病原微生物导致的急慢性传染病)； 其它急慢性疾病 (如呼 吸系统疾病、 免疫系统疾病、 血液与造血系统疾病、 如心脑血管疾病的循环系统疾病、 内分泌系统代谢性疾病、 消化系统疾病、 神经系统疾病、 泌尿系统疾病、 生殖系统疾 病和运动系统疾病)。 组合物
本发明所述组合物 (包括药物组合物、 食品组合物或保健品组合物)可包含： （a) 药 学上可接受的载体或食品学上可接受的载体； 以及 (b) 活性成分。
优选地， 所述的组合物由或基本上由组分 (a)和 (b)构成。
在另一优选例中， 组分 (b)的含量为组合物总重量 0.01-99wt%， 较佳地 0.1-90wt% (按 microRNA计）。
所述组合物的制备方法包括步骤： 将所述的植物功能性 microRNA或含所述功能 性 microRNA 的植物提取物与药学上或食品学上可接受的载体混合， 从而形成所述的 组合物。
现以药物组合物为例， 对组合物作进一步说明： 本发明的药物组合物包含安全有 效量范围内的活性成分及药理上可以接受的赋形剂或载体。 其中"安全有效量"指的是: 活性成分的量足以明显改善病情， 而不至于产生严重的副作用。 通常， 药物组合物含 有 l-2000mg活性成分 /剂， 更佳地， 含有 10-200mg活性成分 /剂。 或者含有 0.01〜100 微摩尔活性成分 /剂， 较佳地为 0.1〜10微摩尔 /剂； 较佳地， 所述的"一剂"为一口服液。
"药学上可以接受的载体"指的是： 一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质， 它们适合于人使用， 而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。 "相容性"在此指的是组 合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互惨和， 而不明显降低化合物的药 效。 药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物 (如羧甲基纤维素钠、 乙基纤 维素钠、 纤维素乙酸酯等)、 明胶、 滑石、 固体润滑剂 (如硬脂酸、 硬脂酸镁)、 硫酸丐、 植物油 (如豆油、 芝麻油、 花生油、 橄榄油等)、 多元醇 (如丙二醇、 甘油、 甘露醇、 山 梨醇等)、 乳化剂 (如吐温 ®)、 润湿剂 (如十二垸基硫酸钠)、 着色剂、 调味剂、 稳定剂、 抗氧化剂、 防腐剂、 无热原水等。
本发明组合物的给药方式包括： 口服、 呼吸道、 注射、 透皮、 粘膜或腔道给药。 本发明组合物的剂型包括： 片剂、 胶囊剂、 粉剂、 丸剂、 颗粒剂、 糖浆剂、 溶液、 混悬液、 乳剂、 混悬剂、 喷雾剂、 气雾剂、 粉雾剂、 挥发性液体、 注射液、 粉针剂、 外用溶液剂、 洗剂、 浇淋剂、 搽剂、 巴布膏剂、 膏药、 橡胶膏剂、 软膏剂、 硬膏剂、 糊剂、 滴眼剂、 滴鼻剂、 眼用软膏剂、 含漱剂、 舌下片剂或栓剂。
优选地，本发明提供了一种 microRNA分子 MIR291 1或含 MIR2911的提取物的用 途， 用于制备治疗病毒性感冒的药物。 较佳地， 所述的提取物 (未浓缩或浓缩)中含 0.01-100 nM (较佳地 0.1-20 nM)的 MIR2911。 二、 指导人工合成植物功能性 microRNA
通过本发明所述的方法鉴定出植物中（尤其是植物提取中)存在的植物功能性 microRNA, 可直接指导技术人员对所述 microRNA 进行人工合成， 从而提高所述的 microRNA的生产。并将合成的植物功能性 microRNA分子与药学上或食品学上可接受 的载体混合， 从而形成组合物。 三、 体外非治疗性调控非植物靶基因表达
在本发明所述的分离的植物功能性 microRNA或含所述植物功能性 microRNA的 提取物存在下， 培养含非植物靶基因 (如细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、 动物基因)的生物材料 (包括病毒、 细胞、 组织)， 从而实现体外调控所述非植物靶基因 的表达
在另一优选例中， 所述的靶基因是病原体 (包括细菌、 病毒、 衣原体等)的基因。 在另一优选例中， 所述的植物功能性 microRNA来自以下植物： 药用植物、 果蔬 植物、 观赏植物； 较佳地， 来自金银花、 菘蓝、 草大青、 马蓝或胡杨； 更佳地， 所述 植物功能性 microRNA包括 MIR291 1。 四、 疾病预防或治疗方法
给需要的对象 (如哺乳动物或人))施用本发明所述分离的植物功能性 microRNA或 含所述植物功能性 microRNA 的提取物、 或本发明所述的组合物， 从而实现预防或治 疗与非植物靶基因相关的疾病， 其中所述的植物功能性 microRNA具有调控非植物靶 基因 (包括细菌基因、 病毒基因、 衣原体基因、 酵母基因、 动物基因)的功能。
