CN109072207A - 用于修饰靶核酸的改进方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于修饰靶核酸的改进方法。该方法涉及构建体,其中引导RNA与供体RNA(融合NA)共价连接,通过同源重组引入靶核酸,并且基于核酸酶(例如CRISPR或TALEN)的引入,进入含有靶核酸的细胞。融合NA可以作为DNA载体引入。
Description
技术领域
本发明涉及用于修饰靶核酸的改进方法。
发明概述
最初将CRISPR(规律成簇间隔短回文重复)系统鉴定为隶属于链球菌属(Streptococcus)的细菌的适应性防御机制(WO2007/025097)。那些细菌CRISPR系统依赖于与切割蛋白质复合的向导RNA(gRNA)来指导存在于侵入的病毒DNA内的互补序列的降解。Cas9(最先鉴定出的CRISPR/Cas系统蛋白质)是通过两种非编码RNA(crRNA和反式激活crRNA(tracrRNA))引导至邻近PAM(原间隔区邻近序列)序列基序的DNA靶序列的大的单体DNA核酸酶。随后,显示通过使crRNA与tracrRNA融合创建的合成RNA嵌合体(单个向导RNA或gRNA)具有同等功能(Jinek等2012)。
若干研究组已发现,CRISPR切割特性可以用于前所未有地轻松破坏几乎任何生物基因组中的基因(Mali P等(2013)Science.339(6121):819-823;Cong L等(2013)Science339(6121))。最近,提供修复模板允许在几乎任何位点编辑具有几乎任何所希望的序列的基因组变得越来越明显,使得CRISPR转化为有力的基因编辑工具(WO/2014/150624、WO/2014/204728)。
基因打靶(gene targeting)指通过经同源重组(HR)发生的核酸缺失、插入或替换来进行的位点特异性基因修饰。基因组靶标中的双链断裂(DSB)高度促进打靶效率。另外,染色体DNA DSB后同源性的存在似乎几乎消除了非同源末端连接(NHEJ)修复,有利于同源重组。
本发明提供与核酸修饰多肽相互作用的与用于HR修复的适当供体融合的向导核酸(包含与至少一个供体核酸(doNA)分子共价连接的向导核酸(gNA)分子的融合核酸(fuNA)分子)。为了改善与侧翼具有核酸酶切割位点的靶DNA具有同源性的供体核酸的递送,提供其中使供体核酸(doNA)与CRISPR成分共价连接的基因打靶策略。这样,基因编辑复合物不仅包含必要的识别和切割工具,还包含修饰模板。向导核酸(gNA)识别时,核酸酶切割靶区域,输入供体(incoming donor)的即刻同步存在将便于HR过程,从而提高基因修复效率。
许多微生物系统缺乏有效的NHEJ系统[Standage-Beier K,Zhang Q,Wang X(2015)Targeted Large-Scale Deletion of Bacterial Genomes Using CRISPR-Nickases.ACS Synth Biol.4(11):1217–1225]。例如,对生物能源研究重要的解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)不能用CRISPR/Cas9容易地改造[Xu T,Li Y,Shi Z,HemmeCL,Li Y,Zhu Y,Van Nostrand JD,He Z,Zhou J(2015)Efficient Genome Editing inClostridium cellulolyticum via CRISPR-Cas9Nickase.Appl Environ Microbiol.81(13):4423-31],通过引入DSB敲除基因的尝试导致细胞死亡。另一个实例是大肠埃希氏菌(Escherichia coli),其也依赖同源重组(HR)进行DSB修复。目前用于这类生物中的基因组编辑技术集中在使用基于CRISPR/Cas9的切口酶后通过非融合核酸供体进行低效修复,CRISPR/Cas的诱导性表达以协调核酸酶作用,及引入在处理定制DNA序列中缺乏灵活性的核酸供体或重组酶。
所提供的FusionCRISPR技术的应用和/或包含fuNA分子的CRISPR/Cas或CRISPR/Cas样系统的应用将简化在之前不适于高通量打靶的多种微生物物种中创建敲除。通过在诱导双链断裂(DSB)时迅速提供供体核酸,HR修复机器将成功使断裂点与伴随的模板连接。用以其他方式用于引入切割形式CRISPR/Cas9、重组酶或任意其他目的(转)基因的常用技术进行FusionCRISPR的引入。这些技术包括但不限于质粒的电穿孔/热激、病毒转导和接合。
而具有有效NHEJ的生物中的基因可以通过引入CRISPR/Cas9来敲除,其中向导RNA包含:(1)匹配靶基因的间隔区;(2)典型长度为~99个核苷酸的向导RNA正确折叠(tracrRNA:crRNA常组合在单个向导RNA(sgRNA)中)所必需的序列,DSB敏感微生物中的敲除可以通过产生以下组成的简单的RNA修改来达到:(1)间隔区;(2)正确二级结构所必需的序列;(3)至少15个匹配靶标的核苷酸;(4)第一串至少15个匹配靶标的核苷酸下游一个或多个碱基的至少15个匹配靶标的核苷酸。代表敲除FusionCRISPR盒的两个互补ssDNA寡核苷酸可以容易地从任何寡核苷酸合成公司购得。备选地,可以将它合成为dsDNA。FusionCRISPR敲除盒的克隆可以用IIS型限制酶与用于克隆常规CRISPR盒中的目的靶标的20核苷酸间隔区的最常用方法类似地进行。因此,通过FusionCRISPR进行可控基因敲除使用的可及性、灵活性和易用性与常规CRISPR/Cas9相当,本发明将高通量敲除扩展至其中NHEJ无效或缺乏的靶物种。
FusionCRISPR也可以用于敲入任何生物中。可以用标准引入技术和标准表达载体(包括简单的质粒)敲入选择标记。可以进行这来破坏和敲除内源基因同时提供容易的选择。
人和其他细胞中的基因组范围敲除允许发现涉及疾病、药物反应和正常生物学过程的基因,并创建疾病模型[Shalem O,Sanjana NE,Hartenian E,Shi X,Scott DA,Mikkelsen TS,Heckl D,Ebert BL,Root DE,Doench JG,Zhang F(2014)Genome-scaleCRISPR-Cas9knockout screening in human cells.Science;343(6166):84-7]。通常通过引入针对特异性靶标的CRISPR/Cas9并依赖NHEJ创建所讨论的基因的“无效”来产生敲除。随此方法产生三个主要问题:(1)常因为NHEJ修复不产生移码(或备选地,使用下游起始密码子,产生截短的基因产物)而未创建出敲除;(2)结果(即确切的一级DNA序列)未知,需要针对每个DNA修饰“事件”进行测定,这成本高且耗时;(3)在二倍体或多倍体生物中,每条染色体上的NHEJ修复会不同地发生,如果甚至在第一个地方达到所有可得“底物”上的成功打靶,则产生复杂的分子分析和/或被迫转向单倍体模型株系[Wade M(2015)High-throughput silencing using the CRISPR-Cas9system:A review of the benefits andchallenges.Journal of Biomolecular Screening,Vol.20(8):1027-39]。FusionCRISPR允许控制上述缺失,这导致可预测的结果。在二倍体和多倍体细胞系统中,每条染色体上的任何引入的修饰将大多数相同。可将缺失设计得足够大,使得选择性转录可能性降低,通过将缺失设计为包含不能被3整除的碱基数,将消除仍然创建仅缺乏一段短氨基酸序列的功能性蛋白质的风险。
用于引入设计用于任何细胞系统中的控制敲除的FusionCRISPR配置(configuration)的方法与用于引入CRISPR/Cas9后通过NHEJ修复创建敲除的方法相同。这包括但不限于对人细胞而言使用AAV和慢病毒载体,对昆虫细胞而言使用杆状病毒表达系统。除上述向导RNA的短延长外,无需对目前的方法进行其他修改。
基因组编辑可以用来治疗多种遗传障碍。许多遗传障碍涉及点突变,其可能可以通过提供位点特异性核酸酶连同含有所需的一个或多个校正的校正核酸模板来校正。一个实例是由β-珠蛋白基因第六密码子中的单DNA碱基突变(A>T)引起的镰形细胞病[Li C,Ding L,Sun CW,Wu LC,Zhou D,Pawlik KM,Khodadadi-Jamayran A,Westin E,GoldmanFD,Townes TM(2016)Novel HDAd/EBV Reprogramming Vector and Highly EfficientAd/CRISPR-Cas Sickle Cell Disease Gene Correction.Sci Rep.6:30422]。通过分别提供核酸酶和校正模板校正细胞中的突变常会导致DNA中的初始断裂和用于HDR修复的校正模板的局部到达的不协调。为了抵消时间/空间协调的缺乏,核酸酶和校正模板浓度需要相对高。核酸酶浓度越高可以导致具有负面后果的脱靶切割越高(患者风险越高和/或分子分析的花费越高)。FusionCRISPR可在低得多的浓度达到正确的基因矫正。应用FusionCRISPR的方法与本领域目前的标准[Maeder ML,Gersbach CA(2016)Genome-editingTechnologies for Gene and Cell Therapy.Mol Ther.24(3):430-46]相同,唯一的不同是包含所希望的校正的sgRNA略长。
FusionCRISPR可以用于改变多种不同生物中的多种酶的底物或产物特异性。例如,已发现单个氨基酸是多种植物物种中三萜合酶底物和产物特异性的主要决定因素[Salmon M,Thimmappa RB,Minto RE,Melton RE,Hughes RK,O'Maille PE,Hemmings AM,Osbourn A(2016)A conserved amino acid residue critical for product andsubstrate specificity in plant triterpene synthases.Proc Natl Acad Sci U SA.113(30):E4407-14]。三萜是在药学和生物技术中应用的一组多样的天然产物,影响产物特异性的能力打开了在目的植物中合成新的或更大量的生物分子的大门。FusionCRISPR允许修饰酶的影响特异性的底物袋或其他结构域中的关键氨基酸。通过在融合模板中包含相应的密码子来引入希望得到的氨基酸,融合模板侧翼是与基因组中需替换的密码子的侧翼序列具有同源性的核苷酸序列。引入FusionCRISPR构建体的一个实例是通过农杆菌介导的T-DNA转化,其中T-DNA包含选择标记、由强启动子驱动的Cas9和包含以下的FusionCRISPR构建体:(1)RNA聚合酶III启动子;(2)匹配目的靶密码子或其邻近序列(找到最近的PAM)的间隔区;(3)向导的正确二级结构所必需的序列;(4)匹配断裂点侧翼一个区域的同源臂;(5)匹配影响酶特异性的一个或多个氨基酸残基的一个或多个新密码子;(6)断裂点另一侧的同源臂;和(7)终止子。取决于在何处切割,可必须包含沉默突变以避免在供体中具有PAM序列。为了无缝掺入供体,同源臂、预期的改变和预期的改变之间的序列可以是相邻的。选择标记用于获得已稳定整合T-DNA的植物细胞。在这些细胞中,在维持和再生转化植物的整个过程中,FusionCRISPR成分有机会在目的靶标处改变基因组。这些改变可以进入种系,可以针对新的内源序列和T-DNA的分离筛选下一代幼苗。
FusionCRISPR允许在任何生物中的内源基因处插入表位或其他标记。标记可以用于在细胞和亚细胞水平跟踪内源基因产物,鉴定蛋白质-蛋白质相互作用、ChIP和其他分子相互作用,及蛋白质纯化。大多数应用将是发现和鉴定药物靶标。FusionCRISPR构建体将与上文针对引入取代所述类似地在同源序列之间具有编码标记的核酸作为荷载。作为DNA或瞬时引入FusionCRISPR将遵循目前在目的生物中用于常规CRISPR/Cas9的相同流程。
我们的酵母实验已显示,FusionCRISPR中的荷载可以是至少731个核苷酸而不影响核酸酶的完整功能。这种大小或可能更大的序列可以包含强启动子或与天然启动子相比具有不同的组织或环境信号特异性活性的启动子。FusionCRISPR可能可以替换内源启动子,允许包括上调在内的其他基因调节方法。
本发明的一个目的是简化CRISPR/Cas DNA修复系统或CRISPR/Cas样DNA修复系统的应用。
本发明的另一个目的是增强DNA断裂修复过程中靶核酸的同源重组效率。
令人惊奇地,通过共价连接供体核酸分子和向导核酸分子达到了这一点,向导核酸分子与作为CRISPR/Cas DNA修复系统或CRISPR/Cas样DNA修复系统元件的位点定向核酸修饰多肽相互作用。
发明详述
本发明的一个实施方案是用于修饰细胞或组合物中的靶核酸(靶NA)分子的方法,其包括步骤:
a.提供包含与至少一个供体核酸(doNA)分子共价连接的向导核酸(gNA)分子的重组融合核酸(fuNA)分子;和
b.将该fuNA分子引入包含靶NA分子的一个或多个细胞或组合物;和
c.将位点定向核酸修饰多肽引入该一个或多个细胞或组合物;和
d.在允许该一个或多个细胞或组合物中同源重组的条件下孵育该一个或多个细胞或组合物;和可选地
e.分离一个或多个其中发生了同源重组的细胞。
