CN113416735B - 一种烟草生殖细胞特异高表达基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种烟草生殖细胞特异高表达基因及应用，核苷酸序列如SEQ I D NO.1所示。本发明通过基因组信息学分析，鉴定获得栽培烟草该基因的编码序列及其启动子序列。通过候选启动子序列元件分析及基因表达谱分析，证实该基因是一个生殖细胞高丰度表达的基因。克隆获得该基因的启动子序列，并以其为启动元件构建生殖细胞特异高丰度表达Cas 9蛋白的基因编辑载体，将载体转入农杆菌，通过叶盘转化法获得转基因烟草植株，通过基因编辑靶位点测序分析发现，转基因烟草植株PDS基因突变效率高，研究结果对于构建高效率的植物基因失活载体并获得突变植株具有重要的指导意义及应用价值。

Description

一种烟草生殖细胞特异高表达基因及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种烟草生殖生殖细胞特异高表达基 因及应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统的原理是通过由crRNA与tracrRNA形成的sgRNA (single-guideRNA，sgRNA)识别靶位点，并引导Cas9对靶基因进行定向剪 切，Cas9是由HNH和RuvC两个结构域组成，两个结构域分别负责切割DNA的 两条链，形成DNA双链断裂(double-strandbreak，DSB)。而DSB主要通过 两种方法进行修复。一种是非同源末端连接(NonhomologousEnd Joining， NHEJ)，这种修复方式会引起碱基的插入和缺失从而导致基因功能缺失。当有 供体DNA模板存在时，同源重组(Homologous recombination，HR)的精确修 复方式就会发生，但其效率较低。CRISPR/Cas9基因编辑系统设计简单，操作 容易，成本较低，得到了科研人员和实验室的“追捧”，因此，CRISPR/Cas9 系统也得到了很好的推广和发展。在2013年CRISPR/Cas9基因编辑体系率先 成功在水稻、拟南芥、烟草和小麦原生质体和农杆菌介导的Cas9-sgRNA共骨 架载体稳定转化。随后在马铃、大豆、玉米、大麦等植物中进行了该体系的应 用，并且在拟南芥、水稻、烟草中还实现了多基因的同时编辑。

CRISPR/Cas9系统在植物中通常是利用农杆菌介导的遗传转化使其整合 到基因组中发挥作用，构建的植物基因编辑载体通常利用花椰菜花叶病毒的 35S启动子启动表达Cas9。已有的研究结果显示，这种常规的基因编辑载体， 获得的后代编辑效率低。2015年，研究人员发现利用拟南芥中的YAO基因启 动子驱动Cas9，T2代的转基因拟南芥突变效率达到40.9％-85.7％，并且在T2 代中出现了靶标基因发生突变但没有Cas9嵌入的植株。在同一年，研究人员 利用拟南芥中的卵母细胞特异性基因EC1.2的启动子驱动Cas9，称为EPC(the egg cell-specific promoter-controlled CRISPR/Cas9 system)系统，高效 的获得了多个目标基因的非嵌合T1代突变体。

作为重要的经济作物和模式植物之一的烟草(Nicotiana tabacum)，有着 重要的研究价值。但是由于栽培烟草是异源四倍体且基因组庞大复杂，在利用 常规CRISPR/Cas9基因编辑载体进行编辑时，后代植株出现嵌合的比例较高且 基因编辑效率低，在应用过程中耗费大量的人力、物力、财力。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟草生殖细胞特异表达基因及应用，以解决现有 的利用常规35S为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑载体进行编辑时，后代植株 出现嵌合的比例较高且编辑效率低，耗费大量的人力、物力、财力的问题。

本发明通过构建烟草基因编辑载体时，以生殖细胞特异高表达NtEC1.2-1 基因启动子驱动Cas9蛋白表达，，实现降低烟草嵌合体的比率，提高基因编辑 效率的目的。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种烟草生殖细胞特异高表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 包括372个碱基，来源于烟草，命名为NtEC1.2-1。

优选的，所述烟草生殖细胞特异高表达基因的启动子，核苷酸序列如 SEQ IDNO.2所示，包括2186个碱基。

优选的，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

基因编辑烟草生殖细胞特异高表达基因，获得具有特异性表达的烟草植 株。

优选的，烟草生殖细胞特异高表达基因的编码序列设计特异定量引物，分 别提取盛花期烟草的各组织的总RNA，通过反转录获得cDNA，并以其为模板， 利用荧光定量PCR的方法检测基因在烟草各组织的表达情况，获得的数据利用 2-ΔΔCt的方法分析基因在烟草各组织的表达情况，确定该基因是在生殖器 官中特异高量表达。

优选的，编辑烟草生殖细胞特异高表达基因所需的特异定量引物的核 苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