在另一优选例中， 所述的非植物靶基因是病原体基因。 发明人通过对植物功能性 microRNA及其进入动物体内后的存在形式、 递送途径 和功能等一系列研究， 1. 形成了一套高效、 稳定地提取植物功能性 microRNA的方法， 提供了一种包含植物功能性 microRNA的植物提取物。 2. 发现了通过多种途径 (如摄食 或静脉注射等)， 植物 (如金银花等)功能性 microRNA可进入动物体并在血液中富集， 并调节非植物靶基因， 进而参与动物体 (如人)的生理病理活动。 3. 形成了一套鉴定植 物功能性 microRNA的方法， 可用于指导选择性合成植物功能性 microRNA的方法， 有利于加快该 microRNA的生产； 还可用于指导筛选富含植物功能性 microRNA的药 材，有利于鉴别药材的优劣。 4. 形成了一套指导制造功能性食物或药物的方法： 4.1 所 述方法利用分离的植物功能性 microRNA或包含植物功能性 microRNA的植物提取物 或筛选出的富含功能性 microRNA的植物， 可用于制造功能性食物或药物等组合物； 4.2所述方法通过提取植物 microRNA并鉴定出植物功能性 microRNA, 并进行所述植 物功能性 microRNA的人工合成， 然后将人工合成的 microRNA用于制造功能性食物 或药物。 本发明主要优点包括：
1. 提供了一种分离的植物功能性 microRNA和 /或含所述植物功能性 microRNA的 植物提取物及其用途。所述 microRNA为可调控非植物靶基因的表达，具有多种用途 (如 可作为中草药有效成分的标准， 有利于指导功能性组合物的开发和制造等)。
2. 提供了一种以分离的植物功能性 microRNA和 /或含所述植物功能性 microRNA 的植物提取物为活性成分的组合物。 所述活性成分的作用机理明确， 效果显著， 有利 于对中医药的科学机制的探索， 且制法简单、 成本低廉， 适合工业化生产。
3. 提供了一种鉴定植物功能性 microRNA的方法。 下面结合具体实施， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常 规条件， 例如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 实施例 1使用 Solexa测序技术检测稳定存在于金银花水提液中的植物 microRNA 首先， 利用水提法提取金银花 microRNA。取适量 (50克）干燥金银花药材，在 500 ml (金银花质量与水体积比为 1 : 10)水的 100°C水浴下加热 0.5小时， 提取液在 60°C下 减压浓缩至原体积的 1/10。 收集浓缩及未浓缩金银花水提液， 用于后续实验。
然后， 使用 Solexa测序技术检测稳定存在于经上述步骤制备出的金银花水提液中 的植物 microRNA, Solexa上样量为 10 RNA。经测定，未浓缩水提液中总 microRNA 的浓度约为 1 nM， 浓缩水提液中总 microRNA浓度约为 10 nM。
检测结果显示，金银花水提液中稳定存在多种植物 microRNA, 能被检测到的包括 表 1中所列出的 85种 microRNA,其序列详见表 1。其中 MIR156h、MIR166f、MIR396a、 MIR166a、 MIR168a、 MI 1440, MIR2910、 MI 291 K MIR2915、 MIR2916含量较高， MI 2911的含量最高。 具体结果见图 1。 表 1中其他 75种 miRNA在提取物中检测出 拷贝数均较低 (都在 2-1000之间)。
表 1. 稳定存在于金银花中且可检测的 microRNAs
microRNA名称 对应序列
SEQ ID NO.: 1 MIR156h uugacagaagauagagagcac
SEQ ID NO.:2 MIR166f ucggaccaggcuucauucccc
SEQ ID NO. :3 MIR396a uuccacagcuuucuugaacug
SEQ ID NO. :4 MIR166a ucggaccaggcuucauucccc
SEQ ID NO. :5 MIR168a ucgcuuggugcaggucgggaa
SEQ ID NO. :6 MIR1440 ugcucaaauaccacucuccu SEQ ID NO.:7 MIR2910 uaguugguggagcgauuuguc
SEQ ID NO.:8 MIR2911 ggccgggggacgggcuggga
SEQ ID NO.:9 MIR2915 cccgucuagcucaguuggua
SEQ ID NO.:10 MIR2916 uggggacucgaagacgaucauau
SEQ ID NO.: 11 MIR818d aaucccuuauauuaugggacgg
SEQ ID NO.: 12 MIR159e auugguuugaagggagcucca
SEQ ID NO.: 13 MIR159c auuggauugaagggagcucca
SEQ ID NO. :14 MIR156j ugacagaagagagagagcac