图1至12中显示本发明的融合核酸分子的多种优选结构。图1中显示最优选的结构。
可以通过将核酸分子引入靶核酸来修饰靶核酸,其中所引入的核酸分子对靶核酸而言是异源的。在这种情况下,供体核酸分子的同源臂1和同源臂2之间的序列可包含待引入靶核酸中且不存在于与同源臂互补的靶核酸区域之间的核酸分子。
还可以通过从靶核酸缺失至少一个碱基来修饰靶核酸。在这种情况下,供体核酸分子的同源臂1和同源臂2之间的序列可包含与靶核酸相比,缺乏至少一个碱基的靶核酸分子互补的序列。
还可通过用一个或多个靶核酸的异源碱基替换靶核酸中的至少一个碱基来修饰靶核酸。在这种情况下,供体核酸的同源臂1和2之间的序列与靶核酸中的互补区相比可包含至少一个错配。
靶核酸可以包含邻近靶核酸分子中所靶向的序列的“原间隔区邻近基序”(PAM)序列,其是一些位点定向核酸修饰多肽进行正确的靶位点鉴定和结合所需的。PAM的序列是多种位点定向核酸修饰多肽特异的(Doudna和Charpentier,2014,Science 346(6213):1258096),且为技术人员已知。
本发明的方法优选应用于活细胞中的靶核酸修饰,但也可应用于体外系统。
靶核酸分子可以是RNA或DNA,它可以是单链或双链。优选地,靶核酸分子是DNA,更优选地,靶核酸分子是双链DNA。
位点定向核酸修饰多肽可以作为多肽引入细胞或组合物,或者可以通过引入编码该位点定向核酸修饰多肽的RNA分子或通过引入表达该位点定向核酸修饰多肽的表达构建体来引入,其中表达构建体包含与编码该位点定向核酸修饰多肽的基因功能性连接的在该细胞或组合物中具有功能的启动子。表1中显示这类位点定向核酸修饰多肽的实例。另外,这类位点定向核酸修饰多肽的任何功能等同物都可以用于本发明的方法。
表1.位点定向核酸修饰多肽的实例
位点定向核酸修饰多肽可以具有双链核酸消化功能或者它可以具有切口酶功能,仅切割双链核酸分子的一条链。也可以失活位点定向核酸修饰多肽的核酸限制或切口酶能力,将重组位点定向核酸修饰多肽连接至其他官能团,如FokI或归巢核酸内切酶的DNA限制区。这类重组位点定向核酸修饰多肽例如描述于Tsai等(2014;Nat Biotechnol.2014 32(6):569-76.)或Guilinger等(2014;Nat Biotechnol.2014 32(6):577-82)中。
gNA分子包含含有至少12个与靶NA分子100%互补的碱基的间隔区核酸(间隔区NA)分子。优选地,它包含与靶NA分子互补的至少13个碱基、至少14个碱基或至少15个碱基。更优选地,它包含与靶NA分子互补的至少16个碱基、至少17个碱基或至少18个碱基。甚至更优选地,它包含与靶NA互补的至少19个碱基或至少20个碱基。
gNA分子进一步包含支架核酸(支架NA)分子。
支架NA可以包含一个核酸分子,该核酸分子包含两个各含有彼此互补的至少8个碱基、能够杂交并形成发夹结构的区域。支架NA可以包含两个核酸分子,该两个核酸分子各包含至少一个彼此互补的至少8个碱基的区域,能够杂交并形成双链结构。如果该区域包含8个以上互补碱基,则每个区域包含至少8个与另一个区域的至少8个碱基互补的碱基。
优选地,该支架NA包含一个分子。
支架NA分子与间隔区NA分子共价连接。在这种情况下,支架NA分子包含两个独立分子,这些支架NA分子中的至少一个与间隔区NA分子共价连接。
除包含彼此互补的至少8个碱基的两个区域外,支架NA分子还包含形成含有至少一个发夹、优选至少两个发夹的二级结构的区域。
供体NA分子包含两个同源臂。供体NA分子的每个同源臂包含至少15个碱基,且大小为同源臂间附加NA区大小的至少5%、优选至少10%、更优选至少15%、最优选至少20%。同源臂1和2可具有相同长度或不同长度。
同源臂各包含至少15个与靶NA分子中相同数据的连续碱基100%互补的碱基。在这种情况下,同源臂大于15个碱基,与靶NA分子优选至少60%、优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%、甚至更优选至少98%、甚至更优选至少99%互补。最优选地,各同源臂与靶NA分子100%互补。
本发明的方法可应用于含有靶NA分子的细胞或组合物。优选地,该方法应用于细胞,其中细胞是微生物细胞、动物细胞、人细胞或植物细胞,更优选地,该方法应用于酵母细胞或植物细胞。
本发明的方法可应用于任何植物细胞,例如裸子植物或被子植物,优选被子植物,例如双子叶植物或单子叶植物细胞。优选的单子叶植物细胞是例如玉米、小麦、稻、大麦、高粱、芭蕉、甘蔗、芒草和短柄草,尤其优选的单子叶植物细胞是玉米、小麦和稻。优选的双子叶植物细胞是例如大豆、油菜籽、卡诺拉、亚麻籽、棉花、马铃薯、甜菜、万寿菊和拟南芥,尤其优选的双子叶植物细胞是大豆、油菜籽、卡诺拉和马铃薯。
本发明的方法还可应用于任何微生物。该微生物可以是细菌,细菌细胞可以是任何革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)和海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。
革兰氏阴性菌包括但不限于大肠埃希氏菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、醋杆菌属(Acetobacter)、产黄菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)。优选地,该革兰氏阴性细胞是大肠埃希氏菌细胞。
在本发明的方法中,该细菌细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。用于实施本发明的芽孢杆菌属细胞包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝固芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(
Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。在优选方面,该细菌细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的方面,该细菌细胞是地衣芽孢杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞,优选枯草芽孢杆菌细胞。
在本发明的方法中,该细菌宿主细胞可以是嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戈氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricusk)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri);金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);棒杆菌属,尤其是物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、Corynebacterium thermoaminogenes、Corynebacterium melassecola和Corynebacterium effiziens、Corynebacteriumefficiens、Corynebacterium deserti;黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、Brevibacterium divarecatum;恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae);链霉菌属,尤其是物种天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis);氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、Gluconobacter morbifer、泰国葡糖杆菌(Gluconobacterthailandicus);醋化醋杆菌(Acetobacter aceti);丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、Clostridium saccharobutylicum、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii);类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)。另一优选细菌是Basfia succiniciproducens。
该微生物可以是真核细胞。适宜的真核细胞包括酵母细胞,例如酵母属(Saccharomyces)物种,如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),汉逊酵母属(Hansenula)物种,如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha),裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种,如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe),克鲁维酵母属(Kluyveromyces)物种,如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus),耶氏酵母属(Yarrowia)物种,如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),毕赤酵母属(Pichia)物种,如甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、Pichia stipites和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),接合酵母属(Zygosaccharomyces)物种,如Zygosaccharomyces rouxii和Zygosaccharomyces bailii,念珠菌属(Candida)物种,如博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、Candida freyschussii、光滑假丝酵母(Candida glabrata)和Candidasonorensis,许旺酵母属(Schwanniomyces物种),如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis),Arxula物种,如Arxula adeninivorans,Ogataea物种,如Ogataea minuta,克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种,如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)。
靶核酸分子对细胞而言可以是内源的,或者它对细胞而言可以是异源的,例如转基因或病毒核酸分子。
doNA分子和gNA分子彼此共价结合形成融合核酸(融合NA)分子。供体NA分子可以共价结合gNA分子的间隔区NA部分,或者结合gNA分子的支架NA部分。在优选实施方案中,供体NA与gNA分子的支架NA部分共价连接。
最优选地,融合NA分子是一个分子,优选一个连续的RNA分子,其中所有元件(gNA、支架NA和doNA)共价连接。
doNA分子和向导NA分子可以包含RNA、DNA、PNA。优选地,它们包含RNA或DNA。更优选地,doNA分子包含DNA,向导NA分子包含RNA。
在最优选的实施方案中,向导和供体NA都包含RNA,其中至少doNA和gNA彼此共价连接形成融合核糖核酸分子(fuRNA)。
fuRNA分子可以作为RNA分子或作为编码该fuRNA分子的一个或多个表达构建体引入包含靶NA分子的细胞或组合物。
在另一实施方案中,doNA分子和gNA分子可以包含DNA,其中doNA和gNA彼此共价连接形成融合脱氧核糖核酸分子(fuDNA)。
fuDNA分子可以作为DNA分子通过多种方法引入包含靶NA分子的细胞或组合物,该多种方法例如转染、生物射弹、电穿孔、光穿孔(photoporation)、颈须(whisker)、超声处理、纳米抗体或微流体。它还可以用农杆菌作为载体引入,农杆菌能够将T-DNA分子转移入细胞但不能介导该T-DNA分子整合入靶细胞的基因组DNA。T-DNA可以包含fuDNA分子或由其组成。
本发明的另一实施方案是包含与gNA分子共价连接的doNA分子的重组fuNA分子,例如fuRNA或fuDNA分子。
本发明的另一实施方案是包含含有与编码本发明的fuNA分子的DNA分子功能性连接的启动子的表达构建体的载体。
本发明的另一实施方案是包含本发明的fuNA分子和核酸修饰多肽的细胞。
本发明的另一实施方案是载体系统,其包含:
a.包含含有与编码本发明的fuNA分子的DNA分子功能性连接的启动子的表达构建体的第一载体;和
b.编码位点定向核酸修饰多肽的第二载体;和可选的
c.编码支架NA分子的一部分的第三载体。
在优选实施方案中,a.下的载体包含编码含有间隔区NA、支架NA和doNA的fuNA分子的表达构建体。
