CN111926009B - 阻断或减弱水稻OsMIR394基因表达以改良水稻籽粒性状的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及阻断或减弱水稻OsMIR394基因表达以改良水稻籽粒性状的方法。本发明要解决的技术问题是，改良水稻籽粒性状。为了解决该技术问题，提供的技术方案是通过阻断或者减弱水稻中OsMIR394的表达，提高水稻籽粒性状的方法。本发明方法能得到籽粒千粒重、粒长或粒宽增加的水稻突变体，表明其籽粒性状得到了很大的改良，在水稻的品质改良以及基因组功能研究和应用方面具有很好的前景。

Description

阻断或减弱水稻OsMIR394基因表达以改良水稻籽粒性状的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及阻断或减弱水稻OsMIR394基因表达以改良水稻籽粒性状的方法。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是真核生物中一类非编码内源小分子RNA长度约为20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子(大多为21个核苷酸)。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中，经RNA聚合酶II转录为长约300-1000个碱基的初级miRNA(primary miRNA，pri-miRNA)，接着加工为长约70-90个碱基含茎环结构的前体miRNA(pre-miRNA)，然后再经过Dicer酶酶切，成为长约20-24个碱基的成熟miRNA。成熟的miRNA随后组装进RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，通过碱基互补配对的方式识别并集合靶基因mRNA，根据互补程度的不同指导RISC降解靶mRNA(完全互补)或者阻遏靶mRNA翻译(不完全互补)，从而参与真核生物的转录后基因表达调控。然而，随着越来越多的植物miRNA被鉴定和获得，绝大部分miRNA的生物学功能还不清楚。

水稻OsmiR394基因位于基因组的第三号染色体上，其前体(stem-loop)DNA长110个核苷酸。有研究表明MicroRNA394(miR394)通过对其靶基因LEAF CURLINGRESPONSIVENESS(LCR)进行剪切，调控植物的盐胁迫及叶片夹角大小。但是目前对miR394的其它生物学功能还知之甚少。

以前，研究miRNA功能主要通过靶基因类似物(Target Mimicry，TM)或短串联靶标类似物(Short Tandem Target Mimic，STTM)来干扰(封闭)miRNA，从而能反映目标基因去阻遏的影响。但该模式对很多miRNA的干扰效率较低，甚至完全无活性的情况。近来，也有用CRISPR-Cas9来创制miRNA突变体的报道，但利用CRISPR-Cas9创制的突变体的缺失/插入片段大多集中在1～2bp的范围内，往往不会导致miRNA功能的完全丧失。

CRISPR-Cas12a(CRISPR-Cpf1)系统是近年来发现的新的基因编辑系统。其与CRISPR-Cas9不同，因其具备“T/A”富集区的PAM识别位点、向导RNA为结构简单的单一crRNA分子、产生粘性末端、删除片断比较大(大多为6～13bp)等特性，对于定向敲除miRNA有其特有的优势。目前尚无运用该技术敲除水稻miRNA的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，改良水稻籽粒性状。为了解决该技术问题，提供的技术方案是一种改良水稻籽粒性状的方法。该方法是通过阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达，提高水稻籽粒性状。

其中，上述方法中所述的阻断或者减弱水稻中OsMIR394的表达通过敲除水稻OsMIR394基因或者干扰OsMIR394基因表达产物的作用进行。进一步的，上述方法中所述敲除水稻基因组中的OsMIR394基因的方法为基因组编辑法、同源重组法或随机插入突变法中的至少一种进行。更进一步的，所述的基因组编辑法包括巨大核酸酶(Meganuclease)法、ZFN法、TALEN法或CRISPR-Cas法中的至少一种。

其中，上述方法中使用CRISPR-Cas法敲除水稻基因组中的OsMIR394基因时，包括以下步骤：

a、设计针对水稻OsMIR394基因的向导RNA；

b、构建可表达该向导RNA的Cas编辑表达载体；

c、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas基因编辑体系得到转化植株；

d、收集转化植株的种子，筛选出水稻OsMIR394基因定向编辑突变体种子，即得提高籽粒性状的水稻突变体。

优选的，上述方法中所述的CRISPR-Cas法包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a或CRISPR-Cas12b中的至少一种。

其中，上述方法中步骤a中所述的针对水稻OsMIR394基因的向导RNA的核苷酸序列为Seq ID No.1所示。

其中，上述方法中所述的提高水稻籽粒性状为提高千粒重、粒长或粒宽中的至少一种。

同时，本发明还提供了阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达的试剂在提高水稻籽粒性状中的用途。

其中，上述用途中所述阻断或者减弱水稻中OsMIR394的表达的试剂包括敲除水稻OsmiR394基因的试剂。进一步的，所述的敲除水稻基因组中的OsmiR394基因的试剂包括针对OsmiR394基因的用于巨大核酸酶法的巨大核酸酶、用于ZFN法的ZFN蛋白、用于TALEN法的TALEN蛋白、用于CRISPR-Cas法编辑OsmiR394编码基因的向导RNA、用于同源重组法的重组DNA片段、用于随机插入突变法的T-DNA或转座子中的至少一种。

其中，上述用途中所述用于CRISPR-Cas12a的crRNA的核苷酸序列为Seq ID No.1所示。

本发明还提供了一种针对水稻OsmiR394基因的crRNA，核苷酸序列为Seq ID No.1所示。

相应的，本发明还提供了装载有上述crRNA的载体。优选的，所述载体含有核苷酸序列为SEQ ID No.2所述的主要表达单元。

优选的，上述表达载体的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明的有益效果在于：本发明针对水稻OsMIR394基因设计并筛选得到一条特定的crRNA，并以之为基础构建了用于特定敲除水稻OsMIR394基因的CRISPR-Cas12a基因编辑载体。实验表明，使用本发明方法得到的植株能够有效敲除水稻OsMIR394基因，并得到种子变大及增加千粒重的突变体，这在水稻的基因组功能研究以及miRNAs的研究和应用方面具有很好的前景。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种改良水稻籽粒性状的方法，该方法通过阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达从而来提高水稻籽粒性状。本发明方法中，敲除水稻OsMIR394基因，或者影响OsMIR394基因表达产物的作用，是阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达的两种主要方式。在本发明的实施例中，敲除水稻OsmiR394编码基因后得到了籽粒千粒重、粒长或粒宽增加的水稻突变体，表明其籽粒性状得到了很大的改良，而其他农艺性状没有明显改变。本发明方法步骤简明、易于操作，在水稻的品质改良以及基因组功能研究和应用方面具有很好的前景。