SEQ ID NO.: 15 MIR1432 cucaggagagaugacaccgac
SEQ ID NO.: 16 MIR166k ucggaccaggcuucauucccc
SEQ ID NO.: 17 MIR167b ugaagcugccagcaugaucua
SEQ ID NO.: 18 MIR396c uuccacagcuuucuugaacuu
SEQ ID NO.: 19 MIR156e ugacagaagagagugagcaca
SEQ ID NO. :20 MIR169k uagccaaggaugacuugccug
SEQ ID NO.:21 MIR167c uaagcugccagcaugaucuug
SEQ ID NO. :22 MIR160d ugccuggcucccuguaugcca
SEQ ID NO. :23 MIR399a ugccaaaggagaauugcccug
SEQ ID NO. :24 MIR156d ugacagaagagagugagcac
SEQ ID NO. :25 MIR160e ugccuggcucccuguaugcca
SEQ ID NO. :26 MIR169n ugagccaaggaugacuugccg
SEQ ID NO. :27 MIR1661 ucggaccaggcuucaaucccu
SEQ ID NO. :28 MIR159f uuuggauugaagggagcucug
SEQ ID NO. :29 MIR166c ucggaccaggcuucauucccc
SEQ ID NO.:30 MIR159b uuuggauugaagggagcucug
SEQ ID NO.:31 MIR166j ucggaucaggcuucauuccuc
SEQ ID NO.:32 MIR167i ugaagcugccagcaugaucug
SEQ ID NO.:33 MIR169c cagccaaggaugacuugccgg
SEQ ID NO. :34 MIR164c uggagaagcagggcacgugca
SEQ ID NO.:35 MIR167j ugaagcugccagcaugaucug
SEQ ID NO.:36 MIR167g ugaagcugccagcaugaucug
SEQ ID NO.:37 MIR160c ugccuggcucccuguaugcca
SEQ ID NO. :38 MIR399e ugccaaaggagauuugcccgg
SEQ ID NO.:39 MIR399b ugccaaaggagauuugcccgg
SEQ ID NO. :40 MIR529b agaagagagagaguacagcuu
SEQ ID NO.:41 MIR164e uggagaagcaggacacgugag
SEQ ID NO. :42 MIR166d ucggaccaggcuucauucccc
SEQ ID NO. :43 MIR166h ucggaccaggcuucauucccc
SEQ ID NO. :44 MIR164b uggagaagcagggcacgugca
SEQ ID NO. :45 MIR156f ugacagaagagagugagcac
SEQ ID NO. :46 MIR164a uggagaagcagggcacgugca
SEQ ID NO. :47 MIR1691 uagccaaggaugacuugccug
SEQ ID NO. :48 MIR166m ucggaccaggcuucauucccu
SEQ ID NO. :49 MIR164f uggagaagcagggcacgugcu SEQ ID NO.:50 MIR156k ugacagaagagagggagcac
SEQ ID NO. :51 MIR166g ucggaccaggcuucauucccc
SEQ ID NO. :52 MIR 166b ucggaccaggcuucauucccc
SEQ ID NO. :53 MIR 160b ugccuggcucccuguaugcca
SEQ ID NO. :54 MIR166e ucggaccaggcuucauucccc
SEQ ID NO. :55 MIR159d cuuggauugaagggagcuccu
SEQ ID NO. :56 MIR818e aaucccuuauauuaugggacgg
SEQ ID NO.:57 MIR172a agaaucuugaugaugcugcau
SEQ ID NO.:58 MIR156b ugacagaagagagugagcac
SEQ ID NO.:59 MIR399g ugccaaaggagauuugcccag
SEQ ID NO. :60 MIR169b cagccaaggaugacuugccgg
SEQ ID NO. :61 MIR399f ugccaaaggagauuugcccag
SEQ ID NO. :62 MI 167a ugaagcugccagcaugaucua
SEQ ID NO. :63 MIR394 uuggcauucuguccaccucc
