CN105505984B - 水稻呼吸爆发氧化酶基因OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体及其应用 - Google Patents
水稻呼吸爆发氧化酶基因OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105505984B CN105505984B CN201610028697.2A CN201610028697A CN105505984B CN 105505984 B CN105505984 B CN 105505984B CN 201610028697 A CN201610028697 A CN 201610028697A CN 105505984 B CN105505984 B CN 105505984B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- osrboh
- loc
- os01g25820
- rice
- respiratory burst
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一个水稻呼吸爆发氧化酶OsRboh(LOC_Os01g25820)及其在叶色改变及育性降低中的应用，属于生物技术领域。该载体为含有双35S启动子和水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因植物表达载体。在水稻中过量表达OsRboh(LOC_Os01g25820)，获得的转基因植株的叶色变黄、过氧化氢含量升高、育性明显降低。以上结果表明OsRboh(LOC_Os01g25820)在水稻的发育过程中发挥重要作用，为研究植物的发育提供了新的基因资源，还可以作为一种潜在的工具来改良植物的形态，应用在分子育种和遗传改良上。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻呼吸爆发氧化酶基因OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体及应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
活性氧(reactive oxygen species，ROS)是生物体一类有氧代谢的副产物，除作为有毒分子伤害细胞外，还作为一类重要的信号分子参与生物体的生长和发育。
研究发现，ROS 的来源包括质膜NADPH 氧化酶、过氧化物酶及胺氧化酶，其中由NADPH 氧化酶介导产生的ROS 最受关注。NADPH氧化酶以定位于细胞质边缘的NADPH为电子供体，催化O2生成超氧阴离子(O2 －·)，随后超氧阴离子歧化生成H2O2，H2O2再经芬顿反应生成·OH。植物NADPH 氧化酶又称呼吸爆发氧化酶（Respiratory burst oxidasehomologue，Rboh），所有植物Rboh蛋白都包含约300个氨基酸大小的N端区，该区存在一对保守的Ca2+结合EF手性结构域。植物中的呼吸爆发氧化酶（Respiratory burst oxidasehomologue，Rboh）主要由呼吸爆发氧化酶基因(Respiratory Burst OxidaseHomologue,Rboh)所控制。
植物Rboh基因的功能主要集中于两个方面：参与胁迫反应和调控生长发育。当病原菌侵染拟南芥细胞时，AtRbohD和AtRbohF基因表达产生大量的ROS来增强组织的抗病性。拟南芥atRbohD/atRbohF双突变体中，Ca2+通道的ABA活化与气孔关闭不能正常进行，通过外源施加H2O2可以部分修复这些缺失的功能。拟南芥AtRbohC基因的突变导致根和根毛生长受抑制，其突变体rdh2 内ROS 的水平较野生型有大幅度的降低，用NADPH 氧化酶的抑制剂二亚苯基碘（DPI）处理可抑制其活性，产生与突变体相同的情况，而ROS 处理突变体根部则可部分恢复表型。番茄反义Rboh 植侧枝增加，花序和花数量为野生型的2-3 倍，大多数花表现不育。菜豆PvRbohB 干扰植株中侧根的密度降低，根瘤的形成受影响，从而影响植株的固氮能力。
水稻(Oryza sativa L.) 是最主要的粮食作物之一，也是一种重要的模式生物，对相关基因进行功能研究具有重要作用。随着水稻功能基因组研究的不断深入，许多重要农艺性状相关基因相继被分离。Respiratory Burst Oxidase Homolog (Rboh) 基因直接参与ROS的形成，但在水稻中的功能并不清楚，值得进一步的研究。我们的研究发现OsRboh(LOC_Os01g25820)的过量表达的水稻植株中叶片变黄，育性降低，利用这一特性可以应用在水稻分子育种和遗传改良上。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因载体及在叶色和育性改变中的应用，该载体含有水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的上游连有双35S启动子。
本发明的上述植物表达载体为PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)，由下述方法构建而成：