优选的，基因编辑烟草生殖细胞特异高表达基因的启动子，获得具有 可在烟草生殖细胞特异高表达的编辑载体优选的，通过含pORE-NtEC1.2-1P： GUS载体的农杆菌侵染烟草植株植，表明NtEC1.2-1启动子在早期的种子和子 房中是特异表达的。。

优选的，将含有pORE-NtEC1.2-1-rbcS-E9敲除载体的农杆菌侵 染烟草植株，获得转基因烟草植株，经突变检测显示在检测的15株 转基因品系中有4株发生了突变，突变效率为26.7％。

本发明的有益效果是：

本发明通过基因组信息学分析，鉴定获得栽培烟草NtEC1.2-1基因的编码 序列及其启动子序列。通过候选启动子序列元件分析及基因表达谱分析，证实 NtEC1.2-1是一个生殖细胞高丰度表达的基因。克隆获得NtEC1.2-1的启动子 序列，并以其为启动元件构建生殖细胞特异高丰度表达Cas9蛋白的基因编辑 载体NtEC1.2-1-Cas9-rbcS-E9。载体转入农杆菌，通过叶盘转化法获得转基 因烟草植株。通过基因编辑靶位点测序分析发现，转基因烟草植株PDS基因突 变效率高达26.7％。研究结果对于构建高效率的植物基因失活载体并获得突变 植株具有重要的指导意义及应用价值。

附图说明

图1为NtEC1.2基因在烟草不同组织的表达情况示意图；

图2为烟草NtEC1.2-1基因启动子的克隆电泳图，其中A为NtEC1.2-1 基因启动子序列PCR产物电泳图，B为拟南芥AtEC1.2基因启动子序列PCR产 物电泳图，P表示启动子；

图3为启动子活性验证荧光显微镜图；

图4为启动子载体构建电泳图，其中，A为NheI和NotI双酶切GUS载体， 1：酶切后GUS载体；2：原始GUS载体；B为NheI和NotI双酶切启动子序列； 1,2：NtEC1.2-1启动子；3,4：对照启动子；

图5为GUS转基因植株PCR鉴定电泳图，其中1-12为不同植株编号；

图6为转基因GUS幼苗染色图片；

图7为转基因组织GUS染色图片；

图8为特异性启动子敲除载体构建电泳图，其中，A：1，2为rbcS-E9终 止子；B：1表示NcoI和NotI酶切后的pORE-Cas9载体，2表示pORE-Cas9 原始载体，4表示NheI和EcoRI酶切后pORE-Cas9-rbcS-E9载体，5表示

pORE-Cas9-rbcS-E9原始载体。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明技术方案，以下的实施例仅是示例性 的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方 案的限制。

在本申请的各实施例中，没有注明具体技术或条件者，按照本领域内现有 技术或条件进行，所使用的材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买 获得的常规产品。

本发明除非另有说明，否则百分号为体积百分数，比例为体积比。

本申请中所使用的烟草品种为红花大金元，一种商品化烟草品种。

本申请提供一种烟草生殖细胞特异高表达基因，从NCBI中得到的拟南芥 的AtEC1.2基因的氨基酸序列，将其比对烟草基因组数据库，在烟草中获得了 AtEC1.2的两个同源候选基因，将其命名为NtEC1.2-1和NtEC1.2-2。其中 NtEC1.2-1的核苷酸序号如SEQID NO.1所示，包括372个碱基。

利用Genomatix在线分析网站对所比对到的NtEC1.2-1和NtEC1.2-2基因 上游2200bp序列进行活性及特异性的元件分析。发现这两个基因的启动子上 除了含有启动子核心元件TATA盒和CAAT盒外，还有一些特有的元件： NtEC1.2-1P和NtEC1.2-2P分别含有15和9个POLLEN ILAT52(AGAAA)元件，5 个和7个花粉特异性转录enhance element(TGTGA)，6个和3个细胞分裂M 时期特异性元件(AACGG)。NtEC1.2-1P含有2个早期激活因子的靶点(AACTTAA)，这些都是参与生殖或早期生长发育相关的特异性元件，这些元件 的鉴定表明了我们所得到的序列有可能是生殖特异性的启动子，得到烟草生殖 细胞特异高表达基因的启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括 2186个碱基。