SEQ ID NO. :64 MIR156a ugacagaagagagugagcac
SEQ ID NO. :65 MIR166i ucggaucaggcuucauuccuc
SEQ ID NO. :66 MIR167f ugaagcugccagcaugaucug
SEQ ID NO. :67 MIR319a agcugccgaaucauccauuca
SEQ ID NO. :68 MIR156g ugacagaagagagugagcac
SEQ ID NO. :69 MIR166n ucggaccaggcuucauucccc
SEQ ID NO. :70 MI 399c ugccaaaggagaauugcccug
SEQ ID NO. :71 MIR160a ugccuggcucccuguaugcca
SEQ ID NO. :72 MIR159a.l uuuggauugaagggagcucug
SEQ ID NO. :73 MIR156c ugacagaagagagugagcac
SEQ ID NO. :74 MIR319b uuggacugaagggugcuccc
SEQ ID NO.:75 MIR169o uagccaagaaugacuugccua
SEQ ID NO. :76 MIR167h ugaagcugccagcaugaucug
SEQ ID NO. :77 MIR156i ugacagaagagagugagcac
SEQ ID NO. :78 MI 167d ugaagcugccagcaugaucug
SEQ ID NO. :79 MIR169a cagccaaggaugacuugccga
SEQ ID NO. :80 MIR172d agaaucuugaugaugcugcau
SEQ ID NO.:81 MIR818b aaucccuuauauuaugggacgg
SEQ ID NO. :82 MIR164d uggagaagcagggcacgugcu
SEQ ID NO.:83 MIR167e ugaagcugccagcaugaucug
SEQ ID NO. :84 MIR396b uuccacagcuuucuugaacug
SEQ ID NO. :85 MIR2914 uaugguggugacgggugacggag 实施例 2利用 Real-time PCR方法检测通过摄食进入动物体内且稳定存在的金银 花 microRNA
本实施例证实金银花 microRNA可通过摄食进入动物体内， 且稳定存在。
向小鼠灌胃金银花水提液 (实施例 1制备的浓缩水提掖)，检测金银花 microRNA在 血清、 肝脏和肺中的表达水平。
具体步骤为： 首先将小鼠饥饿 12小时， 然后向小鼠灌胃 10 ml/kg小鼠体重的金银 花浓缩水提液， 采用 Real-time PCR在 0 h(0小时)、 2 h(2小时)、 4 h(4小时)、 6 h(6小 时)等， 检测金银花 microRNA MIR2911在小鼠血清、 肝脏和肺中的表达水平。
用于 Real-time PC 检测 MIR2911的引物序列为：
正向弓 I物： ACACTCCAGCTGGGGGCCGGGGGACGGG (SEQ ID NO.: 86)；
(SEQ ID NO.: 87)；
探针序歹 Ij： TCCCAGCCCGTCCCCCGGCC (SEQ ID NO.: 88)。
具体结果见图 2A和图 2B。
图 2A是小鼠灌胃金银花水提液后，在不同时间点， 金银花 microRNA在血清中表 达量的 Real-time PC 结果。 从结果可以看出， 小鼠灌胃金银花水提液后， 血清中 MI 2911的含量显著增加。 灌胃金银花水提液 1.5 小时后， 血清中 MIR2911的含量达 到最高值， 6小时后血清中 MIR2911的含量下降到最初水平。
图 2B是小鼠灌胃金银花水提液后， 在不同时间点， 金银花 microRNA在肝脏和肺 中表达量的 Real-time PC 结果。从结果可以看出，小鼠灌胃金银花水提液后， MIR2911 在肝脏和肺中的表达水平增加。 向小鼠灌胃金银花水提液 6小时后， MIR2911在肝脏 中的表达达到最大值； 灌胃金银花水提液 12小时后， MIR2911在肺中的表达达到最大 值。
结果表明， 金银花 microRNA可通过摄食进入动物体内， 且稳定存在。 实施例 3金银花 microRNA可调控生理病理活动
本实施例证实金银花 microRNA可在动物体内调节生理病理活动。
3.1 利用生物信息学预测金银花 microRNA的靶基因
采用生物信息学预测呼吸道传染病病毒的基因组中多个靶基因与 MIR2911序列匹 配。 具体结果见图 3。 图 3是 MIR2911预测靶基因的序列分析结果。 mfe表示候选靶 基因的最低折叠自由能， mfe绝对值越大， 候选靶基因与 Peu-MIR2911序列匹配度越 高。 结果表明， ADV基因、 HPIV1基因、 H1N1基因、 H5N1基因是金银花 microRNA 的潜在靶基因。