如果支架NA包含两个分子,且如果a.下的载体编码仅包含支架NA分子的一个分子的融合NA分子而不编码支架NA分子的第二分子,则c.下的载体是必要的,且是本发明的载体系统的部分。
本发明的另一实施方案是用于修饰细胞中靶NA的系统,其包含:
A.包含含有与编码本发明的fuNA分子的DNA分子功能性连接的启动子的表达构建体的第一载体;和
B.编码位点定向核酸修饰多肽的第二载体;和
C.包含靶NA分子的细胞;和可选的
D.编码支架NA分子的一部分的第三载体。
在优选实施方案中,A.下的载体包含编码含有间隔区NA、支架NA和doNA的fuNA分子的表达构建体。如果支架NA包含两个分子,且如果A.下的载体编码仅包含支架NA分子的一个分子的融合NA分子而不编码支架NA分子的第二分子,则D.下的载体是必要的,且是本发明的系统的部分。
本发明的另一实施方案是组合物,其包含:
a.包含含有与编码本发明的fuNA分子的DNA分子功能性连接的启动子的表达构建体的第一载体;和
b.编码位点定向核酸修饰多肽的第二载体;和
c.包含靶NA分子的细胞;和可选的
d.编码支架NA分子的一部分的第三载体。
在优选实施方案中,a.下的载体包含编码含有间隔区NA、支架NA和doNA的fuNA分子的表达构建体。如果支架NA包含两个分子,且如果a.下的载体编码仅包含支架NA分子的一个分子的融合NA分子而不编码支架NA分子的第二分子,则d.下的载体是必要的,且是本发明的组合物的部分。
本发明的载体、本发明的载体系统、本发明的系统和/或本发明的组合物在修饰细胞或组合物中的靶NA分子中的用途也是本发明的实施方案。
定义
应理解,本发明不限于具体方法或流程。还应理解,本文所用术语仅是为了描述具体实施方案的目的,并非旨在限制本发明的范围,本发明的范围仅通过所附权利要求书限制。必须指出,除非文中另有明确说明,本文和所述权利要求书中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此,例如,提到“一个载体”是提到一个或多个载体,包括本领域技术人员已知的其等同物等。本文中用术语“约”来指大致上、粗略地、大约或在…区域。在术语“约”与数字范围结合使用时,它通过在所示数值之上和之下扩展边界来修饰该范围。通常,本文中用术语“约”来修饰所述值之上和之下20%的变异的数值,优选向上或向下(更高或更低)10%。本文所用的词语“或”指具体列表的任意一个成员,也包括该列表成员的任意组合。在本说明书中和以下权利要求中使用时,词语“包含”、“含有”和“包括”旨在指定一个或多个所述特征、整数、成分或步骤的存在,但它们不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、成分、步骤或其组。为了清晰性,本说明书中使用的某些术语定义和使用如下:
供体NA:术语“供体NA”或“doNA”指包含两个各含有与靶NA的两个至少15个连续碱基的不同区域互补的至少15个碱基的同源臂的核酸,其中该两个同源臂直接彼此相邻或由一个或多个附加碱基分隔开。
与同源臂互补的靶NA的两个不同区域可以直接彼此相邻或可以由至多20kb、优选至多10kb、优选至多5kb、更优选至多3kb、更优选至多2.5kb、更优选至多2kb的附加碱基分隔开。
在同源臂包含超过15个碱基的情况下,它可以与靶NA100%互补,或者它可以与靶NA至少75%互补、优选至少80%互补、更优选至少85%互补、更优选至少90%互补、更优选至少95%互补、更优选至少98%互补,其中同源臂包含至少一段与靶NA中相同数目的连续碱基序列100%互补的至少15个碱基的序列,优选同源臂包含至少一段与靶NA中相同数目的连续碱基序列100%互补的至少18个碱基的序列,更优选同源臂包含至少一段与靶NA中相同数目的连续碱基序列100%互补的至少20个碱基的序列,甚至更优选同源臂包含至少一段与靶NA中相同数目的连续碱基序列100%互补的至少25个碱基的序列,甚至更优选同源臂包含至少一段与靶NA中相同数目的连续碱基序列100%互补的至少50个碱基的序列。
同源臂可以具有相同的长度和/或相同的与靶NA的互补程度,或者可以具有不同的长度和/或不同的与靶NA的互补程度。
同源臂可以直接彼此相邻,或者可以由包含至少一个在与同源臂互补的靶核酸的区域之间不存在的碱基的核酸分子分隔开。
间隔区NA:术语“间隔区核酸”或“间隔区NA”指包含与靶核酸100%互补的至少12个碱基的核酸。
在间隔区NA包含超过12个碱基的情况下,它可以与靶核酸至少75%互补,优选至少80%互补,更优选至少85%互补,更优选至少90%互补,更优选至少95%互补,更优选至少98%互补,最优选它与靶NA100%互补,其中间隔区NA包含至少一段与靶NA中相同数目的连续碱基序列100%互补的至少12个碱基的序列,优选间隔区NA包含至少一段与靶NA中相同数目的连续碱基序列100%互补的至少15个碱基的序列,优选间隔区NA包含至少一段与靶NA中相同数目的连续碱基序列100%互补的至少18个碱基的序列,更优选间隔区NA包含至少一段与靶NA中相同数目的连续碱基序列100%互补的至少20个碱基的序列,甚至更优选间隔区NA包含至少一段与靶NA中相同数目的连续碱基序列100%互补的至少25个碱基的序列,甚至更优选间隔区NA包含至少一段与靶NA中相同数目的连续碱基序列100%互补的至少50个碱基的序列。
间隔区NA与支架NA共价连接。如果支架DNA包含两个核酸分子,则间隔区与支架NA的一个分子共价连接。
支架NA:支架核酸或支架NA包含形成含有至少一个发夹、优选至少两个发夹的二级结构的核酸和/或位点定向核酸修饰多肽所结合的序列。这类位点定向核酸修饰多肽为本领域已知,例如在WO/2014/150624、WO/2014/204728中。支架NA进一步包含两个各含有彼此互补的至少8个碱基的区域,因此能够杂交形成双链结构。如果该彼此互补的至少8个碱基的区域包含超过8个碱基,则每个区域包含与另一区域的至少8个碱基互补的至少8个碱基。
支架NA的两个互补区域可以通过形成发夹的接头分子彼此共价连接或可以包含两个独立的核酸分子。
向导NA:向导核酸或向导NA或gNA包含间隔区核酸和支架核酸,其中间隔区NA和支架NA彼此共价连接。在支架NA包含两个分子的情况下,间隔区NA与支架NA的一个分子共价连接,而支架NA分子的另一分子与第一支架NA分子杂交。因此,向导NA分子可以包含一个核酸分子或可以包含两个核酸分子。优选地,向导NA包含一个分子。
融合NA:融合核酸包含供体NA和向导NA,其中向导NA和供体NA彼此共价连接。
位点定向核酸修饰多肽:“位点定向核酸修饰多肽”、“核酸结合位点定向核酸修饰多肽”或“位点定向多肽”指结合核酸并靶向特异性核酸序列的多肽。本文所述位点定向核酸修饰多肽通过该多肽的固有机制或优选通过它所结合核酸分子靶向靶核酸中的特异性核酸序列。该多肽所结合的核酸分子包含与靶核酸内的靶序列互补的序列,从而将所结合的多肽靶向至靶核酸内的特异性位置(靶序列)。
大多数位点定向核酸修饰多肽引入dsDNA断裂,但可将它们修饰为仅具有产生切口活性或可以失活核酸酶活性。位点定向核酸修饰多肽可以结合于其他多肽,该其他多肽具有活性,如荧光或核酸酶活性,如FokI多肽或归巢核酸内切酶多肽如I-SceI的核酸酶活性。
编码区:在用于提及结构基因时,本文所用的术语“编码区”指核苷酸序列,其由于mRNA分子的翻译而编码见于新生多肽中的氨基酸。在真核生物中,编码区在5’侧以编码起始甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”为界,原核生物还用三联体“GTG”和“TTG”作为起始密码子。在3’侧,它以指定终止密码子(即TAA、TAG、TGA)的三种三联体之一为界。此外,基因可以包含存在于RNA转录物上的定位在该序列5’和3’两端的序列。这些序列称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列定位在存在于mRNA转录物上的非翻译序列的5’或3’。5’侧翼区域可以包含调节序列,如控制或影响基因转录的启动子和增强子。3’侧翼区域可以包含指导转录终止、转录后切割和聚腺苷酸化的序列。
互补:“互补”或“互补性”指包含反向平行核苷酸序列的两个核酸序列能够通过在反向平行核苷酸序列中的互补碱基残基之间形成氢键而彼此配对(通过碱基配对规则)。例如,序列5'-AGT-3'与序列5'-ACT-3'互补。“互补性”可以是“部分的”或“总的”。“部分”互补性是其中一个或多个核酸碱基按照碱基配对规则不匹配。核酸分子间的“总”或“完全”互补性是其中各个和每一个核酸碱基在碱基配对规则下与另一碱基匹配。核酸分子链间的互补性程度对核酸分子链间杂交的效率和强度具有显著影响。本文所用的核酸序列的“互补序列”指这样的核苷酸序列,其核酸分子显示与该核酸序列的核酸分子完全互补。
内源的:“内源”核苷酸序列指存在于野生型微生物基因组中的核苷酸序列。
增强的表达:“增强”或“提高”核酸分子在微生物中的表达在本文中同等地使用,指与参考微生物例如野生型相比,核酸分子在微生物中的表达水平更高。本文所用的术语“增强的”或“提高的”在本文中指更高、优选显著更高的待表达的核酸分子的表达。如本文所使用,物质(agent)如蛋白质、mRNA或RNA的水平的“增强”或“提高”指该水平相对于在基本相同的条件下培养的基本相同的微生物提高。如本文所使用,物质如由靶基因表达的preRNA、mRNA、rRNA、tRNA和/或由它编码的蛋白质产物的水平的“增强”或“提高”指该水平相对于适宜的参考微生物提高50%或更多,例如100%或更多,优选200%或更多,更优选5倍或更多,甚至更优选10倍或更多,最优选20倍或更多,例如50倍。可以通过技术人员熟悉的方法来测定增强或提高。因此,可以例如通过蛋白质的免疫学检测来测定核酸或蛋白质的量的增强或提高。此外,可以利用诸如蛋白质测定、荧光、Northern杂交、凝胶中核酸浓度的光密度测量、核酸酶保护测定、反转录(定量RT-PCR)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、Western印迹、放射免疫测定(RIA)或其他免疫测定和荧光激活细胞分析(FACS)的技术来测量微生物中的具体蛋白质或RNA。取决于所诱导的蛋白质产物的类型,还可以测定其活性或对微生物表型的影响。用于测定蛋白质的量的方法为技术人员已知。可以提到的实例是:micro-Biuret法(Goa J(1953)Scand J Clin Lab Invest 5:218-222)、Folin-Ciocalteau法(Lowry OH等(1951)J Biol Chem 193:265-275)或测量CBB G-250吸光度(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72:248-254)。
表达:“表达”指基因产物的生物合成,优选指细胞中核苷酸序列(例如内源基因或异源基因)的转录和/或翻译。例如,在结构基因的情况下,表达涉及结构基因转录为mRNA,及可选地,随后mRNA翻译为一条或多条多肽。在其他情况下,表达可仅指含有RNA分子的DNA转录。
外来的:术语“外来的”指任何核酸分子(例如基因序列),其通过实验操作引入细胞,且可以包含见于该细胞中的序列,只要所引入的序列包含某种修饰(例如点突变、存在选择标记基因等)并因此相对于天然存在的序列不同。
功能性片段:术语“功能性片段”指任何核酸和/或蛋白质,其仅包含本发明的全长核酸和/或全长多肽的一部分,但仍提供相同的功能,即AAT酶催化丙烯酰-CoA和丁醇反应生成n-BA和CoA的功能。优选地,该片段包含它所衍生自的序列的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%。优选地,该功能性片段包含该功能性片段所衍生自的核酸和/或蛋白质的连续核酸或氨基酸。核酸分子的编码蛋白质的功能性片段指该核酸分子的编码蛋白质功能性片段的片段。
功能性连接:术语“功能性连接”或“功能性连接的”等同于术语“有效连接”或“有效连接的”,理解为意指例如调节元件(例如启动子)与待表达的核酸序列和(如果适当)其他调节元件(如终止子)以这样的方式顺次排列,使得各调节元件可以执行其预期功能,以允许、改变、便于或以其他方式影响该核酸序列的表达。作为同义词,可以使用词语“有效连接”或“有效连接的”。取决于核酸序列相对于有义或反义RNA的排列,可产生表达。为此,并非必然需要化学意义上的直接连接。遗传控制序列例如增强子序列可以从相隔更远的位置或甚至从其他DNA分子发挥其对靶序列的功能。优选的排列是这样,其中待重组表达的核酸序列放置在作为启动子发挥作用的序列之后,使得两个序列彼此共价连接。在优选实施方案中,待转录的核酸序列以这样的方式定位在启动子之后,使得转录起点与所希望的本发明的嵌合RNA的起点相同。可以借助(例如Sambrook J,Fritsch EF和Maniatis T(1989);Silhavy等(1984)Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(NY);Ausubel等(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience;Gelvin等(编辑)(1990)PlantMolecular Biology Manual;Kluwer Academic Publisher,Dordrecht,荷兰)所述的常规重组和克隆技术来产生功能性连接和表达构建体。但是,也可以在两个序列之间放置其他例如作为具有限制酶特异性切割位点的接头或作为信号肽发挥作用的序列。序列的插入也可以导致融合蛋白的表达。优选地,包含调节区例如启动子和待表达的核酸序列的连接的表达构建体可以以载体整合形式存在或可以例如通过转化插入基因组。