为了进一步证明获得的NtEC1.2-1和NtEC1.2-2基因是在生殖器官中特异 表达，对其在烟草各组织的相对表达情况进行了定量分析。

首先根据NtEC1.2-1和NtEC1.2-2基因的编码序列设计特异定量引物，分 别提取盛花期烟草的子房、花柱、花丝、花药、花、根、茎、叶的总RNA，通 过反转录获得cDNA，并以其为模板，利用荧光定量PCR的方法检测这两个基 因在烟草8个组织的表达情况。获得的数据利用2-ΔΔCt的方法分析这两个 基因在烟草八个组织的表达情况。处理后的结果利用GraphPad Prism7软件作 图进行绘图分析。结果如图1所示，NtEC1.2-1和NtEC1.2-2基因均在花药中 高量表达，其中NtEC1.2-2相较于各组织特异高量表达，而NtEC1.2-1不但在 花药中高量表达，在子房中也是高量表达的，该结果证明了以上两个基因是在 生殖器官中特异高量表达，可能参与植物的生殖和早期发育。

具体的NtEC1.2基因表达特征分析：

总RNA的提取

取3株盛花期的烟草，分别对其子房、花柱、花丝、花药、花、根、茎、 叶8个组织进行取材，把三株相同组织的材料放入离心管中后迅速的放入液氮 中，利用EasyPure PlantRNA Kit试剂盒(来自全式金公司)进行RNA提取 (以下操作均在室温下进行)。

(1)将干热灭菌的研钵和研棒倒入液氮进行预冷，将取的烟草各组织样 品分别放入研钵中。

(2)加入液氮并快速的研磨，待液氮即将完全蒸发时立即加入液氮，并 继续研磨，重复操作3-4次，直至样品成粉末状。把样品收集到1.5mL无RNA 酶离心管中。

(3)加入5μLβ-巯基乙醇和500μL BB6，震荡混匀后静置3min。

(4)12000×g离心5min，吸取上清到新的1.5mL无RNA酶离心管中， 加入0.5倍体积的无水乙醇，翻转混匀。

(5)吸取混合液于离心柱中，12000g离心30s，弃流穿液。

(6)吸取500μL CB6于离心柱中，12000g离心30s，弃流穿液，加入 80μL DNaseI并静置15min，继续加500μL CB6，12000g离心30s，弃流 穿液。

(7)吸取500μL WB6于离心柱中，12000g离心30s，弃流穿液。

(8)重复该步骤(7)一次。

(8)12000g离心2min，静置2min使离心柱中残留的乙醇挥发。

(9)吸取30μL无RNA酶水悬空加入离心柱中，静置1min后12000g 离心2min。将洗脱的RNA放置在-80℃冰箱保存。

cDNA的获得：

(1)按照如下体系加样，然后放入PCR仪中70℃，5min，冰浴2min。

(2)然后向体系中加入如下试剂并混匀，置于PCR仪中42℃，60min， 4℃保存。

荧光定量PCR检测基因表达水平：

(1)使用miScript SYBR Green PCR Kit(来自Qiagen公司)按如下体 系进行加样，每个样品进行三次技术重复，混匀离心后按如下扩增程序进行。

(2)对扩增结束的程序结果进行溶解曲线分析，然后利用2^-ΔΔCt的方法 对数据进行处理并计算出基因的相对表达量。将计算出的结果进行作图，分析 基因在各组织中的表达情况。

烟草生殖特异性基因EC1.2的组织特异性表达验证方法：

将本氏烟草种子均匀的撒在湿润的土壤(营养土：蛭石＝2:1)表面，并用 有透气孔的保鲜膜封住盆口，26℃，光照16h，黑暗8h，湿度70％，培养 一周，期间保持土壤湿润，待种子出芽一周后将其移栽到适当的盆中继续培养。

亚细胞定位载体构建：

)pBI221-eEFP载体是购自重庆金喜鹊公司。

(2)用NEB公司的SalI-HF和NcoI-HF双酶切pBI221-eEFP植物表达载 体。通过切胶回收的方式回收pBI221-eEFP骨架载体。

(3)分别设计含有SalI-HF的正向特异性引物和NcoI-HF的反向特异性 引物扩增启动子序列。

(4)利用NEB公司的Gibson Assembly MasterMix酶按照如下体系加样， 置于PCR仪中50℃孵育30min。

(5)将孵育后的产物直接转化到DH5-α大肠杆菌中，37℃过夜倒置培 养。

(6)挑取单克隆利用特异性引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳， 进行初步检测，将阳性克隆的菌液送公司进行Sanger测序。

(7)提取测序结果正确的菌液的质粒，放置-20℃冰箱保存备用。

GV3101农杆菌介导的瞬时表达：

从-80℃冰箱取出GV3101农杆菌感受态细胞，置于冰面冻融。取0.5-1μg 质粒加入到含有50μL感受态细胞的离心管中，按照冰浴5min、液氮冷冻5 min、37℃水浴热激5min、冰浴5min的先后顺序进行。

(2)加入500μL室温的SOD液体培养基,放置在恒温摇床上，28℃，200 g，振荡培养2-3h后6000g离心2min，弃上清后加入100μL的SOD液体 培养基，悬浮菌体后均匀涂布在含有50mg/L卡那霉素、20mg/L利福平、40 mg/L庆大霉素的YEB平板上，放于28℃恒温培养箱倒置避光培养2天。