附图说明

图1.OsmiR394结构及CRISPR-Cas12a miRNA突变载体示意图

A、OsmiR394结构示意图，下划线为成熟miRNA。

B、定向敲除OsmiR394载体构建示意图，加粗为PAM位点，斜体为crRNA。

图2.Cas12a-OsmiR394部分T0突变体植株鉴定

A、转基因阳性PCR检测结果。

B、T0代部分植株PCR-SSCP鉴定突变体结果，粗体下划线为突变体。

C、部分T0代突变体植株测序结果，粗体为PAM位点，斜体为crRNA，下划线为成熟miRNA。

图3.OsmiR394突变系T3代基因型及种子表型

A、OsmiR394突变系T3代基因型，粗体为PAM位点，斜体为crRNA，下划线为成熟miRNA。

B、野生型与OsmiR394突变系T3代种子粒长和粒宽检测，Bar＝10mm。。

图4.OsmiR394突变系T3代种子千粒重、粒长、粒宽及长宽比变化

A、野生型与OsmiR394突变系T3代种子千粒重比较，n＝3。

B、野生型与OsmiR394突变系T3代种子粒长比较，n＝10。

C、野生型与OsmiR394突变系T3代种子粒宽比较，n＝10。

D、野生型与OsmiR394突变系T3代种子长宽比比较，n＝10。

**:极显著差异(p<0.01)，*显著差异(0.01<p<0.05)。

具体实施方式

目前，在植物miRNA公共数据库miRBase(http://www.mirbase.org/index.shtml)中大部分收录的植物miRNA分子是基于小RNA高通量测序获得的，没有具体生物功能实验结果。

水稻OsMIR394基因(编码水稻miRNA394的基因)位于基因组的第三号染色体上，其前体(stem-loop)DNA序列如SEQ ID No.3,其结构示意图为图1A。在本发明前期针对编码水稻未知生物学功能miRNA的基因进行定向编辑突变体创制的大量工作基础上，通过基因组编辑技术，在水稻中敲除了编码miRNA394的基因OsMIR394，结果出人意料地发现，得到了籽粒农艺性状明显改良的植株，这些改良性状具体体现在了籽粒千粒重的增加、粒长增长、粒宽增加等方面，同时并没有观察到其他农艺性状的明显改变，说明能提升水稻产量。

基于上述的实验，说明了水稻的OsMIR394基因与水稻籽粒的农艺性状有密切的相关性，而阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达，能够有效地改良籽粒的农艺性状。

由此，本发明建立并公开了一种新的改良水稻籽粒性状的方法。该方法是通过阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达，以改良籽粒的农艺性状。

目前已经知晓，miRNA的基因在表达过程中会首先得到初级转录物(pri-miRNA)，随后会被加工成miRNA前体(pre-miRNA)，随后pre-miRNA被进一步加工形成成熟miRNA。成熟miRNA分子再发挥其生物学功能。显然，对于OsMIR394基因表达的整个过程中的任何一步施加影响，都可能降低OsMIR394基因表达产物的作用，改良水稻籽粒的农艺性状。而敲除水稻OsMIR394基因，或者干扰OsMIR394基因表达产物的作用，是本领域可用于阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达的两种主要方式。

本发明则主要是从影响OsMIR394基因的转录入手。目前最常用的方法就是从基因组中敲除掉OsMIR394基因，可以采用的技术手段有基因组编辑法、同源重组法或随机插入突变法等。

使用同源重组法时，可以设计特定的重组DNA片段，通过同源重组替换到基因组中，从而使水稻不表达OsMIR394基因。而随机插入突变法可以使用T-DNA(Transfer DNA，转移DNA)插入突变法或转座子插入突变法等方法，也可以达到类似的效果。

而近年来，本领域关注较多的是基因组编辑技术。而目前常用的用于基因敲除的基因组编辑技术有基因组巨大核酸酶(Meganuclease)法、ZFN(锌指核酸酶)法、TALEN(Transcription activator-like effectors Nucleases)法以及CRISPR-Cas法。这些方法都可以用于敲除OsMIR394基因的水稻定向编辑突变体的创制，得到籽粒性状提高的突变植株。

与此同时，本发明也提供了阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达的试剂在提高水稻籽粒性状中的用途。

这些试剂一方面包括干扰OsMIR394基因表达产物并使其难以正常发挥功能的各类分子，包括且不限于针对OsMIR394基因表达产物设计的RNAi分子、反义RNA分子、靶基因类似物(target mimicry，TM)分子、短串联靶标类似物(short tandem target mimic，STTM)分子，用于CRISPR-Cas13法的向导RNA分子。

另一方面则包括可以用于敲除水稻基因组中的OsMIR394基因的试剂。这些试剂包括且不限于针对OsMIR394基因的用于巨大核酸酶(Meganuclease)法的巨大核酸酶，用于ZFN法的ZFN蛋白、用于TALEN法的TALEN蛋白，用于CRISPR-Cas法的向导RNA分子、用于同源重组法的重组DNA片段、或用于随机插入突变法的T-DNA(Transfer DNA，转移DNA)分子或转座子分子。

而用于敲除编码基因的CRISPR-Cas法，目前有CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a、CRISPR-Cas12b等多种具体的技术体系，本领域技术人员在实施本发明时，能够容易地根据各项具体技术的要求进行对OsMIR394基因有针对性的编辑工作。

在本发明的一个实施例中，使用一种特别设计的针对水稻OsMIR394基因的向导RNA。其核苷酸序列为UGUCUCUGAGGAUUCGACAAGGA(SEQ ID No.1)，该向导RNA用于CRISPR-Cas12a基因编辑系统对水稻OsMIR394基因进行了基因编辑。当然，本领域技术人员知晓，在CRISPR-Cas12a基因编辑系统中，crRNA分子的具体作用是作为向导RNA。

在此基础上本发明也开发得到了能表达上述的crRNA的表达载体。并优选得到了含有核苷酸序列为SEQ ID No.2所述的主要表达单元的表达载体作为CRISPR-Cas12a基因编辑。当然，此类Cas12a定向编辑表达载体的骨架载体有很多已报道的可以选择。而对于此条crRNA来说，可选择pTX377、pYPQ230(Tang X,Lowder LG,Zhang T,Malzahn A,Zheng X,Voytas DF,Zhong Z,Chen Y,Ren Q,Li Q,Kirkland ER,Zhang Y,Qi Y.2017.A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression inplants.Nature Plants,3:17018；Tang X,Ren Q,Yang L,Bao Y,Zhong Z,He Y,Liu S,QiC,Liu B,Wang Y,Sretenovic S,Zhang Y,Zheng X,Zhang T,Qi Y,Zhang Y.2019.Singletranscript unit CRISPR 2.0systems for robust Cas9 and Cas12a mediated plantgenome editing.Plant Biotechnology Journal,17(7):1431-1445)等识别5’-TTTV-3’序列PAM的植物Cas12a定向编辑表达载体。在本发明的一个实施例中，使用了pTX377载体作为骨架载体，取得了好的效果，得到了籽粒性状显著改良的水稻OsMIR394基因定向编辑突变体材料。