3.2利用荧光素酶检测方法验证靶基因。 具体步骤如下：
(1) 构建一个将预测的 MIR2911靶基因序列特定片段插入到荧光素酶表达质粒的 3，-UTR区；
(2)筛选阳性克隆， 测序； 扩增克隆并提纯质粒备用； (3)扩增预测的靶基因质粒，提纯备用；同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用；
(4)培养相关细胞， 并接种于 24孔板中， 生长 10-24小时；
(5)将要检测的载有预测靶基因的荧光素酶表达质粒与 MIR2911共转染细胞；
(6) 加入荧光素酶底物， 荧光素酶与底物反应， 产生荧光素， 通过检测荧光的强度 可以测定荧光素酶的活性；
(7) 与空载对照 (NC)比较， 从而判断预测靶点是否能被 MIR2911抑制。
具体结果见图 4。 图 4是荧光素酶检测预测靶基因的结果。 以 NC (即等量的含有 MI 2911 的错配对照序列的 RNA)作为对照。 结果表明， 大多数预测的靶基因可与成 熟 MIR2911结合， 形成双链结构。 这提示， MIR2911可对 ADV基因、 HPIV基因、 H1N1基因、 H5N1等基因通过结合而起到调节作用。
3.3 检测马丁达比狗肾（MDCK)细胞中 MIR2911对病毒基因 ADV、 H1N1、 H5N1 的影响。 具体步骤如下：
(1)在 24孔细胞培养板中培养 MDCK细胞。
(2) 将 MIR2911(20 pmol/106 细胞)通过商用转染试剂 lipofectamine2000 转染进 MDCK细胞 (MIR2911 组)， 同时将 MIR2911 的无义序列 RNA按照相同剂量转染至 MDCK细胞作为对照 (NC)， 并同时设立阳性药物 (达菲)。
(3)使用 H1N1，H5N1和腺病毒 ADV按照感染复数 (MOI) 为 0.001感染上述细胞。
(4)病毒感染 24小时后， 通过 real-time PCR检测细胞中病毒基因 ADV、 H1N1、 H5N1的含量， 通过与对照组比较， 判断 MIR2911是否对病毒复制具有抑制作用。
检测病毒基因的具体步骤为： 将细胞消化收集后， 用 PBS缓冲液冲反复洗 3次， 用蛋白变性试剂提取总 RNA， 然后通过 real-time PC 方法鉴定其中病毒标志 PB1 mRNA的含量， 并与标准曲线对照， 计算病毒的含量。
具体结果见图 5A、图 5B和图 5C。图 5A是 Real-Time PC 技术检测病毒基因 ADV 在 MDCK细胞中的含量。 图 5B是 Real-Time PC 技术检测病毒基因 H1N1在 MDCK 细胞中的含量。 图 5C是 Real-Time PC 技术检测病毒基因 H5N1在 MDCK细胞中的 含量。 结果表明， MIR2911对 ADV5、 H1N1和 H5N1有显著的抑制和阻断作用。 实施例 4金银花 microRNA通过肠道上皮细胞 Caco-2细胞微粒子 (MVs)进入其他 细胞， 并在其他细胞内起调控作用
本实施例证实金银花 microRNA可通过肠道上皮细胞 Caco-2细胞微粒子包裹进入 动物体， 并被细胞微粒子递送进入其他细胞， 对其他细胞的生理病理状况产生影响， 如抑制感冒病毒。
4.1 将金银花 microRNA转入肠道上皮细胞 Caco-2， 具体步骤为： (1)将肠道上皮细胞 Caco-2， 接种于 12孔板或 10毫米培养皿， 过夜；
(2)第二天使用脂质体 2000转染；
(3) MI 2911转染 Caco-2细胞；
(4)转染后， 细胞培养 24或 48小时后， 用于 Real-time PCR分析。
4.2采用差速离心法分离肠道上皮细胞 Caco-2释放的细胞微粒子：
(1) 先将培养肠道上皮细胞 Caco-2于 300 g离心 5分钟， 取上清；
(2)将上清于 1200 g离心 20分钟， 取上清；
(3)将上清于 10000 g离心 30分钟， 取上清；
(4)将上清于 110000 g离心 2小时， 全部操作在 4°C中， 在 FBS-free介质中收集 沉淀， 得到总细胞微粒子。
4.3 检测 Caco-2细胞释放的细胞微粒子中 MIR2911水平，
证实 MIR2911 已被 Caco-2细胞释放的细胞微粒子包裹： 提取微粒子中的 RNA， 通过绝对定量 real-time PC 技术确定其中的 MIR2911的含量。
4.4 收集载有 MIR2911 的细胞微粒子， 用其处理 HEK 293T 细胞， 证实金银花 micro NA由细胞微粒子递送进入其他细胞。
用载有 MIR2911的细胞微粒子处理 HEK 293T细胞后， 采用 Real-time PC 实验 检测 MIR2911在 HEK 293T细胞中的表达水平。 eal-time PC 实验具体步骤如实施例
2所述。
具体结果见图 6。图 6是经载有 MIR2911的 Caco-2细胞分泌的细胞微粒子处理后， HEK 293T细胞分泌的细胞微粒子中的 Real-time PCR结果。 以未经载有 MIR2911的 Caco-2细胞分泌的细胞微粒子 (对照 MV)处理后的 HEK 293T细胞分泌的细胞微粒子作 为对照。 从结果可以看出， 与对照相比， MIR2911在用载有 MIR2911细胞微粒子处理 后 HEK 293T细胞中表达显著增加。