(3)设计特异性的引物对平板中的单菌落进行PCR检测，将阳性克隆置 于含有三抗的液体YEB培养基中，扩大培养待菌液浑浊后，取1mL菌液接种 至50mLYEB培养基中进一步扩大培养10h后，4℃，3000g离心15分钟 收集菌体。

(4)将收集到的菌液用MS液体培养基悬浮，使其OD值调至0.6-0.8。 放置室温中避光黑暗静置2-3h。

(5)使用生长约30d左右的有宽大嫩绿叶片的本氏烟草用于注射。

(6)用除去针头的1mL注射器，选取嫩绿宽大的叶片从叶背缓缓注射菌 液直至菌液侵染整个叶片。

(7)将注射的本氏烟草避光培养8h，随后在光照16h，黑暗8h的环 境中培养，培养36h-48h后可进行荧光观察。

GUS植物表达载体的构建：

)pORE-GUS载体是本实验保存。

(2)用NEB公司的NheI-HF和NotI-HF双酶切pORE-GUS植物表达载体， 并通过切胶回收的方式回收骨架载体。

(3)分别设计含有骨架载体切口同源臂的特异性引物扩增启动子序列。

(4)利用NEB公司的Gibson Assembly Master Mix酶按照如下体系加样， 置于PCR仪中50℃孵育30min。

(5)将孵育后的产物直接转化到DH5-α大肠杆菌中，37℃过夜倒置培 养。

(6)挑取单克隆利用特异性引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳， 进行初步检测，将阳性克隆的菌液送公司进行Sanger测序。

(7)提取测序结果正确的菌液的质粒，放置-20℃冰箱保存备用。

稳定遗传的GUS转基因植株的获得：

将构建好的质粒转化到LBA4404农杆菌中，扩大培养后用MS液体培养基 悬浮菌液备用。

(2)打叶盘：将生长在培养瓶中的四叶期的无菌秒在灭菌后的超净工作 台中去除置于滤纸上，用规格为5mm×5mm打孔器选取嫩绿叶片进行打孔， 避开叶脉，将获得叶盘收集，50个叶盘为一组，放置入含有MS液体培养基的 瓶子中备用。

(3)农杆菌重悬液侵染叶盘：将叶盘捞出放入新的培养瓶中，加入含有 LBA4404农杆菌的重悬液，使叶盘完全浸在重悬液中，侵染8min，将叶盘捞 出放置在滤纸上吸干液体，然后用镊子将叶盘放在MS固体培养基上，28℃黑 暗培养两天。

(4)诱导愈伤组织的生成：将叶盘转移至含有植物激素，卡那霉素，羧 苄霉素

的选择培养基上。在28℃，光照16h，黑暗8h的温室中继续培养，期 间每隔14d更换一次选择培养基，直至叶盘分化出愈伤组织细胞团。

(5)愈伤组织分化成芽：将形成的愈伤组织分散开置于新的选择培养基 中继续培养，两周后会从愈伤组织中分化出幼芽。

(6)诱导生根：用无菌手术刀将生长在愈伤组织上的幼芽切下，插入生 根培养基中，培养10-14d后生根，至此，我们获得了无菌的再生烟草植株。

GUS转基因植株鉴定：

提取转基因GUS植株的基因组，设计特异性引物对GUS基因进行PCR扩增， 获得的PCR产物利用全式金公司的PCR产物纯化试剂盒进行纯化(详细步骤见 试剂盒说明书)，送测序公司进行Sanger测序，将测序结果与GUS基因序列进 行比对，成功比对的PCR产物对应的植株即为GUS转基因植株。PCR扩增体系 和程序如下：

GUS染液的配置：

X－Gluc母液：X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷)，用N-N-二甲 基酰胺(DMF)配成20mM的贮存液，分装成每管100μL，保存于-20℃。

(2)X－Gluc基液，配制方法：

GUS染色液：50μL X-Gluc母液+50μL基液。

GUS植株染色：

(1)取GUS转基因植株的幼苗和盛花期的花苞、花、花药、子房(同时 取相同生长状态的含有pORE-GUS空载质粒的植株作对照)分别放入含有GUS 染色液的试管中，通过真空渗入处理，保证组织完全浸泡在染色液中，放入 37℃恒温培养箱中，过夜孵育。

