CN109022477A - 一种pnCasPA-BEC质粒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种pnCasPA‑BEC质粒及其应用。所述的pnCasPA‑BEC质粒，其特征在于，含有能够表达APOBEC1‑nCas9的基因片段、假单胞菌中的质粒复制子mSF以及大肠杆菌中的质粒复制子ColE1。本发明能够高效并且快速地将各种假单胞菌株基因组上任意位点的胞嘧啶突变成胸腺嘧啶，实现氨基酸突变和基因失活等。所述技术在研究假单胞菌的生理特性、代谢产物、工业生产应用等方面具有广阔地应用前景。

Description

一种pnCasPA-BEC质粒及其应用

技术领域

本发明涉及一种pnCasPA-BEC质粒及其应用。

背景技术

假单胞菌(Pseudomonas)是一种常见的革兰氏阴性变形杆菌，广泛存在于环境，例如泥土、水、植物和人体中。假单胞菌在生物化学、生态学及工业生产上都具有重要意义，是微生物研究的重点之一。例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是一种重要的人类病原菌，很容易造成囊性纤维化、严重烧伤。艾滋病、癌症等免疫力低下患者的临床感染。恶臭假单胞菌(P.putida)是一种常见的土壤细菌，已经被广泛应用于环境生物修复和高附加值化学物质生产。科学家们在代谢工程方面对恶臭假单胞菌进行了大量的研究，促进了其化学物质的生产能力和对恶劣环境的耐受性，使其具有很高的工业生产价值。而丁香假单胞菌(P.syringae)则是一种植物病原菌，是研究病原菌与植物之间相互关系的模式菌株。

假单胞菌的基础生理学研究和应用研究都需要快速高效的基因组编辑工具。但是假单胞菌中传统的基因组编辑仍然是一项费时费力的工作。CRISPR/Cas9系统是一种最新开发的基因编辑工具，它来源于细菌的免疫防御系统，目前已经被应用于一系列的生物体中，包括哺乳动物细胞、斑马鱼、酿酒酵母、大肠杆菌等。在这个系统中，Cas9核酸酶与引导RNA(sgRNA)结合形成复合物，通过sgRNA上的20个核苷酸与基因组上目标基因位点之间的碱基互补配对作用进行精确定位。在结合后，Cas9核酸酶会切割目标基因位点，在基因组上造成双链断裂。利用同源重组修复机制，CRISPR/Cas9系统能在一步操作中就实现精确的基因组编辑。

最近开发的碱基编辑器基于CRISPR/Cas9系统，能对基因组上的任意碱基进行编辑，为生物技术开创了一条新的基因组编辑道路。碱基编辑器主要是由一个缺陷型的Cas9蛋白(Cas9D10A或者Cas9D10AH840A)和一个结合到Cas9蛋白上的脱氨酶构成。在Cas9/sgRNA复合物的介导下，脱氨酶能够定位到基因组上的任意位点进行碱基编辑。这个系统直接通过脱氨反应催化碱基的转变，不产生DNA双链断裂，不需要同源修复模板。目前开发的胞嘧啶编辑器，将胞啶脱氨酶APOBEC1连接到缺陷型的Cas9D10A蛋白上，能够高效地将胞嘧啶(C)转变成胸腺嘧啶(T)。通过催化CAA、CAG、CGA、TGG转变成TAA、TAG、TGA，能够在目标基因上提前产生终止密码子，从而使基因失去活性。

碱基编辑器技术能够极为快速并且准确地靶向突变基因组上的碱基。伴随着大规模DNA微阵列合成技术的突破性发展，此技术能够在基因组层面或特定基因群实现大规模基因失活，大大提高了功能基因筛选的效率。目前，该技术已经在哺乳动物细胞、植物、大肠杆菌等生物体中实现了高效的碱基编辑，但在假单胞菌中还没有得到应用。因此通过工程化和改造碱基编辑器体系，使其能够适用于假单胞菌中的基因组碱基编辑，将极大简化假单胞菌的遗传学操作，还将提升功能性基因的筛选效率，为研究假单胞菌的基因功能提供了有力的工具，为后续的基因生物学功能研究、药物靶标发现、工业化改造等打下基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种pnCasPA-BEC质粒及其应用，其能够高效并且快速地将各种假单胞菌株基因组上任意位点的胞嘧啶突变成胸腺嘧啶，实现氨基酸突变和基因失活等。

为了达到上述目的，本发明提供了一种pnCasPA-BEC质粒，其特征在于，含有能够表达APOBECl-nCas9的基因片段以及假单胞菌中的质粒复制子(mSF)。

优选地，所述的pnCasPA-BEC质粒还含有大肠杆菌中的质粒复制子(ColEl)。

优选地，所述的pnCasPA-BEC质粒含有两个BsaI位点，能够用来插入spacer片段。

优选地，所述的pnCasPA-BEC质粒含有sacB反向筛选基因。

优选地，所述的pnCasPA-BEC质粒还含有庆大霉素抗性基因片段Gm、sgRNA表达的启动子trc promoter、APOBEC1-nCas9融合蛋白表达的启动子rpsL promoter中的至少一种。

优选地，所述的pnCasPA-BEC质粒的序列为SEQ ID NO：1。

本发明还提供了上述的pnCasPA-BEC质粒在假单胞菌中进行基因组碱基编辑中的应用。

优选地，所述的基因组碱基编辑是碱基从胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变。

优选地，所述的假单胞菌为铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌或丁香假单胞菌。

本发明还提供了含有pnCasPA-BEC质粒的菌株。

优选地，所述的菌株为大肠杆菌DH5α菌株。

本发明还提供了含有pnCasPA-BEC质粒的细胞。

本发明能够高效并且快速地将各种假单胞菌株基因组上任意位点的胞嘧啶突变成胸腺嘧啶，实现氨基酸突变和基因失活等。所述技术在研究假单胞菌的生理特性、代谢产物、工业生产应用等方面具有广阔地应用前景。

本发明还提供了含有上述pnCasPA-BEC质粒的大肠杆菌DH5α菌株，其分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018.07.05，保藏号为：CCTCC M 2018448。