（1）根据NCBI上公布的OsRboh(LOC_Os01g25820)全长cDNA (AK065117)序列，设计两端引物：
OsRboh-OE-F:AGATCTATGGCTGACCTGGAAGCAGGCATGG (Bam HI)
OsRboh-OE-R:CACGTGTTAGAAGTTCTCCTTGTGGAAATCA (XbaI)
以日本水稻基因组研究中心(RGRC)购得的质粒AK065117为模板进行PCR扩增，获得OsRboh(LOC_Os01g25820)全长。
（2）回收OsRboh(LOC_Os01g25820)的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE。
（3）使用Bam HI和 XbaI 酶切pMD18-OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE，回收OsRboh(LOC_Os01g25820)片段，同时用Bam HI和XbaI酶切PHB，回收后连接，转化感受态细胞，获得植物表达载体PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE。
本发明的另一目的是公开水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE在叶色和育性改造中的基因工程应用。在水稻中过量表达OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE的转基因植株的叶色变黄、过氧化氢含量升高、育性明显降低。该载体可作为一种潜在的工具应用在水稻分子育种和遗传改良上。
附图说明
（1）图1为pMD18T-OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE的BamHI和XbaI酶切图。
（2）图2为PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE的BamHI和XbaI酶切图。
（3）图3为转基因水稻植株的PCR鉴定图。
（4）图4为转基因水稻植株呈现黄化苗表型；其中A为野生型，B为转基因水稻。
（5）图5为转基因水稻植株呈现育性降低表型；其中A为野生型，B为转基因水稻。
（6）图6为转基因水稻植株叶片中过氧化氢的染色，其中A为野生型，B为转基因水稻。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连) 产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：水稻PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE载体的构建
（1）OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的扩增
根据NCBI上公布的OsRboh(LOC_Os01g25820)全长cDNA (AK065117)序列，设计两端引物：
OsRboh-OE-F:AGATCTATGGCTGACCTGGAAGCAGGCATGG (Bam HI)
OsRboh-OE-R:CACGTGTTAGAAGTTCTCCTTGTGGAAATCA (XbaI)
以日本水稻基因组研究中心(RGRC)购得的质粒AK065117为模板，高保真酶KOD-Plus进行PCR 扩增获得OsRboh(LOC_Os01g25820)全长。PCR 反应条件为：94℃ 5 min；94℃30 s；56℃ 30 s；68℃ 3.0 min，35个循环；68℃ 5 min。PCR 产物用1.2%琼脂糖进行电泳检测，扩增片段大小约2718bp，与预期大小一致（图1）。
（2）OsRboh(LOC_Os01g25820)片段的胶回收
对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。
（3）OsRboh(LOC_Os01g25820)片段加尾
取1.5 ml灭菌的eppendorf管，依次加入回收的PCR产物14μl、10× Taq DNA聚合酶缓冲液2μl、10mM dNTP 2μl、Taq DNA聚合酶2μl；72℃处理45 min；先加0.18 mL无菌水，再加20μl 3M醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀60 min，12,000rpm，4℃离心10min。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20μL无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于-20℃保存备用。
（4）OsRboh(LOC_Os01g25820)片段的T/A克隆和测序
