CN114774420B - 一种水稻增强子及基于CRISPR/Cas9技术评估水稻增强子活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻增强子及基于CRISPR/Cas9技术评估水稻增强子活性的方法，水稻增强子，序列如SEQ ID NO.1。获取增强子，长度为461 bp；LOC_Os07g34589基因的启动子中，分离得到62 bp mini启动子序列；构建负对照载体，使用LOC_Os07g34589基因的两个mini启动子序列反向连接，分别驱动Cas9蛋白和sgRNA表达；构建增强子检测载体，在上述负对照载体中，两个mini启动子中间插入igENH1增强子序列；水稻原生质体的制备与转化；转化后通过分析增强子活性。所述水稻增强子具有较好的增强转录效果。

Description

一种水稻增强子及基于CRISPR/Cas9技术评估水稻增强子活 性的方法

技术领域

本发明涉及增强子及鉴定方法，特别涉及水稻增强子及基于CRISPR/Cas9技术鉴定水稻增强子的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是目前用于基因组定向编辑的主要工具。该系统研究最深入且应用最广泛，主要成分有Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA、相应的目标DNA等。CRISPR/Cas9系统作用机制是crRNA和tracrRNA通过碱基配对形成发夹结构的sgRNA，在sgRNA引导下Cas9蛋白识别靶位点3’端PAM序列并与靶位点结合，利用Cas9内切核酸酶的活性切割靶位点，造成DNA双链断裂。在修复过程中断裂处DNA引入碱基缺失替换等，从而实现对基因组目标序列的定向编辑。

水稻基因组除了编码蛋白质的基因外，还存在大量非编码序列，其中包括顺式调控元件(启动子、增强子等)。顺式调控元件在调控基因表达方面发挥重要作用。本发明鉴定到一段增强子序列，应用mini启动子和增强子组合的调控模块，驱动CRISPR/Cas9表达，实现基因编辑的效果。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种水稻增强子。

本发明的另一目的是提供所述基于CRISPR/Cas9技术鉴定水稻增强子的方法。

技术方案：本发明提供一种水稻增强子，基因序列如SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.1：

进一步地，所述水稻内含子来源于禾本科稻属粳稻日本晴(Oryza sativaL.spp.Japonica var.Nipponbare)，具体用引物以粳稻日本晴的基因组DNA为模板，扩增得到461bp的扩增产物。

进一步地，引物序列如下：

正向F：5’-GCAGAAATGCAAATTTCATA-3’；

反向R：5’-AATCTGTTCATATAAACTGG-3’。

水稻增强子的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)通过分析开放染色质数据，发现LOC_Os02g06640和LOC_Os02g06650基因间区存在开放染色质位点，经分析为增强子，命名为igENH1(intergenic enhancer 1)，长度为461bp。

(2)LOC_Os07g34589基因的启动子中，分离得到62bp mini启动子序列。

(3)构建负对照载体，使用LOC_Os07g34589基因的两个mini启动子序列反向连接，分别驱动Cas9蛋白和sgRNA表达。

(4)构建增强子检测载体，在上述负对照载体中，两个mini启动子中间插入igENH1增强子序列。

(5)水稻原生质体的制备与转化。

(6)转化后通过分析编辑位点是否发生突变评估增强子活性。

鉴定原理：

当基因表达时，增强子与启动子联合作用，增强靶基因的转录。本发明中鉴定一个位于基因间区的增强子，利用mini启动子和增强子组合的调控模块，驱动CRISPR/Cas9表达，在水稻瞬时转化后，评估增强子调控的基因编辑的效果。

有益效果：本发明的水稻增强子序列，本质是DNA分子，461bp。具有较好的增强转录效果，同时，提供了有效评估增强子活性的鉴定方法。

附图说明

图1增强子igENH1在基因组中位置信息；

图2构建载体示意图；

图3Pst I酶切分析编辑位点。

具体实施方式

本实施例的增强子获取及鉴定方法如下：

1.增强子介绍

分析水稻开放染色质数据PlantDHS(http：//plantdhs.org/)寻找潜在增强子位点，筛选发现LOC_Os02g06640和LOC_Os02g06650基因间区存在三个开放染色质位点。检索水稻基因组公共数据库(RGAP，http：//rice.plantbiology.msu.edu/)，发现LOC_Os02g06640和LOC_Os02g06650基因均有较强表达。图1所示，其中两个开放染色质位点(标记为DH1，DH2)位于LOC_Os02g06640基因转录起始位点上游1kb，推断DH1和DH2位于LOC_Os02g06640基因的启动子内。DH3(Chr2：3344072-3344532)在LOC_Os02g06650基因的下游，且与LOC_Os02g06640基因的转录起始位点间距离大于1kb，因此推测DH3为基因间区增强子，命名为igENH1(intergenic enhancer 1)，长度为461bp(SEQ ID NO.1)。