结果表明， 金银花 microRNA可通过 Caco-2分泌细胞微粒子包裹进入动物体， 并 递送至其他细胞。
4.5 金银花 microRNA 由细胞微粒子递送进入其他细胞后， 对细胞生理 /病理状况 的影响：
用载有 MIR2911的细胞微粒子 (制法同本实施例第 4.2部分的差速离心法） 处理被 流感病毒 ADV或 H1N1感染的 HEK 293T细胞。 具体步骤为：
(1)在 24孔板中培养 HEK 293T细胞。 (2)将本实施例 4.4 部分获得的微粒子加入细胞培养基， 微粒子用量为 0.1 pmol MI 2911/106 细胞。
(3) 步骤 (2) 处理 6小时后，按照 MOI = 0.001感染腺病毒 ADV或 H1N1感冒病毒。
(4)病毒感染 24小时后，通过 Real-time PC 检测病毒的含量。采用 Real-time PC 方法检测 HEK 293T细胞中流感病毒 ADV或 H1N1的含量。具体步骤如实施例 3所述。
具体结果见图 7。 图 7A是流感病毒 ADV在载有 MIR2911 的细胞微粒子处理的 HEK 293T细胞中的表达量。图 7B是流感病毒 H1N1在载有 MIR2911的细胞微粒子处 理的 HEK 293T细胞中的表达量。 图 7A和图 7B以感染流感病毒后不作处理的 HEK 293T细胞 (空白对照)和以未载有 MIR2911 的细胞微粒子 (阴性对照)处理的 HEK 293T 细胞作为对照。
从结果可以看出， 在载有 MIR2911的细胞微粒子处理的 HEK 293T细胞中， 流感 病毒 ADV和 H1N1表达显著降低。 结果表明， MIR2911对流感病毒 ADV和 H1N1有 显著抑制作用。
本实施例证实了金银花 microRNA可通过口服等途径进入动物体， 被细胞微粒子 包裹递送进入其他细胞， 并在细胞中发挥作用， 如抑制感冒病毒。 可见， 金银花 microRNA通过可通过口服等途径进入动物组织、 器官， 并调节动物生理病理状况。 实施例 5金银花 microRNA可在动物体内显著抑制感冒病毒
本实施例证实抑制感冒病毒的有效成分为金银花 microRNA, 而非其他。
使小鼠随意饮用未浓缩金银花水提液 (实施例 1制备） 3天后， 接种 ADV或 H1N1 病毒， 继续服用未浓缩金银花水提液 3天， 然后利用 real-time PC 检测小鼠肺部的病 毒含量。 结果表明， 金银花汤药对 ADV和 H1H1病毒的增殖有强烈的抑制作用。
为验证发挥病毒抑制作用的正是金银花 microRNA MI 2911， 采用如下对照组：
1. 使小鼠饮用含有 anti-MIR2911 (用量与 MIR2911的用量相当)的金银花汤药， 包 括： 金银花水提液 +anti-MIR2911(口服组)和金银花水提液 +anti-MIR2911(灌肺组)； 其 中 anti-MIR2911是 MIR2911的反义核酸， 与 MIR2911完全互补。
小鼠灌肺， 具体步骤为：
(1)将小鼠麻醉并固定， 置于超净工作台；
(2)颈部去毛并消毒；
(3)无菌条件下暴露气管， 插导管并固定；
(4)用 1次性注射器抽取金银花水提液 +anti-MIR2911灌肺， 反复抽吸。
2. 使小鼠饮用与金银花汤药等体积的纯水，作为空白对照组。然后，使用 Real-time PC 方法检测各组小鼠肺部感冒病毒 ADV或 H1N1的含量。
Real-time PC 检测感冒病毒 ADV的引物序列如下： 正向引物序列： 5，-CAAAGACTTCTCATCGGTTGC-3，（SEQ ID NO.:89);
反向引物序列： 5，-AATGCAACACTCGGTTCACA-3， (SEQ ID NO.: 90)； 探针序列： TCAGGC CCC CTCAAAGCCGA (SEQ ID NO.: 91)。
Real-time PC 检测感冒病毒 HlNl的引物序列如下：
正向引物序列： 5，-CCCAAAGTGAGGGATCAAGA-3， (SEQ ID NO.: 92)； 反向引物序列： 5，-CCCTTGGGTGTCTGACAAGT-3， (SEQ ID NO.: 93)； 探针序列： TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA (SEQ ID NO.: 94)。
具体结果见图 8A和图 8B。
图 8A是向小鼠饮用金银花水提液、 金银花水提液 +anti-MIR2911 (口服组)、 灌肺 金银花水提液 +anti-MIR2911 (灌肺组)后， 感冒病毒 ADV在肺表达的 Real-time PC 结 果。
