CN112280786B - 一种养分高效利用耐除草剂玉米连hh2823转化事件及其特异性鉴定方法和应用 - Google Patents

一种养分高效利用耐除草剂玉米连hh2823转化事件及其特异性鉴定方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种转AlHAK1和bar基因的养分高效利用耐除草剂玉米连HH2823玉米转化事件及其特异性鉴定方法和应用，所述转化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼序列，以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼序列。本发明提供的玉米转化事件可实现将外源基因特异性引入到玉米品系中，赋予受体玉米钾营养高效利用以及耐除草剂草铵膦的能力。外源基因在受体玉米中能够稳定遗传；外源基因的表达可以提高受体玉米的钾吸收利用效率。本发明检测方法可以为利用转化事件进行分子标记检测，提高育种工作效率。

Description

一种养分高效利用耐除草剂玉米连HH2823转化事件及其特异 性鉴定方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于转AlHAK1基因和bar基因的养分高效利用耐除草剂玉米连HH2823玉米转化事件及其特异性鉴定方法和应用。
背景技术
玉米是我国重要的粮食作物和饲料作物，也是全世界总产量最高的农作物，其种植面积和总产量仅次于水稻和小麦。玉米产量的高低、经济效益的好坏直接影响着我国粮食安全以及农业生产的发展。
钾离子是维持植物正常生理代谢活动所必需的大量元素，它参与植物的生长发育、光合作用、酶的动态平衡、维持细胞内外渗透压、蛋白质合成、细胞延伸、调节气体间交换调节，叶片和气孔运动以及不同信号间的转导过程等生命活动。在植物的整个生长周期和发育中起着至关重要的作用，植物缺钾会造成根系发育不良，生长缓慢，严重时会造成植物的产量和品质的下降。
钾是玉米生长发育必需的营养元素之一，对其生长发育和产量至关重要。随着钾肥用量的增加，钾肥利用率普遍降低，损失提高，农业生产成本增加，也产生了一系列不良的环境反应。因此在保证产量的前提下，提高化肥利用率，降低肥料的使用量，改善农业生态环境成为当前乃至未来很长一段时期我国农业生产迫切需要解决的主要问题之一。培育耐低钾转基因玉米品种是解决这一问题的有效途径。
发明内容
本发明目的是提供优良的养分高效利用耐除草剂玉米转化事件连HH2823，这一转化事件通过大量筛选获得。将外源基因AlHAK1和bar引入到玉米品系中，AlHAK1是一种高亲和K+ 转运蛋白基因，目的基因AlHAK1来自獐茅，全长2844bp，编码776个氨基酸的多肽，理论分子量为86kDa，过量表达AlHAK1的玉米植株在钾吸收效率上表现优异。可以提高玉米植株钾吸收效率。目的基因bar，来自吸水链霉菌的抗草铵膦基因，全长552bp，编码基因产物为草铵膦乙酰转移酶PAT，赋予受体玉米具有耐除草剂草铵膦的能力。
本发明提供一种玉米转化事件，所述转化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼序列，以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼序列。
进一步，所述外源T-DNA插入玉米基因组第8号染色体。
进一步，所述外源T-DNA基因包括钾高效利用基因AlHAK1和耐除草剂草铵膦基因bar，所述钾高效利用基因AlHAK1的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，所述耐除草剂草铵膦基因bar 的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
进一步，优选所述外源T-DNA插入序列为SEQ ID NO.5所示。
进一步，优选所述玉米转化事件连HH2823，其特征DNA序列由外源T-DNA插入序列SEQ ID NO.5、插入序列左侧翼序列区玉米基因组序列SEQ ID NO.1和插入序列右侧翼区玉米基因组序列SEQ ID NO.2构成。连HH2823中T-DNA区的以单拷贝插入到玉米基因组中。
本发明所述玉米转化事件连HH2823是利用农杆菌介导法，将来自于獐茅的目的基因 AlHAK1和来自于吸水链霉素菌的耐除草剂草铵膦基因bar构建到pCAMBIA3300表达载体上，转入到玉米HiII的基因组。利用分子生物学和生物测定的方法筛选得到表现最佳的转化事件。
本发明提供的外源T-DNA含有钾高效基因表达框和耐除草剂草铵膦基因表达框。
本发明提供的钾高效利用基因表达框由玉米ZmUbi启动子、钾高效基因AlHAK1和nos终止子构成。其中ZmUbi启动子大小为1999bp，核苷酸序列为SEQ ID NO.6，是组成型启动子，可驱动目的基因在玉米所有组织中表达。nos终止子大小为207bp，来自根癌农杆菌Ti质粒 T-DNA区胭脂碱合成酶基因终止子，终止AlHAK1基因转录，核酸序列为SEQ ID NO.7。
进一步，所述钾高效利用基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，基因全长2844bp，编码776 个氨基酸的多肽，蛋白分子量约86kDa，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.8。该基因是一种K+ 转运蛋白基因，为进一步探讨玉米钾吸收利用效率性状的遗传改良提供了一定的借鉴，并为培育钾营养高效的玉米品种奠定基础。
本发明提供的耐除草剂草铵膦表达框是由CaMV35S启动子、耐除草剂草铵膦基因bar和 CaMV polyA终止子构成。其中CaMV35S启动子大小为808bp，来自花椰菜花叶病毒CaMV，负责启动植物耐草铵膦基因bar的表达，核苷酸序列为SEQ ID NO.9。CaMV polyA终止子大小为148bp，终止bar基因转录，核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
进一步，所述耐除草剂草铵膦基因全长552bp，核苷酸序列为SEQ ID NO.4。编码形成485 个氨基酸的多肽，其序列为SEQ ID NO.11。最终合成的PAT蛋白属于乙酰转移酶家族，蛋白分子量约23kDa，它可使除草剂草铵膦乙酰化，抑制草铵膦的活性，最终达到耐草铵膦的效果。
本发明提供一种含玉米转化事件的重组细胞，重组细胞中含有本发明所述的重组载体。在一个实验方案中，所述重组细胞为含有本发明所述重组载体的重组农杆菌细胞。
本发明提供用于检测转化事件连HH2823的引物对，所述引物在Ubi启动子序列和玉米基因组序列上，分别为PR1和PR2。
本发明提供一种鉴定玉米转化事件连HH2823的方法，其包括：
(1)从待鉴定的玉米样品中提取基因组DNA；
(2)以提取的DNA样品为模板，使用本发明提供的引物对PR1和PR2进行PCR扩增；
(3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与转化事件上所述PCR引物对的序列之间的理论长度一致，则说明所述样品中含有连HH2823。
本发明还提供一种玉米转化事件连HH2823特异性的PCR鉴定方法，所述用于玉米转化事件连HH2823特异性PCR鉴定的引物(PR1是检测外源基因左侧是否与玉米基因组特异性位点连接，PR2是检测外源基因右侧是否与玉米基因组特异性位点连接)为：
Figure GDA0003857115400000031
本发明所述PCR反应体系为：
Figure GDA0003857115400000032
PCR反应条件：
Figure GDA0003857115400000033
本发明提供一种所述玉米转化事件在制备钾高效利用耐除草剂草铵膦细胞中的应用，利用含有所述玉米转化事件的玉米材料与玉米育种材料进行杂交后，进一步进行回交，获得所述钾高效耐草铵膦玉米细胞。具体利用钾高效耐除草剂转化事件连HH2823与其他玉米材料进行杂交后，进一步进行回交，获得含有本发明所述转化事件连HH2823的新材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了优良的转化事件连 HH2823，所述转化事件可实现将外源基因特异性引入到玉米品系中，赋予受体玉米具有高效利用钾肥以及耐除草剂草铵膦的能力；钾高效基因及耐草铵膦基因在受体玉米中能够稳定遗传；钾高效基因的表达可改良玉米受体的农艺性状。
附图说明
图1用于玉米转化的植物表达载体示意图；
图2转基因玉米连HH2823连续三代的PCR检测；M ： DL2000 ； H ： ddH2O ； WT ：对照； P ： pCAMBIA3300-ubi-AlHAK1 ； 1 ： T2 代连 HH2823 ； 2 ： T3 代连 HH2823 ；3： T4 代连 HH2823 ；图 2A:Fragment-AlHAK1 ；图 2B:Fragment-bar ；
图3转基因玉米连HH2823不同时期组织器官的半定量RT-PCR检测；1 、 2 、 3 、 4、 5 、 6 分别代表根、茎、叶、花丝、雄蕊和种子；图 3A ：连 HH2823 不同组织部分的 RNA；图 3B ： AlHAK1 基因的 RT-PCR ；图 3C ： Bar 基因的 RT-PCR ；
图4转基因玉米连HH2823的Southern blot杂交结果；图 4A ： AlHAK1 探针杂交结果，图 4A 中： WT1 、 WT2 为 Sac Ⅰ和 Xba Ⅰ分别酶切野生型材料； 1 、 2 为 Sac Ⅰ、Xba Ⅰ分别酶切连 HH2823 ； 图 4B ： Bar 基因探针杂交结果，图 4B 中： WT1 、 WT2 为Sac Ⅰ和 EcoR Ⅰ分别酶切野生型材料； 1 、 2 为 Sac Ⅰ、 EcoR Ⅰ分别酶切连 HH2823 ；