具体而言，本发明中使用上述的Cas12a定向编辑向导crRNA(OsmiR394_crRNA1)制备敲除水稻OsMIR394基因定向编辑突变体材料，以提高改良籽粒性状的方法包括以下主要步骤：

a、制备序列如Seq ID No.1的向导RNA的Cas12a基因编辑表达载体；

b、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas12a基因编辑体系得到转化植株；

c、收集转化植株的种子，筛选出水稻OsMIR394基因定向编辑突变体种子，即得水稻籽粒性状显著改善的水稻OsMIR394基因定向编辑突变体。

其中，上述方法步骤b中所述的转化水稻使用农杆菌介导转化法。

更进一步的，本发明方法可按以下更为具体的步骤进行：

(1)crRNA靶位点的选择

因水稻OsMIR394基因位于基因组的第三号染色体上，其前体(stem-loop)DNA序列如SEQ ID No.3,其结构示意图为图1A。该crRNA序列如SEQ ID No.1所示，长度为23bp，其将靶位点位于SEQ ID No.3所示的OsmiR394前体序列中的31-53。PAM位点为TTTC。根据crRNA序列设计合成两条退火形成粘性末端的单链核苷酸序列OsmiR394-crRNA1-F，序列如SEQID No.4和OsmiR394-crRNA1-R，序列如SEQ ID No.5所示。

(2)敲除载体的构建

将OsmiR394-crRNA1-F和OsmiR394-crRNA1-R分别稀释10倍，各取10μL混合一起在PCR仪中98℃变性5min，取出后自然冷却退火，退火产物稀释20倍后与经BsaI进行酶切的骨架载体pTX377连接。经转化大肠杆菌，单菌落PCR和测序鉴定，获得了针对水稻OsMIR394基因的定向敲除载体pMIR394-1，其序列如SEQ ID No.2所示。其结构示意图为图1B.具体构建方法见参考文献(Tang X,Lowder LG,Zhang T,Malzahn A,Zheng X,Voytas DF,Zhong Z,Chen Y,Ren Q,Li Q,Kirkland ER,Zhang Y,Qi Y.2017.A CRISPR-Cpf1 system forefficient genome editing and transcriptional repression in plants.NaturePlants,3:17018；Tang X,Ren Q,Yang L,Bao Y,Zhong Z,He Y,Liu S,Qi C,Liu B,WangY,Sretenovic S,Zhang Y,Zheng X,Zhang T,Qi Y,Zhang Y.2019.Single transcriptunit CRISPR 2.0systems for robust Cas9 and Cas12a mediated plant genomeediting.Plant Biotechnology Journal,17(7):1431-1445)。

(3)转化和分子鉴定

水稻OsmiR394基因定向敲除载体pMIR394-1经农杆菌介导的水稻遗传转化、筛选、再生获得转化植株，提取单株DNA进行阳性鉴定后。

用设计的特异引物OsmiR394-SSCP-F(序列如SEQ ID No.6所示)和OsmiR394-SSCP-R(序列如SEQ ID No.7所示)进行PCR扩增，经PCR-SSCP和PCR产物测序验证，获得OsmiR394定向敲除突变体。对突变体进行移栽，收获T1代种子，后对T1代材料种植、鉴定，得到不含载体的纯合突变体，收获T2代种子，然后种植T2代种子获得T3代种子。

水稻遗传转化及分子鉴定具体过程也可参考文献(Tang X,Lowder LG,Zhang T,Malzahn A,Zheng X,Voytas DF,Zhong Z,Chen Y,Ren Q,Li Q,Kirkland ER,Zhang Y,QiY.2017.A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptionalrepression in plants.Nature Plants,3:17018)中公开的实验方法。

以下通过实施例对本发明进行更进一步的详细说明。

实施例1水稻OsmiR394敲除载体CRISPR-Cas12a的构建

(1)crRNA设计

根据CRISPR-Cas12a对靶位点的识别和剪切规则设计crRNA。根据水稻OsmiR394前体的基因组序列(SEQ ID No.3)，设计单链核苷酸序列OsmiR394-crRNA1-F(序列如SEQ IDNo.4)和OsmiR394-crRNA1-R(序列如SEQ ID No.5所示)。前体序列SEQ ID No.3中的14-33为成熟miR394序列，31-53为crRNA所在位置。

(2)单链核苷酸序列退火

将靶位点的单链核苷酸序列OsmiR394-crRNA1-F和OsmiR394-crRNA1-R单链核苷酸序列分别稀释10倍，各取10μL，98℃，变性5min，自然退火，退火产物稀释20倍。

(3)酶切、胶回收、连接

实验所使用的骨架载体为pTX377。pTX377用BsaI进行酶切，酶切体系的建立和酶切条件参考Thermo Scientific公司限制性内切酶说明书进行。具体的酶切体系如下：10×Fast digest buffer5μL，质粒DNA或PCR产物10μL(1～1.5μg)，限制性内切酶1μL，ddH2O补足至50μL。

于37℃恒温培养箱中静置，BsaI酶切2h，反应结束后加入10μL 6×LoadingBufer，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，切胶回收骨架载体大片段。具体胶回收方案，参照AxyPrepTM DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)内提供方法进行回收。

T4连接酶将酶切回收产物分别与靶位点的退火产物连接，连接方法参考T4 DNA连接酶说明书(New England Biolabs公司)，加入的目的基因片段与载体回收片段之间的摩尔比为3：1至10：1，22℃连接3h，具体的连接体系如下：10×T4 DNA连接酶反应缓冲液2μL，T4 DNA连接酶1μL，pTX377酶切产物70-100ng，退火产物2μL，ddH2O补足25μL。

(4)大肠杆菌转化

采用传统热激法来转化大肠杆菌，取6μL连接回收产物转入100μL DH5α大肠杆菌感受态中，混匀，冰上放置20min，42℃水浴热激1min，加入300μL LB培养液，于37℃振荡培养箱振荡培养2h，之后12000rpm离心1min，移去250μL上清，移液枪吹打，重悬菌体，重悬后的菌液全部涂布于含有相应抗生素(本实验中为50mg/L Kan)的LB平板(LB配方见表2-4)上，于37℃恒温培养箱倒置培养24h，牙签挑取单克隆，溶于无菌水，进行菌落PCR验证。

(5)菌落PCR

无菌牙签挑取平板上转化生长的单克隆，溶于50μL ddH2O中，取5μL菌液作为模板进行菌落PCR扩增检大肠杆菌转化的阳性。采用25uL体系，体系如下：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 0.5μL，OsmiR394-crRNA1-F 0.5μL，ZY010-R1(5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’)0.5μL，Taq DNA enzyme 0.2μL，Template 1μL，ddH₂O 19.8μL。PCR程序为：95℃，3min→(95℃，30s→57℃，30s→72℃，60s)×37cycles→72℃，5min→10℃，5min(Taq DNA enzyme，dNTP等购自天根生物公司)。PCR结束后，加入5μL 6×溴酚蓝，通过琼脂糖凝胶电泳检测，1％琼脂糖凝胶电泳检测，130V，25min。