将回收片段连接到pMD18载体上，其具体步骤为：向1.5 ml 离心管中分别加入：OsRboh(LOC_Os01g25820)片段的cDNA 5μl、pMD18载体0.5μl、10×T4 DNA连接酶缓冲液 1μl, T4 DNA连接酶 1μl，加无菌水至10μl，用封口膜封好；置于16℃连接4-6h。将100μl 感受态肠杆菌E.coli DH5α加入连接体系中混匀；混合液冰浴30 min，42℃热刺激90 s后，冰浴5min；加入800μl LB液体培养基，37℃、200 rpm摇床培养45min 使菌体复苏；培养结束后，常温3,000 rpm 离心2 min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml 时，使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37℃过夜培养；挑取菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，收集菌体，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒pMD18-OsRboh(LOC_Os01g25820)，具体方法为：向0.5 ml的离心管中分别加入：质粒DNA（50ng/μl）2μl、Bam HI 0.5μl、XbaI 0.5μl、10×buffer（K）2μl，使用无菌水补足20μl；37℃反应4h；然后将酶切正确的重组质粒pMD18-CsMADS1进行测序验证插入基因的正确性。
（5）表达载体PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE的构建
使用Bam HI和XbaI对质粒pMD18-OsRboh(LOC_Os01g25820)和PHB载体进行双酶切，分别获得5’端带有Bam HI和3’端带有XbaI的OsRboh(LOC_Os01g25820)片段和PHB载体，电泳后分别进行胶回收，16℃连接4-6h；将100μl感受态肠杆菌E.coli DH5α加入6μl连接体系中混匀；混合液冰浴30min，42℃热刺激90s后，冰浴5 min；加入800μl LB液体培养基，37℃、200 rpm 摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常温3,000 rpm 离心1 min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时，使用移液枪混匀，接入带有Kan抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37℃过夜培养；挑取菌落接种于LB液体+Kan的培养基，37℃、180rpm培养12h后，提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE，具体方法为：向0.5 ml 的离心管中分别加入：质粒DNA（50ng/μl）2 μl、Bam HI 0.5μl、XbaI 0.5μl、10×buffer（K）2μl，使用无菌水补足20 μl；37℃反应4h；经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE可酶切出预期大小的片段（图2）。将酶切正确的重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序进行序列验证（其核苷酸序列如 SEQ ID NO1所示），最后获得表达载体PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE。
实施例2：PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)-OE转农杆菌EHA105
(1) 农杆菌感受态细胞制备
挑取农杆菌 EHA105 单菌落接种于5ml YEB 培养基中，28℃摇培过夜，按 1:100的比例接种于 50 ml YEB培养基中扩培，28℃继续培养约6-7h至OD600=0.4-0.6。将菌液置于冰上30min；5000 rpm，4℃离心5min，弃上清，将菌体悬于10 ml 0.15 M NaCl 中；5000rpm，4℃离心5min，弃上清，菌体用1 ml 20 mM CaCl2，4℃）轻轻悬浮，每管 200μl分装，或加入终浓度为 20％的无菌甘油，-70℃保存。
(2)农杆菌的转化及鉴定
将 10μl 质粒 DNA 加入200μl农杆菌感受态中，混匀，冰浴30min，液氮冷冻 3-5min，37℃水浴5min，加入1 ml YEB 培养基，28℃摇培3-4h。10000rpm，室温离心 30s，弃上清，加入200μl YEB培养基重悬菌体，涂于YEB 培养基上，28℃培养2天；碱裂解法提取农杆菌质粒DNA，质粒再重新转化大肠杆菌（DH5α），过夜培养后，挑取单菌落液体培养，提取质粒DN并进行PCR鉴定。
实施例3：含PHB-OsRboh(LOC_Os01g25820)的农杆菌EHA105转化水稻
(1) 材料的预处理
首先将干种子去壳, 去壳种子在70%乙醇中浸泡1 分钟,然后在50%漂白剂
(含2%HClO)中灭菌20 分钟,再用无菌水洗4 次, 将整个种子转移至MD2 培养基
平板上，26℃暗培养4 天。当黄色愈伤组织在胚轴出现时（通常需要四天，在这
期间，根通常有2-5cm 长），切除根部和胚乳，将胚轴转移至一个新鲜的NBD2
培养基平板，钝形面向上, 26℃暗培养7-10 天。