图5探针、酶切位点在插入片段上的酶切示意图；UBI:ZmUbi 启动子； Nos:nos 终止子； P35S:CaMV35S 启动子； T35S:CaMV Poly A ； LB: 左边界识别序列； RB: 右边界识别序列；
图6转基因玉米连HH2823的T-DNA区插入位点示意图；
图7转基因玉米连HH2823转化体的特异性PCR检测；M ： DL2000 ； H ： ddH2O ；WT ：对照； 1 ： T2 代连 HH2823 ； 2 ： T3 代连 HH2823 ； 3 ： T4 代连 HH2823 ；图 7A:PR1 ；图 7B:PR2 ；
图8 30mg/kg速效钾条件下不同时期转基因玉米连HH2823和对照玉米长势；图8A：拔节期；图 8B ：抽雄吐丝期；
图9不同速效钾条件下转基因玉米连HH2823植株的株高和穗位高；图9A:株高；图9B：穗位高；
图10 30mg/kg速效钾条件下转基因玉米连HH2823不同组织钾含量测定结果；
图11 bar基因的田间性状表现；图11A：对照组地块，图11B：实验组地块。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1转基因玉米事件连HH2823的获得
1.用于玉米转化的植物表达载体的构建
本研究的植物表达载体为pCAMBIA3300-Ubi-AlHAK1-Bar(保存于大连理工大学)，图谱见图1，其中T-DNA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。此序列包含完整的钾高效利用表达框和抗草铵膦表达框，具体由以下部分组成：
钾高效基因表达框：由玉米ZmUbi启动子(核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示)、钾转运蛋白基因AlHAK1和nos终止子(核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示)构成。耐除草剂草铵膦表达框：由CaMV35S启动子(核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示)、耐除草剂草铵膦基因bar 和CaMV polyA终止子(核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示)构成。耐除草剂草铵膦表达框与钾高效基因表达框相连，共同插入到骨架载体pCAMBIA3300(澳大利亚Cambia公司)构建得到pCAMBIA3300-Ubi-AlHAK1-Bar。
表1 pCAMBIA3300-Ubi-AlHAK1-Bar载体各元件信息表
Figure GDA0003857115400000051
2.农杆菌转化玉米幼胚获得转化植株
将载体pCAMBIA3300-Ubi-AlHAK1-Bar通过冻融法转化到农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。
取授粉后9～12天的玉米HiII幼穗，剥去苞叶，75％酒精消毒10min，然后取新鲜剥离的 1-1.5mm的玉米幼胚为材料，将幼胚放到侵染培养基中一个小时后，用侵染培养基洗一次，再浸入到添加100μM乙酰丁香酮的农杆菌菌液中，室温黑暗放置5min。用灭菌滤纸吸干，将幼胚盾面朝上放入共培养基中，26℃黑暗条件下共培养3天，再将幼胚转移至恢复培养基上，28℃黑暗培养7天，再转至含有1.5mg/L双丙氨膦的筛选培养基I中，28℃暗培养2周。如已得到初始愈伤组织，将其转至含有3mg/L双丙氨膦的筛选培养基II中，每两周更换一次 II培养基；当抗性愈伤组织增殖至直径2cm左右时，将其转至暗分化培养基上，25℃暗培养 2～3周。将分化得到的胚芽鞘转至光分再生培养基I上，25℃光下培养2周。待胚芽鞘形成完整的幼苗和根，将幼苗转入培养瓶再生培养基II中促根壮苗。10天后将幼苗移栽入营养钵，室内温室中培养。待幼苗长出1～2片新叶后移入大花盆，转移至大型温室，待雌穗吐丝后，用纸袋套住，等雄穗散粉后进行授粉，并收获果实。
表2玉米转化所用培养基
Figure GDA0003857115400000061
3.转化植株的PCR检测
3.1玉米DNA提取(快捷型植物基因组DNA提取试剂购买自天根公司)
(1)用剪刀取1-2cm2的新鲜玉米叶片，放于2mL的离心管管底，并在管中放入预冷的小钢珠，在液氮中冷冻15min，此时配制缓冲液buffer1与RNaseA混合液，比例为200:3。
(2)从液氮中取出离心管放于恒温震荡器中，选取程序1，震荡40s，然后将离心管放于液氮中，避免样品融化。
(3)倒出小钢珠，加入预先准备好的混合液200μL，颠倒混匀。
(4)选取程序5，震荡1min，震荡结束后于室温静置10min，加入65μL的buffer2缓冲液，用恒温振荡器混匀，12000rpm离心15min。
(5)取上清于1.5mL的离心管中，12000rpm离心15min，重复此步骤一次。
(6)向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇溶液，颠倒混匀，12000rpm离心15min。
(7)弃上清，加入1mL 75％的乙醇溶液，并将沉淀脱离离心管，12000r/min离心10min，重复此步骤。
(8)弃去75％的乙醇溶液，开盖倒置，待DNA沉淀呈透明状时加入适量的ddH2O水溶解进行。
3.2 PCR检测所用引物
AlHAK1基因的检测引物序列为：
F:5'-atcttctgggcgtcttgtcactcat-3'，
R:5'-ccacaacgagatgacaggagcaaag-3'；
目的片段大小为506bp。
Bar基因的检测引物为：
F:5'-accatcgtcaaccactacatcg-3'，
R:5'-gctgccagaaacccacgtcat-3'。
目的片段大小为430bp。
3.3 PCR反应体系：
Figure GDA0003857115400000071
3.4 PCR反应条件：
Figure GDA0003857115400000072
Figure GDA0003857115400000081
利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物(PCR产物上样量10ul)
结果表明(图2)，转基因玉米连HH2823连续三代的PCR检测结果与质粒阳性对照一致，而阴性对照HiII中没有扩增条带。证明外源基因AlHAK1和bar已整合到玉米基因组中，而且能够稳定遗传。
实施例2：转基因玉米连HH2823的半定量RT-PCR检测
1.玉米叶片的总RNA提取(RNAiso Plus试剂盒)
①取一定量的新鲜植物组织材料放于液氮中，在液氮中研磨成粉，然后快速放入冰预冷的含有1mL Trizol试剂的离心管中，振荡混匀，室温静置10min，以充分裂解植物组织。
②加入200μL的氯仿，缓慢颠倒并充分混匀，室温静置5min后，12000rpm离心15min。
③吸取上清液500μL至新的离心管中，加入同体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，于4℃12000rpm离心15min。
④弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇溶液，震荡洗涤RNA沉淀，于4℃8000rpm离心10min。
⑤重复步骤④一次。
⑥弃上清，在超净工作台中吹干，并溶于20μL的DEPC水。
⑦取上述溶液1μL，用Nanodrop2000c进行纯度分析以及浓度测定，并将RNA定量到500ng/μL。
⑧提取出的RNA通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2.单链cDNA的获得
按照PrimerScriptTM RT reagent Kit with g DNA Eraser(Perfect RealTime)试剂盒说明书进行反转录反应。
反转录体系如下：
玉米Total RNA 2μL
5×gDNA Eraser Buffer 2μL
RNase free water Up to 10μL
反应条件：
42℃2min(此步骤为充分降解基因组DNA)
向上述反应液中加入：
Figure GDA0003857115400000091
反应条件：
37℃15min
85℃5s
4℃∞
3.半定量RT-PCR
以上述反转录得到的cDNA为模板，用AlHAK1和bar基因上的引物进行半定量RT-PCR 反应。
引物序列、PCR反应体系和条件同上。
结果表明(图3)，目的基因AlHAK1和bar在不同组织器官(根、茎、叶、花丝、雄穗和种子)均有表达，而且在不同世代间表达稳定。
实施例3：转基因玉米事件连HH2823的Southern Blot
1.用CTAB法提取转玉米基因组DNA，用AlHAK1基因/bar基因内部引物扩增基因组DNA，将扩增得到的PCR产物制成AlHAK1探针/bar探针；
2.将阳性植株DNA分别用限制性内切酶SacⅠ、XbaⅠ和EcoRⅠ进行酶切，酶切后的DNA经过乙醇沉淀后用ddH2O溶解，30V电压电泳过夜；
3.琼脂糖凝胶用变性液处理45min，中和液处理60min后，采用向上毛细管转移法进行过夜转膜。转印后的膜在121℃条件下对DNA进行固定30min；
4.探针在沸水中变性5min后立即置于冰水混合物中；
5.42℃预杂交30min后加入探针，杂交过夜；