附图说明

附图1：编辑质粒pnCasPA-BEC图谱；BsaI位点：用于Golden Gate Assembly技术插入spacer片段；trc promoter：sgRNA表达的启动子；APOBEC1-nCas9：胞嘧啶脱氨酶APOBEC1通过Xlinker与Cas9D10A连接得到的融合蛋白；rpsL promoter：APOBEC1-nCas9融合蛋白表达的启动子；mSF：假单胞菌中的质粒复制子；Gm：庆大霉素抗性基因片段；ColE1：大肠杆菌中的质粒复制子；sacB：反向筛选基因，用于编辑后质粒消除。

附图2：pnCasPA-BEC质粒进行碱基编辑的示意图。图A.pnCasPA-BEC质粒将基因组上特定位点的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶的示意图。其中pnCasPA-BEC质粒在spacer上可编辑的位点为3号位～8号位。图B.胞嘧啶脱氨酶APOBEC1能够将胞苷催化转变成尿苷。

附图3：pnCasPA-BEC质粒在假单胞菌各菌种中实现高效碱基编辑。图A.pnCasPA-BEC质粒对铜绿假单胞菌PAO1菌株中的rhlR基因进行碱基突变，将108位的色氨酸突变成终止密码子的DNA测序结果。图B.pnCasPA-BEC质粒对恶臭假单胞菌KT2440菌株中的cadR基因进行碱基突变，将92位的谷氨酰胺突变成终止密码子的DNA测序结果。图C.pnCasPA-BEC质粒对丁香假单胞菌DC3000菌株中的gacA基因进行碱基突变，将113位的谷氨酰胺突变成终止密码子的DNA测序结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。

各实施例中使用的生物材料来源如下：

pnCasSA-BEC质粒(购自美国Addgene公司，货号：110546)；

pEX18Ap质粒(购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号：pEX18Ap)；

pAK1900质粒(购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号：pAK1900)；

pJM220质粒(购自美国Addgene公司，货号：110559)；

感受态大肠杆菌DH5α菌株(购自武汉淼灵生物科技有限公司，货号：P1435)；

铜绿假单胞菌PAO1菌株(购自美国ATCC公司，货号：ATCC15692)；

恶臭假单胞菌KT2440菌株(购自美国ATCC公司，货号：ATCC47054)；

丁香假单胞菌DC3000菌株(购自美国ATCC公司，货号：ATCCBAA-871)；

含有pnCasPA-BEC质粒的大肠杆菌DH5α菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2018.07.05，保藏号为：CCTCC M 2018448。

各实施例中使用的LB液体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507002-0250；LB固体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507003-0250；硫酸庆大霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A506614-0005；蔗糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A100335-0250；甘油购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A100854-0500。

以下所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例一：pnCasPA-BEC质粒构建：

pnCasPA-BEC质粒的组成如附图1所示，其含有能够表达APOBEC1-nCas9的基因片段以及假单胞菌中的质粒复制子mSF，其序列为SEQ ID NO：1。该质粒能对假单胞菌不同菌株的基因组进行碱基编辑，其作用机制如附图2所示。pnCasPA-BEC质粒的具体构建方法如下：

(1)使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提铜绿假单胞菌PAO1菌株的基因组，具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。以PAO1菌株的基因组为模板，通过PCR扩增rpsL启动子。以pnCasSA-BEC质粒为模板，分别PCR扩增得到ColE1复制子和APOBEC1-Cas9D10A的基因片段。以pEX18Ap质粒为模板，扩增得到sacB基因片段。mSF复制子是通过PCR以pAK1900质粒为模板扩增得到。庆大霉素抗性基因则是以pJM220质粒为模板通过PCR扩增得到。

用于PCR扩增的引物序列为：

扩增rpsL启动子5’引物序列(SEQ ID NO：2)：

5’-CGAACTGGTCTCGTAAGaagTCTAGAATGCTCGAGGCATCAACGACAAGCCCCGG-3’

扩增rpsL启动子3’引物序列(SEQ ID NO：3)：

5’CGAACTGGTCTCGCATCTATAGCTCCACTGATTGTCTTACGAC-3’

扩增ColE1复制子5’引物序列(SEQ ID NO：4)：

5’-CGAACTGGTCTCCGTGgcgggactctggggttcg-3’

扩增ColE1复制子3’引物序列(SEQ ID NO：5)：

5’-CGAACTGGTCTCCtgccgCCCGGGCTCTGTCGACaacgcaggaaagaacatgtgagc-3’

扩增APOBEC1-Cas9D10A基因片段5’引物序列(SEQ ID NO：6)：

5’CGAACTGGTCTCCGATGAGTAGCGAAACCGGTCCGG-3’

扩增APOBECl-Cas9D10A基因片段3’引物序列(SEQ ID NO：7)：

5’CGAACTGGTCTCCTCgggaaaactgtccatacccatg-3’

扩增sacB基因5’引物序列(SEQ ID NO：8)：

5’-CGAACTGGTCTCCggcatcagagcagattgtactgag-3’

扩增sacB基因3’引物序列(SEQ ID NO：9)：

5’-CGAACTGGTCTCCCTTAAGgcaactttatgcccatgcaacag-3’

扩增mSF复制子5’引物序列(SEQ ID NO：10)：

5’-CGAACTGGTCTCCAGTTTTCGTTCCACTGAGCGT-3’

扩增mSF复制子3’引物序列(SEQ ID NO：11)：

5’-CGAACTGGTCTCCcCACGCTCACCGGCTCCAG-3’

扩增庆大霉素抗性基因5’引物序列(SEQ ID NO：12)：

5’-CGAACTGGTCTCGccGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTC-3’

扩增庆大霉素抗性基因3’引物序列(SEQ ID NO：13)：

5’-CGAACTGGTCTCGAACTCTCGAATTGGCCGCGGCGT-3’

使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase分别扩增上述六个DNA片段，反应体系为：34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimestarBuffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl模板DNA(100ng/μl)，0.5μlPrimerSTAR HS DNA Polymerase。

上述PCR反应体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下：98℃30s；之后98℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 5min，共30个循环；最后72℃ 10min。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR产物分别进行纯化。PCR产物纯化的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(2)将上述六个DNA片段组装成一个环形质粒。反应体系为：1μl10×T4 DNAligase Buffer，上述六个DNA片段各20fmol，0.5μl T4 DNA ligase(400units/μl)，0.5μlBsaI-HF(20units/μl)，最后加入适量ddH₂O至总体积为10μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。在PCR仪中进行反应，循环如下：37℃ 3min；16℃ 4min，共25个循环；然后80℃ 15min。