基因:术语“基因”指与能够以某种方式调节基因产物(例如多肽或功能性RNA)的表达的适当调节序列有效连接的区域。基因包括编码区(可读框,ORF)之前(上游)和之后(下游)的非翻译调节区DNA(例如启动子、增强子、阻抑物等)。本文所用的术语“结构基因”旨在指这样的DNA序列,其转录为mRNA,然后该mRNA翻译为具体多肽的特征性氨基酸序列。
基因组和基因组DNA:术语“基因组”或“基因组DNA”指宿主生物的可遗传的遗传信息。该基因组DNA包含髓核的DNA以及自我复制质粒的DNA。
异源的:关于核酸分子或DNA的术语“异源的”是指与第二核酸分子有效连接或经操作变得有效连接的核酸分子,该第二核酸分子在自然界中不与其有效连接,或在自然界中在不同位置与其有效连接。包含核酸分子和一个或多个与之连接的调节核酸分子(如启动子或转录终止信号)的异源表达构建体例如是通过实验操作产生的构建体,其中a)该核酸分子或b)该调节核酸分子或c)二者(即(a)和(b))不定位在其自然(天然)遗传环境中或已通过实验操作进行修饰,修饰的实例是取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基。天然遗传环境指来源生物中的天然基因组基因座,或指存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下,该核酸分子的序列的天然遗传环境优选至少部分保留。该环境至少在一侧处于该核苷酸序列侧翼,且具有长度为至少50bp、优选至少500bp、尤其优选至少1000bp、极其优选至少5000bp的序列。在通过非天然、合成“人工”方法(例如诱变)修饰它时,天然存在的表达构建体(例如启动子与相应基因的天然存在的组合)变为转基因表达构建体。已描述了这类方法(US 5,565,350;WO 00/15815)。例如,认为与不是此分子的天然启动子的启动子有效连接的蛋白质编码核酸分子对该启动子而言是异源的。优选地,异源DNA对它所引入的细胞而言不是内源的或并非与它所引入的细胞天然相关,而是获自另一细胞或是合成的。异源DNA还包括含有某种修饰的内源DNA序列、非天然存在的多拷贝的内源DNA序列、或并非与与之物理连接的另一DNA序列天然相关的DNA序列。通常,虽然并非必然,但异源DNA编码它在其中表达的细胞正常情况下不产生的RNA或蛋白质。
杂交:本文所用的术语“杂交”包括“核酸分子的链通过碱基配对与互补链结合(join with)的任何过程”(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology,StocktonPress,New York)。杂交和杂交的强度(即核酸分子间结合的强度)受诸如核酸分子间的互补性程度、所涉及的条件的严格性、所形成的杂合体的Tm和核酸分子内的G:C比的因素影响。如本文所使用,术语“Tm”用于提及“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群体一半解离为单链的温度。计算核酸分子Tm的方程为本领域公知。如标准参考文献所示,在核酸分子处于1M NaCl的水溶液中时,可通过以下方程计算Tm值的简单估计:Tm=81.5+0.41(%G+C)[参见例如Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridization,in Nucleic AcidHybridization(1985)]。其他参考文献包括更复杂的计算,其对Tm的计算考虑了结构以及序列特征。严格条件为本领域技术人员已知,可见于Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。
适宜的杂交条件是例如在等同于在50℃下在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA中杂交,在50℃下在2X SSC、0.1%SDS中洗涤(低严格性)的条件下与包含序列的互补序列的至少50、优选至少100、更优选至少150、甚至更优选至少200、最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交。其他适宜的杂交条件是在50℃下在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交,在50℃(中等严格性)或65℃(高严格性)下在1X SSC、0.1%SDS中洗涤,与包含序列的互补序列的至少50、优选至少100、更优选至少150、甚至更优选至少200、最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交。其他适宜的杂交条件是在50℃下在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交,在65℃下在0.1X SSC、0.1%SDS中洗涤(极高严格性),与包含序列的互补序列的至少50、优选至少100、更优选至少150、甚至更优选至少200、最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交。
“同一性”:在用于两个或多个核酸或氨基酸分子的比较时,“同一性”指该分子的序列具有某种程度的序列相似性,序列部分相同。
为了测定两个或多个氨基酸或两个或多个核苷酸序列的百分比同一性,开发了若干计算机软件程序。可以用例如fasta软件计算两个或多个序列的同一性,该软件目前已用于版本fasta 3(W.R.Pearson和D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988);W.R.Pearson,Methodsin Enzymology183,63(1990);W.R.Pearson和D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988);W.R.Pearson,Enzymology 183,63(1990))。用于计算不同序列的同一性的另一有用的程序是标准blast程序,其包括在Biomax pedant软件(Biomax,Munich,德意志联邦共和国)。这有时不幸地产生次优结果,因为blast并非总是包括完整的目标序列和查询序列。然而,由于此程序非常有效,可以用它来进行大量序列的比较。以下设定通常用于这类序列比较:
-p程序名称[字符串];-d数据库[字符串];默认=nr;-i查询文件[文件输入];默认=stdin;-e期望值(E)[实际];默认=10.0;-m比对视图选项:0=配对;1=查询-比上区域(query-anchored),显示同一性;2=查询-比上区域,不显示同一性;3=查询-比上区域的屏文形式,显示同一性;4=查询-比上区域的屏文形式,不显示同一性;5=查询-比上区域,不显示同一性,无突然结束;6=查询-比上区域的屏文形式,不显示同一性,无突然结束;7=XML Blast输出;8=表格;9带注释行的表格[整数];默认=0;-o BLAST报告输出文件[文件输出]可选;默认=stdout;-F过滤查询序列(blastn用DUST,其他用SEG)[字符串];默认=T;-G空位开放罚分(0调用默认行为)[整数];默认=0;-E空位扩展罚分(0调用默认行为)[整数];默认=0;-X空位比对的X下拉值(比特)(0调用默认行为);blastn 30,megablast 20,tblastx 0,所有其他15[整数];默认=0;-I提示行中显示GI[T/F];默认=F;-q核苷酸错配罚分(仅blastn)[整数];默认=-3;-r核苷酸匹配加分(仅blastn)[整数];默认=1;-v(V)的整行描述显示的数据库序列数[整数];默认=500;-b(B)的比对显示的数据库序列数[整数];默认=250;-f延伸匹配阈值,0为默认;blastp 11,blastn 0,blastx12,tblastn 13;tblastx 13,megablast 0[整数];默认=0;-g执行空位比对(tblastx不可用)[T/F];默认=T;-Q所使用的查询遗传密码[整数];默认=1;-D DB遗传密码(仅用于tblast[nx])[整数];默认=1;-a使用的处理器数目[整数];默认=1;-O SeqAlign文件[文件输出]可选;-J相信查询提示行[T/F];默认=F;-M矩阵[字符串];默认=BLOSUM62;-W字长,0为默认(blastn 11,megablast 28,所有其他3)[整数];默认=0;-z数据库有效长度(实际大小用0)[实际];默认=0;-K一个区域需保留的最佳匹配数(默认关闭,如果使用,建议使用100的值)[整数];默认=0;-P 0为多字长匹配,1为单字长匹配[整数];默认=0;-Y搜索空间有效长度(实际大小用0)[实际];默认=0;-S搜索数据库的查询链(用于blast[nx]和tblastx);3为二者,1为输入序列,2为反向互补序列[整数];默认=3;-T产生HTML输出[T/F];默认=F;-l数据库搜索限于GI列表[字符串]可选;-U使用FASTA序列的小写字母过滤[T/F]可选;默认=F;-y以比特表示的非空位延伸X下拉值(0.0调用默认行为);blastn20,megablast 10,所有其他7[实际];默认=0.0;-Z以比特表示的最终空位比对的X下拉值(0.0调用默认行为);blastn/megablast 50,tblastx 0,所有其他25[整数];默认=0;-RPSI-TBLASTN检验点文件[文件输入]可选;-n MegaBlast搜索[T/F];默认=F;-L查询序列上的位置[字符串]可选;-A多字长匹配窗口大小,0为默认(blastn/megablast 0,所有其他40[整数];默认=0;-w移码罚分(blastx的OOF算法)[整数];默认=0;-t tblastn中连接HSP允许的最大内含子长度(0停用连接)[整数];默认=0。
通过使用Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法达到高质量结果。因此,优选基于该算法的程序。有利地,可以用程序PileUp(J.Mol.Evolution.,25,351(1987),Higgins等,CABIOS 5,151(1989))或优选用程序“Gap”和“Needle”(二者都基于Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48;443(1970)的算法)及“BestFit”(基于Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2;482(1981)的算法)进行序列的比较。“Gap”和“BestFit”是GCG软件包(Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991);Altschul等,(Nucleic Acids Res.25,3389(1997))的一部分,“Needle”是欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS)(Trends in Genetics16(6),276(2000))的一部分。因此,优选地,用程序“Gap”或“Needle”在整个序列范围内进行测定序列同一性百分比的计算。将以下核酸序列比较标准调整用于“Needle”:矩阵:EDNAFULL,空位罚分:10.0,延伸罚分:0.5。将以下核酸序列比较标准调整用于“Gap”:空位权重:50,长度权重:3,平均匹配:10.000,平均错配:0.000。
例如,将称之为在核酸水平与序列SEQ ID NO:1具有80%同一性的序列理解为指这样的序列,在按以上参数设置通过以上程序“Needle”与SEQ ID NO:1所代表的序列比较时,该序列具有80%同一性。优选地,基于查询序列例如SEQ ID NO:1的全长计算该同一性。
分离的:本文所用的术语“分离的”指物质已人为取出,远离其最初的天然环境存在,因此不是自然的产物。分离的物质或分子(如DNA分子或酶)可以以纯化的形式存在,或者可以存在于非天然环境中,例如转基因宿主细胞中。例如,存在于活细胞中的天然存在的核酸分子或多肽不是分离的,但从天然系统中的一些或全部共存物质分开的同一核酸分子或多肽是分离的。这类核酸分子可以是载体的一部分和/或这类核酸分子或多肽可以是组合物的一部分,且可以是分离的,因为这种载体或组合物不是其最初环境的一部分。优选地,术语“分离的”当用于核酸分子时,如“分离的核酸序列”是指从其天然来源中,与其通常相关的至少一种污染核酸分子中鉴定和分离的核酸序列。分离的核酸分子是以不同于它见于自然界中的形式或环境存在的核酸分子。相反,非分离的核酸分子是以它们存在于自然界中的状态出现的核酸分子,如DNA和RNA。例如,给定的DNA序列(例如基因)靠近邻近基因见于宿主细胞染色体上;RNA序列(如编码具体蛋白质的具体mRNA序列)作为与编码多种蛋白质的许多其他mRNA的混合物见于细胞中。但是,包含例如SEQ ID NO:1的分离的核酸序列作为实例包括细胞中的通常含有SEQ ID NO:1的这类核酸序列,其中该核酸序列处在不同于天然细胞的位置的基因组或质粒位置中,或者侧翼为不同于见于自然界中的核酸序列的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。在用分离的核酸序列来表达蛋白质时,该核酸序列至少将包含有义链或编码链的至少一部分(即该核酸序列可以是单链)。备选地,它可以包含有义链和反义链二者(即该核酸序列可以是双链)。