(6)质粒提取即测序验证

取20μL菌落PCR验证正确的单克隆菌液于的5mL LB培养液(含50mg/LKan)中，震荡培养16h，按照AXYGEN AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit说明书进行质粒提取。提取的质粒样品，测其浓度，送至擎科生物科技有限公司(成都)进行测序。并将质粒命名为pMIR394-1，其序列如SEQ ID No.2所示，其中14467-16487为crRNA表达单元DNA序列，其中14467-15997为水稻泛素启动子pOsUbi1，15998-16170为crRNA scaffold单元，16171-16487为终止子NOS-T。8416-14458Cas12a蛋白的表达单元的核苷酸序列，其中12463-14459为玉米泛素启动子pZmUbi1，8672-12462为带NLS序列的Cas12a，8416-8671为终止子HSP-T。73-2014潮霉素抗性基因表达单元，其中73-750为35S启动子；751-1839为潮霉素抗性基因；1840-12014为35S终止子。

实施例2水稻遗传转化

将构建好的敲除载体pMIR394-1转入农杆菌EHA105中，农杆菌的转化采用热激法，方法如下：感受态置于冰上融化；加入0.5μg-1μg质粒DNA于感受态中，混匀，冰上放置20min；液氮速冻4min后，37℃恒温水浴4min，再置于冰上放置2min；加入900μL LB液体，28℃振荡培养2-4h；12000rpm离心1min收集菌体，移除900μL上清，剩余上清重悬菌体，涂布于含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB平板上；28℃恒温培养箱中倒置培养36-48h。将转化后生长的克隆进行菌落PCR阳性检测，方法同前“菌落PCR”所述

农杆菌介导转化水稻参考文献(Toki等，Early infection of scutellum tissuewith Agrobacterium allows high-speed transformation of rice.The PlantJournal,2006,47(6):969-976.)中公开的方法。其步骤中主要包括诱导愈伤、农杆菌侵染、抗性愈伤筛选、再生苗培养、再生苗生根培养。

遗传转化步骤具体如下：将水稻(日本晴)成熟种子去壳消毒；将消毒过的种子接种于含0.4％结冷胶的N-6-D固体培养基上面，32℃连续光照培养1～5天；培养的种子通过农杆菌介导的转化方法将质粒pMIR394-1转入水稻当中，转化过的水稻种子在诱导选择培养基中连续32℃光照培养2周；增殖产生的愈伤组织转入RE-III培养基中；从愈伤组织产生的幼小植株转移到HF培养基中诱导根的产生。将获得的抗性再生苗长移栽至营养土中，温室培养。

实施例3水稻OsmiR394突变体的分子鉴定

(1)水稻苗基因组DNA提取

采用CTAB法提取水稻基因组DNA，具体操作步骤如下：

取材于2mL EP管中，加3颗钢珠液氮速冻，摇晃粉碎水稻材料；加600μL预热CTAB提取缓冲液，配方如表2-5所示，65℃水浴半小时，十分钟颠倒一次；加入600μL三氯甲烷混匀，4℃，10000rpm离心10min；取上清移至1.5mL EP管中，加入500ul异丙醇混匀，-20℃沉淀30min；12000rpm室温离心10min，去上清，75％乙醇漂洗，10000rpm离心2min；去上清，自然风干，加入30～50μL ddH₂O溶解DNA，-20℃冰箱中保存备用。

(2)水稻苗转基因阳性检测

运用Intron-F1(5’-ttctgatcctctccgttcct-3’)和ZY010-R1进行PCR扩增，扩增片段大小为1068bp，结果如图2A。PCR扩增体系及反应程序同前菌落PCR。

(3)运用PCR-SSCP对突变体检测

将检测所得到的阳性植株用引物OsmiR394-SSCP-F(序列如SEQ ID No.6所示)和OsmiR394-SSCP-R(序列如SEQ ID No.7所示)进行PCR扩增，扩增片段长度为290bp。然后利用单链构象多态性(Single-strand conformation polymorphism，SSCP)检测突变位点的突变类型，方法参见文献(Zheng等,Effective screen of CRISPR/Cas9-induced mutantsin rice by single-strand conformation polymorphism.Plant Cell Rep,2016,(7):1545-54.)。

具体步骤为：PCR产物在95℃变性5分钟，然后立即放入冰盒中进行自退火。在15％非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺-双丙烯酰胺；29:1,w/w)中进行恒流电泳，45mA，电泳4h。电泳后用银染法染色。步骤如下：凝胶染色10分钟用0.1％硝酸银溶液(0.1g硝酸银和200μl37％甲醛，定容至100ml)；用2.5％氢氧化钠溶液显色10分钟(2.5g氢氧化钠,400μl 37％甲醛和1ml 4％碳酸钠)；然后用水冲洗终止显色，将胶平铺于灯箱上面，观察，照像。

SSCP结果(图2B)显示：单株OsmiR394-1-2，OsmiR394-1-3，OsmiR394-2-2，OsmiR394-2-3，OsmiR394-3-1，OsmiR394-4-1，OsmiR394-6-1的条带与野生型(WT)不一致，初步表明其为突变体。表明CRISPR-Cas12系统能对OsmiR394进行定向编辑，从而获得突变体。

(4)敲除突变体测序验证

将SSCP筛选获得的与野生型有差异的单株OsmiR394-1-2，OsmiR394-2-2，OsmiR394-2-3和OsmiR394-6-1，用引物OsmiR394-SSCP-F和OsmiR394-SSCP-R(引物序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示)进行PCR扩增，PCR扩增体系及反应程序同前。送交成都擎科生物公司测序。测序结果(图2C)显示，单株OsmiR394-1-2，OsmiR394-2-2，OsmiR394-2-3和OsmiR394-6-1均为杂合突变体。

(5)敲除突变体农艺性状检测

进一步对OsmiR394-1-2、OsmiR394-2-2和OsmiR394-6-1的T2代植株进行筛选，获得纯合突变体，分别命名OsmiR394-L1、OsmiR394-L2和OsmiR394-L3(图3A)，对其T3代种子观察发现种子长度和宽度比对照有明显增加(图3B)，进一步对其分析发现千粒重、粒长和长宽比有极显著增加，粒宽有显著增加(图4)。

实验结果表明，通过基于本发明发现的向导crRNA构建的水稻OsMIR394基因定向编辑表达载体及对应实验方法，可以有效获得不含转基因成分的OsMIR394基因定向编辑突变体水稻材料，实现籽粒千粒重、粒长及粒宽增加，进而提升水稻产量。