(2) 挑取EHA105 农杆菌单菌落，在100ml 含相应抗性的YEB 培养基中震荡培
养约16 小时（200rpm，28℃），至OD600 为0.6-0.8 左右。
(3) 3000rmp 离心10 分钟，在AAM-AS 液体培养基液体培养基中重悬沉淀至浓
度OD600 为0.6-0.8。
(4) 将300 个带有黄色愈伤的胚浸泡在细菌悬液中20 分钟，间或震荡。
(5) 从悬液中收集胚，在两张无菌滤纸间吸干。
(6) 在NBD2-AS 培养基平板表面放上无菌滤纸，把胚放在滤纸表面，26℃暗培
养2 天。
(7) 把胚的根部去掉，把胚放入新NBD2 培养基平板上（含潮霉素和头孢霉素），
切割面向下，26℃暗培养12 天。
(8) 再转入新鲜的NBD2 培养基平板上（含潮霉素和头孢霉素），26℃暗培养12-15
天，在这个时间可以看见新的愈伤长出。
(9) 把抗性愈伤（将抗性愈伤从胚上切下）放在Pre-MS 预分化培养基平板上，
26℃暗培养8 天。
(10) 把愈伤放在生芽培养基MS-H 分化培养基平板上，26℃（12 小时光照，12
小时 黑暗）培养，当绿芽出现（大约15 天），立即将它们转入新鲜的MS-H 培
养平板上不要加潮霉素（如果只看见绿点，立即将它们转入新鲜的MS-H 培养基
平板上加入终浓度为25mg/L 的潮霉素，防止愈伤形成），新的无根苗在10 天内
形成。
(11) 将无根苗移入MSNH 再生培养基上，诱导根的形成。
(12) 当根形成后，将培养瓶打开7天后，把苗移入温室。
实施例4：转基因植株的鉴定和分析
(1)水稻DNA的提取
将适量的经筛选的水稻叶片放入1.5 ml的离心管中，加入400 μl的CTAB抽提缓冲液，用蓝色小棒研磨成浆状，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），猛烈摇匀，12000 rpm，离心10 min。取上清至新的离心 管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M 醋酸钠(PH5.2)，剧烈混匀使DNA成团，放入-20℃沉淀2hr以上。随后12000 rpm，离心10 min。弃上清，沉淀用 70% 乙醇洗涤一次后室温晾干，加适量的TE或超纯水溶解。
（2）转基因水稻植株的鉴定
以抽提的DNA为模板、使用引物OsRboh-F：AACTTCAGCATGCGAAGAAGG和载体上的引物rbcs-R：ATTAACTTCGGTCATTAGAGGC 进行PCR扩增OsRboh片段，PCR的25μl体系为：PCR 缓冲液（10*） 2.5μl、Taq 0.5μl、cDNA模板2μl、10mM dNTP 0.5μl、10μM OsRboh-F引物1μl、10μM OsRboh-R引物1μl、使用无菌水补足25μl。反应条件为：94℃5min，35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，72℃反应10min。可以发现大部分转化苗都为阳性植株，能扩增出目的条带，见图3。
(3)转基因水稻植株表型分析
通过尼康D7100数码相机进行拍照，进行表型观察，可以发现在苗期会出现白化苗，见图4，成熟期育性降低，见图5。
转基因水稻植株的DAB染色
过氧化氢的染色采用DAB染色试剂盒（北京赛驰生物科技有限公司）。按照DAB试剂盒说明书的方法，用去离子水将B显色液（B显色液与去离子水按照1:25体积比配制）稀释为B工作液，然后将B工作液与A显色液以25:1的体积比配制成DAB染色液，配好后立即使用。将野生型和转基因植株的叶片置于配好的15ml DAB染色溶液中，放置在光照培养箱中反应8h（27℃,35%湿度，3000LX光照强度），将叶片取出并在盛有20ml 75%乙醇的试管中煮沸脱色，通过尼康D7100数码相机进行拍照。可以发现，转基因植株中的过氧化氢含量明显要高于野生型中。
SEQ ID NO：1
〈210〉：1
〈211〉:2718
〈212〉：DNA
〈213〉：水稻（Oryza sativa L.）
〈400〉: 1
ATGGCTGACC TGGAAGCAGG CATGGTTGCT GCTGCCACAG ACCAGGGCAA TTCAACAAGG 60
TCACAAGATG ACGCAGCCAC ACTGATCCCG AACAGTGGCA ATCTGGGCTC GAGCAACAGG 120
AGCACCAAGA CGGCCAGGTT CAAGGACGAC GACGAGCTGG TCGAGATCAC CCTCGACGTG 180
CAGCGCGATT CGGTGGCAAT CCAAGAAGTG AGAGGGGTGG ATGAGGGTGG CTCCGGGCAC 240
GGTACCGGGT TCGACGGCCT GCCACTGGTG TCACCCTCGT CGAAGAGCGG AAAGCTGACG 300
TCAAAGCTCA GGCAGGTGAC CAATGGGCTC AAGATGAAGA GCTCCAGCAG GAAGGCGCCA 360
TCCCCGCAGG CGCAGCAGTC TGCGAAGAGG GTGAGGAAGA GGCTGGACAG GACCAAGAGC 420