非编码的:术语“非编码的”指核酸分子的不编码所表达的蛋白质的部分或全部的序列。非编码序列包括但不限于增强子、启动子区、3’非翻译区和5’非翻译区。
核酸和核苷酸:术语“核酸”和“核苷酸”指天然存在或合成或人工的核酸或核苷酸。术语“核酸”和“核苷酸”包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或任何核苷酸类似物及其单链或双链、有义或反义形式的聚合物或杂合体。除非另有说明,具体的核酸序列还暗含其保守修饰变体(例如简并密码子取代)和互补序列,以及明确指出的序列。术语“核酸”在本文中可与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“核酸分子”互换使用。核苷酸类似物包括具有碱基、糖和/或磷酸的化学结构中的修饰(包括但不限于5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、胞嘧啶外环胺修饰、5-溴-尿嘧啶取代等)及2’-位糖修饰(包括但不限于糖修饰的核糖核苷酸,其中选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代2'-OH)的核苷酸。短发夹RNA(shRNA)还可以包含非天然元件,如非天然碱基,例如肌苷和黄嘌呤,非天然糖,例如2’-甲氧核糖,或非天然磷酸二酯键,例如甲基磷酸酯、硫代磷酸酯和肽。
核酸序列:短语“核酸序列”指从5’至3’端读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。它包括染色体DNA、自我复制质粒、DNA或RNA的聚合物和发挥初步结构作用的DNA或RNA。“核酸序列”还指代表核苷酸的缩写、字母、字符或词语的连续罗列。在一个实施方案中,核酸可以是“探针”,探针是相对短的核酸,长度通常小于100个核苷酸。通常,核酸探针从长度约50个核苷酸至长度约10个核苷酸。核酸的“靶区域”是核酸的鉴定为具有意义的部分。核酸的“编码区”是核酸的部分,在放置在适当的调节序列控制下时,其以序列特异的方式转录和翻译来产生具体的多肽或蛋白质。称该编码区编码这种多肽或蛋白质。
寡核苷酸:术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或多聚物,以及具有相似地发挥功能的非天然存在的部分的寡核苷酸。这类修饰或取代的寡核苷酸常由于希望得到的特性(例如细胞摄取增强、对核酸靶标的亲和力增强和核酸酶存在下的稳定性提高)而比天然形式更优选。寡核苷酸优选包含通过连接(例如磷酸二酯)或取代连接彼此共价偶联的两个或多个核单体(nucleomonomer)。
突出端:“突出端”是双链寡核苷酸分子的5’-或3’-羟基端的相对短的单链核苷酸序列(也称为“延伸”、“凸起端”或“黏端”)。
多肽:术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在本文中可互换使用,指连续氨基酸残基的多聚物或寡聚物。
启动子:术语“启动子”或“启动子序列”是等同术语,如本文中所使用,指在与目的核苷酸序列有效连接时能够控制该目的核苷酸序列转录为RNA的DNA序列。启动子定位在5’(即上游),靠近它控制其转录为mRNA的目的核苷酸序列的转录起始位点,为起始转录的RNA聚合酶和其他转录因子的特异性结合的提供位点。启动子不包含编码区或5’非翻译区。启动子对各细胞而言可以是例如异源的或同源的。如果核酸分子序列源自外来物种,或如果源自同一物种但从其原始形式修改,则它对生物或第二核酸分子序列而言是“异源的”。例如,启动子与异源编码序列有效连接指编码序列来自不同于启动子所衍生自的物种的物种,或者如果来自同一物种,则编码序列并非与启动子天然相关(例如遗传改造的编码序列或来自不同生态型或变种的等位基因)。适宜的启动子可以源自其中应发生表达的宿主细胞的基因或源自此宿主的病原体。
纯化的:本文所用的术语“纯化的”指从其天然环境取出、分离或分开的分子(核酸或氨基酸序列)。“基本纯化的”分子是至少60%游离、优选至少75%游离和更优选至少90%游离于它们天然与之结合的其他成分。纯化的核酸序列可以是分离的核酸序列。
显著提高:例如酶活性、基因表达、某种产物的生产力或产率的大于测量技术固有误差幅度的提高,优选对照酶的活性、表达、生产力或产率或对照细胞中的表达、对照细胞的生产力或产率提高约10%或25%、优选50%或75%、更优选2倍或5倍或更多,甚至更优选提高约10倍或更多。
显著降低:例如酶活性、基因表达、某种产物的生产力或产率的大于测量技术固有误差幅度的降低,优选降低至少约5%或10%、优选至少约20%或25%、更优选至少约50%或75%、甚至更优选至少约80%或85%、最优选至少约90%、95%、97%、98%或99%。
基本互补:在其最广泛的含义上,在本文中与参考或靶核苷酸序列关联用于核苷酸序列时,术语“基本互补”指在该基本互补的核苷酸序列和该参考或靶核苷酸序列的精确互补的序列之间具有至少60%、更希望至少70%、更希望至少80%或85%、优选至少90%、更优选至少93%、还更优选至少95%或96%、还更优选至少97%或98%、还更优选至少99%或最优选100%(在此背景中,后者等同于术语“同一的”)的百分比同一性的核苷酸序列。优选地,在该参考序列的至少19个核苷酸、优选至少50个核苷酸、更优选全长的长度内评估同一性(如果下文未以其他方式指定)。用基于Needleman和Wunsch(Needleman和Wunsch(1970)J Mol.Biol.48:443-453;如上文所定义)算法的威斯康星大学GCG,SEQWEB应用GAP的默认GAP分析进行序列比较。与参考序列“基本互补”的核苷酸序列在低严格性条件、优选中等严格性条件、最优选高严格性条件(如上文所定义)下与参考核苷酸序列杂交。
转基因:本文所用的术语“转基因”指通过实验操作引入细胞基因组的任何核酸序列。转基因可以是“内源DNA序列”或“异源DNA序列”(即“外来DNA”)。术语“内源DNA序列”指天然见于它所引入的细胞中的核苷酸序列,只有它相对于天然存在的序列不包含某种修饰(例如点突变、存在选择标记基因等)。
转基因的:在提到生物时,术语“转基因的”指用至少一个重组核酸分子转化、优选稳定转化。
载体:本文所用的术语“载体”指能够转运与之连接的另一核酸分子的核酸分子。一类载体是基因组整合载体,或“整合载体”,其可以整合入宿主细胞的基因组DNA。另一类载体是附加型载体,即能够染色体外复制的质粒或核酸分子。能够指导与之有效连接的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。在本说明书中,除非文中另有明确说明,“质粒”和“载体”可互换使用。
野生型:对于生物,术语“野生型”、“天然的”或“天然来源”指该生物未人为改变、突变或以其他方式操作。对于多肽或核酸序列,指该多肽或核酸序列是天然存在的或可在未人为改变、突变或以其他方式操作的至少一种天然存在的生物中获得。
野生型微生物指这样的微生物,该微生物的基因组以引入某基因的遗传修饰之前的状态存在。遗传修饰可以是例如缺失基因或其部分或点突变或引入基因。
术语“生产”或“生产力”为本领域公知,包括在给定时间和给定发酵体积内形成的发酵产物(例如dsRNA)的浓度(例如千克产物/小时/升)。术语“生产效率”包括达到特定水平的生产所需的时间(例如细胞达到最终化学产品的特定输出速率所耗费的时间)。
术语“产率”或“产物/碳产率”为本领域公知,包括碳源转化为产物(例如精细化学产品)的效率。这通常书写为例如千克产物/千克碳源。通过提高化合物的产率或生产,在给定量的时间内在给定量的培养物中回收的分子或回收的该化合物的有用分子的量提高。
术语“重组微生物”包括这样的微生物,该微生物已这样进行遗传修饰,使得它们与衍生它的野生型微生物相比显示改变或不同的基因型和/或表型(例如,在该遗传修饰影响该微生物的编码核酸序列时)。重组微生物包含至少一个重组核酸分子。
对于核酸分子,术语“重组的”指用重组核酸技术人为产生的核酸分子。该术语包括这样的核酸分子,该核酸分子不这样存在于自然界中或不存在于该核酸分子所衍生自的生物中,而是人为修饰、改变、突变或以其他方式操作。优选地,“重组核酸分子”是因至少一个核酸而在序列上不同于天然存在的核酸分子的非天然存在的核酸分子。“重组核酸分子”还可以包含“重组构建体”,其包含(优选有效连接)不以该顺序天然存在的核酸分子序列。用于产生该重组核酸分子的优选方法可以包括克隆技术、定向或非定向诱变、基因合成或重组技术。
这种重组核酸分子的实例是已插入异源DNA序列的质粒或与该重组核酸分子所衍生自的基因或启动子相比已突变的基因或启动子。可以借助本领域已知的定向诱变技术或通过随机诱变技术(如化学、UV或x射线诱变)或定向进化技术引入突变。
术语“定向进化”与术语“代谢进化”在本文中作为同义词使用,涉及应用有利于具有目的性状的突变体生长的选择压力。选择压力可以基于不同培养条件、ATP和生长偶联选择及氧化还原相关选择。可以用伴随系列转移接种的批次发酵或使用相同压力的连续培养实现选择压力。
术语“表达”或“基因表达”指一个或多个具体基因或具体遗传载体构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其指一个或多个基因或遗传载体构建体转录为mRNA。该过程包括DNA的转录,且可以包括所得到的RNA产物的加工。术语“表达”或“基因表达”还可以包括mRNA的翻译和随之发生的所编码的蛋白质的合成,即蛋白质表达。
附图简述
图1至12显示本发明的融合核酸分子的优选结构。通过与供体NA融合的向导NA(其一起形成fuNA分子),使位点定向核酸修饰多肽定位至靶双链核酸内的靶序列。
图1
融合NA分子从5’至3’包含:向导NA(间隔区后跟随支架)及可选地由附加核酸区分隔开的同源臂1和2。
图2
融合NA分子从5’至3’包含:可选地由附加核酸区分隔开的同源臂2和1及向导NA(支架后跟随间隔区)。
图3
融合NA分子从5’至3’包含:向导NA(间隔区后跟随支架)、可选地由附加核酸区分隔开的同源臂2和1。
图4
融合NA分子从5’至3’包含:可选地由附加核酸区分隔开的同源臂1和2及向导NA(支架后跟随间隔区)。
图5
融合NA分子从5’至3’包含:可选地由附加核酸区分隔开的同源臂1和2及向导NA(间隔区后跟随支架)。
图6
融合NA分子从5’至3’包含:向导NA(支架后跟随间隔区)、可选地由附加核酸区分隔开的同源臂1和2。
图7
融合NA分子从5’至3’包含:可选地由附加核酸区分隔开的同源臂2和1及向导NA(间隔区后跟随支架)。
图8
融合NA分子从5’至3’包含:向导NA(支架后跟随间隔区)、可选地由附加核酸区分隔开的同源臂2和1。
图9
融合NA分子从5’至3’包含:向导NA(包含间隔区和支架的第一分子)、可选地由附加核酸区分隔开的同源臂1和2。支架的第二分子与支架的第一分子杂交。
图10
融合NA分子从5’至3’包含:可选地由附加核酸区分隔开的同源臂1和2、向导NA(包含支架的第一分子和间隔区)。支架的第二分子与支架的第一分子杂交。
图11
融合NA分子从5’至3’包含:向导NA(包含间隔区和支架的第一分子)、可选地由附加核酸区分隔开的同源臂2和1。支架的第二分子与支架的第一分子杂交。
图12
融合NA分子从5’至3’包含:可选地由附加核酸区分隔开的同源臂2和1、向导NA(包含支架的第一分子、间隔区和与支架的第一分子杂交的支架的第二分子)。
图13
载体RWL121。
图14
载体Cas003。
图15
载体Cas018。
图16
载体Cas006。
图17
载体RWL137。
图18
载体Cas019。
图19
载体RLW138。
图20
载体Cas020。
图21
载体RLW139。
图22
显示枯草芽孢杆菌ATCC6051菌株(A)的淀粉酶amyE基因座,同源区HomA和HomB的位置如所示。显示amyE基因内的原间隔区序列PS的位置(A),突出显示PS的序列(黑底白字,B)。
图23
显示pCC004质粒(携带amyE原间隔区及邻近amyE基因区域的同源区HomA和HomB)的质粒图谱。PS=原间隔区;PvanP*=半合成启动子;‘gRNA=向导RNA;λT0终止子;PmanP=枯草芽孢杆菌manP基因启动子;Cas9=来自酿脓链球菌(S.pyrogenes)的核酸内切酶;KanR=卡那霉素抗性基因;pUC起点用于大肠埃希氏菌中的复制,pE194起点用于芽孢杆菌中的复制。
图24
显示用于此研究中的多种质粒(如图2中用质粒pCC004所示例)的EcoRI/XbaI片段的示意图。未显示Cas9核酸内切酶、PmanP启动子,和具有pUC复制起点、pE194复制起点、卡那霉素抗性基因的载体骨架。显示驱动下游遗传元件转录的启动子(Pro)。PS=原间隔区;gRNA=含有crRNA-环-tracrRNA的向导RNA;T=λT0终止子;同源区A和同源区B显示为指示amyE基因方向的箭头。J.Altenbuchner(Altenbuchner J.2016.Editing of the Bacillussubtilis genome by the CRISPR-Cas9system.Appl Environ Microbiol 82:5421–5)的质粒遗传元件详述。