序列表

<110> 成都极谷基因科技有限公司

<120> 阻断或减弱水稻OsMIR394基因表达以改良水稻籽粒性状的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ugucucugag gauucgacaa gga 23

<210> 2

<211> 16495

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catggtggag cacgacactc tcgtctactc caagaatatc aaagatacag tctcagaaga 60

ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca 120

ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa 180

atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc 240

caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc 300

ttcaaagcaa gtggattgat gtgataacat ggtggagcac gacactctcg tctactccaa 360

gaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggctatt gagacttttc aacaaagggt 420

aatatcggga aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcaaaaggac 480

agtagaaaag gaaggtggca cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggctatcgt 540

tcaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt 600

ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac 660

tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gaccttcctc tatataagga 720

agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct 780

ctcctaggat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa 840

agttcgacag cgtgtccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca 900

gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct 960

acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc 1020

ttgacattgg ggaattcagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg 1080

tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctgcagccg gtcgcggagg 1140

ccatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac 1200

cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc 1260

atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc 1320

tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg 1380

atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga 1440

gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt 1500

ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag 1560

gatcgccgcg gctccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct 1620

tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc 1680

gatccggagc cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga 1740

ccgatggctg tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccgg 1800

gatcttggag gtgattaatt aacgatcgac aagctctatt ttctccataa taatgtgtga 1860

gtagttccca gataagggaa ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat 1920

aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt 1980

cctaaaacca aaatccagta ctaaaatcca gatcccccga attaattcgg cgttaattca 2040

gtacattaaa aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc 2100

acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc 2160

accactcgat acaggcagcc catcagtccg ggacggcgtc agcgggagag ccgttgtaag 2220

gcggcagact ttgctcatgt taccgatgct attcggaaga acggcaacta agctgccggg 2280

tttgaaacac ggatgatctc gcggagggta gcatgttgat tgtaacgatg acagagcgtt 2340

gctgcctgtg atcaccgcgg tttcaaaatc ggctccgtcg atactatgtt atacgccaac 2400

tttgaaaaca actttgaaaa agctgttttc tggtatttaa ggttttagaa tgcaaggaac 2460

agtgaattgg agttcgtctt gttataatta gcttcttggg gtatctttaa atactgtaga 2520

aaagaggaag gaaataataa atggctaaaa tgagaatatc accggaattg aaaaaactga 2580

tcgaaaaata ccgctgcgta aaagatacgg aaggaatgtc tcctgctaag gtatataagc 2640

tggtgggaga aaatgaaaac ctatatttaa aaatgacgga cagccggtat aaagggacca 2700

cctatgatgt ggaacgggaa aaggacatga tgctatggct ggaaggaaag ctgcctgttc 2760

caaaggtcct gcactttgaa cggcatgatg gctggagcaa tctgctcatg agtgaggccg 2820

atggcgtcct ttgctcggaa gagtatgaag atgaacaaag ccctgaaaag attatcgagc 2880

tgtatgcgga gtgcatcagg ctctttcact ccatcgacat atcggattgt ccctatacga 2940

atagcttaga cagccgctta gccgaattgg attacttact gaataacgat ctggccgatg 3000

tggattgcga aaactgggaa gaagacactc catttaaaga tccgcgcgag ctgtatgatt 3060

ttttaaagac ggaaaagccc gaagaggaac ttgtcttttc ccacggcgac ctgggagaca 3120

gcaacatctt tgtgaaagat ggcaaagtaa gtggctttat tgatcttggg agaagcggca 3180

gggcggacaa gtggtatgac attgccttct gcgtccggtc gatcagggag gatatcgggg 3240

aagaacagta tgtcgagcta ttttttgact tactggggat caagcctgat tgggagaaaa 3300

taaaatatta tattttactg gatgaattgt tttagtacct agaatgcatg accaaaatcc 3360

cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 3420

cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 3480

cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 3540

tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 3600

tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 3660

ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 3720

aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 3780

cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 3840

ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 3900

agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 3960

ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 4020

acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 4080

cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 4140

gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga 4200

tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca 4260

gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga 4320

ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg 4380

tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtt tccgggagct gcatgtgtca 4440

gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagggt gccttgatgt gggcgccggc 4500