6.洗膜后观察条带，确定拷贝数。
根据目的基因AlHAK1和bar的Southern杂交结果(图4)，推测出转基因玉米连HH2823 中T-DNA区的插入拷贝数为1，在此基础上预测的杂交片段的大小跟Southern杂交结果中的片段大小一致(图5，表3)。
表3转化体限制性内切酶酶切片段与不同探针的杂交片段大小预测
Figure GDA0003857115400000092
Figure GDA0003857115400000101
实施例4：转基因玉米连HH2823的侧翼序列分析及转化体特异性PCR
1.侧翼序列分析
提取二叶期转基因玉米的基因组DNA，以DNA为模板，采用锚定PCR方法克隆AlHAK1基因插入位点的侧翼序列，获得约800bp的玉米基因组DNA序列(SEQ ID NO.1)，在此基础上设计引物PR1进行PCR验证，目的片段大小为1045bp，将该序列在网上数据库 (http://www.gramene.org/)中进行BLAST比对分析，结果表明该序列位于玉米8号染色体，说明AlHAK1基因整合到玉米的8号染色体上。
根据上述侧翼序列的生物信息学分析预测得到插入位点另一侧序列，结合载体序列，设计引物PR2以连HH2823基因组连续三代的DNA为模板进行PCR扩增，得到一个约700bp的片段。测序分析后得到约300bp侧翼序列(SEQ ID NO.2)。
对该插入位点旁侧进行分析发现：该位点玉米基因组上序列缺失29bp序列，T-DNA上左边界缺失15bp序列，右边界完全缺失且旁侧序列缺失25bp，但有51bp未知序列伴随T-DNA 插入该位点(T-DNA右边界一侧)。
2.转化体特异性PCR检测
在Ubi启动子序列和玉米基因组序列上设计特异性引物PR1和PR2(图6)，进行转化体的特异性PCR检测。
设计的引物如下：
Figure GDA0003857115400000102
PCR结果表明(图7)，玉米转化体连HH2823连续三代均扩增出目的条带，而阴性对照 HiII没有扩增出目的条带。说明外源基因已整合到玉米基因组上并且能够稳定遗传，而且引物PR1和PR2作为玉米转化体连HH2823的特异性引物，可用来特异性地鉴定转化体连HH2823。
实施例5：转基因玉米连HH2823的农艺性状分析
通过农杆菌介导法获得了钾高效耐除草剂玉米转化事件。对植株各个世代进行PCR检测，筛选阳性植株。在不同钾素水平下检测植株的形态及生理指标，以筛选出最优的转化事件。试验证明，转基因玉米转化事件连HH2823在不同世代的形态及生理指标均优于其他转化事件。具体试验结果如下：
1.玉米总体长势
选取一块低钾地块(速效钾含量30mg/kg)进行实验，将该地块划分为三个相对独立的区域，通过施肥将其中两个区域的速效钾含量调整至80mg/kg和100mg/kg。挑选大小一致，饱满程度相当的转基因和对照玉米种子。三个小区各种植30棵转基因和对照玉米。实验过程中随时观察玉米生长状态，发现当速效钾含量30mg/kg时，无论是拔节期还是抽雄吐丝期，转基因玉米连HH2823长势明显好于对照玉米(图8)。
2.株高、穗位
在玉米抽雄吐丝期分别统计株高、穗位、叶长、叶宽和叶面积等指标。结果表明：在土壤速效钾含量30mg/kg条件下，转基因玉米的株高、穗位显著高于对照玉米，当土壤速效钾含量达到80mg/kg及以上时，转基因玉米连HH2823和对照玉米的这两项指标差异不显著(图 9)。叶长、叶宽、叶面积均差异不显著。
3.钾离子含量
分别测定低钾区域(速效钾含量30mg/kg)转基因和对照玉米的根、茎、叶和种子的钾离子含量进，结果表明：转基因玉米根中的钾离子含量显著高于对照玉米(图10)，说明相较于对照玉米，转基因玉米连HH2823在低钾条件下具有更高的钾吸收能力。
4.bar性状鉴定
挑选大小一致，籽粒饱满的转基因玉米连HH2823和对照玉米种子，对照组地块(A)和实验组地块(B)均分别播种30粒转基因玉米和30粒对照玉米种子。待玉米长至4叶1 心期时，对照组地块(A)内玉米喷施清水，实验组地块(B)内玉米喷施等量浓度为750mg/L 的Basta溶液，7天后统计玉米成活率。结果表明：A地块喷水后转基因玉米和对照玉米均没有死亡，B地块喷施除草剂后转基因玉米均能正常生长，对照玉米全部死亡(表4，图11)。 Bar基因在转基因玉米连HH2823中正常表达并发挥相应功能。
表4转基因玉米除草剂抗性
Figure GDA0003857115400000111
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连理工大学
<120> 一种养分高效利用耐除草剂玉米连HH2823转化事件及其特异性鉴定方法和应
用
<130> 2020
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 789
<212> DNA
<213> 外源基因左侧侧翼序列
<400> 1
gaagtctttt agagaactac tggagttgct ctaatagagg gactaaacca ctttagtctc 60
tagtctctcc aagggctcct aaacgagact aaacagcaaa atttcctctt ctgccctcga 120
gctgcattta gaatatttga aatatatttg tggttgcttc ttatttgtat actcatttgg 180
aatatttgaa actcatttgc tcatttgaaa tataagcacg cacaggtgtt tgtataagca 240
cgtgctcggt ttgtttgtat aagcacgcac aggtgtttgt ataagcagca ggggcaagcg 300
tgagggcatt ttggtattta tatactgctt taactgtgtt tagctaatgt tagtctctag 360
aaccaaacag ggtagggact aaagattagt cccttgacta aactttagtc ttaggactaa 420
tgaaaccaaa cagggcctta atattctagg atcaaagtga accgtcaaaa actaaacttg 480
ttttgcgtga cttttgtgac taaaaaatac tccaatttaa tttgtaacag tcctatccta 540
aaatcactca aaatagctgt ggtaaaaaaa atgtttgcaa ttcctgtagt tgcttcatct 600
cgcatgcaat gcaatgcacc cggcgtgcta tgacactacg agcgaaccca attgaacgac 660
gagtctacga ccgccgttgc tggcacgcat atgacgctta ccccatttaa gttcaaaggg 720
atagaatttt attggcggcc gccggcaagt tgcactactt cctgccattc atgcatctgc 780
atctcgtcg 789
<210> 2
<211> 288
<212> DNA
<213> 外源基因右侧侧翼序列
<400> 2
ggaccaaggc atgcatgctt cgttcgccga tcgcaccagg aacaaactca ttttggatag 60
gcggctgtct caatttgacc acggttgacc catgtcggca ctcgtcagct tggcagatcc 120
atccacgaat taaggtcctg tcatttcatc aacagtttca tccggttgtt atgaattgta 180
ttttcgtcaa acaggttttt taaacagctt catctatctg tcaagtgtcg taacggggtt 240
ctcttccaaa atcgtgtcct catatttaca gcttcatctt gtatttag 288
<210> 3
<211> 2844
<212> DNA
<213> 目的基因AlHAK1的核苷酸序列
<400> 3
gcaagcggcc tccgtatcac gcagctttcc cttcttcctc tgtctcgctc tgttgctctc 60
acccttttgt ccctcttcag ctcgaggcaa acctctctcg ccgccggtag ctcggctgaa 120
cctagtcgct gccgccgccg ggcatcttct cttgcctcaa ctagcatttt ctagcctgat 180
gcaggtggca actggcgcag ctcattagag tttgatactc ccctaattcc aacaccttga 240
gaaggccact ctccaaggtg tccggaggtg cacagggaga gcaccagcaa gtcatcgcaa 300
atgtcgctcg aggtcgagaa cccggcgagc acggagtcga ccaaccgtct gagtctcaaa 360
cgccatgatt cgctcttcgg agacgcggag aaagtctccg gcggcaagta ccatggctcc 420
gaggggagct gggctcggac actgcacctt gctttccaga gcgttggcat catctacggt 480
gacatcggga cctcgcctct gtacgtctac tccagcacct tccctaatgg catcaagaac 540
aatgacgatc ttctgggcgt cttgtcactc atcatctaca ccctcatcat cataccaatg 600