图25
将各基因删除构建体(pJOE8999、pCC005-pCC008)相对于pCC004的如淀粉酶基因所示例的基因敲除效率对所示删除构建体作图。
图26
显示用寡核苷酸Seq ID NO:60和61对来自所示质粒pCC004、pCC005、pCC006、pCC007、pCC008的基因删除反应的13个单克隆的基因组DNA进行的PCR反应的0.8%琼脂糖凝胶。1.4kb DNA片段的扩增指示重组基因敲除,而3.4kb的DNA片段指示通过SOS修复机制达到淀粉酶基因失活。WT的3.4kb条带指示枯草芽孢杆菌WT ATCC6051的野生型淀粉酶基因座。C表示未加入基因座DNA的水对照。M表示DNA梯‘Perfect plus 1kb DNAladder’(roboklon),显示三条带的大小(1.0kb、1.5kb、4.0kb)。
实施例
化学品和常用方法
除非另有说明,为本发明的目的而进行的克隆方法,包括限制消化、琼脂糖凝胶电泳、核酸纯化、核酸连接、转化、细菌细胞的选择和培养,按(Sambrook J,Fritsch EF和Maniatis T(1989))所述进行。重组DNA的序列分析用使用Sanger技术(Sanger等,1977)的激光荧光DNA测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)进行。除非另有说明,化学品和试剂购自Sigma Aldrich(Sigma Aldrich,St.Louis,USA)、Promega(Madison,WI,USA)、Duchefa(Haarlem,荷兰)或Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。限制性核酸内切酶购自New England Biolabs(Ipswich,MA,USA)或Roche Diagnostics GmbH(Penzberg,德国)。寡核苷酸由Eurofins MWGOperon(Ebersberg,德国)合成。
实验方法介绍
合成具有C端SV40核定位信号的Cas9蛋白质的酵母密码子优化形式(SEQ ID NO:1),并克隆入酵母表达载体。同一载体包含一个或多个从酿酒酵母SNR52聚合酶III启动子表达的向导RNA(gRNA)。
在通过gRNA识别靶序列时,Cas9结合DNA并切割两条链,但除非3’端存在正确的原间隔区邻近基序(PAM)。理论上,可以靶向GN20GG形式的任何序列。因此,构建了第二载体来在酵母中共表达待通过所设计的CRISPR系统靶向的报道系统(GAL4-UAS(SEQ ID NO:7))。用gRNA-供体融合(融合NA)来靶向和修复若干非功能性Gal4靶标(SEQ ID NO:9-15)。
Gal4(SEQ ID NO:8)是包含两种成分的酵母转录激活物:位于N端的DNA结合结构域和C端的转录激活区。Gal4结合酵母基因组中标记基因的特异性识别序列UAS(上游激活序列),激活其转录。MaV203酵母菌株包含稳定整合在酵母基因组中不同基因座的三个报道基因(HIS3、URA3和lacZ)中每一个的单个拷贝。URA3、HIS3和lacZ的启动子区不相关(除存在GAL4结合位点外)。
合成Gal4的若干非功能性(删除和/或通过插入终止密码子破坏)形式(SEQ IDNO:9-15),并转化入酵母细胞,使得可以通过共表达的CRISPR机器来靶向和修复它们。通过同源重组(HR)用随CRISPR成分提供的适当修复供体序列恢复全长Gal4,导致lacZ和HIS3报道基因激活。Gal4基因修复和随后的转录激活可以通过细胞在缺乏组氨酸的平板上的生长来监测,而lacZ基因的诱导在用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳吡喃糖苷)测定时产生蓝色。
所利用的酵母菌株包含两个附加的营养缺陷突变(leu2和trp1),以允许针对两个表达构建体进行选择。
为了验证本文公开的融合系统的修复效率提高,所有实验都与其中供体和向导RNA分开转录的非融合盒平行进行。
酵母菌株、培养基和培养条件
用于所述实施例中的酿酒酵母菌株是由Life Technologies商业化的MaV203(MATα,leu2-3,112,trp1-901,his3Δ200,ade2-101,gal4Δ,gal80Δ,SPAL10::URA3,GAL1::lacZ,HIS3UAS GAL1::HIS3@LYS2,can1R,cyh2R)。将酵母培养在补充了2%葡萄糖和缺乏适当营养缺陷化合物的基于Yeast Nitrogen Base的合成基础培养基(SD培养基)(ForMedium,英国)中。培养物在摇瓶或孵箱中30℃培养。
对于在我们的实验中使用的所有质粒,以及对于修饰靶标的进一步繁殖和维持,用大肠埃希氏菌作为繁殖微生物。大肠埃希氏菌按标准微生物学实践(MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版,卷1、2和3.J.F.Sambrook和D.W.Russell编辑,ColdSpring Harbor Laboratory Press,2001)培养。含有Cas9、向导RNA和供体NA的质粒包含用于在大肠埃希氏菌中复制和维持的基于pUC的复制起点和氨苄青霉素抗性基因。而GAL4靶标质粒包含庆大霉素抗性基因(Gmr)。
实施例1.质粒构建
Cas9基因是最初构建用于在真核细胞中表达的酵母密码子优化形式的酿脓链球菌Cas9(SpCas9;WO2007/025097)(Mali等(2013)Science339(6121);Cong等(2013)Science339(6121))。在两端都用SV40核定位信号标记此Cas9基因并合成。另外,合成用于体内RNA合成的含有SNR52启动子的gRNA和供体表达盒。
通过无缝克隆(Life Technologies)用合成的Cas9替换pDEST22(LifeTechnologies)中的GAL4-AD编码序列。此载体包含用于在酵母中表达的酵母醇脱氢酶基因(ADH1)的组成型中等强度启动子和转录终止子,以及用于在缺乏色氨酸的培养基上选择酵母的TRP1基因。
同一载体包含两个重组位点attR1和attR2,侧翼为氯霉素抗性基因(Cmr)和ccdB基因,允许通过Gateway Cloning(Life Technologies)将所设计的gRNA和供体表达盒(作为融合或双分子)引入同一表达载体。LR重组反应后,融合NA盒或非融合供体和向导表达盒替换Cmr和ccdB基因。
合成用作酵母中CRISPR修复靶标的经修饰的GAL4编码序列。用HindIII和SacII切割用于酵母中表达的pDEST32质粒(Life Technologies),凝胶纯化包含ADH1启动子和终止子的骨架。用无缝克隆将GAL4合成插入片段组装入载体。此载体包含用于在缺乏色氨酸的培养基上选择酵母的LEU2基因。
根据经验通过选择GAL4基因内潜在PAM(NGG)序列前的20聚体区来选择GAL4序列中的Cas9识别靶位点(Sternberg等(2014);Nature507(7490))。
为了便于Cas9结合和R环形成,我们选择了最初由Jinek等(2012)Science;337(6096)设计的具有包含悬垂间隔区(dangling spacer)、延长的发夹区和长3’端的二级结构的单向导RNA设计。
实施例2.酵母转化
按照厂家流程(Life Technologies)中所述通过热激来进行CRISPR编辑工具(Cas9酶和融合NA表达盒)和GAL4靶质粒的同时转化,并在缺乏由所引入的质粒补充的营养缺陷化合物(亮氨酸和色氨酸)的适当的合成完全(SC)培养基中繁殖。使转化细胞过夜繁殖,并将等量转化体(根据OD测量结果)转移至包含含有100mM 3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT;ForMedium,UK)的缺乏组氨酸的合成完全(SC)培养基的固体平板。HIS3的表达(允许酵母在不含组氨酸的培养基中生长)依赖于GAL4,因此转化体只有在已发生GAL4修复时能够生长。此外,3-AT是HIS3基因产物的竞争性抑制剂,通过将3-AT加至依赖于HIS3来产生组氨酸的酵母转化体,为了酵母细胞存活,需要高水平的HIS3表达。
此外,所使用的酵母菌株包含GAL4控制下的lacZ标记基因,其允许进行GAL4修复转化体的蓝/白选择。lacZ基因的诱导在用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳吡喃糖苷)测定是产生蓝色。
实施例3.X-gal测定
将在缺乏组氨酸的平板中生长的转化体复制接种至放置在含YPAD培养基(含蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖的均质混合物的复合酵母培养基;ForMedium,UK)的平板表面的硝酸纤维素膜(Hybond,GE Healthcare)上。孵育包含膜的YPAD平板18-24小时后进行测定。对于每张膜,将5mg X-gal溶解在50μl DMF中,并与30μl 2-巯基乙醇和5ml Z缓冲液组合。用此溶液饱和15cm培养皿中的两张圆滤纸(Whatman 541)。用钳子小心地从YPAD平板表面取下膜,完全浸入液氮中约20秒。将冷冻的膜放置在经浸泡的Whatman滤纸上(菌落侧向上)。盖紧平板,并在37℃孵育。24小时后监测蓝色外观。
实施例4.靶(CRISPR修复)质粒的测序
对于每个实验,在液体培养基中过夜培养至少8个GAL4修复阳性转化体(能够在不含组氨酸的培养基中生长的菌落),并分离含有GAL4的质粒(使用Zymoprep Yeast PlasmidMiniprep II,Zymo Research)。将所分离的质粒引入大肠埃希氏菌进行进一步繁殖和商业化测序。GAL4测序允许验证序列修复和与供体分子的组装。
阳性克隆中Gal4基因的Sanger测序进一步验证了此靶向过程的序列特异性,并显示作为融合或非融合表达供体和gRNA的细胞的修复无差异,甚至用融合NA转化的细胞显示数目高得多的成功HR事件。
实施例5.用15bp同源臂删除1nt
供体(供体1;SEQ ID NO:26)与向导RNA的融合产生修复转化体(能够在缺乏组氨酸的培养基上生长),而未观察到非融合向导和供体RNA的转化体生长。低效率的基因修复与可用于同源重组的序列重叠减少相一致。
实施例6.用50bp同源臂删除1nt
供体(供体2;SEQ ID NO:27)与向导RNA的融合产生比非融合供体和向导NA多至少50倍的转化体。
阳性克隆中Gal4基因的测序显示,修复结果仅或很大程度上来自HR(所有测序的克隆均没有NHEJ迹象)。
实施例7.用50/26bp同源臂插入20nt
用与以上相同的融合NA来修复其中去除了20nt的相似靶标(靶标3;SEQ ID NO:11),因此缩短一个同源臂。融合产生比非融合供体和向导NA多约5倍的转化体。阳性克隆中Gal4基因的测序显示,修复结果专一性来自同源重组。
实施例8.用50bp同源臂插入缺失的400bp(同时测试相隔3nt的两个靶序列)
我们独立地和一起地(多重靶向)测试了同时靶向位置紧密靠近(两个20nt靶标之间有3nt缺口)的两个序列(间隔区2和间隔区3;SEQ ID NO:20和21)。多重融合盒包含启动子,启动子后跟随两个串联融合NA序列,导致产生由两个gRNA和修复模板组成的单个分子。我们的实验清楚地显示,融合NA也适于同时靶向两个序列。
对于两个靶标,供体-向导融合存在下的修复在很大程度上比非融合形式更有效(间隔区2靶向高至多10倍,间隔区3高5倍)。
实施例9.用120bp同源臂插入除HR端的全长GAL4基因(960bp)
为了测试融合CRISPR对引入全长编码序列是否有效,我们测试了引入全长GAL4基因(SEQ ID NO:7)。作为实例,我们选择了120bp同源臂,以保持在实施例4中已发现有效的供体/同源臂长度比值。融合构建体的插入全长GAL4基因更有效约4倍。
我们的结果显示,在使修复供体序列与gRNA融合时,靶向编辑更有效至少50倍。所进行的实验从单碱基去除至全基因插入显示广泛的融合相关的效率改善。所报道的实例显示,此CRISPR融合系统适于携带与向导RNA融合的相对大的供体分子。
实施例10a.用于稻中表达的构建体
为了使CRISPR/Cas系统适应农杆菌介导的植物转化,设计了Gateway二元T-DNA载体用于共表达Cas9核酸酶和向导RNA-供体表达盒(作为单个或两个RNA分子)。合成在两端附着SV40核定位信号(NLS)的针对稻(Oryza sativa)中表达进行了密码子优化的酿脓链球菌Cas9(SpCas9)形式。所合成的盒包含定位在Cas9上游的用于组成性表达的玉米多聚遍在蛋白(Ubi)启动子(Seq ID NO:32),及3’端胭脂碱合酶(nos)终止子(Seq ID NO:33)。经无缝克隆将此基因盒克隆入载体,该载体在T-DNA边界内包含以下作为功能性元件:植物选择标记;筛选标记表达盒;预期用于与入门克隆(entry clone)中的gRNA-供体表达盒的LR重组的Gateway盒。
设计了三个gRNA,其靶向稻原卟啉原氧化酶(PPO)基因(WO/2015/092706;WO/2015/022640(Seq ID NO:35),在所选择的靶位点处产生基因组双链切割(间隔区8、间隔区9和间隔区10(Seq ID NO:36、37和38))。修饰指向之前已鉴定为苯嘧磺草胺(Saflufenacil)存活的潜在热点的两个氨基酸取代(L419F、F442V;单位点突变和双位点突变)。