ggtcgagtgg cgacggcgcg gcttgtccgc gccctggtag attgcctggc cgtaggccag 4560

ccatttttga gcggccagcg gccgcgatag gccgacgcga agcggcgggg cgtagggagc 4620

gcagcgaccg aagggtaggc gctttttgca gctcttcggc tgtgcgctgg ccagacagtt 4680

atgcacaggc caggcgggtt ttaagagttt taataagttt taaagagttt taggcggaaa 4740

aatcgccttt tttctctttt atatcagtca cttacatgtg tgaccggttc ccaatgtacg 4800

gctttgggtt cccaatgtac gggttccggt tcccaatgta cggctttggg ttcccaatgt 4860

acgtgctatc cacaggaaag aggccttttc gacctttttc ccctgctagg gcaatttgcc 4920

ctagcatctg ctccgtacat taggaaccgg cggatgcttc gccctcgatc aggttgcggt 4980

agcgcatgac taggatcggg ccagcctgcc ccgcctcctc cttcaaatcg tactccggca 5040

ggtcatttga cccgatcagc ttgcgcacgg tgaaacagaa cttcttgaac tctccggcgc 5100

tgccactgcg ttcgtagatc gtcttgaaca accatctggc ttctgccttg cctgcggcgc 5160

ggcgtgccag gcggtagaga aaacggccga tgccgggatc gatcaaaaag taatcggggt 5220

gaaccgtcag cacgtccggg ttcttgcctt ctgtgatctc gcggtacatc caatcagcta 5280

gctcgatctc gatgtactcc ggccgcccgg tttcgctctt tacgatcttg tagcggctaa 5340

tcaaggcttc accctcggat accgtcacca ggcggccgtt cttggccttc ttcgtacgct 5400

gcatggcaac gtgcgtggtg tttaaccgaa tgcaggtttc taccaggtcg tctttctgct 5460

ttccgccatc ggctcgccgg cagaacttga gtacgtccgc aacgtgtgga cggaacacgc 5520

ggccgggctt gtctcccttc ccttcccggt atcggttcat ggattcggtt agatgggaaa 5580

ccgccatcag taccaggtcg taatcccaca cactggccat gccggccggc cctgcggaaa 5640

cctctacgtg cccgtctgga agctcgtagc ggatcacctc gccagctcgt cggtcacgct 5700

tcgacagacg gaaaacggcc acgtccatga tgctgcgact atcgcgggtg cccacgtcat 5760

agagcatcgg aacgaaaaaa tctggttgct cgtcgccctt gggcggcttc ctaatcgacg 5820

gcgcaccggc tgccggcggt tgccgggatt ctttgcggat tcgatcagcg gccgcttgcc 5880

acgattcacc ggggcgtgct tctgcctcga tgcgttgccg ctgggcggcc tgcgcggcct 5940

tcaacttctc caccaggtca tcacccagcg ccgcgccgat ttgtaccggg ccggatggtt 6000

tgcgaccgtc acgccgattc ctcgggcttg ggggttccag tgccattgca gggccggcag 6060

acaacccagc cgcttacgcc tggccaaccg cccgttcctc cacacatggg gcattccacg 6120

gcgtcggtgc ctggttgttc ttgattttcc atgccgcctc ctttagccgc taaaattcat 6180

ctactcattt attcatttgc tcatttactc tggtagctgc gcgatgtatt cagatagcag 6240

ctcggtaatg gtcttgcctt ggcgtaccgc gtacatcttc agcttggtgt gatcctccgc 6300

cggcaactga aagttgaccc gcttcatggc tggcgtgtct gccaggctgg ccaacgttgc 6360

agccttgctg ctgcgtgcgc tcggacggcc ggcacttagc gtgtttgtgc ttttgctcat 6420

tttctcttta cctcattaac tcaaatgagt tttgatttaa tttcagcggc cagcgcctgg 6480

acctcgcggg cagcgtcgcc ctcgggttct gattcaagaa cggttgtgcc ggcggcggca 6540

gtgcctgggt agctcacgcg ctgcgtgata cgggactcaa gaatgggcag ctcgtacccg 6600

gccagcgcct cggcaacctc accgccgatg cgcgtgcctt tgatcgcccg cgacacgaca 6660

aaggccgctt gtagccttcc atccgtgacc tcaatgcgct gcttaaccag ctccaccagg 6720

tcggcggtgg cccatatgtc gtaagggctt ggctgcaccg gaatcagcac gaagtcggct 6780

gccttgatcg cggacacagc caagtccgcc gcctggggcg ctccgtcgat cactacgaag 6840

tcgcgccggc cgatggcctt cacgtcgcgg tcaatcgtcg ggcggtcgat gccgacaacg 6900

gttagcggtt gatcttcccg cacggccgcc caatcgcggg cactgccctg gggatcggaa 6960

tcgactaaca gaacatcggc cccggcgagt tgcagggcgc gggctagatg ggttgcgatg 7020

gtcgtcttgc ctgacccgcc tttctggtta agtacagcga taaccttcat gcgttcccct 7080

tgcgtatttg tttatttact catcgcatca tatacgcagc gaccgcatga cgcaagctgt 7140

tttactcaaa tacacatcac ctttttagac ggcggcgctc ggtttcttca gcggccaagc 7200

tggccggcca ggccgccagc ttggcatcag acaaaccggc caggatttca tgcagccgca 7260

cggttgagcc gtgcgcgggc ggctcgaaca cgtacccggc cgcgatcatc tccgcctcga 7320

tctcttcggt aatgaaaaac ggttcgtcct ggccgtcctg gtgcggtttc atgcttgttc 7380

ctcttggcgt tcattctcgg cggccgccag ggcgtcggcc tcggtcaatg cgtcctcacg 7440

gaaggcaccg cgccgcctgg cctcggtggg cgtcacttcc tcgctgcgct caagtgcgcg 7500

gtacagggtc gagcgatgca cgccaagcag tgcagccgcc tctttcacgg tgcggccttc 7560

ctggtcgatc agctcgcggg cgtgcgcgat ctgtgccggg gtgagggtag ggcgggggcc 7620

aaacttcacg cctcgggcct tggcggcctc gcgcccgctc cgggtgcggt cgatgattag 7680

ggaacgctcg aactcggcaa tgccggcgaa cacggtcaac accatgcggc cggccggcgt 7740

ggtggtgtcg gcccacggct ctgccaggct acgcaggccc gcgccggcct cctggatgcg 7800

ctcggcaatg tccagtaggt cgcgggtgct gcgggccagg cggtctagcc tggtcactgt 7860

cacaacgtcg ccagggcgta ggtggtcaag catcctggcc agctccgggc ggtcgcgcct 7920

ggtgccggtg atcttctcgg aaaacagctt ggtgcagccg gccgcgtgca gttcggcccg 7980

ttggttggtc aagtcctggt cgtcggtgct gacgcgggca tagcccagca ggccagcggc 8040

ggcgctcttg ttcatggcgt aatgtctccg gttctagtcg caagtattct actttatgcg 8100

actaaaacac gcgacaagaa aacgccagga aaagggcagg gcggcagcct gtcgcgtaac 8160

ttaggacttg tgcgacatgt cgttttcaga agacggctgc actgaacgtc agaagccgac 8220

tgcactatag cagcggaggg gttggatcaa agtactttga tcccgagggg aaccctgtgg 8280

ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt taaatatccg 8340

attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac 8400

tgatagtttg agctccttat ctttaatcat attccatagt ccataccata gcacatacag 8460

tagttatatg ctgcagaaga gatccaacaa aacattcaca atggattata gaaacatttg 8520

tttattcatt ataatgtgat cttacattca tttaatatta gaaaaagcca caaattcata 8580

acacaacaag ccaagaaaaa aacacaaact taagcacaca agctttttat ttgacacacc 8640

aaatatttca tcttcatctt catattctag atcacttctt tttcttagcc tgtccggcct 8700

ttttggtggc agcaggacgc ttatgcttta cggatgtctg agcatactcc agccactctt 8760

tgttgctgat agcgattttg accttgtcca atttttcgtc ttcggccttt ttgaactggc 8820

cgatcgccca caggactttc ctggcgatgt tataggcacc gttggcgtct gcattttttg 8880

gcagaatcgc attctcttgc gcttcatagt tcctgctatc gtaaaagatg ccatcagaat 8940