AGCGCCGCCG TGGCGCTCAA AGGATTGCAG TTTGTGACTG CAAAGGTTGG CAATGACGGC 480
TGGGCCGCGG TGGAGAAGCG GTTCAATCAG CTGCAGGTGG ATGGTGTGCT GCTCCGTTCA 540
AGATTTGGGA AATGCATTGG AATGGATGGG TCCGACGAGT TTGCGGTGCA AATGTTCGAT 600
TCTCTGGCGA GGAAGAGAGG GATAGTGAAG CAGGTGCTCA CTAAGGACGA GCTCAAAGAT 660
TTCTATGAGC AATTGACTGA TCAGGGGTTT GACAATCGTC TTCGGACATT CTTTGACATG 720
GTTGACAAGA ACGCTGATGG AAGGCTCACA GCAGAAGAGG TTAAGGAGAT TATTGCCCTT 780
AGTGCATCAG CAAACAAACT TTCCAAGATC AAGGAGCGAG CTGATGAGTA CACAGCACTC 840
ATTATGGAAG AGCTTGACCC TACAAACTTG GGATACATCG AGATGGAGGA CTTGGAAGCA 900
CTATTGCTTC AGTCACCATC TGAAGCTGCT GCAAGATCAA CAACGACGCA CAGCTCCAAA 960
CTTAGCAAAG CTCTTAGCAT GAAGCTTGCG TCTAACAAAG AAATGAGCCC AGTTCGTCAT 1020
TACTGGCAGC AGTTCATGTA CTTCCTTGAA GAGAATTGGA AGCGCAGTTG GGTTATGACT 1080
CTGTGGATCT CAATCTGCAT TGCCCTTTTC ATTTGGAAGT TCATTCAGTA CCGTAATCGA 1140
GCCGTATTCG GCATCATGGG TTATTGTGTG ACCACTGCAA AGGGTGCTGC AGAGACCCTC 1200
AAATTCAACA TGGCTTTGGT CCTACTTCCT GTCTGCAGAA ATACAATCAC ATGGATTCGG 1260
TCAAAGACAC AGGTTGGAGC TGTTGTACCC TTCAACGACA ATATAAACTT TCATAAGGTC 1320
ATAGCCGCAG GTGTTGCAGT TGGTGTTGCT TTGCATGCAG GTGCTCATCT GACATGTGAT 1380
TTTCCCCGGC TGCTCCATGC GAGTGATGCA CAATATGAAC TAATGAAGCC CTTCTTTGGG 1440
GAGAAGAGGC CACCAAATTA CTGGTGGTTT GTAAAGGGAA CTGAAGGCTG GACAGGTGTG 1500
GTCATGGTGG TGCTCATGGC AATAGCATTT ACATTAGCCC AACCATGGTT CCGACGTAAC 1560
AAGCTCAAGG ACTCCAATCC CCTCAAAAAA ATGACTGGCT TCAATGCCTT CTGGTTTACC 1620
CACCACCTGT TTGTCATTGT GTACACTTTG CTCTTTGTCC ATGGAACGTG CTTGTATCTA 1680
AGCAGGAAAT GGTACAAGAA GACGACATGG ATGTACCTCG CTGTTCCTGT TGTCCTGTAT 1740
GTAAGTGAGC GTATTCTTCG GTTGTTTAGG AGCCATGATG CAGTTGGGAT TCAGAAGGTT 1800
GCAGTGTATC CCGGGAATGT ATTGGCTCTT TATATGTCGA AGCCACCTGG TTTCAGATAC 1860
CGTAGTGGGC AGTACATCTT CATAAAATGC ACTGCTGTGT CTCCATATGA ATGGCATCCA 1920
TTTTCCATAA CATCAGCACC TGGAGATGAT TATCTTAGTG TTCATATTCG CACAAGGGGT 1980
GATTGGACTT CACGGCTTAG AACTGTTTTC TCTGAGGCAT GCCGACCCCC CACTGAGGGA 2040
GAAAGTGGAC TACTTAGAGC TGACCTTTCC AAGGGAATAA CGGACGAAAA AGCAAGATTC 2100
CCAAAACTTT TGGTCGATGG ACCGTATGGT GCACCGGCAC AAGATTACCG TGAATACGAT 2160
GTGCTACTTC TCATCGGGCT GGGCATCGGA GCCACCCCTT TGATTAGCAT TGTGAAGGAC 2220
GTGCTTAACC ACATTCAAGG TGAGGGATCA GTTGGAACCA CGGAGCCGGA GAGCAGCAGC 2280
AAGGCGAAGA AGAAACCTTT CATGACGAAG AGAGCCTACT TCTACTGGGT GACGAGAGAG 2340
GAGGGCTCGT TTGAGTGGTT CAGAGGCGTC ATGAACGAGG TGTCTGAGAA GGACAAGGAT 2400