合成包含融合或非融合NA的RNA表达盒(包括所选择的PPO基因中的位置的基因特异性间隔区序列),并克隆入入门载体(entry vector),将该入门载体克隆(经Gateway)入含有CAS9表达盒的目的载体。gRNA和供体的RNA表达由U3snRNA的pol III型启动子驱动。
LR重组步骤后,按照本领域公知的方法将所得到的表达载体转化入农杆菌菌株LBA4044。
实施例10b.用于稻中表达的构建体
除在N端用植物核定位信号(NLS)(MSERKRREKL,SEQ ID NO:71)和在C端用输入蛋白NLS(KRPAATKKAGQAKKKK SEQ ID NO:72)替换源自SV40的NLS、以及驱动gRNA和供体的RNA表达的启动子是U3snRNA的稻pol III型启动子(SEQ ID NO:73)外,合成与实施例10a中所述相同的载体。
合成包含融合或非融合NA的RNA表达盒(包括所选择的PPO基因中的位置的基因特异性间隔区序列),并克隆入入门载体,将该入门载体克隆(经Gateway)入含有CAS9表达盒的目的载体。
用作非融合对照的载体包含PRO0231::U3RNA pol III启动子::间隔区::sgRNA支架::TTTTTTTT终止子::U3RNA pol III启动子::模板::TTTTTTTT终止子。
LR重组步骤后,按照本领域公知的方法将所得到的表达载体转化入农杆菌菌株LBA4044。
实施例11.稻转化和除草剂耐受愈伤组织的选择
用含有表达载体的农杆菌转化盾片来源的籼稻(Oryza sativa L.)愈伤组织。通过在70%乙醇中孵育1分钟、然后在6%次氯酸钠中孵育40分钟、然后用无菌MQ水洗涤3至5次来进行成熟种子的消毒。然后使经消毒的种子在含2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。光照孵育6天后,在细菌溶液(OD600=0,1)中孵育盾片来源的愈伤组织90秒,流干,在无菌滤纸上干燥,然后与细菌在25℃避光共培养3天。将共培养的愈伤组织转移至含G418的选择培养基,32℃避光4周。将抗生素抗性愈伤组织块转移至含25或50μM苯嘧磺草胺(KixorTM)的选择培养基,32℃光照2周。这些除草剂选择条件是通过在苯嘧磺草胺杀伤曲线中分析组织存活确定的。将除草剂抗性材料转移至再生培养基并光照孵育后,胚胎发生潜能得到释放,并在随后4至5周发展为幼苗。从愈伤组织切下幼苗,在含生长素的培养基上孵育2至3周,直至幼苗良好生根,适于转移至土壤。在温室中高湿度和短光照下培养硬化幼苗。
实施例12.除草剂耐受转化体的分子表征
用从每一单个植物转化体采集的叶组织进行拷贝数分析和PPO基因序列突变的分子表征。按厂家的指导用Wizard 96Magnetic DNA Plant System试剂盒(Promega,美国专利号6,027,945&6,368,800)提取基因组DNA。用适当的探针与正向和反向引物一起PCR扩增所分离的DNA。此定量PCR分析验证T-DNA插入片段的拷贝数之后,仅保留对选择剂显示耐受性的低拷贝转基因植物用于收获T1种子。然后在移栽后3至5个月收获种子。
用Fusion Taq DNA Polymerase(Thermo Scientific)进行PPO基因组序列的PCR扩增,使用以下热循环程序:96℃15分钟,然后35个循环(96℃,30秒;58℃,30秒;72℃,3分30秒),72℃10分钟。通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的浓度和片段大小,送样用PCR引物测序。在代表性层析示踪文件和相应的使用默认设置并编辑为调用次峰的AlignX比对上进行序列分析。
根据序列信息在若干个体中鉴定出的突变显示,本发明中所述的涉及NA与CRISPR成分融合的技术可适用于植物生物。用所提供的供体进行的同源重组修复赋予对苯嘧磺草胺的耐受性(单位点突变和多位点突变)。
实施例13.大肠埃希氏菌中的受控基因敲除
在此实施例中,用FusionCRISPR来敲除大肠埃希氏菌K-12菌株MG1655亚系中的靶基因RecA。将细菌菌株接种在100ml锥形瓶中的10ml SOB中,37℃过夜培养(SOB:2%细菌用胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4)。将3ml过夜培养物稀释在1升锥形瓶中的250ml SOB中,18℃剧烈震荡(200-250转/分钟)培养,直至OD660nm为0.6。随后,将培养物转移至预冷的50ml管,4℃、5000转/分钟离心5分钟。将沉淀重悬在1/3原体积的冰冷TB(TB:250mM KCl、10mM PIPES游离酸、15mM CaCl2·2H2O、55mMMnCl2·2H2O)中,冰上孵育10分钟。4℃、5000转/分钟离心细胞5分钟,将沉淀重悬在1/12原体积的冰冷TB中。轻轻搅拌加入DMSO至终浓度为7%。将感受态细胞按每份200μl分装,冷冻在液氮中。将一份感受态细胞与0.1-0.5μg质粒加在一起,该质粒包含存在于pCas9中的氯霉素选择标记和Cas9表达盒[Jiang W,Bikard D,Cox D,Zhang F,Marraffini L(2013)RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.NatBiotechnol],及具有以下FusionCRISPR序列和RecA间隔区的用于表达融合RNA的盒[ZhaoD,Yuan S,Xiong B,Sun H,Ye L,Li J,Zhang X,Bi C.(2016)Development of a fast andeasy method for Escherichia coli genome editing with CRISPR/Cas9.Microb CellFact.15(1):205]:
其中识别RecA的间隔区突出显示,sgRNA的必需序列大写、无下划线,RecA的同源臂1双下划线,RecA的同源臂2单下划线。用于FusionCRISPR构建体和Cas9的启动子和终止子可选自http://parts.igem.org/Promoters/Catalog/Constitutive和http://parts.igem.org/Terminators/Catalog。所靶向的RecA基因具有以下序列:
其中PAM序列为斜体,同源臂1双下划线,同源臂2单下划线,原间隔区突出显示。将DNA和细胞冰上放置30分钟,然后42℃热激90秒。将细胞和DNA转移至冰上,1分钟后加入1mlLB(LB:1%胰蛋白胨、1%NaCl、0.5%酵母提取物、pH 7.0)。使细胞在37℃复苏1小时。复苏期可延长至16小时,以使FusionCRISPR成分有更多时间编辑大肠埃希氏菌基因组。1小时后应加入25μg/ml氯霉素,以防止质粒丢失。将细胞接种在含25μg/ml氯霉素的LB平板上,37℃孵育1天。从平板选择单菌落,在含氯霉素的LB中37℃过夜培养,然后提取基因组DNA[He,F.(2011)E.coli Genomic DNA Extraction.Bio-protocol Bio101:e97]。进行使用第一同源臂上游的正向引物(ATGGCTATCGACGAAAACAAA)(SEQ ID NO:44)和第二同源臂下游的反向引物(CGTCAGCGTGGTTTTACCGGA)(SEQ ID NO:45)的PCR来鉴定这样的菌落,其中在RecA序列(SEQ ID 43)中以黑体显示的11个核苷酸由于用FusionCRISPR模板进行的同源重组修复而不再存在。PCR片段可以测序(预期大小220bp),或者在这种情况下,进行AgeI消化(所删除的PAM周围的序列包含AgeI限制位点ACCGGT),以在标准凝胶电泳后验证基因座的修饰。11个核苷酸的缺失确保了可读框的破坏。
实施例14.人诱导型多能干细胞(hiPSC)和HEK293细胞中PRDM9基因的受控敲除
Yang L,Yang JL,Byrne S,Pan J,Church G(2014)CRISPR/Cas9-directedgenome editing of cultured cells.Current Protocols in Molecular Biology31.1.1-31.1.17中非常详细地描述了细胞培养物维持、质粒构建、转染方法及hiPSC和HEK293细胞中基因组编辑的分子分析。对于PRDM9基因的敲除,所有步骤都按照其中所述进行,只有gRNA质粒设计有小的改动。合成的gRNA应具有以下序列:
其中U6启动子以斜体显示,识别PRDM9外显子ENSE00001804383的间隔区突出显示,sgRNA的必需序列大写、无下划线或为斜体,PRDM9的同源臂1双下划线,PRDM9的同源臂2单下划线,终止子小写。所靶向的PRDM9外显子ENSE00001804383具有序列:
其中PAM序列为斜体,同源臂1双下划线,同源臂2单下划线,原间隔区突出显示。黑体显示的核苷酸在与FusionCRISPR构建体同源重组时被删除,产生如从基因组DNAPCR扩增各基因组区域并在随后测序所得到的PCR产物所显示的移码。
实施例15.稻植物中引入点突变在稻中产生环己二酮(DIM)和芳氧苯氧丙酸酯(FOP)
已知质体乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)中的突变I1781L和G2096S赋予对DIM和FOP除草剂的耐受性。可以用以下载体在内源ACCase基因座引入这些突变。
载体RLW137 SEQ ID NO:66
此载体的骨架是使得能够进行gateway的构建体RLW121SEQ ID NO:62。
用于RLW137的ENTR载体是载体CC003SEQ ID NO:63(用于输入T-DNA的选择标记)、CC018SEQ ID NO:64(提供FusionCRISPR构建体,其靶向并在对应于G2096的DNA上游切割后引入G2096S)和CC006SEQ ID NO:65(提供Cas9)。
CC018(CRISPRCas018的缩写)包含位于输入核苷酸(在这种情况下编码G2096S)侧翼的~300nt同源臂。共同引入附加突变以避免T-DNA的自我切割(突变的PAM,备选地或此外,间隔区可以包含许多突变,如果存在,该突变优选在对应于外显子的部分中沉默且不影响内含子/外显子边界)和存在于同源臂或输入核苷酸中的长T序列上的转录提前终止。
合成对照载体,该对照载体除供体分子表达为不与向导RNA连接的分开的分子外是相同的。
用上文所述流程将载体RLW137和对照载体转化入稻。最初的选择是针对ZmAHASA122T S553N标记的存在。按实施例12中所述进行转化植物的分析。
与上文针对RLW137所述的方法类似,RLW138引入相同的突变,但这次使用另一下游原间隔区位点。RLW138包含具有CC003、CC019(SEQ ID NO:67)和CC006的RLW121骨架。
通过包含RLW121、CC003、CC020(SEQ ID NO:69)和CC006的RLW139(SEQ ID NO:70)引入突变I1781L。
实施例16.融合CRISPR在芽孢杆菌中的应用
电转感受态枯草芽孢杆菌细胞和电穿孔
通过电穿孔进行DNA进入枯草芽孢杆菌ATCC 6051的转化。电转感受态枯草芽孢杆菌ATCC 6051细胞的制备和DNA的转化基本按Xue等(Xue,G.-P.,1999,Journal ofMicrobiological Methods 34,183-191)所述进行,进行以下修改:转化DNA时,将细胞复苏在1ml LBSPG缓冲液中,37℃孵育60分钟(J.,1989,FEMSMicrobio.Lett.,61:165-170),然后接种在选择性LB琼脂平板上。对于包含温度敏感型pE194复制起点的质粒,33℃复苏细胞3小时。
质粒分离
通过(Sambrook,J.和Russell,D.W.Molecular cloning.Alaboratory manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.2001.)中所述的标准分子生物学方法或碱裂解法(Birnboim,H.C.,Doly,J.(1979).Nucleic Acids Res 7(6):1513-1523)从芽孢杆菌和大肠埃希氏菌分离质粒DNA。与大肠埃希氏菌相比,在细胞裂解之前用10mg/ml溶菌酶37℃处理芽孢杆菌细胞30分钟。
寡核苷酸退火形成寡核苷酸双链体
在水中调节寡核苷酸至100μM浓度。向90μl 30mM Hepes缓冲液(pH7.8)中加入5μl正向寡核苷酸和5μl相应的反向寡核苷酸。将反应混合物加热至95℃5分钟,然后通过从95℃降温至4℃来退火,按0.1℃/秒降低温度(Cobb,R.E.,Wang,Y.,&Zhao,H.(2015).High-Efficiency Multiplex Genome Editing of Streptomyces Species Using anEngineered CRISPR/Cas System.ACS Synthetic Biology,4(6),723–728)。
分子生物学方法和技术
质粒pJOE8999:
Altenbuchner J.2016.Editing of the Bacillus subtilis genome by theCRISPR-Cas9system.Appl Environ Microbiol 82:5421–5.