ttttaaccgg ggagatcaag aaatccacgt cggttctgcc tgtaattgaa tttctcatct 9000

ggagcatcag gctcatcaaa gccatgaagg atgagtagaa agccttgtca gattgttcgc 9060

aaagcagtgc tctgatatca ccctgttggt agttaatgcc atacttatta aagagctcct 9120

tgtacgcgct agtcaagcaa acttcctccc aatcaaagac gttattcttc ttagggttgc 9180

gaaaaatcct gattctgttg ccgtacgaat agagtttcca ttttttaatg taatccgcat 9240

cggtccgcga aaagtttttg tagtcgagag caaactcgaa aagatcttcc tctgggacgt 9300

acataatacg atcaaaacta gatatgaact ttttcgaatc ggcaatggac gtgtatttcg 9360

tcttcaacag gttgacaaaa ccagttgacg ggtcgatctt agacgtaagc cacgccggta 9420

tataaaatat gaacccattc tgagtactca tcgatttgaa ggactcgaat ttgtttgtta 9480

tttggtaacc tttgagtgcg ccgccggtgg cacatgggtt cgatttctta tcgaccatgt 9540

agttgagctt atctataagc atcttctcga acttttgata gacctgcttc tccactttaa 9600

cgcggctatt cttaaagccc gagttgaggt cctcaagagc gatcactgcg tcatacttct 9660

caaccagctc gcatatctta tgcacaactt gagagatata acctgctttg agttccttga 9720

tgttctcgat acttgtccaa ttttgccgcg cctcaaatct ctccttctcc ttcttgtcca 9780

gcaacgaatg gtagtcggtc ttgatacgga tgccgttgaa attgttaatt atttcgttaa 9840

gggagtactg ttcgactatg ttccccttcc cgtccaccac cacaatatag aggaggttcc 9900

tctcgccccg atcaatccca atgacgtaag gattgtcgtc atgcttcagg agtacacgca 9960

cctctgtgtt tatcttgaaa atattctttg ggcacttgtt gatcgcaatc gggatgtgga 10020

gctcgtactg atcctcggaa aacctcttat ccttgtacac gtcgtagctc aatgttgtag 10080

tctttttagg attgtccggg ttcttattcg caattggact attcgcaggg tggactacaa 10140

gctcctcctt cttcagggat gcgcgccgca tgaagagttc agcccctcct gacaacctga 10200

tttggccgtg gttattctcg tcgaagagca gcttgaaata cattgtgtgg agattaggtg 10260

tcccgtggct cttatcgcta aagtctttat tataaatctg gaacatgtag agcttaccct 10320

cttccacgag cttgtccact tccttcttgc tggcggactc gaatgacacc ttgtagccct 10380

gctcttccac ctctctataa aatccggcta tatccttgta cttctcggtt tccgaaaagt 10440

tgaagtcata ggcgttagac cactttgggt accggctaat tgagtctttg aagaagtcga 10500

tcagcttgtg acagtcgtta agattgaaca tgtcgccctt cttgaacgta ccgttcttat 10560

aaatcttctg gatgtcctcg cttgggttat agtaggccat ccatttcttg ctgaagaaaa 10620

cctttgggag catcttgttc ggacccggaa gcagcttgta gttgatcttc tcataattgc 10680

cattgacatc gtctttgtca atcttctgga gacacttggc gtacttcttg tccataatcg 10740

ccaagtagta ttttgaacca tacctcagga tcgtagccct gtaatccgtt tccttgtcct 10800

tgtcccagcc gcccatgaac tgggggttct ggaagtagag tttgaacttg tccttgctgt 10860

acggcttttg tgtcacgtaa tttctgattg cgtcgtagat gtggtctacc ttaaggagta 10920

tatcgtacgc gaggacgaag tctccgtaga aggactcatc tctgttagtc tccttcccct 10980

ccccgaaaaa agccttaata tagttctcga aactcttcac gctgtcgagc agatccttca 11040

taatggcaac aacagcgtcg ttcttcttca gggacttctc caaaacgaag tcggcgtcga 11100

acagtttttc acttgatcca tagactttat atatctcatc gaccttttgg atgattatct 11160

ccttcaactt ctcgacgacg ctaagatcgg cgtcagcata ctcctgcaac tgttccaggc 11220

tgaaacttcc gatctttttg aagcttttcc tgcgatcatc ctcgtacttc tccgttacga 11280

cagccttctt cttcaggtga atatcgtcat actccgcgtt ccatttgtct ctgatcacgt 11340

tccattcgcc gaagatatct ttacttatcg ttgatatggc cgggccgttt ttcacaaata 11400

tgccggcgct agagtattcg tcaaaattct taaacaactt ttccagtttt tttatagaag 11460

agaaaatctc cgaattctta ttgagagtat tcctgaacac ctccaggact tcctcatccg 11520

aagtgtagcc ctccccatag aacgagagtg actcgcggtc tgaaagaacc tgtttgtaaa 11580

gaggcttgaa ctttggcagc ttctgtttcg tcttttggtt gtaaaggttg atatactcgt 11640

tcaatccctt aatcttttca ccggactcag tcacgaaccc accgatgatc gcattataca 11700

cgtcgatacc ctcttgagtg agcacgaaat taaaaaactc accttcgaag aagtcctcaa 11760

cgtcataatc ggaattgagg atcttctcct taatctcctg aacttcgtgc ttgtcaaaaa 11820

ttgcgtcaac cttctcaaag atatccatgt tggaaatgta cctagtgaga ttctcattga 11880

tacacctgaa cgcaatagaa gtggactttg cctcctcaga gaacatattt tcccgattat 11940

caaagaagcc tgtgaatgct gttgtgaatc cgttgaacga attgaccagc gcaatctcgt 12000

ccttgtcatc gaggaactct ggcaaaattg tctcaattat atccttcttg aacagacttt 12060

tgtatccttc gttgccttta aaggctttcg cgatctcttt cctcagattg atctccaaat 12120

tttcaagttc cttattctcc ttttctgtcc ttgttttctt tctgaagagg gagatgtagt 12180

tgttcagatt cttcaatttg attgagtgca agacatcatt gataaaagag aggtagtatc 12240

tgtccaacaa cttcttcacc cctttgtagt cttccgcgcg cttttcatct tccaccaaca 12300

gccgcttatt gtctatattc tcttgagtct tgccgactgg aatcgcttta aaccgcagtg 12360

ttttgctcaa cgaataacag ttggtgaatt tctcgagctt tgaagccgca ggcaccccgt 12420

gaataccaac cttccgcttc ttcttaggag ccatcctgca ggctgcagaa gtaacaccaa 12480

acaacagggt gagcatcgac aaaagaaaca gtaccaagca aataaatagc gtatgaaggc 12540

agggctaaaa aaatccacat atagctgctg catatgccat catccaagta tatcaagatc 12600

aaaataatta taaaacatac ttgtttatta taatagatag gtactcaagg ttagagcata 12660

tgaatagatg ctgcatatgc catcatgtat atgcatcagt aaaacccaca tcaacatgta 12720

tacctatcct agatcgatat ttccatccat cttaaactcg taactatgaa gatgtatgac 12780

acacacatac agttccaaaa ttaataaata caccaggtag tttgaaacag tattctactc 12840

cgatcttgaa cgaatgaacg accgcccaac cacaccacat catcacaacc aagcgaacaa 12900

aaagcatctc tgtatatgca tcagtaaaac ccgcatcaac atgtatacct atcctagatc 12960

gatatttcca tccatcatct tcaattcgta actatgaata tgtatggcac acacatacag 13020

atccaaaatt aataaatcca ccaggtagtt tgaaacagaa ttaattctac tccgatcttg 13080

aacgaccgcc caaccagacc acatcatcac aaccaagaca aaaaaaagca tgaaaagatg 13140

acccgacaaa caagtgcacg gcatatattg aaataaagga aaagggcaaa ccaaacccta 13200

tgcaacgaaa caaaaaaaat catgaaatcg atcccgtctg cggaacggct agagccatcc 13260