(2)将染色后的组织放入含有70％乙醇中进行脱色处理，期间更换乙醇 2-3次，直至我们的对照组材料呈白色。

(3)通过显微镜或者肉眼直接观察，于对照组比较各组织部位的染色情 况。

NtEC1.2启动子的克隆：

为了获得以上两个基因的启动子序列，首先根据NtEC1.2-1和NtEC1.2-2 基因启动子的预测序列，分别对其设计特异性引物，以烟草花粉组织cDNA为 模板，分别对两条启动子序列进行PCR扩增。同时也对拟南芥的AtEC1.2基因 的启动子为模板进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示(图2)，以上3个 基因的启动子条带大小与预测序列的长度相符合，其中Pro:NtEC1.2-1和 Pro:NtEC1.2-2长度分别为2118bp和2201bp。将PCR产物通过切胶回收连 接到TA载体上，转化到DH-5α大肠杆菌，通过卡那霉素抗性筛选后挑取单克 隆进行菌落PCR初步检测，将阳性单克隆菌液送公司测序，测序结果与获得的 数据库序列进行Blast比对，序列是一致的。将正确的菌液提取质粒于-20℃ 冰箱储存。

具体步骤为：

(1)选取野生型的嫩绿烟草叶片约100mg，加入液氮在研钵中充分研磨， 放入1.5mL离心管中并加入250μL RB1和15μL RNase A，震荡使其充分混 匀。放入55℃水浴锅中孵育15min。12000g离心15min，吸取上清于新的 离心管中，加入100μL PB1后充分混匀，冰浴5min，12000g离心5min。 吸取上清于干净的离心管中加入375μL含有无水乙醇的BB1混匀后加入到离 心柱中，12000g离心30s，弃流出液。然后加入500μL CB1，12000g离心 30s，弃流出液。加入500μL WB1，12000g离心30s，弃流出液。然后12000 g空离2min，将离心柱放入新的1.5mL的离心管中，室温放置一分钟，加入 65℃的ddH₂O室温放置一分钟后，12000g离心1min，洗脱在离心管底部的 液体即为烟草基因组。

(2)设计特异性性引物，利用高保真酶对预测启动子进行PCR扩增，扩 增体系和程序如下：

(2)将PCR产物割胶回收后连接到pEASY-T5载体上，将载体转化到 DH-5α大肠杆菌中，37℃复苏40min后涂布到含有卡那霉素的LB平板中， 37℃倒置避光过夜培养。

(3)从平板中挑取单克隆，利用M13F/R通用引物进行菌液PCR，扩增体 系和程序如下：

(4)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将条带大小与克隆的启动子序列 大小相吻合的菌液或PCR产物送测序公司进行Sanger测序。测序结果与数据 库中获得的启动子序列进行Blast比对，将比对结果完全正确的菌液，扩大培 养，进行质粒的提取，然后放置在-20℃冰箱保存备用。至此，得到了烟草内 源的EC1.2启动子。

构建含有生殖特异性启动子的eGFP植物表达载体：

通过设计了含有SalI酶切位点及骨架载体同源臂的正向引物和含有NcoI 酶切位点及骨架载体同源臂的反向引物特异性扩增启动子序列，使用SalI-HF 和NcoI-HF双酶切pBI221-eEFP植物表达载体并回收其骨架载体。采用无缝克 隆的原理，用NEB公司的GibsonAssembly Master Mix酶，将启动子构建到 PBI221-eGFP载体上。

为了探究克隆的启动子是否有活性，将构建好的eGFP植物表达载体 PBI221-NtEC1.2-1-eGFP、PBI221-NtEC1.2-2-eGFP和PBI221-35S-eGFP通过 化学转化法转入GV3101农杆菌中。将阳性农杆菌菌落扩大培养后，用MS液体 培养基调节菌液OD值到0.6-0.8，黑暗静置2-3h后，用1mL注射器吸取适 当的菌液从本氏烟草的叶背进行缓缓注射，直至整个叶片完全浸染菌液。为了 获得更可靠的结果，将每种菌液在一株本氏烟草的三片叶子进行注射，并用标 签进行标记，注射完成后将本氏烟草置于黑暗环境培养8h，然后进行正常培 养。侵染36-48h后，取不同叶片置于荧光显微镜下进行观察，结果表明，与 对照组(35S：eGFP)相比，2个实验组全都有绿色荧光信号的出现。实验组 绿色荧光的出现说明了eGFP荧光蛋白有所表达，证明了克隆的2个生殖特异 性启动子是有活性的，具体见图3。

为了验证克隆的启动子不仅有活性，而且是特异性表达的，构建了 pORE-NtEC1.2-1P:GUS和pORE-NtEC1.2-2P:GUS植物表达载体。首先分别设计 特异引物克隆启动子得到含有NheI酶切位点和NotI酶切位点的NtEC1.2-1P 和NtEC1.2-2P序列(图4)，用NEB公司的NheI-HF酶和NotI-HF酶分别对 pORE-GUS植物表达载体和克隆的启动子进行双酶切(图4)，分别进行切胶 回收，将载体骨架(pORE-GUS)和片段(NtEC1.2-1P和NtEC1.2-2P)通过T4 连接酶进行连接。连接产物用化学转化法转化到大肠杆菌感受态中，用含有卡 那霉素的LB平板培养后，挑取单克隆菌落，用特异引物进行检测，根据琼脂 糖凝胶电泳结果，选择可能的阳性菌落进行测序，将测序结果正确的菌液提取 其质粒。放置-20℃冰箱储存备用。

pORE-GUS转基因烟草植株的获取：将构建好的pORE-NtEC1.2-1P：GUS和 pORE-NtEC1.2-2P：GUS植物表达载体分别转化到LBA4404农杆菌中，通过抗 性培养基筛选培养后，挑取阳性单克隆扩大培养，用MS液体培养基将菌液悬 浮，并使其OD值达到0.6-0.8，室温黑暗静置2-3h后，倒入含有叶盘的玻 璃瓶中，使其叶盘完全浸没叶盘，侵染8min后，用滤纸吸干液体，将叶盘放 入MS固体培养基中共培养2d后，转入到含有卡那霉素和羧苄霉素的培养基 中进行选择培养，期间更换培养基，直至叶盘脱分化形成愈伤组织，对愈伤组 织进行修剪后继续培养，直至愈伤组织分化成芽，将芽切下放入生根培养基中 培养直至生根。提取生根植株叶片基因组，用特异性引物进行PCR扩增GUS 基因序列，琼脂糖凝胶电泳初步检测后，送公司进行测序，测序结果与数据库 序列进行Blast比对，比对正确的植株即为转基因GUS烟草植株(图5)。

取pORE-NtEC1.2-1P：GUS、pORE-NtEC1.2-2P：GUS植株的幼苗和盛花期 的花苞、花、花药、子房(同时取相同生长状态的野生型植株作为对照)分别 放入配置好的GUS染色液中，由于烟草的组织较厚不易染色，我们将花苞纵向 切割成两半，用去掉针头的针管抽取试管中的空气，使染色液完全渗入烟草组 织中，放入37℃恒温培养箱中，过夜孵育。用75％的无水乙醇对孵育后的各 组织进行脱色处理，脱色2-3次，直至对照组染色完全脱去。然后分别用显微 镜观察和肉眼直接观察。发现与对照组相比，pORE-NtEC1.2-1P：GUS和pORE-NtEC1.2-2P：GUS植株转基因植株的幼苗都是呈现白色。该结果说明GUS 基因在幼苗中没有表达或者表达量极低，进一步表明了NtEC1.2-1P和 NtEC1.2-2P启动子在幼苗期是没有表达的(图6)。而在花苞和种子的染色中， pORE-NtEC-1.2-1P：GUS实验组植株的种子和花苞剖面的子房处显现出明显的 蓝色，而pORE-NtEC1.2-2P：GUS实验组在种子和花苞子房处没有显色或在种 子叶柄处有很浅的蓝色出现，该结果说明了NtEC1.2-1启动子在早期的种子和 子房中是特异表达的，而且从染色的程度看，表达量也很高。而 pORE-NtEC1.2-2P：GUS植株在早期种子和子房处没有明显的染色出现，说明NtEC1.2-2启动子在早期种子时期和子房处没有表达或者在其他时期表达(图 7)。

特异性启动子敲除载体的构建及编辑效率检测：

首先，以含有NtEC1.2-1和NtEC1.2-2启动子序列的T5载体为模板，用 特异性引物分别扩增NtEC1.2-1、NtEC1.2-2启动子序列。然后，用特异性引 物扩增公司合成的rbcS-E9终止子片段。利用NcoI和NotI酶切pORE-Cas9 载体，用T4连接酶将载体中原有的NOS终止子替换成我们克隆的rbcS-E9终 止子。通过NheI和EcoRI酶切pORE-Cas9-rbcS-E9载体，利用T4连接酶将原 有的35S启动子替换成克隆的NtEC1.2-1和NtEC1.2-2启动子，以驱动Cas9的表达。至此，pORE-NtEC1.2-1-rbcS-E9、pORE-NtEC1.2-2-rbcS-E9敲除载 体构建完成。同时，用同样的方法构建了pORE-AtEC1.2-rbcS-E9载体，作为 对照质粒，结构示意图如下图8。

将构建好的pORE-NtEC1.2-1-rbcS-E9、pORE-NtEC1.2-2-rbcS-E9以及对 照质粒pORE-AtEC1.2-rbcS-E9利用农杆菌介导的遗传转化和组织培养技术获 得T0代转基因植株。此处用的为含有利福平(Rif)、链霉素(Str)和卡那霉 素(Kan)的YEB抗性培养基。通过打叶盘、农杆菌侵染、农杆菌共培养、选 择培养、生根培养等农杆菌介导的遗传转化和组织培养获得T0代转基因植株。 用特异性JC-F对植株进行阳性检测。每种转化敲除载体获得的植株为一个品 系，三种品系每种检测20株转基因阳性植株。

T1代转基因植株的获得：

将收取到的3组转基因烟草(pORE-NtEC1.2-1-rbcS-E9、 pORE-NtEC1.2-2-rbcS-E9、pORE-AtEC1.2-rbcS-E9)的T0代种子用75％的酒 精浸泡T0代转基因植株的种子30s后，用灭菌的ddH₂O洗涤2-3次，再用5％ 次氯酸钠浸泡8min，期间轻容震荡2-3次后用灭菌的ddH₂O洗涤2-3次，倒 于滤纸中吸干水分等步骤进行消毒灭菌处理后，将其放在含有卡那霉素的MS 固体培养基上，用封口膜将平板密封，放置在26℃的温室中，光照16h，黑 暗10h。约7d后种子萌发长出幼芽，待幼芽长到1-2cm时，将其分别移栽 到含有卡那霉素的MS固体培养基的大玻璃瓶中继续培养。通过抗性筛选后， 每组植株随机挑选，提取其基因组，并通过特异性引物进行PCR扩增载体sgRNA scaffold序列，琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后，将阳性菌落送公司进行测序， 将测序结果进行Blast比对，筛选出每组烟草的转基因植株。检测了pORE-NtEC1.2-1-rbcS-E9、pORE-NtEC1.2-2-rbcS-E9品系各20株，检测到 的转基因植株分别为16株和19株，转基因阳性率分别为80％和95％。检测 了pORE-AtEC1.2-rbcS-E9品系25株，检测到的转基因植株为21株，转基因 阳性率为84％。

T1代转基因植株突变检测：

分别提取检测结果为阳性的转基因株系的基因组，用检测引物JC-F和 U26-R检测叶片基因组中的sgRNA及gRNA scaffold基因片段鉴定烟草是否为 转基因植株。用正向引物5'CTGAAGCAGTCACCAAGAAT 3'和反向引物5' AGCTATCTGATTAATGGACAAA 3'扩增烟草PDS基因序列，进行PCR扩增，将PCR 产物切胶回收后连接到T载体上，转化涂板后，挑取单克隆，进行琼脂糖凝胶 电泳初步检测，将条带大小与扩增片段相吻合的样品送公司进行测序检测。检 测结果与PDS基因序列进行Blast比对，结果发现在检测的20株 pORE-AtEC1.2-rbcS-E9转基因品系中有4株发生了突变，突变效率为20％， 突变形式均为碱基的缺失。检测的15株pORE-NtEC1.2-1-rbcS-E9转基因品系 中有4株发生了突变，突变效率为26.7％，突变形式为碱基的缺失和插入。 检测的20株pORE-NtEC1.2-2-rbcS-E9转基因品系中有1株发生了突变，突变 效率为5％，突变形式为碱基的替换，突变信息见表1。

表1T1代转基因植株突变信息统计表

其中加深字母代表PAM区，斜体字母和点代表碱基的缺失、插入和替换。 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本 发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由 所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种烟草生殖细胞特异高表达基因及应用

<130> WPM210175

<140> 2021102866437

<141> 2021-03-17

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(NtEC1.2-1)

<400> 1

atggctcctt tcaaacttcc attagtactt ttaatctcgt ggcttctgac aacaacaacg 60

gcaataaact tgtccaaaat gaaactagga caagacattg ttgctagact tcaactcgga 120

gaaggtagca tgccagtgtg ctggaatgca ttatttgaga taaaatcatg cacgaatgag 180

atcatacttt tcttcttcaa tggcgaatct tatttaggga ggaaagattg ttgtaaggct 240

attagaacta ttacttataa ctgttggcct tctatgctta cttccattgg ttttactgct 300

gaggaagttg atattctacg tggttattgt ggaactccat cacctcaacc tgctgtggcc 360

attaaagttt aa 372

<210> 2

<211> 2186

<212> DNA

<213> 人工序列(NtEC1.2-1启动子)