GGAGTCATTG AGCTCCATAA CCACTGCTCA AGCGTGTACC AGGAAGGCGA TGCTCGTTCT 2460
GCTCTCATTG TCATGCTCCA AGAACTTCAG CATGCGAAGA AGGGCGTCGA TATCTTGTCG 2520
GGAACTAGTG TGAAGACCCA TTTCGCACGA CCTAATTGGC GAAGCGTCTT CAAGAAGGTT 2580
GCGGTCAGCC ATGAGAACCA GCGCGTCGGT GTGTTCTACT GTGGTGAGCC TGTGCTGGTT 2640
CCCCAACTAA GGCAGTTGTC AGCAGATTTC ACCCACAAGA CAAACACAAG ATTTGATTTC 2700
CACAAGGAGA ACTTCTAA 2718
Claims (1)
1.水稻呼吸爆发氧化酶基因OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体的应用，其特征在于：所述水稻呼吸爆发氧化酶基因OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体用于改变水稻叶色及育性；
OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的扩增引物：
OsRboh-OE-F:AGATCTATGGCTGACCTGGAAGCAGGCATGG(BamHI)；
OsRboh-OE-R:CACGTGTTAGAAGTTCTCCTTGTGGAAATCA(XbaI)；
OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体含有水稻OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的编码区全长、双35启动子，所述OsRboh(LOC_Os01g25820)基因的GenBank登录号为AK065117。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610028697.2A CN105505984B (zh) | 2016-01-18 | 2016-01-18 | 水稻呼吸爆发氧化酶基因OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610028697.2A CN105505984B (zh) | 2016-01-18 | 2016-01-18 | 水稻呼吸爆发氧化酶基因OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105505984A CN105505984A (zh) | 2016-04-20 |
| CN105505984B true CN105505984B (zh) | 2023-08-15 |
Family
ID=55714277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610028697.2A Active CN105505984B (zh) | 2016-01-18 | 2016-01-18 | 水稻呼吸爆发氧化酶基因OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105505984B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113416747B (zh) * | 2020-03-03 | 2023-09-12 | 山东舜丰生物科技有限公司 | 一种创建温度敏感型雄性不育植物的方法 |
| CN116121278B (zh) * | 2023-02-10 | 2023-10-31 | 西南大学 | CsRBOH5的磷酸化突变及其在提高柑橘溃疡病抗性中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103710382A (zh) * | 2014-01-20 | 2014-04-09 | 江西农业大学 | 一种改变植物花型的双35s过表达载体及其应用 |
-
2016
- 2016-01-18 CN CN201610028697.2A patent/CN105505984B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103710382A (zh) * | 2014-01-20 | 2014-04-09 | 江西农业大学 | 一种改变植物花型的双35s过表达载体及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 水稻 OsRbohB 基因原位杂交载体的构建及其在花药中的表达分析;胡丽芳 等;《广东农业科学》;20141231;第1.2.2节、第121页左栏第3段、第3节讨论 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105505984A (zh) | 2016-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PH12018000119A1 (en) | A transgenic plant and the method for producing the same | |