caggattccc caaagagaaa cactggcaag ttagcaatca gaacgtgtct gacgtacagg 13320

tcgcatccgt gtacgaacgc tagtagcacg gatctaacac aaacacggat ctaacacaaa 13380

catgaacaga agtagaacta ccgggcccta accatggacc ggaacgccga tcttgagaag 13440

gtagagaggg gggggggggg aggacgagcg gcgtaccttg aagcggaggt gccgacgggt 13500

ggatttgggg gagttctggt tgtgtgtgtg tgcgctccga acaacacgag gttggggaaa 13560

gagggtgtgg agggggtgtc tatttattac ggcgggcgag gaagggaaag cgaaggagcg 13620

gtgggaaagg aatcccccgt agctgccggt gccgtgagag gaggaggagg ccgcctgccg 13680

tgccggctca cgtctgccgc tccgccacgc aatttctgga tgccgacagc ggagcaagtc 13740

caacggtgga gcggaactct cgagaggggt ccagaggcag cgacagagat gccgtgccgt 13800

ctgcttcgct tggcccgacg cgacgctgct ggttcgctgg ttggtgtccg ttagactcgt 13860

cgacggcgtt taacaggctg gcattatcta ctcgaaacaa gaaaaatgtt tccttagttt 13920

ttttaatttc ttaaagggta tttgtttaat ttttagtcac tttattttat tctattttat 13980

atctaaatta ttaaataaaa aaactaaaat agagttttag ttttcttaat ttagaggcta 14040

aaatagaata aaatagatgt actaaaaaaa ttagtctata aaaaccatta accctaaacc 14100

ctaaatggat gtactaataa aatggatgaa gtattatata ggtgaagcta tttgcaaaaa 14160

aaaaggagaa cacatgcaca ctaaaaagat aaaactgtag agtcctgttg tcaaaatact 14220

caattgtcct ttagaccatg tctaactgtt catttatatg attctctaaa acactgatat 14280

tattgtagta ctatagatta tattattcgt agagtaaagt ttaaatatat gtataaagat 14340

agataaactg cacttcaaac aagtgtgaca aaaaaaatat gtggtaattt tttataactt 14400

agacatgcaa tgctcattat ctcaagagag gggcacgacc gggtcacgct gcactgcagg 14460

cgcgcccaca tcagtctctg cacaaagtgc atcctgggct gcttcaatta taaagcccca 14520

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gttgtgttgt ggttggattg attctaatat ataccaaatc aatataattc actaccaaaa 14640

tataccatag ccatcacaac tttattaatt ttggtagctt aagatggtat atataataac 14700

caattaacaa ctgattctaa ttttactacg gcccagtatc taccaataca aaacaacgag 14760

tatgttttct tccgtcgtaa tcgtacacag tacaaaaaaa cctggccagc ctttcttggg 14820

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tccgcggcgc cgtctggacc cgcccccttt ccgttccttt ctttccttct cgcgtttgcg 15000

tggtggggac ggactcccca aaccgcctct ccctctcttt atttgtctat attctcactg 15060

ggccccaccc accgcacccc tgggcccact cacgagtccc cccctcccca cctataaata 15120

ccccaccccc tcctcgcctc ttcctccatc aatcgaatcc ccaaaatcgc agagaaaaaa 15180

aaatctcccc tcgaagcgaa gcgtcgaatc gccttctcaa ggtatgcgat tttctgatcc 15240

tctccgttcc tcgcgtttga tttgatttcc cggcctgttc gtgattgtga gatgttgtgg 15300

ttagtctccg ttttgcgatc tgtggtagat ttgaacaggg ttagatgggg ttcgcgtggt 15360

atgctggatc tgtgattatg agcgatgctg ttcgtggtcc aagtattgat tggttcggat 15420

ctagaagtag aactgtgcta gggttgtgat ttgttccgat ctgttcaatc agtaggattt 15480

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tctcgggata gtgctagtag ttattgaatc agtttgccga tggaattcta gtagttcata 15780

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tacaaagtgg ttcgataatt ccttaattcg aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa 16260

taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg 16320

ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg 16380

gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag 16440

cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactact agtcc 16495

<210> 3

<211> 110

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

uacugagagu ucuuuggcau ucuguccacc uccuugucga auccucagag acagaaaucu 60

cauaucuguu gaucuuggag gugggcauac ugccaaugga gcuguguagg 110

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agattgtctc tgaggattcg acaagga 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcctccttg tcgaatcctc agagaca 27

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttacagtgag actgtgggaa ta 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggtttccaa agaactaatc ag 22

Claims (13)

1.改良水稻籽粒性状的方法，其特征在于：阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达，提高水稻籽粒性状，所述籽粒性状为千粒重、粒长或粒宽中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达通过敲除水稻OsMIR394基因或者干扰OsMIR394基因表达产物的作用进行。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述敲除水稻基因组中的OsMIR394基因的方法为基因组编辑法、同源重组法或随机插入突变法中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的基因组编辑法为巨大核酸酶法、ZFN法、TALEN法或CRISPR-Cas法中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：当使用CRISPR-Cas法敲除水稻基因组中的OsMIR394基因时，包括以下步骤：

a、设计针对水稻OsMIR394基因的向导RNA；

b、构建可表达该向导RNA的Cas编辑表达载体；

c、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas基因编辑体系得到转化植株；

d、收集转化植株的种子，筛选出水稻OsMIR394基因定向编辑突变体种子，即得提高籽粒性状的水稻突变体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的CRISPR-Cas法为CRISPR-Cas9法、CRISPR-Cas12a法或CRISPR-Cas12b法中的至少一种。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤a中所述的针对水稻OsMIR394基因的向导RNA的核苷酸序列为Seq ID No.1所示。

8.阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达的试剂在提高水稻籽粒性状中的用途，所述籽粒性状为千粒重、粒长或粒宽中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达的试剂为敲除水稻OsMIR394基因的试剂。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的敲除水稻基因组中的OsMIR394基因的试剂为针对OsMIR394基因的用于巨大核酸酶法的巨大核酸酶、用于ZFN法的ZFN 蛋白、用于TALEN法的TALEN蛋白、用于CRISPR-Cas法编辑OsMIR394基因的向导RNA、用于同源重组法的重组DNA片段、用于随机插入突变法的T-DNA或转座子中的至少一种。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述用于CRISPR-Cas法编辑OsMIR394基因的向导RNA为用于CRISPR-Cas12a法的crRNA，其核苷酸序列为Seq ID No.1所示。

12.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述阻断或者减弱水稻中OsMIR394基因的表达的试剂为装载有核苷酸序列为Seq ID No.1所示的crRNA的载体。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述载体含有核苷酸序列为SEQ IDNo.2所述的主要表达单元。

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