2.mini启动子介绍

在水稻各个组织中LOC_Os07g34589基因表达量较高，分析该基因启动子序列，发现在转录起始位点上游62bp序列中包含转录必需的元件，如TATA box等，将这段序列定义为mini启动子(SEQ ID NO.2)。

SEQ ID NO.2：

3.检测

为评估增强子活性，使用CRISPR/Cas9系统构建检测载体。CRISPR/Cas9载体pGEL051由电子科技大学张勇课题组提供，详情见参考文献。

Ren，Qiurong；Zhong，Zhaohui；Wang，Yan；You，Qi；Li，Qian；Yuan，Mingzhu et al.(2019)：Bidirectional Promoter-Based CRISPR-Cas9 Systems for Plant GenomeEditing.In Frontiers in plant science 10，p.1173.DOI：10.3389/fpls.2019.01173

实验设计思路为，构建负对照载体，LOC_Os07g34589mini启动子两个反向连接分别驱动Cas9蛋白和sgRNA表达，这种情况下，mini启动子不能启动任意一方的表达，如图2所示。构建增强子检测载体，在两个mini启动子之间连入igENH1，在体内调控蛋白的参与下，增强子会与mini启动子作用，从而同时启动Cas9蛋白和sgRNA表达，实现目标序列定点突变。

(1)构建负对照载体

pGEL051载体包括Cas9蛋白和OsPDS基因的sgRNA(SEQ ID NO.3)，当发生编辑时，靶位点为OsPDS基因编码区。将pGEL051载体用限制性内切酶Spe I和SbfI酶切，得到骨架载体。LOC_Os07g34589 mini启动子“头对头”反向连接的序列(SEQ ID NO.4)，长度227bp，使用所述引物扩增：

mini pro-F：5’-ACACTAGTCCCTCTTCTTGG-3’

mini pro-R：5’-TACCTGCAGGCCCTCTTCTT-3’

SEQ ID NO.3：

SEQ ID NO.4：

将骨架载体和扩增片段连接，获得负对照载体，命名为mini vector(如图2所示)。

(2)构建增强子检测载体

将上述构建好的mini vector做单酶切，使用限制性内切酶Xba I，回收载体片段。使用所述引物扩增igENH1片段(SEQ ID NO.1)，长度为461bp。

igENH1-F：5’-CTTAGCAGGCTTCTAGAGTCTTGGGAACAAGCGAAAGA-3’

igENH1-R：5’-CAGGCGATCCTCTCTAGATGGTGGCTAAGTTTTCTCTCT-3’

将载体与扩增片段连接，构建增强子检测载体，命名为igENH1 vector(如图2所示)。

4.水稻原生质体制备与转化

4.1水稻原生质体制备：

(1)叶片准备。取无菌培养14天左右生长良好的新鲜水稻植株40-60株，去掉根部，备用。

(2)酶解。将水稻叶片和茎段用锋利刀片切成宽度为0.5mm的条状，速度要快，防止叶片脱水，将切好的叶片放入盛有10mL酶解液的培养皿中，置于密闭容器中用真空泵抽真空30min，用封口膜封口，置于60rpm转速的摇床上25℃黑暗条件下过夜酶解。

(3)过滤。将过夜酶解的粗酶液通过预先用2mL W5 washing Buffer润洗过的孔径40μm的细胞筛进行过滤，去除酶解不充分的杂质。

(4)提纯。将过滤过的细胞酶解液转移到两个15mL离心管中，每管6mL细胞酶解液，用装有长针头的注射器吸取16mL 0.55M蔗糖，每管细胞酶解液底部加入8mL0.55M蔗糖，注意：加蔗糖时，针头伸入底部，推动注射器，随着液面升高，缓慢上移注射器，动作要轻柔，防止对原生质体细胞造成破坏。1000g离心5min。

(5)清洗。取50mL离心管一个，加入10mL Washing buffer，置于试管架上。用装有长针头的注射器吸取8mL Washing buffer，再将针头伸到上步离心后的中间细胞层，慢慢吸取该层的所有原生质体，然后小心转移至盛有10mL Washing buffer的50mL离心管中。轻弹混匀，100g室温离心5min。

(6)重复清洗一次。移除上清，沿壁慢慢加入10mL Washing buffer，轻弹混匀，100g离心2min。

(7)重悬。去掉上清，加入5mL Washing buffer，注意沿壁缓慢加入，轻弹混匀，使细胞保持悬浮。

(8)计数。吸取100μL细胞用于计数，取6-7μL细胞置于细胞计数板进行计数，如果细胞数目太多可采用MGG稀释后再进行计数。

(9)细胞稀释。根据计数结果取适量细胞悬浮液进行离心，然后用MGG Buffer重悬细胞，最终将细胞稀释至1×10⁶个/mL，用于原生质体转化。

4.2水稻原生质体的转化：

(1)质粒的准备。采用质粒小提试剂盒(TIANGEN，Cat#DP-106)提取以下质粒：minivector和igENH1 vector。确保其浓度尽量在500ng/μL以上，整个过程最好为无菌操作。质粒置于-20℃冰箱冻存。使用前以离心机最高转速进行离心10min处理，使杂质沉淀于离心管底部，避免因杂质影响原生质体转化的效率。处理好的质粒用MGG Buffer稀释到实验所需质粒浓度，稀释后充分混匀备用。