质粒pCC001
用AvrII和XbaI切割pJOE8999和在标准大肠埃希氏菌克隆载体(pUC衍生载体)中提供的合成基因片段Seq ID 048,然后分离pJOE8999质粒骨架和Seq ID 048的较小的AvrII/XbaI片段。用T4-DNA连接酶(NEB)连接两个片段,然后转化入大肠埃希氏菌XL1-Blue感受态细胞(Stratagene)。回收正确的质粒,命名为pCC001。
质粒pCC002
用AvrII和XbaI切割pJOE8999和在标准大肠埃希氏菌克隆载体(pUC衍生载体)中提供的合成基因片段Seq ID 049,然后分离pJOE8999质粒骨架和Seq ID 049的较小的AvrII/XbaI片段。用T4-DNA连接酶(NEB)连接两个片段,然后转化入大肠埃希氏菌XL1-Blue感受态细胞(Stratagene)。回收正确的质粒,命名为pCC002。
质粒pCC003
使具有5’磷酸化的寡核苷酸SeqID 050和Seq ID 051退火形成编码靶向枯草芽孢杆菌ATCC6051淀粉酶基因amyE的原间隔区的寡核苷酸双链体。用BsaI切割pJOE8999,然后连接寡核苷酸双链体以回收质粒pCC003。
质粒pCC004
分别用寡核苷酸Seq ID NO:52、Seq ID NO:53和SeqID NO:54、Seq ID NO:55在分离的基因组DNA上PCR扩增邻近枯草芽孢杆菌ATCC6051淀粉酶amyE基因的5’同源区(也称为HomA)和3’同源区(也称为HomB)。用寡核苷酸Seq ID NO:52和Seq ID NO:55进行重叠PCR来融合和扩增两个同源区HomA和HomB,以回收amyE基因同源区的HomAB PCR片段。用SfiI切割质粒pCC003和HomAB-amyE PCR片段,然后用T4-DNA连接酶(NEB)连接。将反应混合物转化入大肠埃希氏菌XL1-Blue感受态细胞(Stratagene)。回收含有amyE原间隔区和amyE的HomAB的正确质粒,命名为pCC004(图23)。
质粒pCC005
用BsaI切割质粒pCC001,然后按针对pCC003所述克隆amyE原间隔区寡核苷酸双链体(SeqID 050/Seq ID051)。用SfiI切割所得到的质粒和针对pCC004的构建所述的amyE基因同源区HomAB的PCR片段,然后用T4-DNA连接酶(NEB)连接。将反应混合物转化入大肠埃希氏菌XL1-Blue感受态细胞(Stratagene)。回收含有amyE原间隔区和amyE的HomAB的正确质粒,命名为pCC005。
质粒pCC006
分别用寡核苷酸Seq ID NO:56、Seq ID NO:57和SeqID NO:58、Seq ID NO:59在分离的基因组DNA上PCR扩增邻近枯草芽孢杆菌ATCC6051淀粉酶amyE基因的5’同源区(也称为HomA)和3’同源区(也称为HomB)。用寡核苷酸Seq ID NO:56和Seq ID NO:59进行重叠PCR来融合和扩增两个同源区HomA和HomB,以回收amyE基因同源区的HomAB PCR片段。用BsaI切割质粒pCC001,然后按针对pCC003所述用T4-DNA连接酶(NEB)连接amyE原间隔区寡核苷酸双链体(SeqID NO:50/Seq ID NO:51)。用SfiI切割所得到的质粒和amyE基因同源区HomAB的PCR片段,然后用T4-DNA连接酶(NEB)连接。将反应混合物转化入大肠埃希氏菌XL1-Blue感受态细胞(Stratagene)。回收含有amyE原间隔区和与pCC005相比方向相反的amyE的HomAB的正确质粒,命名为pCC006。
质粒pCC007
用BsaI切割质粒pCC002,然后按针对pCC003所述用T4-DNA连接酶(NEB)连接amyE原间隔区寡核苷酸双链体(SeqID NO:50/Seq ID NO:51)。用SfiI切割所得到的质粒和amyE基因同源区HomAB的PCR片段,然后用T4-DNA连接酶(NEB)连接。将反应混合物转化入大肠埃希氏菌XL1-Blue感受态细胞(Stratagene)。回收含有amyE基因的HomAB和amyE原间隔区的正确质粒,命名为pCC007。
质粒pCC008
用BsaI切割质粒pCC002,然后按针对pCC003所述用T4-DNA连接酶(NEB)连接amyE原间隔区寡核苷酸双链体(SeqID NO:50/Seq ID NO:51)。用SfiI切割所得到的质粒和针对pCC006所述的用寡核苷酸Seq ID NO:56和Seq ID NO:59扩增的amyE同源区HomAB的PCR片段,然后用T4-DNA连接酶(NEB)连接。将反应混合物转化入大肠埃希氏菌XL1-Blue感受态细胞(Stratagene)。回收含有与pCC007相比方向相反的amyE的HomAB和amyE原间隔区的正确质粒,命名为pCC008。
使用融合-CRISPR的基因删除
基本按Xue等(Xue,G.-P.,1999,Journal of Microbiological Methods34,183-191)所述用各1μg质粒pJOE8999、pCC004、pCC005、pCC006、pCC007、pCC008转化电转感受态枯草芽孢杆菌ATCC6051细胞,进行以下修改:转化DNA时,将细胞复苏在1ml LBSPG缓冲液中,33℃孵育3小时(J.,1989,FEMS Microbio.Lett.,61:165-170),然后接种在补充了20μg/ml卡那霉素和0.2%D-甘露糖的LB-Lennox平板上进行Cas9诱导。33℃孵育平板20-22小时。从每个质粒转化挑取至多10个克隆,转移至新鲜预热的LB-Lennox平板上,然后50℃孵育18小时。从每个大的长出菌落挑取细胞,在新鲜LB-Lennox平板上进行3道划线,以在45℃孵育7-8小时后产生单菌落。将单菌落转移至LB-Lennox平板和补充了20μg/ml卡那霉素的LB-Lennox平板,然后30℃孵育16-18小时。将卡那霉素敏感克隆(指示质粒丢失)接种在补充了1%可溶性淀粉的LB-Lennox平板上,然后30℃孵育20小时。通过用含碘的Lugols溶液覆盖平板来显示淀粉酶amyE基因的失活,分析光晕的存在或缺乏,后者指示成功失活。
表2总结质粒处理后的总克隆量、淀粉酶失活的克隆量、淀粉酶失活的克隆相对于总克隆的百分比,和所示质粒相对于pCC004的相对敲除效率(图25)
表2
构建体 | 总亚克隆 | 淀粉酶阴性亚克隆 | 淀粉酶阴性亚克隆[%] | 相对于pCC004 |
pJOE8999 | 90 | 0 | 0 | 0 |
pCC004 | 177 | 42 | 24 | 100 |
pCC005 | 197 | 113 | 57 | 242 |
pCC006 | 192 | 79 | 41 | 173 |
pCC007 | 117 | 95 | 81 | 342 |
pCC008 | 146 | 116 | 79 | 335 |
Claims (13)
1.用于修饰细胞中的靶核酸(靶NA)分子的方法,其包括步骤:
a.提供包含与至少一个供体核酸(doNA)分子共价连接的向导核酸(gNA)分子的重组融合核酸(fuNA)分子;和
b.将所述fuNA分子引入包含靶NA分子的一个或多个细胞;和
c.将位点定向核酸修饰多肽引入所述一个或多个细胞;和
d.在允许所述一个或多个细胞中同源重组的条件下孵育所述一个或多个细胞;和可选地
e.分离一个或多个其中发生了同源重组的细胞,
其中fuNA分子由RNA组成。
2.权利要求1的方法,其中gNA分子包含含有至少12个与靶NA分子的相同数目的连续碱基互补的碱基的间隔区核酸(间隔区NA)分子。
3.权利要求2的方法,其中gNA分子进一步包含支架核酸(支架NA)分子。
4.权利要求3的方法,其中支架NA分子与gNA分子共价结合。
5.权利要求1至4中任一项的方法,其中细胞是微生物、动物、人或植物细胞。
6.权利要求1至5中任一项的方法,其中位点定向核酸修饰多肽是核酸指导的核酸修饰多肽或其功能等同物。
7.权利要求1至6中任一项的方法,其中将fuNA分子作为编码所述fuNA分子的一个或多个表达构建体引入。
8.重组fuNA分子,其包含与gNA分子共价连接的doNA分子,其中fuNA由RNA组成。
9.载体,其包含含有与编码权利要求8的fuNA分子的DNA分子功能性连接的启动子的表达构建体。
10.载体系统,其包含:
a.权利要求9的载体;和
b.编码位点定向核酸修饰多肽的载体;和可选的
c.编码支架NA分子的载体。
11.用于修饰细胞中靶NA的系统,其包含:
a.权利要求9的载体;和
b.编码位点定向核酸修饰多肽的载体;和
c.包含靶NA分子的细胞;和可选的
d.编码支架NA分子的载体。
12.组合物,其包含:
a.权利要求9的载体;和
b.编码位点定向核酸修饰多肽的载体;和
c.包含靶NA分子的细胞;和可选的
d.编码支架NA分子的载体。
13.权利要求9的载体、权利要求10的载体系统、权利要求11的系统或权利要求12的组合物的用途,用于修饰细胞中的靶NA分子。
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