将上述10μl反应产物转化到感受态大肠杆菌DH5α菌株中，并平铺在含有15μg/ml庆大霉素的LB固体培养基上。待转化液被固体培养基吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒。质粒抽提的具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(3)在金唯智生物科技有限公司化学合成含有trc启动子和sgRNA序列的DNA片段，其序列如下(SEQ ID NO：14)：

5’-CCTGCGTTCTTAAGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGCGAGACCATTGGTCTCAgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgagatctgtccatacccatggTCTAGATCAGAA-3’

其中加粗的大写部分为trc启动子序列；小写部分为sgRNA序列；下划线的大写部分为两个BsaI酶切位点。

(4)将上述步骤(2)得到的质粒和步骤(3)的DNA片段分别用SalI-HF和XhoI进行酶切，其反应体系如下：5μl 10×CutSmart Buffer，2μg质粒或DNA片段，2μl SalI-HF(20units/μl)，2μl XhoI(20units/μl)，最后加入适量ddH₂O至总体积为50μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对双酶切产物分别进行纯化回收。具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(5)将纯化回收的质粒和DNA片段用T4DNA ligase进行连接，最终得到pnCasPA-BEC质粒。其反应体系如下：1μl 10×T4 DNA ligase Buffer，100ng酶切后的质粒，50ng酶切后的DNA片段，0.5μl T4 DNA ligase(400units/μl)，加入适量ddH₂O至总体积为10μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。

在室温下反应2～3个小时后，将10μl连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5α菌株中，并平铺在含有15μg/ml庆大霉素的LB固体培养基上。待转化液被固体培养基吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，并用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提pnCasPA-BEC质粒用于后续实验，同时将质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确认。含有正确pnCasPA-BEC质粒的大肠杆菌DH5α菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M 2018448。

该pnCasPA-BEC质粒的特征在于是一种穿梭质粒，能够在大肠杆菌和假单胞菌(例如铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、丁香假单胞菌等)中复制传代；在于该质粒在大肠杆菌和假单胞菌中均为庆大霉素抗性，能用于菌株筛选；在于该质粒能在假单胞菌中进行基因组碱基编辑，实现碱基从胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变；在于sacB反向筛选基因，通过在蔗糖条件下培养能够实现菌株中的质粒消除；在于含有两个BsaI位点，能够用来插入spacer片段。

实施例二：pnCasPA-BEC质粒在铜绿假单胞菌株中实现高效碱基编辑：

用pnCasPA-BEC质粒可以在铜绿假单胞菌各种菌株中实现对不同基因的高效碱基编辑。实验中选取rhlR基因为例，在铜绿假单胞菌PAO1菌株中进行碱基编辑实验。附图3A为pnCasPA-BEC质粒对铜绿假单胞菌PAO1菌株中的rhlR基因进行碱基突变，将108位的色氨酸突变成终止密码子的DNA测序结果。

(1)先在PAO1菌株目标基因上选定某一NGG(N为任意碱基)序列前面20个碱基的DNA片段(这20个碱基被称为spacer，NGG不包含在其中)。本步骤的特征在于，需要发生突变的胞嘧啶C应当位于spacer上20个碱基的3～8号位(以5’→3’的顺序计数)。例如实验选定的rhlR基因spacer的DNA序列为：5’-cgttCCagagcatccggctc-3’(SEQ ID NO：15)，其中需要发生碱基编辑的胞嘧啶C(大写加粗)为5号位和6号位。

为使spacer片段能插入到pnCasPA-BEC质粒中，需在选定spacer的单链DNA序列的5’端加上GTGG。同时需要合成spacer的反补序列，并在反补序列5’端加上AAAC。则具体序列设计如下：

5’-GTGGcgttCCagagcatccggctc-3’(SEQ ID NO：16)

3’-gcaaGGtctcgtaggccgagCAAA-5’(SEQ ID NO：17)

在生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述两条引物，并按实施例五的步骤将spacer插入到实施例一中得到的pnCasPA-BEC质粒中，得到pnCasPA-BEC-rhlR质粒。

(2)将构建的pnCasPA-BEC-rhlR质粒转入实施例六制备的铜绿假单胞菌PAO1菌株电转感受态中。具体操作如下：取一管实施例六中制备的铜绿假单胞菌PAO1菌株的电转感受态细菌，在冰上放置5～10分钟后，加入～1μg质粒。混合均匀后转入1mm电转杯(Bio-Rad公司)，室温下在GenePulser Xcell电击仪(Bio-Rad公司)中进行电击。电击参数为：2100V，200Ω，25μF。电击后立即加入1ml LB培养液，混合均匀后转入干净的EP管中，在37℃摇床中振摇1～2个小时。取100μl菌液平铺在含有30μg/ml庆大霉素的LB固体培养平板上。待菌液被固体培养基吸收后，于37℃培养箱倒置培养过夜，只有成功转入质粒的细菌能在培养基上生长。

(3)挑取单克隆菌落到10μl ddH₂O中，在95℃下加热10min使细菌裂解，作为PCR模板扩增rhlR基因部分。反应体系为34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimeSTAR Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl PCR模板，0.5μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司，货号：R010A)。

rhlR基因碱基突变的PCR引物序列为：

5’Primer：5’-ctgcgcttcagatgagacc-3’(SEQ ID NO：18)

3’Primer：5’-agggcttactgcaatgagga-3’(SEQ ID NO：19)

将PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证，测序引物为：5’-ctgcgcttcagatgagacc-3’(SEQ ID NO：18)。