ctcaagtacg tcttcatcgt cctctatgcg aacgacaatg gagacggcgg cacgtttgca 660
ctgtattcgc tgatctctcg gtacgcgaag atacggttga tcccgaacca gcaggcagag 720
gacgccatgg tgtcaaatta cagcatagaa gctcctacct cgcagatgag gagagcacag 780
tgggtgaagc agaagcttga gtccagcaag actgccaaga tcgtactctt cactctcaca 840
atccttggca catcaatggt gatgggcgat ggaaccttga cacctgcgat atctgtgctc 900
tctgcagttg gcgggatcag agaaaaagca ccaagcctga atcagacaca agtagtctgg 960
atctctgtgg caattctatt catgctcttc tcagtccagc gtttcgggac cgacaaggtc 1020
ggctacacct ttgctcctgt catctcgttg tggttcctta tgattgctgg taccggaatg 1080
tacaatcttg ttgtccacga ggtcggtgtt ttacgggctt tcaacccgtg gtacattgta 1140
caatacttca ggaggaacgg gaaggatgga tgggtttcac taggaggtgt tatcttgtgc 1200
gtcacaggca cggaaggaat gtttgctgac ctggggcatt tcaacatcag agctgtacag 1260
atcagcttta acggtatctt gttcccatca gtggcattat gttacatcgg gcaggcggca 1320
tatcttagaa gatttccaga gaatgttgga gacaccttct acagatccat cccagcacct 1380
ttgttctggc caaccttcgt catcgcaatt ctcgcggcta tcattgcaag ccaagctatg 1440
ctctcaggtg catttgccat cctctccaag gcattgtccc tcggttgctt gcccagggtt 1500
caagtgatcc acacctcaaa aaagtacgag ggacaagtgt acattcccga agtgaacttc 1560
atgatgggat tggcgagcat cttggtcaca atcgccttca gaacgaccac cagcatcggc 1620
aatgcttatg ggatctgtgt ggtgaccaca ttcttgatca ccacccatct tatgaccgtc 1680
gtgatgctcc tcatatggaa gaagcacctc gtgttcatcc ttctgttcta tgtcgttttt 1740
ggtttcacgg agatggtcta cctttcctcc atactgtcaa agttcatcga gggcgggtac 1800
cttccgttct gtttcgccct ggtcctgatg acactgatgg ctacatggca ctatgtccac 1860
gtcaagagat attggtacga gcttgaccat gttgttccta ccaatgaaat gacaactctg 1920
atggagaaga acgatgtgcg gcggatccct gggttgggac tcctatacac ggagcttatc 1980
cagggtatac ccccagtgtt ccctcggctg atcaagaaga taccatccgt gcactccgtg 2040
tttgtgttca tgtcgatcaa gcacctgcca atcccacatg tgattcctgc ggagaggttc 2100
ctcttcaggc aggtcggacc gagggagcag aggatgttcc ggtgcgtggc gcggtacggg 2160
tacagcgaca ggctggagga gcccaaggag tttgcagggt tccttgtgga tagtctgaaa 2220
atgttcattc aggaggaaag cgtattcagg ctgaacgaag cagagaatga cgagatcaac 2280
agcattgaag tttctgaagc acagacaagg ccggtgaggt ctacgcagtc tgttgtgcat 2340
agtgaggagg cgatccaacc tcgggtgagc agccactcag ggagaatcac tttccatgag 2400
aaccagacag ttgatgagga gaagcagttg attgacagag aggtggagcg aggggtggtg 2460
tatctgatgg gagaggccaa tgtgtcagca gctcccaact cgtccatctt gaagaaggta 2520
gttgtcaatt gtatctatac attcttgagg aagaacttga ccgaggggca caaggcattg 2580
gccatcccca aagatcagct gctcaaagtt gggatcacat atgaaatata ggaattttgt 2640
aaaaatatga ggtgcgccta accaagcttt tcgtagggta ttaatctgaa agggcagagt 2700
gccactgcct atccaataaa gaggcatgtg tgagtgggct tttcttttgg ctgcaaggct 2760
tcttttcatt ctctgtacag tttggtgcta tcagaatcca tcaaatgcaa gggtaatact 2820
ggaattaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2844
<210> 4
<211> 552
<212> DNA
<213> 目的基因bar的核苷酸序列
<400> 4
atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60
gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120
caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180
gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 240
aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300
ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360
agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 420
ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 480
gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 540
accgagattt ga 552
<210> 5
<211> 6941
<212> DNA
<213> 外源T-DNA插入区的核苷酸序列
<400> 5
aaacactgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgatccaagc tcaagctgct 60
ctagcattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 120
gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 180
agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttg catgcctgca 240
gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta 300
taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt 360
atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca 420
gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt 480
ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg 540
caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta 600
gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct 660
ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa 720
tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta 780
aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt 840
ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca 900
cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg 960
ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag 1020
gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc 1080
ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc 1140
caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt 1200
cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct ctaccttctc 1260
tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt catgtttgtg 1320
ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta 1380
cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg 1440
ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt 1500
ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt 1560
ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat 1620
cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat ctgtatgtgt 1680
gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc gatctaggat 1740
aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt ttgttcgctt 1800
ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg gagtagaata 1860
ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt gtcatacatc 1920
ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga 1980
tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca tatgctctaa 2040
ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt gatcttgata 2100
tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct gccttcatac 2160
gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt ttggtgttac 2220
ttctgcaggt cgactctaga ggatccccgg ggcaagcggc ctccgtatca cgcagctttc 2280
ccttcttcct ctgtctcgct ctgttgctct cacccttttg tccctcttca gctcgaggca 2340
aacctctctc gccgccggta gctcggctga acctagtcgc tgccgccgcc gggcatcttc 2400
tcttgcctca actagcattt tctagcctga tgcaggtggc aactggcgca gctcattaga 2460
gtttgatact cccctaattc caacaccttg agaaggccac tctccaaggt gtccggaggt 2520
gcacagggag agcaccagca agtcatcgca aatgtcgctc gaggtcgaga acccggcgag 2580
cacggagtcg accaaccgtc tgagtctcaa acgccatgat tcgctcttcg gagacgcgga 2640
gaaagtctcc ggcggcaagt accatggctc cgaggggagc tgggctcgga cactgcacct 2700
tgctttccag agcgttggca tcatctacgg tgacatcggg acctcgcctc tgtacgtcta 2760
ctccagcacc ttccctaatg gcatcaagaa caatgacgat cttctgggcg tcttgtcact 2820
catcatctac accctcatca tcataccaat gctcaagtac gtcttcatcg tcctctatgc 2880
gaacgacaat ggagacggcg gcacgtttgc actgtattcg ctgatctctc ggtacgcgaa 2940
gatacggttg atcccgaacc agcaggcaga ggacgccatg gtgtcaaatt acagcataga 3000
agctcctacc tcgcagatga ggagagcaca gtgggtgaag cagaagcttg agtccagcaa 3060
gactgccaag atcgtactct tcactctcac aatccttggc acatcaatgg tgatgggcga 3120
tggaaccttg acacctgcga tatctgtgct ctctgcagtt ggcgggatca gagaaaaagc 3180
accaagcctg aatcagacac aagtagtctg gatctctgtg gcaattctat tcatgctctt 3240
ctcagtccag cgtttcggga ccgacaaggt cggctacacc tttgctcctg tcatctcgtt 3300
gtggttcctt atgattgctg gtaccggaat gtacaatctt gttgtccacg aggtcggtgt 3360
tttacgggct ttcaacccgt ggtacattgt acaatacttc aggaggaacg ggaaggatgg 3420
atgggtttca ctaggaggtg ttatcttgtg cgtcacaggc acggaaggaa tgtttgctga 3480
cctggggcat ttcaacatca gagctgtaca gatcagcttt aacggtatct tgttcccatc 3540
agtggcatta tgttacatcg ggcaggcggc atatcttaga agatttccag agaatgttgg 3600
agacaccttc tacagatcca tcccagcacc tttgttctgg ccaaccttcg tcatcgcaat 3660
tctcgcggct atcattgcaa gccaagctat gctctcaggt gcatttgcca tcctctccaa 3720
ggcattgtcc ctcggttgct tgcccagggt tcaagtgatc cacacctcaa aaaagtacga 3780
gggacaagtg tacattcccg aagtgaactt catgatggga ttggcgagca tcttggtcac 3840
aatcgccttc agaacgacca ccagcatcgg caatgcttat gggatctgtg tggtgaccac 3900
attcttgatc accacccatc ttatgaccgt cgtgatgctc ctcatatgga agaagcacct 3960
cgtgttcatc cttctgttct atgtcgtttt tggtttcacg gagatggtct acctttcctc 4020
catactgtca aagttcatcg agggcgggta ccttccgttc tgtttcgccc tggtcctgat 4080
gacactgatg gctacatggc actatgtcca cgtcaagaga tattggtacg agcttgacca 4140
tgttgttcct accaatgaaa tgacaactct gatggagaag aacgatgtgc ggcggatccc 4200
tgggttggga ctcctataca cggagcttat ccagggtata cccccagtgt tccctcggct 4260
gatcaagaag ataccatccg tgcactccgt gtttgtgttc atgtcgatca agcacctgcc 4320
aatcccacat gtgattcctg cggagaggtt cctcttcagg caggtcggac cgagggagca 4380