(2)PEG介导的转化。将上述准备好的质粒(mini vector和igENH1 vector)中加入200μL按照2.2.6制备过程制备的原生质体细胞，轻弹混匀。然后，每管加入210-230μL40％PEG(PEG加入量与质粒体积相关，确保等体积加入)，轻弹混匀，直至细胞均匀悬浮于PEG当中，从第一管加入PEG开始计时，计时20min。从第一管加入到最后一管加入的时间尽量控制在5min以内。

(3)清洗。加入PEG反应20min后，每管加入1mL W5 Washing Buffer，终止反应，轻轻颠倒混匀，250g离心5min。

(4)重复清洗一次。用枪轻轻吸掉上清，重新加入800μL Washing Buffer，轻轻颠倒混匀，150g离心5min，轻轻吸掉上清。

(5)细胞重悬与培养。取40mm培养皿加入2mL W5 Buffer，再取培养皿中的W5Buffer重悬离心管中的细胞，并全部转移至培养皿中，25℃黑暗培养两天。

5.结果分析

mini vector和igENH1 vector质粒分别转化原生质体，收集培养2天后的原生质体细胞，分别提取基因组DNA。用所述特异引物扩增OsPDS基因sgRNA两侧的序列，长度680bp。

F：5’-ATGTCAGTAACTTGCAAGGT-3’

R：5’-CAAGGTTCACAGTCCGGGAT-3’

由于使用的OsPDS基因sgRNA的编辑位点也是Pst I限制内切酶酶切位点，因此用Pst I酶切来检测目标位点序列是否发生突变。图3所示酶切电泳检测结果，日本晴DNA中没有发生编辑，因此Pst I酶切后有2条带。mini启动子载体转化后，由于mini启动子不能启动CRISPR/Cas9系统表达，编辑位点没有发生改变，因此Pst I酶切后也是2条带。mini启动子和igENH1增强子组合载体转化后，Pst I酶切后观察到三条电泳条带，除了2条酶切条带外，还存在680bp的条带，说明酶切位点碱基发生突变不能被Pst I所切割，证实mini启动子和增强子组合模块构建的载体能够启动CRISPR/Cas9单元表达，从而指导目标位点发生编辑。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种水稻增强子及基于CRISPR/Cas9技术评估水稻增强子活性的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 461

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagaaatgc aaatttcata aaacaaacta ctagtactgt ttgttcattg gtcttatcca 60

aaacttagcc actgcaacaa gttcttgacc cttagcacaa tcatattgtg catgcacttg 120

tttattgcaa agaatggtgc gtagggaaca cgcatgattt ttgaattgct ggcacataat 180

tttatcatta gaaactggaa tgcaacatgt accctttgtc atggtttctt tccgagacat 240

tgcactgttt tttttaatcc tatcattatc ataatgccaa gaactggtca ccaaccagca 300

atttgcatca tggttagttg agctgtcccc atgtatcaat aggtgcattg tattggtccg 360

aaatataaat gcagtggatg caaacctatc tcatggccgt caacaaaaga aatcaaaagg 420

gaaatgcacc atcttatatc tccagtttat atgaacagat t 461

Claims (4)

1.一种水稻增强子，其特征在于：基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的水稻增强子，其特征在于：所述水稻增强子的制备方法为用引物以粳稻日本晴的基因组DNA为模板，扩增得到461 bp的扩增产物即为水稻增强子。

3.根据权利要求2所述的水稻增强子，其特征在于：所述引物序列如下：

正向F: 5’-GCAGAAATGCAAATTTCATA-3’ ；

反向R: 5’-AATCTGTTCATATAAACTGG-3’ 。

4.一种基于CRISPR/Cas9技术评估权利要求1所述水稻增强子活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1) 通过分析开放染色质数据，发现LOC_Os02g06640和LOC_Os02g06650基因间区存在开放染色质位点，经分析为增强子，命名为igENH1 intergenic enhancer 1，长度为461bp，即为权利要求1所述的增强子；

(2) LOC_Os07g34589基因的启动子中，分离得到62 bp mini启动子序列；所述mini启动子序列如下：

TCTATAAATTCCTCCCCCCTTTTCCCCTCTCTATATAGGAGGCATCCAAGCCAAGAAGAGGG

(3) 构建负对照载体，使用LOC_Os07g34589基因的两个mini启动子序列反向连接，分别驱动Cas9蛋白和sgRNA表达；

(4) 构建增强子检测载体，在上述负对照载体中，两个mini 启动子中间插入igENH1增强子序列；

(5) 水稻原生质体的制备与转化；

(6) 转化后通过分析编辑位点是否发生突变评估增强子活性。