实验结果发现，在选取的12个菌落中，有11个碱基突变成功，5号位和6号位的胞嘧啶C都突变为胸腺嘧啶T。

(4)对已经碱基编辑成功的假单胞菌各菌株，可以通过在含有蔗糖的LB培养平板上培养，消除质粒。具体步骤为：从碱基编辑成功的含有pnCasPA-BEC质粒的假单胞菌中挑取一个单克隆，接种到3ml含有30μg/ml庆大霉素的LB液体培养基中，在37℃下振摇过夜。第二天，取3μl菌液，以1∶1000比例稀释到3ml新鲜的LB液体培养基中，在37℃下振摇培养至菌液浑浊。用新鲜的LB液体培养基将菌液稀释10000倍，取100μl稀释后的菌液平铺在含有5％w/v蔗糖的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。由于pnCasPA-BEC质粒中含有sacB基因，使得质粒在蔗糖条件下会产生对细菌有害的物质，造成细菌死亡，从而在培养平板上长出来的菌落都是不含质粒的。从含有5％w/v蔗糖的LB固体培养平板上挑取单克隆菌落，接种在10μl LB液体培养基中，分别在LB固体培养平板和含有30μg/ml庆大霉素的LB固体培养平板上划线。能在LB固体培养基生长，但是不能在含有30μg/ml庆大霉素的LB固体培养平板上生长的菌落，即为消除了pnCasPA-BEC质粒的菌落，对其进行培养与保种。

实施例三：pnCasPA-BEC质粒在恶臭假单胞菌株中实现高效碱基编辑：

使用pnCasPA-BEC质粒可以在恶臭假单胞菌各种菌株实现对不同基因的高效碱基编辑。实验中选取cadR基因为例，在恶臭假单胞菌KT2440菌株中进行碱基编辑实验。附图3B为pnCasPA-BEC质粒对恶臭假单胞菌KT2440菌株中的cadR基因进行碱基突变，将92位的谷氨酰胺突变成终止密码子的DNA测序结果。

(1)设计用于恶臭假单胞菌KT2440菌株中cadR基因的spacer片段序列，选定的spacer DNA序列为：5’-catgttCaggcgcggatcga-3’(SEQ ID NO：20)，其中需要发生碱基编辑的胞嘧啶C(大写加粗)为7号位。具体序列设计如下：

5’-GTGGcatgttCaggcgcggatcga-3’(SEQ ID NO：21)

3’-gtacaaGtccgcgcctagctCAAA-5’(SEQ ID NO：22)

在生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述两条引物，并按实施例五的步骤将spacer插入到实施例一中得到的pnCasPA-BEC质粒中，得到pnCasPA-BEC-cadR质粒。

(2)将构建的pnCasPA-BEC-cadR质粒转入实施例六制备的恶臭假单胞菌KT2440菌株电转感受态中。具体操作如下：取一管实施例六中制备的KT2440电转感受态细菌，在冰上放置5～10分钟后，加入～1μg质粒。混合均匀后转入1mm电转杯(Bio-Rad公司)，室温下在GenePulser Xcell电击仪(Bio-Rad公司)中进行电击。电击参数为：1800V，200Ω，25μF。电击后立即加入1ml LB液体培养基，混合均匀后转入干净的EP管中，在30℃摇床中振摇1～2个小时。取100μl菌液平铺在含有20μg/ml庆大霉素的LB固体培养平板上。待菌液被固体培养基吸收后，于30℃培养箱倒置培养过夜，只有成功转入质粒的细菌能在培养基上生长。

(3)挑取单克隆菌落到10μl ddH₂O中，在95℃下加热10min使细菌裂解，作为PCR模板扩增cadR基因部分。反应体系为34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimeSTAR Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl PCR模板，0.5μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司，货号：R010A)。

cadR基因碱基突变的PCR验证引物序列为：

5’Primer：5’-TGCCAAGTGAACACCCTGTA-3’(SEQ ID NO：23)

3’Primer：5’-CAACTGGACGAAATGGCACT-3’(SEQ ID NO：24)

将PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证，测序引物为：5’-TGCCAAGTGAACACCCTGTA-3’(SEQ ID NO：23)。

实验结果发现，在选取的14个菌落中，有13个菌落的7号位胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T，对其进行培养与保种。

实施例四：pnCasPA-BEC质粒在丁香假单胞菌株中实现高效碱基编辑：

使用pnCasPA-BEC质粒可以在丁香假单胞菌各种菌株实现对不同基因的高效碱基编辑。实验中选取gacA基因为例，在丁香假单胞菌DC3000菌株中进行碱基编辑实验。附图3C为pnCasPA-BEC质粒对丁香假单胞菌DC3000菌株中的gacA基因进行碱基突变，将113位的谷氨酰胺突变成终止密码子的DNA测序结果

(1)设计用于丁香假单胞菌DC3000菌株中gacA基因的spacer片段序列，选定的spacer DNA序列为：5’-gatggttCaggccattcgcc-3’(SEQ ID NO：25)，其中需要发生碱基编辑的胞嘧啶C(大写加粗)为8号位。具体引物序列设计如下：

5’-GTGGgatggttCaggccattcgcc-3’(SEQ ID NO：26)

3’-ctaccaaGtccggtaagcggCAAA-5’(SEQ ID NO：27)

在生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述两条引物，并按实施例五的步骤将spacer插入到实施例一中得到的pnCasPA-BEC质粒中，得到pnCasPA-BEC-gacA质粒。

(2)将构建的pnCasPA-BEC-gacA质粒转入实施例六制备的丁香假单胞菌DC3000菌株电转感受态中。具体操作如下：取一管实施例六中制备的DC3000电转感受态细菌，在冰上放置5～10分钟后，加入～1μg质粒。混合均匀后转入1mm电转杯(Bio-Rad公司)，室温下在GenePulser Xcell电击仪(Bio-Rad公司)中进行电击。电击参数为：1800V，200Ω，25μF。电击后立即加入1ml LB液体培养基，混合均匀后转入干净的EP管中，在30℃摇床中振摇1～2个小时。取100μl菌液平铺在含有20μg/ml庆大霉素的LB固体培养平板上。待菌液被固体培养基吸收后，于30℃培养箱倒置培养过夜，只有成功转入质粒的细菌能在培养基上生长。

(3)挑取单克隆菌落到10μl ddH₂O中，在95℃下加热10min使细菌裂解，作为PCR模板扩增cadR基因部分。反应体系为34.4μl ddH₂O，4μl dNTP Mixture(2.5mM each)，10μl 5×PrimeSTAR Buffer，0.3μl 5’Primer(50μM)，0.3μl 3’Primer(50μM)，0.5μl PCR模板，0.5μl PrimerSTAR HS DNA Polymerase。

gacA基因碱基突变的PCR验证引物序列为：

5’Primer：5’-tgtcgatgaccatgaccttg-3’(SEQ ID NO：28)