从结果可以看出： 以喂食相同体积的水的小鼠作为空白对照， 饮用金银花水提液 后， ADV在小鼠肺部表达显著降低， 表明金银花 microRNA抑制感冒病毒 ADV的表 达。 与饮用金银花水提液相比， 小鼠饮用金银花水提液 +anti-MIR2911 后， ADV在小 鼠肺部表达增加， 说明 anti-MIR2911破坏 MIR2911对感冒病毒 ADV的抑制作用。 结 果表明， 金银花 microRNA有直接抗病毒作用。
图 8B是向小鼠饮用金银花水提液、 金银花水提液 +anti-MIR2911 (口服组)、 灌肺 金银花水提液 +anti-MIR2911(灌肺组)后， 感冒病毒 H1N1在肺表达的 Real-time PCR结 果。
从结果可以看出： 与饮用纯水的空白对照组小鼠相比， 饮用金银花水提液的小鼠 肺部 H1N1表达显著降低， 表明金银花 microRNA抑制感冒病毒 H1N1 的表达。 而饮 用金银花水提液 +anti-MIR2911后， 小鼠肺部 H1N1表达增加。 由于 anti-MIR2911破坏 MI 2911 , 结果表明， 金银花 microRNA有直接抗病毒作用。 实施例 6金银花 microRNA通过消化道进入人体
本实施例证实金银花 microRNA通过消化道被人体吸收， 进入循环系统。
首先将干金银花水煮 30 min， 制成 1000 ml的水提液， MIR2911在水提液中的含 量约为 0.4 n mol/L。然后招募 20名健康志愿者， 每人服用制成的水提液 1000 ml， 在 0 h (0小时)、 l h (l小时)、 2 h (2小时)、 3 h (3小时)、 4 h (4小时)、 5 h (5小时)、 6 h (6 小时） 收集志愿者的血液， 利用 Real-time PCR检测其中 MIR2911 的含量， Real-time PC 实验具体步骤如实施例 2所述。
具体结果见图 9。图 9是服用金银花水提液后，人血液中 MIR2911的 Real-time PCR 结果。 从结果可以看出， 服用金银花水提液后， 人血液中 MIR2911的含量显著增加。 服用金银花水提液 1.5 小时后， 人血液中 MIR2911的含量达到最大值， 3小时后人血 液中 MIR2911 的含量下降到最初水平。 这些结果与实施例 2中小鼠实验结果一致 (图 2A)。 结果表明， 金银花 microRNA可通过摄食进入人体， 被消化道吸收， 进入循环系 统。 实施例 7金银花 microRNA可显著抑制人体内的感冒病毒
本实施例证实抑制人体感冒病毒的有效成分为金银花 microRNA, 而非其他。 首先招募 15名携带 ADV病毒的病毒性感冒患者， 15名携带 H1N1病毒的病毒性 感冒患者， 然后将上述病毒性感冒患者分成 6组， 每组 5人， 组 1-3为携带 ADV病毒 的病毒性感冒患者， 组 4-6为携带 H1N1病毒的病毒性感冒患者：
组 1 : 服用金银花水提液 (实施例 6制备) 1000mL。
组 2： 服用金银花水提液 1 OOOmL + anti-MIR2911 (用量与 MIR2911的用量相当)； 其中 anti-MIR2911是 MIR2911的反义核酸， 与 MIR2911完全互补。
组 3: 服用与水提液等体积纯水。
组 4: 服用金银花水提液 (实施例 6制备) 1000mL。
组 5： 服用金银花水提液 1 OOOmL + anti-MIR2911 (用量与 MIR2911的用量相当)； 其中 anti-MIR2911是 MIR2911的反义核酸， 与 MIR2911完全互 卜。
组 6: 服用与水提液等体积纯水。
服用 6天后， 采用 Real-time PC 检测人血液中感冒病毒 ADV或 H1N1的含量。 具体步骤如实施例 5所述。
结果表明：
1. 以服用水的感冒患者 (组 3，组 6)作为对照，服用金银花水提液后， ADV或 H1N1 在人血液中表达显著降低，表明金银花 microRNA抑制人体感冒病毒 ADV或 H1N1的 表达。
2. 以服用金银花水提液的感冒患者 (组 1， 组 4)作为对照， 感冒患者服用金银花水 提液 +anti-MIR2911后， ADV或 H1N1在人血液中表达增加。 可见 anti-MIR2911破坏 MI 2911对感冒病毒 ADV或 H1N1的抑制作用。结果表明，金银花 microRNA有直接 抗病毒作用。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书 所限定的范围。

Claims

权 利 要 求
1.一种分离的植物功能性 microRNA或含所述植物功能性 microRNA的提取物， 其特征在于， 所述的植物功能性 microRNA是来源于某一植物的内源性 microRNA且 存在于所述植物的水溶性和 /或脂溶性的提取物中， 而且所述植物功能性 microRNA 具有调控非植物靶基因的功能。
2. 如权利要求 1所述的植物功能性 microRNA或含所述植物功能性 microRNA的 提取物， 其特征在于， 所述的非植物靶基因包括细菌基因、 病毒基因、 衣原体基因、 酵母基因、 动物基因。
3. 如权利要求 1所述的植物功能性 microRNA或含所述植物功能性 microRNA的 提取物， 其特征在于， 所述的植物包括： 药用植物、 果蔬植物、 观赏植物。