gaggatgttc cggtgcgtgg cgcggtacgg gtacagcgac aggctggagg agcccaagga 4440
gtttgcaggg ttccttgtgg atagtctgaa aatgttcatt caggaggaaa gcgtattcag 4500
gctgaacgaa gcagagaatg acgagatcaa cagcattgaa gtttctgaag cacagacaag 4560
gccggtgagg tctacgcagt ctgttgtgca tagtgaggag gcgatccaac ctcgggtgag 4620
cagccactca gggagaatca ctttccatga gaaccagaca gttgatgagg agaagcagtt 4680
gattgacaga gaggtggagc gaggggtggt gtatctgatg ggagaggcca atgtgtcagc 4740
agctcccaac tcgtccatct tgaagaaggt agttgtcaat tgtatctata cattcttgag 4800
gaagaacttg accgaggggc acaaggcatt ggccatcccc aaagatcagc tgctcaaagt 4860
tgggatcaca tatgaaatat aggaattttg taaaaatatg aggtgcgcct aaccaagctt 4920
ttcgtagggt attaatctga aagggcagag tgccactgcc tatccaataa agaggcatgt 4980
gtgagtgggc ttttcttttg gctgcaaggc ttcttttcat tctctgtaca gtttggtgct 5040
atcagaatcc atcaaatgca agggtaatac tggaattaaa aaaaaaaaaa aaaaagagct 5100
cgaatttccc cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg 5160
ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta 5220
acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat 5280
acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg 5340
cggtgtcatc tatgttacta gatcgggaat tcgtaatcat gtcatagctg tttcctgtgt 5400
gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 5460
cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 5520
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 5580
gcggtttgcg tattggctag agcagcttgc caacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta 5640
ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca 5700
aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa 5760
aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 5820
tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 5880
catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 5940
ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 6000
ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctacaaa 6060
tctatctctc tcgagtctac catgagccca gaacgacgcc cggccgacat ccgccgtgcc 6120
accgaggcgg acatgccggc ggtctgcacc atcgtcaacc actacatcga gacaagcacg 6180
gtcaacttcc gtaccgagcc gcaggaaccg caggagtgga cggacgacct cgtccgtctg 6240
cgggagcgct atccctggct cgtcgccgag gtggacggcg aggtcgccgg catcgcctac 6300
gcgggcccct ggaaggcacg caacgcctac gactggacgg ccgagtcgac cgtgtacgtc 6360
tccccccgcc accagcggac gggactgggc tccacgctct acacccacct gctgaagtcc 6420
ctggaggcac agggcttcaa gagcgtggtc gctgtcatcg ggctgcccaa cgacccgagc 6480
gtgcgcatgc acgaggcgct cggatatgcc ccccgcggca tgctgcgggc ggccggcttc 6540
aagcacggga actggcatga cgtgggtttc tggcagctgg acttcagcct gccggtaccg 6600
ccccgtccgg tcctgcccgt caccgagatt tgactcgagt ttctccataa taatgtgtga 6660
gtagttccca gataagggaa ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat 6720
aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt 6780
cctaaaacca aaatccagta ctaaaatcca gatcccccga attaattcgg cgttaattca 6840
gtacattaaa aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc 6900
acaatatatc ctgccatggc aggatatatt gtggtgtaaa c 6941
<210> 6
<211> 1995
<212> DNA
<213> ZmUbi启动子的核苷酸序列
<400> 6
ttgcatgcct gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg 60
catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag 120
tttatctatc tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac 180
tacaataata tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg 240
acaattgagt attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc 300
tccttttttt ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc 360
catttagggt ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat 420
tctattttag cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa 480
tttagatata aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa 540
attaaaaaaa ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac 600
gccgtcgacg agtctaacgg acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc 660
gaagcagacg gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc 720
accgttggac ttgctccgct gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga 780
gccggcacgg caggcggcct cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct 840
ttcccaccgc tccttcgctt tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca 900
caccctcttt ccccaacctc gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc 960
caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc cccccccccc 1020
tctctacctt ctctagatcg gcgttccggt ccatggttag ggcccggtag ttctacttct 1080
gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg 1140
gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg 1200
aatcctggga tggctctagc cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt 1260
cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt 1320
gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc 1380
ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg 1440
gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat 1500
atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat acagagatgc 1560
tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga 1620
tcggagtaga atactgtttc aaactacctg gtgtatttat taattttgga actgtatgtg 1680
tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga tctaggatag 1740
gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat 1800
tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa caagtatgtt ttataattat 1860
tttgatcttg atatacttgg atgatggcat atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc 1920
cctgccttca tacgctattt atttgcttgg tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt 1980
tgtttggtgt tactt 1995
<210> 7
<211> 270
<212> DNA
<213> nos终止子的核苷酸序列
<400> 7
gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 60
cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 120
catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 180
catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc 240
ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt 270
<210> 8
<211> 776
<212> PRT
<213> AlHAK1的氨基酸序列
<400> 8
Met Ser Leu Glu Val Glu Asn Pro Ala Ser Thr Glu Ser Thr Asn Arg
1 5 10 15
Leu Ser Leu Lys Arg His Asp Ser Leu Phe Gly Asp Ala Glu Lys Val
20 25 30
Ser Gly Gly Lys Tyr His Gly Ser Glu Gly Ser Trp Ala Arg Thr Leu
35 40 45
His Leu Ala Phe Gln Ser Val Gly Ile Ile Tyr Gly Asp Ile Gly Thr
50 55 60
Ser Pro Leu Tyr Val Tyr Ser Ser Thr Phe Pro Asn Gly Ile Lys Asn
65 70 75 80
Asn Asp Asp Leu Leu Gly Val Leu Ser Leu Ile Ile Tyr Thr Leu Ile
85 90 95
Ile Ile Pro Met Leu Lys Tyr Val Phe Ile Val Leu Tyr Ala Asn Asp
100 105 110
Asn Gly Asp Gly Gly Thr Phe Ala Leu Tyr Ser Leu Ile Ser Arg Tyr
115 120 125
Ala Lys Ile Arg Leu Ile Pro Asn Gln Gln Ala Glu Asp Ala Met Val
130 135 140
Ser Asn Tyr Ser Ile Glu Ala Pro Thr Ser Gln Met Arg Arg Ala Gln
145 150 155 160
Trp Val Lys Gln Lys Leu Glu Ser Ser Lys Thr Ala Lys Ile Val Leu
165 170 175
Phe Thr Leu Thr Ile Leu Gly Thr Ser Met Val Met Gly Asp Gly Thr
180 185 190
Leu Thr Pro Ala Ile Ser Val Leu Ser Ala Val Gly Gly Ile Arg Glu
195 200 205
Lys Ala Pro Ser Leu Asn Gln Thr Gln Val Val Trp Ile Ser Val Ala
210 215 220
Ile Leu Phe Met Leu Cys Ser Val Gln Arg Phe Gly Thr Asp Lys Val
225 230 235 240
Gly Tyr Thr Phe Ala Pro Val Ile Ser Leu Trp Phe Leu Met Ile Ala
245 250 255
Gly Thr Gly Met Tyr Asn Leu Val Val His Glu Val Gly Val Leu Arg
260 265 270
Ala Phe Asn Pro Trp Tyr Ile Val Gln Tyr Phe Arg Arg Asn Gly Lys
275 280 285
Asp Gly Trp Val Ser Leu Gly Gly Val Ile Leu Cys Val Thr Gly Thr
290 295 300
Glu Gly Met Phe Ala Asp Leu Gly His Phe Asn Ile Arg Ala Val Gln
305 310 315 320
Ile Ser Phe Asn Gly Ile Leu Phe Pro Ser Val Ala Leu Cys Tyr Ile
325 330 335
Gly Gln Ala Ala Tyr Leu Arg Lys Phe Pro Glu Asn Val Gly Asp Thr
340 345 350
Phe Tyr Arg Ser Ile Pro Ala Pro Leu Phe Trp Pro Thr Phe Val Ile
355 360 365
Ala Ile Leu Ala Ala Ile Ile Ala Ser Gln Ala Met Leu Ser Gly Ala
370 375 380
Phe Ala Ile Leu Ser Lys Ala Leu Ser Leu Gly Cys Leu Pro Arg Val
385 390 395 400
Gln Val Ile His Thr Ser Lys Lys Tyr Glu Gly Gln Val Tyr Ile Pro
405 410 415
Glu Val Asn Phe Met Met Gly Leu Ala Ser Ile Leu Val Thr Ile Ala
420 425 430
Phe Arg Thr Thr Thr Ser Ile Gly Asn Ala Tyr Gly Ile Cys Val Val
435 440 445
Thr Thr Phe Leu Ile Thr Thr His Leu Met Thr Val Val Met Leu Leu
450 455 460
Ile Trp Lys Lys His Leu Val Phe Ile Leu Leu Phe Tyr Val Val Phe
465 470 475 480
Gly Phe Thr Glu Met Val Tyr Leu Ser Ser Ile Leu Ser Lys Phe Ile
485 490 495
Glu Gly Gly Tyr Leu Pro Phe Cys Leu Ala Leu Val Leu Met Thr Leu
500 505 510
Met Ala Thr Trp His Tyr Val His Val Lys Arg Tyr Trp Tyr Glu Leu
515 520 525
Asp His Val Val Pro Thr Asn Glu Met Thr Thr Leu Met Glu Lys Asn
530 535 540
Asp Val Arg Arg Ile Pro Gly Leu Gly Leu Leu Tyr Thr Glu Leu Ile
545 550 555 560
Gln Gly Ile Pro Pro Val Phe Pro Arg Leu Ile Lys Lys Ile Pro Ser
565 570 575
Val His Ser Val Phe Val Phe Met Ser Ile Glu His Leu Pro Ile Pro
580 585 590
His Val Ile Pro Ala Glu Arg Phe Leu Phe Arg Gln Val Gly Pro Arg
595 600 605
Glu Gln Arg Met Phe Arg Cys Val Ala Arg Tyr Gly Tyr Ser Asp Arg
610 615 620
Leu Glu Glu Pro Lys Glu Phe Ala Gly Phe Leu Val Asp Ser Leu Lys
625 630 635 640
Met Phe Ile Gln Glu Glu Ser Val Phe Arg Leu Asn Glu Ala Glu Asn
645 650 655
Asp Glu Ile Asn Ser Ile Glu Val Ser Glu Ala Gln Thr Arg Pro Val
660 665 670
Arg Ser Thr Gln Ser Val Val His Ser Glu Glu Ala Ile Gln Pro Arg
675 680 685
Val Ser Ser His Ser Gly Arg Ile Thr Phe His Glu Asn Gln Thr Val
690 695 700
Asp Glu Glu Lys Gln Leu Ile Asp Arg Glu Val Glu Arg Gly Val Val
705 710 715 720
Tyr Leu Met Gly Glu Ala Asn Val Ser Ala Ala Pro Asn Ser Ser Ile
725 730 735
Leu Lys Lys Val Val Val Asn Cys Ile Tyr Thr Phe Leu Arg Lys Asn
740 745 750
Leu Thr Glu Gly His Lys Ala Leu Ala Ile Pro Lys Asp Gln Leu Leu
755 760 765
Lys Val Gly Ile Thr Tyr Glu Ile
770 775
<210> 9
<211> 482
<212> DNA
<213> CaMV35S启动子的核苷酸序列
<400> 9
gcgtattggc tagagcagct tgccaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag 60
aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaagggta 120
atatcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca 180
gtagaaaagg aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt 240
caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg 300
gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact 360
gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga 420
agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct 480
ct 482
<210> 10
<211> 148
<212> DNA
<213> CaMV PolyA终止子的核苷酸序列
<400> 10
gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa atccagtact 60
aaaatccaga tcccccgaat taattcggcg ttaattcagt acattaaaaa cgtccgcaat 120
gtgttattaa gttgtctaag cgtcaatt 148
<210> 11
<211> 183
<212> PRT
<213> bar的氨基酸序列
<400> 11
Met Ser Pro Glu Arg Arg Pro Ala Asp Ile Arg Arg Ala Thr Glu Ala
1 5 10 15
Asp Met Pro Ala Val Cys Thr Ile Val Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Val Asn Phe Arg Thr Glu Pro Gln Glu Pro Gln Glu Trp Thr Asp
35 40 45
Asp Leu Val Arg Leu Arg Glu Arg Tyr Pro Trp Leu Val Ala Glu Val
50 55 60
Asp Gly Glu Val Ala Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys Ala Arg
65 70 75 80
Asn Ala Tyr Asp Trp Thr Ala Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser Pro Arg
85 90 95
His Gln Arg Thr Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys
100 105 110
Ser Leu Glu Ala Gln Gly Phe Lys Ser Val Val Ala Val Ile Gly Leu
115 120 125
Pro Asn Asp Pro Ser Val Arg Met His Glu Ala Leu Gly Tyr Ala Pro
130 135 140
Arg Gly Met Leu Arg Ala Ala Gly Phe Lys His Gly Asn Trp His Asp
145 150 155 160
Val Gly Phe Trp Gln Leu Asp Phe Ser Leu Pro Val Pro Pro Arg Pro
165 170 175
Val Leu Pro Val Thr Glu Ile
180
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> PR1上游引物
<400> 12
cgagtttctc cataataatg tgtga 25
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> PR1下游引物
<400> 13
gagaactact ggagttgctc tata 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> PR2上游引物
<400> 14
agcttggcac tggccgtcgt tttac 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> PR2下游引物
<400> 15
tgaggacacg atttacgaca cttga 25

Claims (2)

1.一种耐除草剂转基因玉米的鉴定方法，其特征在于，该转基因玉米以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区，外源T-DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中包含编码钾转运蛋白基因AlHAK1和耐除草剂草铵膦基因bar的核苷酸序列；所述鉴定方法中用于特异性PCR鉴定的引物如下：
PR1上游引物：CGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGA；
PR1下游引物：GAGAACTACTGGAGTTGCTCTATA；
PR2上游引物：AGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTAC；
PR2下游引物：TGAGGACACGATTTACGACACTTGA；
其中PR1引物对检测外源基因左侧是否与玉米基因组特异性位点连接，预期扩增目的片段大小为1045bp；PR2引物对检测外源基因右侧是否与玉米基因组特异性位点连接，预期扩增目的片段大小为700bp，根据是否扩增出符合预期片段大小的目的条带鉴定是否为耐除草剂转基因玉米。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述钾转运蛋白基因AlHAK1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述耐除草剂草铵膦基因bar的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
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