3’Primer：5’-atatcgacccttggccttct-3’(SEQ ID NO：29)

将PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证，测序引物为：5’-tgtcgatgaccatgaccttg-3’(SEQ ID NO：28)。

实验结果发现，在选取的12个菌落中，有11个菌落的8号位胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T，对其进行培养与保种。

实施例五：将spacer片段插入pnCasPA-BEC质粒：

首先将设计合成的两个spacer引物进行磷酸化，具体反应体系如下：5μl 10×T4DNA ligase Buffer(NEB公司)，2μl spacer 5’primer(50μM)，2μl spacer 3’primer(50μM)，1μl T4 polynucleotide kinase(Takara公司，货号：2021S，10units/μl)，40μlddH₂O。在37℃下反应1小时。向反应产物中加入2.5μl 1M NaCl，在95℃加热5min，然后在1～2小时内缓慢地降低到室温，使磷酸化的两条单链引物通过碱基配对形成双链DNA。然后用ddH₂O将得到的产物稀释20倍。

将上述得到的双链DNA插入pnCasPA-BEC质粒的BsaI位点，反应体系为：1μl10×T4DNA ligase Buffer，1μl上述20倍稀释的磷酸化双链DNA，20fmol实施例一中得到的pnCasPA-BEC质粒，0.5μl T4 DNA ligase(400units/μl)，0.5μl BsaI-HF(20units/μl)，最后加入适量ddH₂O至总体积为10μl。该反应中所用buffer和酶均由NEB公司生产。在PCR仪中进行反应，循环如下：37℃ 2min；16℃ 5min，共25个循环；然后50℃ 5min，80℃ 15min。

将该10μl反应产物转化到感受态大肠杆菌DH5α菌株中，并平铺在含有15μg/ml庆大霉素的LB固体培养平板上。待转化液被固体培养平板吸收后于37℃培养箱倒置培养过夜。将培养基上长出的转化菌株转接保存，同时抽提质粒并送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。

实施例六：制备假单胞菌的电转感受态：

将实验室保种的铜绿假单胞菌菌株在LB固体培养平板上划线，于37℃培养箱倒置培养过夜。挑取培养平板上长出的一个单克隆菌落，接种到3ml LB液体培养基中，在37℃摇床中以250rpm转速振摇过夜。第二天取1ml菌液接种到100ml新鲜的LB培养基中，在37℃摇床中继续振摇。当菌液的OD₆₀₀达到1.0～1.5时，将菌液放在冰上冷却十分钟。在4℃离心机中以6000rpm转速离心5分钟收菌，弃去培养基上清，将底部的细菌沉淀用20ml 10％v/v甘油(高压灭菌，并在冰上预冷)重悬。以同样的转速离心，弃去上清，将底部的细菌沉淀再次用20ml 10％v/v甘油重悬。以同样的转速再一次离心，弃去上清后用1ml 10％v/v甘油重悬底部的细菌沉淀。将得到的细菌电转感受态分装到EP管中，每管50μl菌液。将分装的菌液先在液氮中快速冷冻，然后放入-80℃冰箱中保存。需要注意的是，在重悬时动作要轻柔，可以使用移液枪轻轻吹打的方式使细菌重悬。

恶臭假单胞菌KT2440和丁香假单胞菌DC3000，在30℃下进行培养，其电转感受态的制备过程与铜绿假单胞菌的电转感受态制备过程相同。

序列表

<110> 上海科技大学

<120> 一种pnCasPA-BEC质粒及其应用

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10419

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggcgaga ccattggtct cagttttaga 60

gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga 120

gtcggtgctt tttttgagat ctgtccatac ccatggtcta gaatgctcga ggcatcaacg 180

acaagccccg gctatcccga tagccggggc tttgtcttga cggtgtacaa gaacctcttt 240

actattttgt accccgaaaa ttggcagggc gcacgctctg tcatttcgtt tgtgtgtcgt 300

aagacaatca gtggagctat agatgagtag cgaaaccggt ccggttgcag tggatccgac 360

cctgcgccgt cgcattgaac cgcacgagtt tgaagtgttc tttgatccgc gcgagctgcg 420

caaagaaact tgcctgctgt acgagattaa ctggggtggc cgccatagca tctggcgcca 480

taccagccag aacaccaata agcacgtgga agtgaatttt attgaaaaat ttaccaccga 540

gcgctacttc tgccctaata cccgctgcag catcacctgg tttctgagct ggagcccgtg 600

cggcgaatgt agtcgcgcca ttaccgagtt cctgagccgc tatccgcatg tgaccctgtt 660

catctacatc gcccgtctgt accatcacgc cgatccgcgc aatcgccaag gtctgcgtga 720

tctgattagc agcggtgtga ccatccagat catgaccgaa caagagagcg gctattgctg 780

gcgcaacttc gtgaactatt ctccgagcaa cgaagcccac tggccgcgtt atccgcatct 840

gtgggtgcgc ctgtatgtgc tggagctgta ctgcatcatc ctgggcctgc cgccttgcct 900

gaatattctg cgccgtaaac agccgcaact gacattcttc accatcgcac tgcagagctg 960

ccattatcag cgcctgccgc cgcacatttt atgggccacc ggtctgaaaa gcggtagtga 1020

aactccgggc acaagcgaaa gcgcaacccc ggaaagtgat aagaaatact caataggctt 1080

agctatcggc acaaatagcg tcggatgggc ggtgatcact gatgaatata aggttccgtc 1140

taaaaagttc aaggttctgg gaaatacaga ccgccacagt atcaaaaaaa atcttatagg 1200

ggctctttta tttgacagtg gagagacagc ggaagcgact cgtctcaaac ggacagctcg 1260

tagaaggtat acacgtcgga agaatcgtat ttgttatcta caggagattt tttcaaatga 1320

gatggcgaaa gtagatgata gtttctttca tcgacttgaa gagtcttttt tggtggaaga 1380

agacaagaag catgaacgtc atcctatttt tggaaatata gtagatgaag ttgcttatca 1440

tgagaaatat ccaactatct atcatctgcg aaaaaaattg gtagattcta ctgataaagc 1500

ggatttgcgc ttaatctatt tggccttagc gcatatgatt aagtttcgtg gtcatttttt 1560

gattgaggga gatttaaatc ctgataatag tgatgtggac aaactattta tccagttggt 1620

acaaacctac aatcaattat ttgaagaaaa ccctattaac gcaagtggag tagatgctaa 1680

agcgattctt tctgcacgat tgagtaaatc aagacgatta gaaaatctca ttgctcagct 1740

ccccggtgag aagaaaaatg gcttatttgg gaatctcatt gctttgtcat tgggtttgac 1800

ccctaatttt aaatcaaatt ttgatttggc agaagatgct aaattacagc tttcaaaaga 1860

tacttacgat gatgatttag ataatttatt ggcgcaaatt ggagatcaat atgctgattt 1920

gtttttggca gctaagaatt tatcagatgc tattttactt tcagatatcc taagagtaaa 1980

tactgaaata actaaggctc ccctatcagc ttcaatgatt aaacgctacg atgaacatca 2040

tcaagacttg actcttttaa aagctttagt tcgacaacaa cttccagaaa agtataaaga 2100

aatctttttt gatcaatcaa aaaacggata tgcaggttat attgatgggg gagctagcca 2160

agaagaattt tataaattta tcaaaccaat tttagaaaaa atggatggta ctgaggaatt 2220

attggtgaaa ctaaatcgtg aagatttgct gcgcaagcaa cggacctttg acaacggctc 2280

tattccccat caaattcact tgggtgagct gcatgctatt ttgagaagac aagaagactt 2340

ttatccattt ttaaaagaca atcgtgagaa gattgaaaaa atcttgactt ttcgaattcc 2400

ttattatgtt ggtccattgg cgcgtggcaa tagtcgtttt gcatggatga ctcggaagtc 2460

tgaagaaaca attaccccat ggaattttga agaagttgtc gataaaggtg cttcagctca 2520

atcatttatt gaacgcatga caaactttga taaaaatctt ccaaatgaaa aagtactacc 2580

aaaacatagt ttgctttatg agtattttac ggtttataac gaattgacaa aggtcaaata 2640

tgttactgaa ggaatgcgaa aaccagcatt tctttcaggt gaacagaaga aagccattgt 2700

tgatttactc ttcaaaacaa atcgaaaagt aaccgttaag caattaaaag aagattattt 2760

caaaaaaata gaatgttttg atagtgttga aatttcagga gttgaagata gatttaatgc 2820

ttcattaggt acctaccatg atttgctaaa aattattaaa gataaagatt ttttggataa 2880

tgaagaaaat gaagatatct tagaggatat tgttttaaca ttgaccttat ttgaagatag 2940

ggagatgatt gaggaaagac ttaaaacata tgctcacctc tttgatgata aggtgatgaa 3000

acagcttaaa cgtcgccgtt atactggttg gggacgtttg tctcgaaaat tgattaatgg 3060

tattagggat aagcaatctg gcaaaacaat attagatttt ttgaaatcag atggttttgc 3120

caatcgcaat tttatgcagc tgatccatga tgatagtttg acatttaaag aagacattca 3180

aaaagcacaa gtgtctggac aaggcgatag tttacatgaa catattgcaa atttagctgg 3240

tagccctgct attaaaaaag gtattttaca gactgtaaaa gttgttgatg aattggtcaa 3300

agtaatgggg cggcataagc cagaaaatat cgttattgaa atggcacgtg aaaatcagac 3360

aactcaaaag ggccagaaaa attcgcgaga gcgtatgaaa cgaatcgaag aaggtatcaa 3420

agaattagga agtcagattc ttaaagagca tcctgttgaa aatactcaat tgcaaaatga 3480

aaagctctat ctctattatc tccaaaatgg aagagacatg tatgtggacc aagaattaga 3540

tattaatcgt ttaagtgatt atgatgtcga tcacattgtt ccacaaagtt tccttaaaga 3600

cgattcaata gacaataagg tcttaacgcg ttctgataaa aatcgtggta aatcggataa 3660

cgttccaagt gaagaagtag tcaaaaagat gaaaaactat tggagacaac ttctaaacgc 3720

caagttaatc actcaacgta agtttgataa tttaacgaaa gctgaacgtg gaggtttgag 3780

tgaacttgat aaagctggtt ttatcaaacg ccaattggtt gaaactcgcc aaatcactaa 3840

gcatgtggca caaattttgg atagtcgcat gaatactaaa tacgatgaaa atgataaact 3900

tattcgagag gttaaagtga ttaccttaaa atctaaatta gtttctgact tccgaaaaga 3960

tttccaattc tataaagtac gtgagattaa caattaccat catgcccatg atgcgtatct 4020

aaatgccgtc gttggaactg ctttgattaa gaaatatcca aaacttgaat cggagtttgt 4080

ctatggtgat tataaagttt atgatgttcg taaaatgatt gctaagtctg agcaagaaat 4140

aggcaaagca accgcaaaat atttctttta ctctaatatc atgaacttct tcaaaacaga 4200

aattacactt gcaaatggag agattcgcaa acgccctcta atcgaaacta atggggaaac 4260

tggagaaatt gtctgggata aagggcgaga ttttgccaca gtgcgcaaag tattgtccat 4320

gccccaagtc aatattgtca agaaaacaga agtacagaca ggcggattct ccaaggagtc 4380

aattttacca aaaagaaatt cggacaagct tattgctcgt aaaaaagact gggatccaaa 4440

aaaatatggt ggttttgata gtccaacggt agcttattca gtcctagtgg ttgctaaggt 4500

ggaaaaaggg aaatcgaaga agttaaaatc cgttaaagag ttactaggga tcacaattat 4560

ggaaagaagt tcctttgaaa aaaatccgat tgacttttta gaagctaaag gatataagga 4620

agttaaaaaa gacttaatca ttaaactacc taaatatagt ctttttgagt tagaaaacgg 4680

tcgtaaacgg atgctggcta gtgccggaga attacaaaaa ggaaatgagc tggctctgcc 4740

aagcaaatat gtgaattttt tatatttagc tagtcattat gaaaagttga agggtagtcc 4800

agaagataac gaacaaaaac aattgtttgt ggagcagcat aagcattatt tagatgagat 4860

tattgagcaa atcagtgaat tttctaagcg tgttatttta gcagatgcca atttagataa 4920

agttcttagt gcatataaca aacatagaga caaaccaata cgtgaacaag cagaaaatat 4980

tattcattta tttacgttga cgaatcttgg agctcccgct gcttttaaat attttgatac 5040

aacaattgat cgtaaacgat atacgtctac aaaagaagtt ttagatgcca ctcttatcca 5100

tcaatccatc actggtcttt atgaaacacg cattgatttg agtcagctag gaggtgactg 5160

atggctggtt ggcgtactgt tgtggtaaat acccatgggt atggacagtt ttcccgaata 5220

ggaacttcgg aataggaact tcaagatccc ctgattccct ttgtcaacag caatggatcg 5280

aattgacata agcctgttcg gttcgtaaac tgtaatgcaa gtagcgtatg cgctcacgca 5340

actggtccag aaccttgacc gaacgcagcg gtggtaacgg cgcagtggcg gttttcatgg 5400

cttgttatga ctgttttttt gtacagtcta tgcctcgggc atccaagcag caagcgcgtt 5460

acgccgtggg tcgatgtttg atgttatgga gcagcaacga tgttacgcag cagcaacgat 5520

gttacgcagc agggcagtcg ccctaaaaca aagttaggtg gctcaagtat gggcatcatt 5580

cgcacatgta ggctcggccc tgaccaagtc aaatccatgc gggctgctct tgatcttttc 5640

ggtcgtgagt tcggagacgt agccacctac tcccaacatc agccggactc cgattacctc 5700

gggaacttgc tccgtagtaa gacattcatc gcgcttgctg ccttcgacca agaagcggtt 5760

gttggcgctc tcgcggctta cgttctgccc aagtttgagc agccgcgtag tgagatctat 5820

atctatgatc tcgcagtctc cggcgagcac cggaggcagg gcattgccac cgcgctcatc 5880

aatctcctca agcatgaggc caacgcgctt ggtgcttatg tgatctacgt gcaagcagat 5940

tacggtgacg atcccgcagt ggctctctat acaaagttgg gcatacggga agaagtgatg 6000

cactttgata tcgacccaag taccgccacc taacaattcg ttcaagccga gatcggcttc 6060

ccggccgcgg agttgttcgg taaattgtca caacgccgcg gccaattcga gagttttcgt 6120

tccactgagc gtcagacccc aattacacgc cactggctgt gcttgctggg gtgacggtgg 6180

caacggtggc ggccttgctg ggctatcgcg ttggaaagaa acgagggaaa ggggactgat 6240

aaaccggtct tagcccctcc ccttggtgtc caaccgctct gtaggcctct caggcgccgc 6300

tggtgccgct ggttggacgc caagggtgaa tccgcctcga taccctgatt actcgcttcc 6360

tgcgccctct caggcggcga taggggactg gtaaaacggg gattgcccag acgcctcccc 6420

cgccccttca ggggcacaaa tgcggcccca acggggccac gtagtggtgc gttttttgcg 6480

tttccaccct tttcttcctt ttccctttta aaccttttag gacgtctaca ggccacgtaa 6540

tccgtggcct gtagagttta aaaagggacg gatttgttgc cattaaggga cggatttgtt 6600

gttaagaagg gacggatttg ttgttgtaaa gggacggatt tgttgtattg tgggacgcag 6660

atacagtgtc cccttataca caaggaatgt cgaacgtggc ctcaccccca atggtttaca 6720

aaagcaatgc cctggtcgag gccgcgtatc gcctcagtgt tcaggaacag cggatcgttc 6780

tggcctgtat tagccaggtg aagaggagcg agcctgtcac cgatgaagtg atgtattcag 6840

tgacggcgga ggacatagcg acgatggcgg gtgtccctat cgaatcttcc tacaaccagc 6900

tcaaagaagc ggccctgcgc ctgaaacggc gggaagtccg gttaacccaa gagcccaatg 6960

gcaaggggaa aagaccgagt gtgatgatta ccggctgggt gcaaacaatc atctaccggg 7020

agggtgaggg ccgtgtagaa ctcaggttca ccaaagacat gctgccgtac ctgacggaac 7080

tcaccaaaca gttcaccaaa tacgccttgg ctgacgtggc caagatggac agcacccacg 7140

cgatcaggct ttacgagctg ctcatgcaat gggacagcat cggccagcgc gaaatagaaa 7200

ttgaccagct gcgaaagtgg tttcaactgg aaggccggta tccctcgatc aaggacttca 7260

agttgcgagt gcttgatcca gccgtgacgc agatcaacga gcacagcccg ctacaggtgg 7320

agtgggcgca gcgaaagacc gggcgcaagg tcacacatct gttgttcagt tttggaccga 7380

agaagcccgc caaggcggtg ggtaaggccc cagcgaagcg caaggccggg aagatttcag 7440

atgctgagat cgcgaaacag gctcgccctg gtgagacatg ggaagcggcc cgcgctcgac 7500

taacccagat gccgcttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 7560

caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 7620

cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg cgggactctg 7680

gggttcgaga gctcgcttgg actcctgttg atagatccag taatgacctc agaactccat 7740

ctggatttgt tcagaacgct cggttgccgc cgggcgtttt ttattggtga gaatccaagc 7800

actagtcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 7860

agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 7920

aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 7980

ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta 8040

gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 8100

aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 8160

aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 8220

gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agcattgaga 8280

aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 8340

aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 8400

cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 8460

cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 8520

tgctcacatg ttctttcctg cgttgtcgac agagcccggg cggcatcaga gcagattgta 8580

ctgagagtgc accataatcg gcattttctt ttgcgttttt atttgttaac tgttaattgt 8640

ccttgttcaa ggatgctgtc tttgacaaca gatgttttct tgcctttgat gttcagcagg 8700

aagctaggcg caaacgttga ttgtttgtct gcgtagaatc ctctgtttgt catatagctt 8760

gtaatcacga cattgtttcc tttcgcttga ggtacagcga agtgtgagta agtaaaggtt 8820

acatcgttag gatcaagatc catttttaac acaaggccag ttttgttcag cggcttgtat 8880

gggccagtta aagaattaga aacataacca agcatgtaaa tatcgttaga cgtaatgccg 8940