4. 如权利要求 1所述的植物功能性 microRNA或含所述植物功能性 microRNA的 提取物， 其特征在于， 所述的植物功能性 microRNA 包括选自下组的一种或多种： MIR156h、 MIR166f、 MIR396a、 MIR 166a, MIR 168a, MI 1440, MI 2910, MI 291 MIR2915、 MIR2916、 MIR818d、 MIR159e、 MIR159c、 MIR156j、 MIR 1432, MIR166k、 MIR 167b, MIR396c、 MIR156e、 MIR 169k, MIR 167c, MIR160d、 MIR399a、 MIR156d、 MIR160e、 MIR169n、 MI 166K MIR159f、 MIR 166c, MIR159b、 MIR166j、 MIR167i、 MIR 169c, MIR 164c, MIR167j、 MIR167g、 MIR 160c, MIR399e、 MIR399b、 MIR529b、 MIR164e、 MIR166d、 MIR166h、 MIR 164b, MIR156f、 MIR 164a, MI 169K MIR166m、 MIR164f、 MIR156k、 MIR166g、 MIR 166b, MIR 160b, MIR166e、 MIR159d、 MIR818e、 MIR172a、 MIR156b、 MIR399g、 MIR 169b, MIR399f、 MIR 167a, MIR394、 MIR156a、 MIR166i、 MIR167f、 MIR319a、 MIR156g、 MIR166n、 MIR399c、 MIR160a、 MIR159a.l、 MIR156c、 MIR319b、 MIR169o、 MIR167h、 MIR156i、 MIR167d、 MIR169a、 MIR172d、 MIR818b、 MIR164d、 MIR167e、 MIR396b、 MIR2914。
5. 如权利要求 1所述的植物功能性 microRNA或含所述植物功能性 microRNA的 提取物， 其特征在于， 所述的植物提取物包括植物的水溶性和 /或脂溶性的提取物。
6. 一种权利要求 1 所述的分离的植物功能性 microRNA 或含所述植物功能性 microRNA的提取物的用途， 其特征在于， （a) 用于制备调控非植物靶基因的组合物； 或 (b) 用于制备治疗非植物靶基因相关疾病的药物。
7. 一种组合物， 其特征在于， 包含 (a) 药学上可接受的载体或食品学上可接受的 载体以及 (b) 权利要求 1 所述的植物功能性 microRNA 和 /或含所述植物功能性 microRNA的植物提取物。
8.一种体外非治疗性调控非植物靶基因表达的方法， 其中， 非植物靶基因包括 细菌基因、 病毒基因、 衣原体基因、 酵母基因、 动物基因， 其特征在于， 包括步骤： 在权利要求 1所述的分离的植物功能性 microRNA或含所述植物功能性 microRNA的 提取物存在下， 培养含所述靶基因的生物材料， 从而调控所述非植物靶基因的表达。
9.一种植物功能性 microRNA的鉴定方法，其中所述植物功能性 microRNA具有 调控非植物靶基因的功能， 其特征在于， 包括步骤：
(1) 提供某一植物的提取物；
(2) 检测所述提取物中植物内源性 microRNA的种类或水平；
(3) 将被检测到的植物 microRNA的序列与非植物靶基因进行比对和分析， 从而 鉴定出具有调控非植物靶基因的功能的植物功能性 microRNA。
10. 一种由权利要求 9所述的方法所鉴定出的植物功能性 microRNA分子。
11. 如权利要求 10 所述的植物功能性 microRNA 分子， 其特征在于， 所述 microRNA分子包括 MIR2911。
12. 一种制备组合物的方法， 其特征在于， 包括步骤：
人工合成权利要求 10所述的植物功能性 microRNA分子； 以及
将所述的植物功能性 microRNA分子与药学上或食品学上可接受的载体混合，从 而形成组合物。
13.—种 microRNA分子 MIR2911或含 MIR2911的提取物的用途， 其特征在于， 用于制备治疗病毒性感冒的药物。
14. 如权利要求 13所述的用途， 其特征在于， 所述的提取物 (未浓缩或浓缩)中含 0·01-100ηΜ (较佳地 0·1-20ηΜ)的 MIR2911。
15.一种预防或治疗疾病的方法， 其中所述疾病是与非植物靶基因相关的疾病， 其特征在于， 包括步骤： 给需要的对象施用权利要求 1 所述分离的植物功能性 microRNA或含所述植物功能性 microRNA的提取物、 或权利要求 7所述的组合物， 从而预防或治疗所述的疾病，其中所述的植物功能性 microRNA具有调控非植物靶基 因的功能。
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