<400> 2

ataataggtg gaggaggacg ggtaacaggt ctgggtcggg gagccggagg aagagtagta 60

gcttggctac tagattcacc aattttagat tttcccttac ccttaccacc aaaaatattt 120

tttaaagaaa atgccatatt aattataatt atactaaata aaactaacaa aactataata 180

ttaaaactta agagttggaa cgagtttacc gaattgacga acaacttctt gaaaattgaa 240

tatcgttgaa gacttgaata cttcaattca ccaacttcac aatttttcac gaaattgcaa 300

taataaagta agcaattata gaagaaaatt agagagagat tgatgaattt gtgagtaaaa 360

atgaaagaat ggggggtatt tatagttgag aattgagaaa aagtgtaatt ataaaaagtt 420

tggggttaaa gcaaagtttg ggggccaaat ggctattttt taaagtgccc aacggataga 480

ttttgaaggc caacggctag attttaaaaa tctgaccgtt ggtctttttt ttaaaattag 540

ccgttggagc ctgttaggcc tgttgggccc ggttgaaccg gcccaggccc gcctgccggt 600

cccgggttca cgggctattt gtgttgaact ggcccaccac gagcttttgc accactagag 660

cccaggcctg gttgaaccag cccgtttggc ccgcggtcct gggccaggcc cgggccacaa 720

tacagcctta tatggaactc ctgcgtttaa acttccagaa tattatgttg gaacttcagc 780

acattatgct gaaatctcat atgtaaaaaa ttcgaactcc agcatattat gctggaatat 840

ttccgtattt ttaagggtgt ttttgttcaa attttatctt tacaagaaaa atgtctaaat 900

ttcgattact tttgaaactt tgactatttt tcaattacca atttaaatct agttagtttt 960

tattttttct cgaattcaac agattgctat ccaatctaac atgggccaat ccaaactata 1020

ctcttgattc aagtcaaacc aaacactcag gctggtcata agttacgaat cttgtgttca 1080

actgttcata ccggatgccg ataatcccct agtcaccaga aaacgagaat aacaatgcag 1140

aaattttcaa atgaaaatgg aataacaata ataaataaag actatttcaa gtgaatacac 1200

tctaatgaat aatataagaa gaatattttg ggcagtcttt tctaggtgaa tctctcccat 1260

aaaaaaaaaa ggaatctgtc gcatcccatt tttgcgggat ttcaaaagtt atcgtcagtt 1320

ggaactttga atcggttcct tttcaattta attggagctt tgattctcac ccttcccctt 1380

tttgtttttt cttttattta ttattgggtg gggagggaga aggttcttga tttggttggc 1440

catgaattat agaaacaaat ctaagtaaag caaatggttt taattaattt tctcgtttca 1500

atcttttatg acttagctgg tagttaaact aagatgatat aataaatttt tatactttat 1560

gtagcaaaga gaaaggtaca agaatttgct caaaatacta aagctagaat ttggattgcc 1620

tctgcagtgg attttctttt agatatgtga tgtctaaatt tgaaatatct tttgctcaac 1680

gcaataaaag aaataaagga aaagtgtgaa aatactagta ctatttttta gctccgtttg 1740

agatattaac attttaagtg ctatcatatt ataaaagacg tttcaattat aggcagagat 1800

aaaatactag tttaggttgg aactagtcta aaataagtac agtattaatt aagttaggta 1860

tctacacata taattccttt tggtgatcat agctagctgt actatgattg gattcctttt 1920

ttaattatcc aaaacgttac gttgattaat atttctatca gacaaaatga atctttgatt 1980

atatttctaa cttttcacat tccacatata ttaactcata aattaaattt attaaaggta 2040

tatcaaattc ttaattaatt ctgccccttc aacttacatc agttacactc tctatagctt 2100

actctacaac ctataaatca ccatgtccaa accttcattt ccttcaccat aacgcactct 2160

acacatattc tacactacat ttcaag 2186

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(NtEC1.2-1引物)

<400> 3

aacctgcagg ataataggtg gaggaggacg 30

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(NtEC1.2-1引物)

<400> 4

gctctagact tgaaatgtag tgtagaatat gtg 33

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(NtEC1.2-1特异定量引物)

<400> 5

ggcgccccgc ggaaagcttg ataataggtg gaggaggacg 40

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(NtEC1.2-1特异定量引物)

<400> 6

ggccgcaaag tcgacgaatt cttgaaatgt agtgtagaat atgtg 45

Claims (4)

1.一种烟草生殖细胞特异高表达基因NtEC1.2-1的应用，其特征在于，所述应用为由烟草生殖细胞特异高表达基因的启动子NtEC1.2-1P介导获得转NtEC1.2-1基因烟草植株，所述基因NtEC1.2-1在生殖器官中特异高量表达，基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子NtEC1.2-1P在早期的种子和子房中特异表达，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，启动子NtEC1.2-1P介导基因编辑载体在烟草生殖细胞中特异高表达，获得转基因烟草植株。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因编辑载体为敲除目标基因PDS的生殖细胞特异表达的编辑载体pORE-NtEC1.2-1-rbcS-E9。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将含有敲除载体pORE-NtEC1.2-1-rbcS-E9的农杆菌侵染烟草植株，获得转基因烟草植株。

Images