tcaatcgtca tttttgatcc gcgggagtca gtgaacagat accatttgcc gttcatttta 9000

aagacgttcg cgcgttcaat ttcatctgtt actgtgttag atgcaatcag cggtttcatc 9060

acttttttca gtgtgtaatc atcgtttagc tcaatcatac cgagagcgcc gtttgctaac 9120

tcagccgtgc gttttttatc gctttgcaga agtttttgac tttcttgacg gaagaatgat 9180

gtgcttttgc catagtatgc tttgttaaat aaagattctt cgccttggta gccatcttca 9240

gttccagtgt ttgcttcaaa tactaagtat ttgtggcctt tatcttctac gtagtgagga 9300

tctctcagcg tatggttgtc gcctgagctg tagttgcctt catcgatgaa ctgctgtaca 9360

ttttgatacg tttttccgtc accgtcaaag attgatttat aatcctctac accgttgatg 9420

ttcaaagagc tgtctgatgc tgatacgtta acttgtgcag ttgtcagtgt ttgtttgccg 9480

taatgtttac cggagaaatc agtgtagaat aaacggattt ttccgtcaga tgtaaatgtg 9540

gctgaacctg accattcttg tgtttggtct tttaggatag aatcatttgc atcgaatttg 9600

tcgctgtctt taaagacgcg gccagcgttt ttccagctgt caatagaagt ttcgccgact 9660

ttttgataga acatgtaaat cgatgtgtca tccgcatttt taggatctcc ggctaatgca 9720

aagacgatgt ggtagccgtg atagtttgcg acagtgccgt cagcgttttg taatggccag 9780

ctgtcccaaa cgtccaggcc ttttgcagaa gagatatttt taattgtgga cgaatcgaac 9840

tcaggaactt gatatttttc atttttttgc tgttcaggga tttgcagcat atcatggcgt 9900

gtaatatggg aaatgccgta tgtttcctta tatggctttt ggttcgtttc tttcgcaaac 9960

gcttgagttg cgcctcctgc cagcagtgcg gtagtaaagg ttaatactgt tgcttgtttt 10020

gcaaactttt tgatgttcat cgttcatgtc tcctttttta tgtactgtgt tagcggtctg 10080

cttcttccag ccctcctgtt tgaagatggc aagttagtta cgcacaataa aaaaagacct 10140

aaaatatgta aggggtgacg ccaaagtata cactttgccc tttacacatt ttaggtcttg 10200

cctgctttat cagtaacaaa cccgcgcgat ttacttttcg acctcattct attagactct 10260

cgtttggatt gcaactggtc tattttcctc ttttgtttga tagaaaatca taaaaggatt 10320

tgcagactac gggcctaaag aactaaaaaa tctatctgtt tcttttcatt ctctgtattt 10380

tttatagttt ctgttgcatg ggcataaagt tgccttaag 10419

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

cgaactggtc tcgtaagaag tctagaatgc tcgaggcatc aacgacaagc cccgg 55

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cgaactggtc tcgcatctat agctccactg attgtcttac gac 43

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

cgaactggtc tccgtggcgg gactctgggg ttcg 34

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

cgaactggtc tcctgccgcc cgggctctgt cgacaacgca ggaaagaaca tgtgagc 57

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

cgaactggtc tccgatgagt agcgaaaccg gtccgg 36

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

cgaactggtc tcctcgggaa aactgtccat acccatg 37

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

cgaactggtc tccggcatca gagcagattg tactgag 37

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

cgaactggtc tcccttaagg caactttatg cccatgcaac ag 42

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

cgaactggtc tccagttttc gttccactga gcgt 34

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

cgaactggtc tccccacgct caccggctcc ag 32

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

cgaactggtc tcgccgaata ggaacttcgg aataggaact tc 42

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

cgaactggtc tcgaactctc gaattggccg cggcgt 36

<210> 14

<211> 182

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

cctgcgttct taagttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtggc gagaccattg 60

gtctcagttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 120

aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttg agatctgtcc atacccatgg tctagatcag 180

aa 182

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

cgttccagag catccggctc 20

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

gtggcgttcc agagcatccg gctc 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

aaacgagccg gatgctctgg aacg 24

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

ctgcgcttca gatgagacc 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

agggcttact gcaatgagga 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

catgttcagg cgcggatcga 20

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

gtggcatgtt caggcgcgga tcga 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

aaactcgatc cgcgcctgaa catg 24

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

tgccaagtga acaccctgta 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

caactggacg aaatggcact 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

gatggttcag gccattcgcc 20

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

gtgggatggt tcaggccatt cgcc 24

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

aaacggcgaa tggcctgaac catc 24

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 28

tgtcgatgac catgaccttg 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 29

atatcgaccc ttggccttct 20

Claims (10)

1.一种pnCasPA-BEC质粒，其特征在于，含有能够表达APOBEC1-nCas9的基因片段以及假单胞菌中的质粒复制子。

2.如权利要求1所述的pnCasPA-BEC质粒，其特征在于，所述的pnCasPA-BEC质粒还含有大肠杆菌中的质粒复制子。

3.如权利要求1所述的pnCasPA-BEC质粒，其特征在于，所述的pnCasPA-BEC质粒含有两个BsaI位点，能够用来插入spacer片段。

4.如权利要求1所述的pnCasPA-BEC质粒，其特征在于，所述的pnCasPA-BEC质粒含有sacB反向筛选基因。

5.如权利要求1所述的pnCasPA-BEC质粒，其特征在于，所述的pnCasPA-BEC质粒还含有庆大霉素抗性基因片段Gm、sgRNA表达的启动子trc promoter和APOBEC1-nCas9融合蛋白表达的启动子rpsL promoter中的至少一种。

6.一种pnCasPA-BEC质粒，其特征在于，所述的pnCasPA-BEC质粒的序列为SEQ ID NO：1。

7.权利要求1-6中任一项所述的pnCasPA-BEC质粒在假单胞菌中进行基因组碱基编辑中的应用。

8.如权利要求7中的应用，其特征在于，所述的基因组碱基编辑是碱基从胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变。

9.含有权利要求1-6中任一项所述的pnCasPA-BEC质粒的菌株。

10.含有权利要求1-6中任一项所述的pnCasPA-BEC质粒的细胞。