| CN111218470B (zh) | 一种调控植物抗逆性的方法 | |
| CN103451228B (zh) | 一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法 | |
| WO2020221029A1 (zh) | 玉米类受体激酶基因ZmRLK7及其应用 | |
| US20210163973A1 (en) | Plant constitutive expression promoter and applications thereof | |
| CN107881172B (zh) | 一种逆境诱导型启动子、逆境诱导型启动子植物表达载体及诱导目标基因表达方法 | |
| JP4677568B2 (ja) | 窒素固定活性の高い根粒を着生する植物の作出法 | |
| CN112280786B (zh) | 一种养分高效利用耐除草剂玉米连hh2823转化事件及其特异性鉴定方法和应用 | |
| CN112011557B (zh) | 一种水稻基因OsRMT1及其在制备具有高温胁迫耐性转基因植物中的用途 | |
| CN105505984B (zh) | 水稻呼吸爆发氧化酶基因OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体及其应用 | |
| CN106967720B (zh) | 一个逆境诱导启动子SlWRKY31P的克隆及应用 | |
| CN106916818B (zh) | 一种干旱诱导型启动子、其制备方法、重组表达载体及转化子 | |
| CN113416735B (zh) | 一种烟草生殖细胞特异高表达基因及应用 | |
| CN111424038B (zh) | 一种春兰CgWRKY40基因及其应用 | |
| CN111454966B (zh) | 一种春兰CgWRKY4基因及其应用 | |
| CN108424911B (zh) | 种子特异性双向启动子及其应用 | |
| CN111304222A (zh) | 一种春兰CgWRKY11基因及其应用 | |
| CN117660451B (zh) | 一种紫花苜蓿根尖特异启动子及其应用 | |
| CN111424041B (zh) | 一种春兰CgWRKY49基因及其应用 | |
| CN114231556B (zh) | GmECT2在调控植物高度方面的应用 | |
| CN111454987B (zh) | GhNAC091基因在提高植物光合利用效率和强光耐受中的应用 | |
| CN107142262B (zh) | 一种水稻种子特异性启动子Posseed及其应用 | |
| JP3772974B2 (ja) | 植物由来のプロモーター | |
| CN116444637A (zh) | 调控植物叶片衰老和产量相关蛋白GmWRKY100及其编码基因与应用 | |
| CN105669849B (zh) | 小麦抗病相关蛋白TaCAD12及其相关生物材料与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: He Haohua Inventor after: Bian Jianmin Inventor after: Xu Jie Inventor after: Sun Xiaotang Inventor after: Zhou Dahu Inventor after: Hu Lifang Inventor after: Liu Shiqiang Inventor after: Zhu Changlan Inventor after: OuYang Linjuan Inventor after: Peng Xiaosong Inventor after: Chen Xiaorong Inventor after: He Xiaopeng Inventor after: Fu Junru Inventor before: Hu Lifang Inventor before: Bian Jianmin Inventor before: Xu Jie Inventor before: Sun Xiaotang Inventor before: Zhou Dahu Inventor before: He Haohua Inventor before: Liu Shiqiang Inventor before: Zhu Changlan Inventor before: Ouyang Linjuan Inventor before: Peng Xiaosong Inventor before: Chen Xiaorong Inventor before: He Xiaopeng Inventor before: Fu Junru |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |