CN111032684A - 提高谷物生产率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过减少或消除植物中OTUB1的表达和/或活性来增加植物产量，特别是谷物产量的方法。还描述了以上述表型为特征的遗传改变的植物及产生此类植物的方法。

Description

提高谷物生产率的方法
技术领域
本发明涉及通过降低OTUB1的表达和/或活性并因此改变植物中至少一种类SQUAMOSA启动子结合蛋白样(SBP-结构域)转录因子的水平来增加植物产量，特别是谷物产量的方法。还描述了以上述表型为特征的遗传改变的植物以及产生此类植物的方法。
背景技术
水稻是世界人口消费的重要食物。水稻的粒度和形状是决定谷物产量和谷物外观的关键农业性状。在水稻中，谷物的长度、宽度和厚度与粒度和形状有关。水稻中已经鉴定出影响粒度和形状的几种重要基因(Fan等，2006；Song等，2007；Shomura等，2008；Weng等，2008；Che等，2015；Duan等，2015；Hu等，2015；Wang等，2015和Si等，2016)，但决定粒度和形状的分子机制仍然有限。
影响细胞增殖的几个因素决定了水稻的粒度。例如，由于细胞数量增加，GRAINSIZE 3(GS3)的功能丧失导致了长粒(Fan等，2006；Mao等，2010)。GS3编码假定G蛋白γ亚基。同样，由GL3.1/qGL3编码的假定蛋白磷酸酶(OsPPKL1)限制细胞增殖，其功能丧失的突变体表现出长粒(Hu等，2012；Qi等，2012；Zhang等，2012)。相比之下，由GS5和转录因子OsSPL16编码的假定丝氨酸羧肽酶主要通过影响细胞数量来促进谷物生长(Li等，2011b；Wang等，2012)。OsMKK4-OsMPK6模块通过增加细胞数量来影响谷物的生长(Duan等，2014；Liu等，2015)。细胞扩增过程在决定粒度方面也起着至关重要的作用。转录因子SPL13的高表达由于长细胞而导致长粒(Si等，2016)。由GS2编码的生长调节因子4(OsGRF4)与转录共激活因子(OsGIF1/2/3)结合，主要通过影响细胞大小来增加粒度(Che等，2015；Duan等，2015；Hu等，2015；Li等，2016；Sun等，2016)。这些研究表明，转录调控对于水稻的谷粒生长很重要。GW7/GL7/SLG7的高表达可能与微管的组织有关，由于较长的细胞和/或更多的细胞而导致长粒(Wang等，2015a；Wang等，2015b；Zhou等，2015年)。因此，细胞增殖和细胞扩增过程协同地影响水稻的粒度。
泛素-蛋白酶体途径对于水稻和其他植物物种的种子生长至关重要(Li和Li，2014；Li和Li，2016)。泛素可以通过泛素化作用添加到靶蛋白上。去泛素化酶(DUB)，例如otubain蛋白酶、泛素特异性蛋白酶、泛素C末端水解酶、Josephins和JAMM，可以从泛素化蛋白上切除泛素(Nijman等，2005)。在水稻中，已提出由qSW5/GW5编码的功能未知的蛋白质参与泛素途径，qSW5的破坏会导致宽谷粒(Shomura等，2008；Weng等，2008)。应该注意的是，最近有报道称qSW5/GW5基因座中先前未被识别的基因GSE5限制了谷粒宽度(Duan等，2017)。GSE5编码具有IQ结构域的质膜相关蛋白，在某些籼稻品种和大多数粳稻品种中GSE5的低表达导致宽粒(Duan等，2017)。由GW2编码的RING型E3泛素连接酶限制了谷粒生长，其功能丧失的突变体具有宽粒(Song等，2007)。同样，其拟南芥同源物DA2通过母本珠被限制了种子的生长(Xia等，2013)。DA2和另一种E3泛素连接酶BB/EOD1与泛素受体DA1发生物理相互作用，从而抑制种子和器官的生长(Li等，2008；Xia等，2013)。DA1还具有可切割泛素特异性蛋白酶(UBP15/SOD2)的肽酶活性(Du等，2014；Dong等，2017)。因此，通过泛素修饰蛋白质对于确定植物的种子大小至关重要。
水稻养活了一半以上的世界人口。尽管通过半矮化的开发和杂种优势的利用在谷物产量上取得了长足的进步1-3，但与现有的优良品种相比，增加水稻的产量潜力仍是育种者面临的主要挑战4。为了打破目前水稻品种的产量上限，已经提出了自定模式标本方法(ideotype approach)并用于水稻育种计划4-7。自1990年代初以来，国际水稻研究所(IRRI)培育了许多“新植物类型”(NPT)水稻品种；这些植物的结构与常规品种不同：它们形成更大的穗，更少的不育分蘖和更强的茎秆。尽管已经有几种NPT水稻株系被商业发布6,7，但仅在数量性状基因座(QTL)水平上解释了其表型的遗传基础8。我们已经发现NPT1编码OTUB1基因，一种具有去泛素化活性的otubain样蛋白酶。
为了进一步阐明粒度和形状确定的机制，我们独立鉴定了几种水稻粒度突变体(Duan等，2014；Fang等，2016)。现在我们已经表征了一个宽而厚的谷物1(wtg1-1)突变体，该突变体产生宽、厚、短和重的谷粒。WTG1编码OTUB1，与水稻NPT基因座中存在的基因相同。WTG1的过表达会导致窄、薄和长的谷粒。因此，我们的发现将otubain样蛋白酶WTG1定义为决定粒度和形状以及其他重要农业性状(包括作物总产量)的重要因素。
因此，需要增加具有商业价值的农作物(例如水稻)的谷物产量。本发明解决了这一需求。
发明内容
我们惊奇地发现OTUB1基因(在本文中也被称为“NPT1”，“DEP5”和“WTG1”；这些术语可以互换使用)支撑了谷物产量的定量性状。特别是，我们已经鉴定，下调或消除该蛋白的表达或去泛素酶活性可增强分生组织活性，增加单穗谷粒数量，增加谷粒重量和宽度，并且重要的是增加谷物产量。
在一个方面，提供了一种增加植物的谷物产量的方法，所述方法包括降低至少一种编码otubain样蛋白酶(OTUB1)的核酸的表达和/或降低otubain样蛋白酶的活性。优选地，所述谷物产量的增加包括谷粒数量、单穗谷粒数量、谷粒重量、谷粒宽度、谷粒厚度和/或千粒重中的至少一项的增加。
所述方法可以包括将至少一个突变引入至少一个编码OTUB1多肽和/或OTUB1多肽的启动子的核酸序列中。所述突变可以是功能丧失或功能部分丧失突变，和/或插入、缺失和/或取代。优选地，所述突变是可以降低OTUB1的表达或活性的任何突变。
当所述方法包括引入突变时，可以使用靶向的基因组修饰来引入突变，优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9。或者，在某些实施方案中，可以使用诱变引入突变，优选为TILLING或T-DNA插入。
在其他实施方案中，所述方法可以包括使用RNA干扰来减少或消除OTUB1核酸的表达。
在某些实施方案中，所述产量增加是相对于野生型或对照植物。
在某些实施方案中，所述突变降低或消除了OTUB1的去泛素酶活性。
本发明还提供了遗传改变的植物，其部分或植物细胞，其中所述植物在至少一个编码OTUB1多肽和/或OTUB1启动子的核酸中包括至少一个突变。
所述植物的特征可以在于OTUB1多肽表达的减少或消失。备选地或另外，所述植物的特征可以在于OTUB1去泛素酶活性的降低或缺失。
在某些实施方案中，所述植物的特征在于谷物产量的增加，优选地，当将所述植物与对照或野生型植物进行比较时。所述谷物产量的增加可包括谷粒数量、单穗谷粒数量、谷粒重量、谷粒宽度、谷粒厚度、千粒重中至少一项的增加和/或谷粒长度的减小。
在某些实施方案中，所述突变是功能突变的丧失或部分丧失。优选地，所述突变是插入、缺失和/或取代。优选地，该突变是可以降低OTUB1的表达或活性的任何突变。
在某些实施方案中，可以使用靶向的基因组修饰，优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9来引入所述突变。或者，可以使用诱变，优选TILLING或T-DNA插入引入所述突变。
在某些实施方案中，所述植物包括降低OTUB1多肽表达的RNA干扰构建体。在一个实例中，所述RNA干扰构建体包括如本文所定义的SEQ ID NO：210或其变体或由其组成。
植物部分优选是谷物或种子。
本发明还提供了一种产生具有增加的谷物产量的植物的方法，所述方法包括将至少一个突变引入至少一个编码OTUB1多肽和/或OTUB1多肽的启动子的核酸序列中。所述突变可以是功能突变的丧失或部分丧失，并且优选是插入、缺失和/或取代。优选地，所述突变是可以降低OTUB1的表达或活性的任何突变。
在某些实施方案中，突变是使用靶向基因组修饰引入的，优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9。或者，突变是使用诱变引入的，优选TILLING或T-DNA插入。
本发明还提供了一种生产具有增加的谷物产量的植物的方法，所述方法包括在所述植物中引入并表达降低或消除OTUB1核酸表达的RNA干扰构建体。在一个实例中，所述RNA干扰构建体包括如本文所定义的SEQ ID NO：210或其变体或由其组成。
本发明的方法可以进一步包括测量至少一种谷物产量的增加，其中所述测量包括测量谷粒数量、单穗谷粒数量、谷粒重量、谷粒宽度、谷粒厚度、千粒重中至少一项的增加和/或谷粒长度的减小。优选地，将所述增加与对照或野生型植物进行比较。
本发明的方法可以进一步包括测量OTUB1核酸表达的减少或消失和/或测量OTUB1多肽的活性(优选去泛素酶活性)的降低或缺失。
本发明的方法可以进一步包括使植物再生并筛选谷物产量的增加。
本发明进一步提供了通过上述任何一种或多种方法获得或可获得的植物、植物部分或植物细胞。
进一步提供了一种鉴定和/或选择(优选地与野生型或对照植物相比)将具有增加的谷物产量的植物的方法，所述方法包括在植物或植物种质中检测OTUB1基因和/或OTUB1启动子中的至少一个多态性并选择所述植物或其后代。所述多态性可以是插入、缺失和/或取代。所述方法可以进一步包括将在OTUB1基因和/或OTUB1启动子中包括至少一个多态性的染色体区域渗入第二植物或植物种质中以产生基因渗入的植物或植物种质。
在任何上述方面的一个实施方案中，OTUB1多肽可以包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其功能同源物或变体或由其组成。在另一个实施方案中，OTUB1核酸包括编码SEQ IDNO：1的核酸序列或由其组成。在优选的实施方案中，OTUB1核酸包括选自SEQ ID NO：2至5的核酸序列或其功能变体或同源物或由其组成。在一个实例中，所述同源物可具有编码如本文所定义的SEQ ID NO：14至20所定义的OTUB1多肽或其功能变体的核酸序列。优选地，OTUB1同源核酸序列选自如本文所定义的SEQ ID NO：7至13之一或其功能变体。
在任何上述方面的其他实施方案中，OTUB1启动子的核酸序列可以包括SEQ IDNO：6或其功能变体或同源物或由其组成。在一个实施方案中，该同源物选自如本文所定义的SEQ ID NO：21至27或其功能变体。
所述植物优选选自水稻、小麦、玉米、大豆、高粱、芸苔和大麦。在一个实例中，所述植物是水稻。在另一个实例中，所述植物是小麦。在另一个实例中，所述植物是玉米。
本发明还进一步提供了一种核酸构建体，其包括编码至少一个可以结合OTUB1基因和/或启动子中的至少一个靶序列的DNA结合结构域的核酸序列。在一个实例中，DNA结合结构域的序列选自SEQ ID NO：28、34、38、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142和146，或与SEQ IDNO：28、34、38、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142和146之一至少有至少90％同一性的序列。
在一个实施方案中，所述核酸构建体包括至少一种原间隔子(protospacer)元件，其中所述原间隔子元件包括DNA结合结构域。在一个实施方案中，原间隔子元件的序列选自SEQ ID NO：29、35、39、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、82、85、88、91、94、97、100、103、107、111、115、119、123、127、131、135、139、143和147，或与SEQ ID NO：29、35、39、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、82、85、88、91、94、97、100、103、107、111、115、119、123、127、131、135、139、143和147有至少90％同一性的序列。
所述构建体可以进一步包括编码CRISPR RNA(crRNA)序列的核酸序列，其中所述crRNA序列包括所述原间隔子元件序列和其他核苷酸。所述构建体可以进一步包括编码反式激活RNA(tracrRNA)的核酸序列。在一个实施方案中，所述tracrRNA包括SEQ ID NO：30或其功能变体或由其组成。
在另一个实施方案中，核酸构建体包括编码至少一个单向导RNA(sgRNA)的核酸序列，其中所述sgRNA包括tracrRNA序列和crRNA序列或原间隔子序列。在一个实施方案中，所述sgRNA的序列包括选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO：31、36、40、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144和148，或与SEQ ID NO：31、36、40、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144和148有至少90％同一性的序列。
在本发明的另一方面，提供了一种核酸构建体，其包括至少一个编码sgRNA分子的核酸，其中所述sgRNA分子与选自以下的靶序列结合：SEQ ID NO：28、34、38、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142和146或其变体。在一个优选的实施方案中，所述sgRNA核酸的序列选自SEQ ID NO：31、36、40、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144和148或其变体。
在一个实例中，所述核酸构建体的序列选自SEQ ID NO：33、37、41、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145和149或变体，其中所述变体与SEQ ID NO：33、37、41、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145和149具有至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％并且最优选至少95％的序列同一性。
在某些实施方案中，所述构建体可以可操作地连接至启动子，优选组成型启动子。
在某些实施方案中，所述核酸构建体进一步包括编码CRISPR酶的核酸序列。在一个实例中，CRISPR酶可以是Cas蛋白，优选Cas9或其功能变体。
在另一个实施方案中，所述核酸构建体编码TAL效应子。在某些实施方案中，所述核酸构建体包括编码至少一个DNA结合结构域的核酸序列，该DNA结合结构域可与OTUB1基因和/或启动子中的至少一个靶序列结合。在一个实例中，所述DNA结合结构域的序列选自SEQ ID NO：28、34、38、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142和146，或与SEQ ID NO：28、34、38、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142和146之一有至少90％同一性的序列，并进一步包括编码内切核酸酶或其DNA切割结构域的序列。内切核酸酶可以是FokI。
在本发明的另一方面，提供了一种单向导(sg)RNA分子，其中所述sgRNA包括crRNA序列和tracrRNA序列，其中所述sgRNA序列可以结合选自以下的至少一个序列SEQ ID NO：28、34、38、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142和146，或与SEQ ID NO：28、34、38、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142和146之一有至少90％同一性的序列。
还提供了用至少一种本文定义的核酸构建体转染的分离的植物细胞；或用至少一种本文定义的核酸构建体和第二核酸构建体转染的分离的植物细胞，其中所述第二核酸构建体包括编码Cas蛋白，优选Cas9蛋白或其功能变体的核酸序列。所述第二核酸构建体可以在本文定义的核酸构建体之前，之后或同时转染。在本发明的另一方面，提供了用如上定义的sgRNA分子转染的分离的植物细胞。
还提供了基因修饰的植物，其中所述植物包括本文定义的转染细胞。编码sgRNA的核酸和/或编码Cas蛋白的核酸可以以稳定形式整合。
本发明还提供了一种增加植物的谷物产量的方法，所述方法包括在植物中引入和表达本文所述的核酸构建体或sgRNA分子，其中优选地，所述增加是相对于对照或野生型植物。还提供了通过这种方法获得或可获得的植物。
本发明进一步提供了获得本文定义的基因修饰的植物的方法，所述方法包括：
a)选择所述植物的一部分；
b)用本文定义的核酸构建体或sgRNA转染(a)段中所述植物的一部分的至少一个细胞；
c)再生至少一种源自转染细胞或多个细胞的植物；
d)选择根据(c)段获得的一个或更多个植物，其在所述植物中显示至少一个OTUB1核酸的表达降低。
在本发明的另一方面，提供了一种改变(优选地增加)至少一种SQUAMOSA启动子结合蛋白样(SBP-结构域)转录因子的水平的方法，所述方法包括增加UBC13的表达或活性，或降低或消除如本文所述OTUB1的表达或活性。
附图说明
在以下非限制性附图中进一步描述了本发明：
图1显示了qNPT1的位置克隆。(a)成熟的植物外观。RIL52是从杂交品种Chunjiang06(CJ06)x IR66167-27-5-1-6中选择的。比例尺：20cm。(b)穗形态。比例尺：5cm。(c-e)RIL52及其亲本在(c)谷粒数量、(d)分蘖数和(e)茎秆直径方面的比较。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝30)。存在相同的小写字母表示均值之间无显著差异(P<0.05)。(f)，针对谷粒数量、分蘖数和茎秆直径的QTL作图。(g)qNPT1的位置克隆。该基因座被定位到一个约4.1Kbp的基因组区域，侧翼是P139和P143。线下的数字表示qNPT1和所示相邻标记之间的重组体数量。预测该候选基因将产生两种备选转录物。(h)g中所示启动子和编码区中NPT1基因座处的序列变体。
图2显示了OsOTUB1转录物的丰度(abundance)与穗分枝和谷物产量相关。(a)NIL植物器官中存在的OsOTUB1转录物的水平。R：根；C：茎秆；LB：叶片；LS：叶鞘；SAM：茎顶端分生组织(shoot apical meristem)；YP0.2，YP6，YP12：平均长度分别为0.2cm，6cm和12cm的幼穗。相对表达水平表示为每1,000份水稻Actin1拷贝的相对拷贝数。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。(b)植物形态。比例尺：20cm。(c)穗形态。比例尺：5cm。(d)谷粒形态。比例尺：2mm。(e-j)两个NIL的定量比较。(e)抽穗期。(f)株高。(g)每株植物的分蘖数。(h)每穗次生枝数。(i)每穗谷粒数量。(j)1,000粒重。(k)茎顶端分生组织的图像。比例尺：50μm。(l)，茎秆的扫描电子显微镜图像。比例尺：25μm。(m)茎秆维管系统。(n)m中所示大维管束和小维管束的总数。(o)每株植物的总谷粒产量。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝288)。所有表型数据均从正常栽培条件下的稻田生长的植株测得。斯氏t检验用于生成P值。
图3显示了OsOTUB1-OsSPL14相互作用控制植物结构。(a)BiFC分析。YFP标记的OsSPL14的N末端，SBP结构域或OsSPL14的缺失版本与YFP标记的OsOTUB1.1的C末端一起共转化到水稻原生质体中。小图(panel)(从左到右)：DAPI染色，YFP信号，差分干扰对比，合并通道(merged channel.)。比例尺：10μm。(b)OsOTUB1.1-GFP和OsSPL14的共免疫沉淀。IB，免疫印迹；IP，免疫沉淀。(c)植物形态。比例尺：20cm。(d)穗形态。比例尺：5cm。(e)OsSPL14转录物丰度。相对于ZH11植物的转录水平设为1。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。(f)每株植物的分蘖数。(g)每穗谷粒数量。(h)茎秆直径。所有表型数据均从正常栽培条件下的田间种植的植株测得。f-h中的数据显示为平均值±s.e.m.(n＝120)。存在相同的小写字母表示均值之间无显著差异(P<0.05)。
图4显示了OsOTUB1促进OsSPL14的降解。(a)OsSPL14在ZH11和ZH11-npt1植物中的积累。将HSP90蛋白的丰度用作内参(loading control)。(b)用蛋白酶体抑制剂MG132处理使OsSPL14稳定。从暴露于0或50μm MG132的ZH11植物的幼穗(长度<0.2cm)中提取总蛋白。用抗OsSPL14或抗HSP90抗体探测免疫印迹。(c)OsOTUB1使OsSPL14去稳定化。在存在或不存在His-OsOTUB1的情况下，将ZH11和ZH11-npt1植物幼穗的裂解物与GST-OsSPL14共温育。在不同时间收集裂解物并进行免疫印迹以评估OsSPL14和HSP90的积累。(d)OsSPL14的泛素化。使用抗Myc抗体免疫沉淀来自幼穗的蛋白质提取物，然后使用抗泛素、抗K48泛素或抗K63泛素链缀合物进行分析。(e)Flag-OsSPL14可以用K48-泛素连接修饰。水稻原生质体与Flag-OsSPL14和HA-泛素(HA标记的WT或K48R泛素)共转染，并使用抗Flag抗体免疫沉淀泛素化形式的Flag-OsSPL14，然后使用抗HA抗体进行分析。(f)OsSPL14的K63连接的OsSPL14泛素化由OsOTUB1调节。在存在或不存在Myc-OsOTUB1的情况下，将水稻原生质体与Flag-OsSPL14和HA-泛素(HA标记的WT，K48R、K63R、K48O或K63O泛素)共转染，收获裂解物并进行免疫印迹以评估OsSPL14的积累，并分析e中所述泛素化形式的Flag-OsSPL14。
图5显示了系统发育分析。人OTUB1序列及其在小鼠(MmOTUB1)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(AtOTUB1)、大豆(GmOTUB1)、玉米(ZmOTUB1)、高粱(SbOTUB1)、大麦(HvOTUB1)、野生单粒小麦(wild einkorn wheat)(TuOTUB1)和水稻(OsOTUB1)中的直向同源物从www.ncbi.nlm.nih.gov获得。右边的数字表示残基在每个蛋白中的位置。相同的残基用深色阴影表示，保守的残基用浅阴影表示，可变的残基不用阴影表示。
图6显示了功能性OsOTUB1对植物结构和谷物产量的影响。(a)成熟的植物形态。比例尺：20cm。(b)由CRISPR/Cas9产生的OsOTUB1功能丧失突变。(c)抽穗期。(d)株高。(e)最高节间的直径。(f)每株植物的分蘖数。(g)穗长。(h)每穗主枝数。(i)，每穗次生枝数。(j)每穗谷粒数量。(k)1,000粒重。(l)每株总谷物产量。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝288)。所有表型数据均从正常栽培条件下的稻田生长的植株测得。存在相同的小写字母表示均值之间无显著差异(P<0.05)。
图7显示了pOsOTUB1::GUS表达的分析。(a)五日龄幼苗中的GUS表达。比例尺：1cm。(b)a中所示植物的根尖。比例尺：200μm。(c)a中所示GUS染色的根伸长区的横截面。比例尺：200μm。(d)茎秆的横截面。比例尺：100μm。(e)穗发育的各个阶段。比例尺：1cm。(f)受精前的小穗壳(Spikelet hull)。比例尺：1mm。
图8显示了OsOTUB1.1-GFP的亚细胞定位。(a)OsOTUB1-GFP在根伸长区中的表达。比例尺：20μm。(b)从过表达OsOTUB1.1-GFP的ZH11植物的叶鞘分离的原生质体中的GFP表达。比例尺：10μm。小图(从左到右)：GFP信号，差分干扰对比(DIC)，合并通道(mergedchannel.)。
图9显示了过表达OsOTUB1.1的ZH11植物的表型。(a)两个独立的转基因株系显示了减少的分蘖数和矮化。比例尺：10cm。(b)穗尺寸减小。比例尺：5cm。(c)叶片坏死。比例尺：3mm。(d)通过伊文思蓝(Evans Blue)染色测定，在旗叶中诱导了凋亡。比例尺：3mm。(e)幼穗中OsOTUB1.1转录物的丰度。相对于ZH11植物的转录水平设为1。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。(f)株高。(g)每株植物的分蘖数。(h)每穗谷粒数量。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝60)。所有表型数据都是从正常栽培条件下的稻田生长的水稻植株中测得。存在相同的小写字母表示均值之间无显著差异(P<0.05，图f至h)。
图10显示了OsOTUB1对K48和K63连接的泛素四聚体表现出切割活性。使用OTUB1、His-OsOTUB1.1或OsOTUB1.2分析对K48和K63连接的泛素四聚体(Tetra-ub)的切割活性。输入(Ub4)及其裂解产物[三聚体(Ub3)，二聚体(Ub2)和单体(Ub1)]标记在左侧。使用抗泛素抗体通过蛋白质印迹将产物可视化。
图11显示了表达人OTUB1或其直向同源物对ZH11-npt1的植物结构的影响。(a)植物形态。比例尺：20cm。(b)穗形态。比例尺：5cm。(c)相对于ZH11-npt1植株中OsOTUB1的水平，幼穗中OTUB1(或其直向同源物)转录物的丰度。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。(d)每株植物的分蘖数。(e)每穗谷粒数量。(f)最高节间的直径。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝30)。所有表型数据都是从正常栽培条件下的稻田生长的水稻植株测得的。存在相同的小写字母表示均值之间无显著差异(P<0.05，图d至f)。
图12显示了OsOTUB1和OsUBC13之间的相互作用调节植物结构。(a)酵母双杂交试验。(b)使用重组GST-OsOTUB1和His-OsUBC13进行下拉(pull-down)测定。(c)水稻原生质体中的BiFC分析。比例尺：10μm。(d)转基因ZH11植物的形态。比例尺：20cm。(e)最高节间的横截面。比例尺：500μm。(f)OsUBC13对穗分支的影响。比例尺：5cm。(g)粒度和形状。比例尺：2mm。(h)相对于ZH11中的水平，幼穗中OsOTUB1转录物的丰度。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。(i)每株植物的分蘖数。(j)每穗谷粒数量。(k)1,000粒重。(l)最高节间的直径。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝30)。所有表型数据都是从正常栽培条件下的稻田生长的水稻植株测得的。存在相同的小写字母表示均值之间无显著差异(P<0.05，图i至l)。
图13显示了OsSPL14-OsOTUB1相互作用需要SBP结构域。(a)酵母双杂交试验证实了OsOTUB1和OsSPL14的C末端之间的相互作用。(b)用于BiFC分析的OsSPL14蛋白的缺失和未缺失版本的示意图。(c)BiFC分析。比例尺：10μm。
图14显示了OsOTUB1与水稻SPL转录因子相互作用。使用水稻原生质体进行BiFC分析，将YFP标记的OsOTUB1.1的C末端与YFP标签的OsSPLs的N末端共转化。小图(从左到右)：YFP，差分干涉对比，合并通道。小图(从左到右)：YFP信号，差分干扰对比(DIC)，合并通道。比例尺：10μm。
图15显示了OsOTUB1和OsSPL14拮抗性地调控共同的靶基因。(a)OsSPL14激活和OsOTUB1抑制的靶基因的数量和重叠。通过使用NIL植株的幼穗(长度＜0.2cm)进行RNA-seq。(b)相对于ZH11中的水平，在幼穗中检测到的OsSPL14调节基因的丰度。数据显示为平均值±s.e.m.(n＝3)。
图16显示了OsSPL14-OsOTUB1相互作用对OsSPL14的DNA结合亲和力的影响。OsSPL14-GST蛋白结合的竞争是分别使用10×、20×和50×未标记的探针(这些探针包括来自DEP1基因启动子的GTAC-box基序)或者使用1×、2×和4×未标记的Myc-OsOTUB1.1融合蛋白进行的。
图17显示了用于DNA构建体和转录物分析的引物序列。
图18显示WTG1影响粒度、形状和重量。
(a)Zhonghuajing(ZHJ)和wtg1-1的水稻粒。
(b)ZHJ和wtg1-1的糙米粒。
(c)ZHJ和wtg1-1糙米粒的横截面。红线表示谷粒厚度。
(d)ZHJ和wtg1-1谷粒长度(n≥50)。
(e)ZHJ和wtg1-1谷粒宽度(n≥50)。
(f)ZHJ和wtg1-1谷粒宽度(n≥50)。
(g)ZHJ和wtg1-1的1000粒重。测量了三个样品批次的重量(n＝3)。
(d-g)中的值为平均值±SD。通过斯氏t检验，与亲本系(ZHJ)相比**P<0.01。
比例尺：3mm(a-c)。
图19显示WTG1影响穗大小，穗形状和每穗谷粒数量。
(a，b)ZHJ(a)和wtg1-1(b)植株。将稻田中生长的植株挖出并放入盆中，以进行完整的植株摄影。
(c，d)ZHJ(c)和wtg1-1(d)的旗叶。
(e)ZHJ(左)和wtg1-1(右)的穗。
(f)ZHJ和wtg1-1的株高(n≥10)。
(g，h)ZHJ和wtg1-1(n≥10)的叶片长度(g)和宽度(h)。
(i)ZHJ和wtg1-1的穗长(n≥10)。
(j)每个主枝与穗颈之间的距离(n≥10)。
(k，l)主穗分枝数(k)和次穗分枝数(l)(n≥10)。
(m)每穗谷粒数量(n≥10)。
(f-m)中的值为平均值±SD。通过斯氏t检验，与ZHJ相比**P<0.01。
比例尺：10cm(a，b)；1cm(c，d)；5cm(e)。
图20显示WTG1编码具有去泛素化活性的otubain样蛋白酶。
(a)WTG1基因。空心框(open box)显示5'和3'非翻译的区域。实心框(closed box)显示编码顺序。显示了起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)。wtg1-1在第四个内含子的外显子-内含子连接区中含有4bp缺失。
(b)基于wtg1-1突变开发了dCAPS1标记。限制性酶Hpy188I用于消化PCR产物。
(c)ZHJ和wtg1-1穗中WTG1的RT-PCR分析。wtg1-1突变导致WTG1的改变的剪接。
(d，e)WTG1蛋白(d)和突变的wtg1-1蛋白(e)。WTG1蛋白具有otubain结构域。突变的wtg1-1蛋白具有N末端区域、otubain结构域的一部分和无关的肽(绿色框)。
(f)ZHJ，wtg1-1和gWTG1；wtg1-1的水稻粒。gWTG1；wtg1-1表示WTG1基因的基因组序列已转化为wtg1-1突变体。
(g)ZHJ，wtg1-1和gWTG1；wtg1-1的糙米粒。
(h)ZHJ，wtg1-1和gWTG1；wtg1-1糙米粒的横截面。红线表示谷粒厚度。
(i-k)ZHJ，wtg1-1和gWTG1；wtg1-1(n≥50)的谷粒长度(i)、谷粒宽度(j)和谷粒厚度(k)。
(l)WTG1在体外具有去泛素化活性。MBP-WTG1在体外切割了His-UBQ10，但MBP，MBP-WTG1wtg1-1和MBP-WTG1D68E；C71S；H267R并未切割His-UBQ10。抗His和抗MBP抗体分别用于检测His-UBQ、切割的His-UBQ、MBP、MBP-WTG1wtg1-1和MBP-WTG1D68E；C71S；H267R。
(i-k)中的值为平均值±SD。通过斯氏t检验，与亲本系(ZHJ)相比**P<0.01。
比例尺：3mm(f-h)。
图21显示了WTG1的表达和亚细胞定位。
(a)通过定量实时RT-PCR分析在幼苗的根和叶以及1cm(P1)至15cm(P15)的发育中的穗中的WTG1表达。给定的值是三次重复的平均值±SD。
(b-d)使用proWTG1:GUS转基因植株研究了WTG1的表达。8天龄幼苗(b)，发育中的小穗壳(c)和发育中的穗(d)中的GUS活性。
(e-g)GFP-WTG1在pro35S:GFP-WTG1根细胞中的亚细胞定位。显示了GFP-WTG1的GFP荧光(e)，DAPI染色(f)和合并(g)图像。
(h)亚细胞分级分离和免疫印迹测定。pro35S:GFP-WTG1叶片用于分离细胞质蛋白级分(C)和核蛋白级分(N)。用针对GFP的抗体进行免疫印迹。Bip(一种鲁米诺结合蛋白)被用作细胞质标记。组蛋白H4被用作核标记。
比例尺：5mm(b)，2mm(c)，10mm(d)和10μm(e-g)。
图22显示，WTG1的过表达会导致窄、细和长的谷粒。
(a)Zhonghuajing(ZHJ)和proActin:WTG1转基因株系的水稻粒。
(b)ZHJ和proActin:WTG1转基因株系的糙米粒。
(c)ZHJ和proActin:WTG1转基因谷粒的横截面。红线表示谷粒厚度。
(d-f)ZHJ和proActin:WTG1谷粒(n≥40)的长度(d)、宽度(e)和厚度(f)。
(g)WTG1在ZHJ和proActin:WTG1转基因株系中的表达水平。检查三次重复。
(d-g)中的值为平均值±SD。通过斯氏t检验，与亲本系(ZHJ)相比**P<0.01。
比例尺：3mm(a-c)。
图23显示了使用MutMap方法鉴定wtg1-1突变。
整个基因组测序揭示了LOC-Os08g42540基因中的一个缺失，该基因的SNP/INDEL-指数＝1。
图24显示了WTG1及其同源物的进化系统树。
从数据库搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得了WTG1同源物。使用MEGA7.0软件的邻接法构建了WTG1同源物的进化系统树。注释上的数字表示1000个引导复制(bootstrap replicate)的百分比。
图25显示了WTG1及其同源物的比对。
来自水稻(Oryza sativa)(MSU_Locus：LOC_Os08g42540)，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(C.elegans，NP_506709)，智人(Homo sapiens)(OTUB1，AK000120；OTUB2，AK025569)，小家鼠(Mus musculus，NP_080856)，果蝇(Drosophilamelanogaster)(D.melanogaster，NP_609375)，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)(C.reinhardtii，CHLREDRAFT_55169)，玉米(Zea mays，ACG38232)，大麦(Hordeumvulgare，BAJ96717)，乌拉尔图小麦(Triticum urartu,EMS61506)，拟南芥(Arabidopsisthaliana)(A.thaliana,At1g28120)和大豆(Glycine max，XP_014623731)的蛋白质用于进行比对。红色三角形表示半胱氨酸蛋白酶的假定催化三联体中的保守氨基酸，红色框表示在otubain样结构域中的保守序列。
图26显示了WTG1的过表达会影响小穗壳中的细胞扩增。
(a，b)ZHJ和proActin:WTG1转基因植株的外稃中外表皮细胞的平均长度(a)和宽度(b)。测量了100多个细胞(n>100)。
(c)外稃的谷粒长度方向上外表皮细胞的数量。使用二十个谷粒来计算细胞数(n＝20)。
(d)宽度方向上外表皮细胞的数量。用二十个谷粒计数细胞数(n＝20)。
(a-d)中的值为平均值±SD。通过斯氏t检验，与亲本系(ZHJ)相比**P<0.01。
图27显示了实施例2中使用的引物。
图28显示了OsOTUB1的RNAi沉默。(a)OsOTUB1的RNAi沉默表现出类ZH11-npt1表型，比例尺，20cm。(b)OsOTUB1在转基因植株中的表达水平。(c)转基因植株的茎秆厚度，比例尺，5mm。(d)转基因植株的穗结构，比例尺，5cm。(e)转基因植株的谷粒形状，比例尺，5mm。(f)转基因植株的旗叶形状，比例尺，5cm。
图29显示了通过RNAi使OTUB1表达水平降低的植物的表型。(a)每穗主枝数。(b)每穗次枝数。(c)每穗谷粒数量。(d)穗长。(e)株高。(f)每株总谷物产量。
具体实施方式
现在将进一步描述本发明。在以下段落中，将更详细地定义本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其他一个或更多个方面结合，除非明确地指出相反。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其他一个或更多个特征组合。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术、生物信息学的常规技术，它们在本领域技术范围内。文献中对这些技术进行了充分的解释。
如本文所用，词语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、天然存在的、突变的、合成的DNA或RNA分子、以及使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA的类似物。它可以是单链或双链的。此类核酸或多核苷酸包括但不限于结构基因的编码序列、反义序列和不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调控序列。这些术语也包括基因。术语“基因”或“基因序列”宽泛地用于指与生物功能相关的DNA核酸。因此，基因可以如包括基因组序列中的内含子和外显子，或者可以如cDNA中那样仅包括编码序列，和/或可以包括与调控序列组合的cDNA。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指通过肽键连接在一起的任何长度的聚合形式的氨基酸。
本发明的方面涉及重组DNA技术，并且排除了仅基于通过传统育种方法产生植物的实施方案。
增加产量的方法
因此，在本发明的第一方面，提供了一种增加植物产量的方法，所述方法包括减少或消除至少一种编码otubain样蛋白酶的核酸(在本文中称为“OTUB1”((含有卵巢肿瘤结构域的泛素醛结合蛋白1))的表达，和/或降低或消除所述植物中OTUB1多肽的活性。优选地，提供了一种增加谷物产量的方法。OTUB1在本文中也可以称为“NPT1”、“DEP5”或“WTG1”，并且这些术语可以互换使用。在一个实施方案中，所述方法减少但不消除OTUB1的表达和/或活性。
术语“产量”通常是指通常与特定作物、某个地区和一段时间有关的可测量的经济价值的生产。各个植物部分根据其数量、大小和/或重量直接贡献产量。实际产量是一种作物在一年中每平方米的产量，其通过总产量(包括收获的和评估的产量)除以种植的平方米来确定。
本文所定义的术语“增加的产量”可被认为包括以下任何一项或至少一项，并且可通过评估其中的一项或多项来测量，(a)地上(可收获部分)植物的一个或更多个部分增加的生物量(重量)、或增加的根生物量、增加的根体积、增加的根长、增加的根直径或增加的根长或任何其他可收获部分增加的生物量。增加的生物量可以表示为g/植株或kg/公顷；(b)每株植物增加的种子产量，这可能包括每株植物种子生物量(重量)或个体基础增加的一种或多种；(c)增加的种子填充率(seed filling rate)；(d)增加的饱满种子(filledseed)的数量；(e)增加的收获指数，其可以表示为可收获部分(例如种子)的产量与总生物量的比例；(f)增加的生存力/发芽效率；(g)增加的种子或豆荚或豆类或谷物的数量、大小或重量；(h)增加的种子体积(可能是组成(即脂质(在本文中也称为油))、蛋白质和碳水化合物总含量和组成的变化结果)；(i)增加的(个体或平均)种子面积；(j)增加的(个体或平均)种子长度；(k)增加的(个体或平均)种子宽度；(l)增加的(个体或平均)种子周长；(m)增加的生长或增加的分枝，例如具有更多分枝的花序；(n)增加的鲜重或增加的谷粒填充；(o)增加的穗重(ear weight)；(p)增加的千粒重(TKW)，其可以是从计数的已填充种子的数量及其总重量中得出的，并且可以是由于种子大小和/或种子重量增加的结果；(q)每株植物不育分蘖数量减少和(r)更结实或更强的秆或茎。所有参数均是相对于野生型或对照植株。
优选地，增加的产量包括以下至少一项的增加：谷粒数量、每穗谷粒数量、谷粒重量、谷粒宽度和谷粒厚度、千粒重。相对于对照或野生型植物，产量增加。例如，相对于对照或野生型植株，产量增加了2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％或20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％。在一个实施方案中，与对照植株相比，产量可增加20-50％，更优选5-15％或更多。谷物产量的增加可通过评估以下一项或多项来测定：谷粒数量、每穗谷粒数量、谷粒重量、谷粒宽度和谷粒厚度、千粒重和/或每株植物可育分蘖的数量。技术人员将能够使用本领域中的已知技术来测量上述任何谷物产量参数。
如本文所使用的术语“种子”和“谷物”可以互换地使用。本文所用的术语“增加”、“改善”或“增强”也可以互换。
如本文所用，术语“减少”是指与野生型或对照植物中的水平相比，OTUB1表达和/或活性水平的减少可达或超过10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％。减少可以包括或不包括消除表达，优选为不包括。术语“消除”表达是指没有检测到OTUB1的表达或没有产生功能性OTUB1多肽。确定OTUB1表达和/或活性水平的方法是技术人员熟知的。这些减少可以通过技术人员已知的任何标准技术来测量。例如，至少OTUB1表达的表达和/或含量水平的减少可以是蛋白质和/或核酸水平的量度，并且可以通过技术人员已知的任何技术来测量，例如但不限于，任何形式的凝胶电泳或层析(例如HPLC)。在一个实施方案中，该突变降低或消除了OTUB1的去泛素酶活性。因此，所述方法可以包括使用本领域标准技术(例如使用荧光去泛素酶底物)测量蛋白质的去泛素酶活性。
在本文描述的本发明的任何方面的优选实施方案中，OTUB1的表达和/或活性降低，但不消除。
“至少一个突变”是指当OTUB1基因以一个以上的拷贝或同源物(具有相同或略有不同的序列)存在时，在至少一个基因中存在至少一个突变。优选所有基因都突变。
在一个实施方案中，所述方法包括将至少一个突变引入编码OTUB1和/或OTUB1启动子的基因，优选内源基因中。优选地，所述突变在OTUB1基因的编码区域中。或者，所述突变在内含子序列或5′UTR中。在另一个实施方案中，如本文所定义，可以将至少一个突变或结构改变引入OTUB1启动子，使得OTUB1基因不表达(即，消除表达)或降低表达。在备选实施方案中，可以将至少一个突变引入OTUB1基因中，以使改变的基因不表达全长(即表达截短的)OTUB1蛋白或不表达功能完整的OTUB1蛋白。以这种方式，如本文所述，可以认为OTUB1多肽的活性被降低或消除。在任何情况下，所述突变都可以导致OTUB1的表达而不明显降低或改变在体内的生物学活性。或者，OTUB1可以根本不表达。
在一个实施方案中，OTUB1基因的序列包括SEQ ID NO：2至5中任一个定义的核酸序列或其功能变体或同源物，或由其组成，并编码SEQ ID NO：1定义的多肽或其功能变体或同源物。
“OTUB1启动子”是指在OTUB1 ORF的ATG密码子上游延伸至少2.5kbp的区域。在一个实施方案中，OTUB1启动子的序列包括SEQ ID NO：6中定义的核酸序列或其功能变体或同源物或由其组成。启动子同源物的实例显示在SEQ ID NO：21至27中。
在以上实施方案中，“内源”核酸可以指植物基因组中自然或天然的序列。在一个实施方案中，OTUB1基因的内源序列包括SEQ ID NO：2、3、4或5中的任一个，并编码如SEQ IDNO：1所定义的氨基酸序列或其同源物。以上鉴定的序列的功能变体(如本文所定义)和同源物也包括在本发明的范围内。同源物的实例显示在SEQ ID NO：7至27中。因此，在一个实施方案中，该同源物编码选自SEQ ID NO：14至20的多肽，或者包括选自SEQ ID NO：7至13的核酸序列或由其组成的同源物。
参考SEQ ID NO：2至210中的任一个，如本文所使用的术语“功能变体”(或“变体”)是指保留完整的非变体序列的生物功能的变体序列或部分序列。功能变体还包括目的基因的变体，其具有不影响功能的序列改变，例如在非保守残基中。还涵盖了基本上相同的变体，即与本文所示的野生型序列相比，例如在非保守残基中仅具有一些序列变化，并且具有生物活性。导致在给定位点产生不同氨基酸而不影响所编码多肽的功能特性的核酸序列改变是本领域众所周知的。例如，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较小的残基(例如甘氨酸)或疏水性更大的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，也可以预期导致用一个带负电荷的残基取代另一个带负电荷的残基(例如用天冬氨酸取代谷氨酸)或者用一个带正电荷的残基取代另一个带正电荷的残基(例如用赖氨酸取代精氨酸)的变化会产生功能上等效的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也不会被期望改变多肽的活性。所提出的每种修饰都适当地在本领域的常规技术范围内，如确定保留编码产物的生物学活性一样。
在一个实施方案中，功能变体与非变体核酸或氨基酸序列具有至少25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的总序列同一性。
如本文所用，术语同源物还表示来自其他植物物种的OTUB1启动子或OTUB1基因直向同源物。以递增的优选顺序，同源物可以与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或SEQ ID NO：2或6所示核酸序列具有至少为25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的总序列同一性。在一个实施方案中，总序列同一性为至少37％。在一个实施方案中，总序列同一性为至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％，最优选90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％。
如上定义的OTUB1同源物的功能变体也在本发明的范围内。
“OTUB1”(含有卵巢肿瘤结构域的泛素醛结合蛋白1)编码otubain样蛋白酶。如上所述，“OTUB1”在本文中也可以称为“NPT1”、“DEP5”或“WTG1”，并且这些术语可以互换使用。
OTUB1的特征在于许多保守的结构域，包括但不限于otubain样otubain样结构域。
在另一个实施方案中，所述类otubain结构域的序列如下：
SEQ ID NO：211
Figure BDA0002378288710000221
其中在SEQ ID NO：211中以粗体突出显示的氨基酸形成催化三联体。
或SEQ ID NO：212
Figure BDA0002378288710000222
因此，在一个实施方案中，OTUB1核酸(编码)序列编码包括至少一个如下定义的SBP结构域和/或otubain样结构域的OTUB1蛋白或其变体，其中该变体与SEQ ID NO 211或212具有至少25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的总序列同一性。在一个优选实施方案中，OTUB1多肽的特征在于至少一个otubain样结构域，并与SEQ ID NO 211或212具有至少75％的同源性。在另一个实施方案中，OTUB1蛋白包括催化三联体，并且优选地，OTUB1蛋白包括SEQ ID NO：211和/或SEQ IDNO：212或其如上定义的变体，其中变体的序列包含在SEQ ID NO：211中至少一个天冬氨酸和半胱氨酸(优选在位置4和7)和/或组氨酸(优选在第一位)。
如果当按如下所述针对最大一致性比对两个核酸序列或多肽时，这两个序列中的核苷酸或氨基酸残基序列分别相同，则这两个核苷酸序列或多肽被称为是“相同的”。在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或百分比“同一性”是指当为了最大一致性通过比较窗口比较和比对时，如使用下列序列比较算法之一或通过手动比对和目测测量，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸。当序列同一性的百分比用于指蛋白质或肽时，应当认识到，不相同残基位置的区别往往在于保守的氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不改变该分子的功能性质。如果序列的不同在于保守取代，则可以向上调整百分比序列同一性以校正取代的保守性质。用于进行这种调整的方法为本领域技术人员所熟知。为了进行序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定备选参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的非限制性实例是BLAST和BLAST 2.0算法。
合适的同源物可以通过序列比较和保守结构域的识别来鉴定。本领域中存在可用于识别此类序列的预测因子。可以如本文所述鉴定同源物的功能，并且因此技术人员将能够确认该功能，例如当在植物中过表达时。
因此，本发明和本文所述的核苷酸序列也可以用于从其他生物(特别是其他植物，例如农作物)中分离相应的序列。以这种方式，可以使用诸如PCR、杂交等之类的方法基于与本文所述序列的序列同源性来鉴定此类序列。鉴定和分离同源物时，也可以考虑序列的拓扑结构和特征结构域结构。可以基于它们与整个序列或其片段的序列同一性来分离序列。在杂交技术中，全部或部分已知核苷酸序列被用作探针，该探针与所选植物的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组或cDNA文库)群体中存在的其他相应核苷酸序列选择性地杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团或任何其他可检测标记物标记。用于杂交以及构建cDNA和基因组文库的探针的制备方法是本领域公知的，并且公开于Sambrook等，(1989)Molecular Cloning:A LibraryManual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)。
这些序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”是指在该条件下，相对于与其他序列，探针将与其靶序列以可检测的更大程度杂交(例如，比背景高至少2倍)。严格条件取决于序列，并且在不同情况下会有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低的相似度(异源探测)。通常，探针的长度小于约1000个核苷酸，优选地小于500个核苷酸。
典型地，严格条件将是其中盐浓度小于约1.5M Na离子，通常在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，对于长探针(例如，大于50个核苷酸)温度为至少约60℃的条件。杂交的持续时间通常小于约24小时，通常为约4至12小时。还可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺实现严格的条件。
在另一个实施方案中，本文所用的变体可以包括编码本文所定义的OTUB1多肽的核酸序列，其能够在本文所定义的严格条件下与SEQ ID NO：2至5中任一项所定义的核酸序列杂交。
在一个实施方案中，如本文所述，所述方法包括降低或消除，优选降低至少一个编码OTUB1多肽的核酸的表达，或降低或消除OTUB1多肽的活性，其中所述方法包括将至少一个突变引入至少一个OTUB1基因和/或启动子，其中该OTUB1基因包括以下序列或由其组成：
a.编码如SEQ ID NO：1和14至20之一定义的多肽的核酸序列；或者
b.如SEQ ID NO：2至13之一定义的核酸序列；或者
c.与(a)或(b)具有至少75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的总序列同一性的核酸序列；或者
d.编码本文定义的OTUB1多肽的核酸序列，其能够在本文定义的严格条件下与(a)至(c)中任一项的核酸序列杂交，
并且其中OTUB1启动子包括以下序列或由其组成：
e.如SEQ ID NO：6和21至27之一定义的核酸序列；
f.与(e)具有至少75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或至少99％的总序列同一性的核酸序列；或者
g.能够在如本文定义的严格条件下与(e)至(f)中任一项的核酸序列杂交的核酸序列。
在一个优选的实施方案中，引入内源性OTUB1基因或其启动子以沉默、降低或抑制OTUB1基因或蛋白质的生物活性和/或表达水平的突变可以选自以下突变类型：
1.“错义突变”，其是导致用一个氨基酸取代另一种氨基酸的核酸序列变化；
2.“无义突变”或“终止密码子突变”，其是导致引入早熟终止密码子并因此终止翻译(导致截短的蛋白质)的核酸序列的变化；在植物中，翻译终止密码子可以选自“TGA”(RNA中是UGA)、“TAA”(RNA中是UAA)和“TAG”(RNA中是UAG)；因此，导致这些密码子之一在被翻译的成熟mRNA中(在阅读框中)的任何核苷酸取代、插入、缺失都会终止翻译。
3.一个或更多个核苷酸或一个或更多个氨基酸的“插入突变”，这是由于已在核酸的编码序列中添加了一个或更多个密码子；
4.一个或更多个核苷酸或一个或更多个氨基酸的“缺失突变”，这是由于在核酸的编码序列中已经缺失了一个或更多个密码子；
5.“移码突变”，导致核酸序列在突变下游的不同框架中被翻译。移码突变可具有多种原因，例如一个或更多个核苷酸的插入、缺失或重复。
6.“剪接位点”突变，其是导致核苷酸在剪接位点插入、缺失或取代的突变。
如本文所用，“插入”、“缺失”或“取代”可以指至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个核苷酸的插入、缺失或取代。在一个特定的实施方案中，所述突变可包括以下至少之一的取代：
-SEQ ID NO：2或5的1135位的C取代为T；
-SEQ ID NO：2或5的1462位的G取代为C；和/或
-SEQ ID NO：2或5的1798位的G取代为C。
在另一个另外的或备选的实施方案中，所述突变是在SEQ ID NO：2或5的2234位插入单个氨基酸，优选T。
在另一个另外的或备选的实施方案中，所述突变是至少四个核苷酸的缺失，优选SEQ ID NO：3中加下划线的四个核苷酸。该突变是外显子-内含子剪接序列中的突变，其导致含有如SEQ ID NO：153所定义的第四个内含子序列(带下划线的第四个内含子)的突变CDS序列。结果，wtg突变导致预期蛋白质的过早终止(如SEQ ID NO：154中所述)。
在另一个另外的或备选的实施方案中，所述突变可以是SEQ ID NO：155的1824位上的G到A的取代。
一般而言，技术人员将理解，与野生型OTUB1启动子或OTUB1核酸或蛋白序列相比，至少一个如上所定义并且导致至少一个核酸或氨基酸的插入、缺失或取代的突变会影响OTUB1蛋白的生物活性。优选地，所述突变消除或降低OTUB1的去泛素酶活性。
在一个实施方案中，将突变引入SBP结构域和/或otubain样结构域中。优选地，所述突变是功能丧失或部分丧失的突变，例如过早的终止密码子，或者是预期对蛋白质结构重要的高度保守区域中的氨基酸改变。在另一个实施方案中，该突变被引入OTUB1启动子，并且至少是至少一个核酸的缺失和/或插入。其他主要变化，例如去除启动子功能区的缺失也将包括在内，因为这些将减少OTUB1的表达。在一个实施方案中，可将突变引入构成上述催化三联体的至少一个氨基酸中。例如，所述突变可以是以下至少一个，优选地是以下所有：
-SEQ ID NO：1的68位上的D突变为E；
-SEQ ID NO：1的71位上的C突变为S和/或
-SEQ ID NO：1的267位上的H突变为R。
在一个实施方案中，可以将突变引入OTUB1启动子中，并且将至少一个突变引入OTUB1基因中。
在一个实施方案中，使用诱变或靶向基因组编辑来引入突变。即，在一个实施方案中，本发明涉及一种通过如上所述的基因工程方法产生的方法和植物，并且不包括天然存在的品种。
靶向基因组修饰或靶向基因组编辑是一种基因组工程技术，其使用靶向DNA双链断裂(DSB)通过同源重组(HR)介导的重组事件来刺激基因组编辑。为了通过引入位点特异性DNA DSB来实现有效的基因组编辑，可以使用四类主要的可定制DNA结合蛋白：源自微生物移动遗传元件的大范围核酸酶、基于真核转录因子的ZF核酸酶、来自黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌的转录激活因子样效应子(TALE)以及来自II型细菌适应性免疫系统CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)的RNA引导的DNA内切核酸酶Cas9。大范围核酸酶、ZF和TALE蛋白都通过蛋白质-DNA相互作用识别特定的DNA序列。尽管大范围核酸酶整合了核酸酶和DNA结合结构域，ZF和TALE蛋白分别由靶向DNA的3个或1个核苷酸(nt)的单个模块组成。ZF和TALE可以以所需的组合进行组装，并连接至FokI的核酸酶结构域，以将溶核活性导向特定的基因组位点。
通过细菌III型分泌系统递送到宿主细胞后，TAL效应子进入细胞核，与宿主基因启动子中的效应子特异性序列结合并激活转录。它们的靶向特异性由串联的33-35个氨基酸重复序列的中央结构域决定。随后是20个氨基酸的单个截短重复序列。检查的大多数天然TAL效应子具有12至27个完整重复序列。
这些重复序列之间的区别仅在于两个相邻的氨基酸，即它们的重复可变双残基(RVD)。RVD决定TAL效应子将识别哪个单核苷酸：一个RVD对应一个核苷酸，四个最常见的RVD各自优先与四个碱基之一关联。天然存在的识别位点之前统一为在TAL效应子活性所需的T。可以将TAL效应子融合到FokI核酸酶的催化结构域上，以创建TAL效应子核酸酶(TALEN)，该酶可以在体内产生靶向的DNA双链断裂(DSB)以进行基因组编辑。该技术在基因组编辑中的使用在本领域中有充分的描述，例如在US 8,440,431，US 8,440,432和US 8,450,471中。Cermak T等描述了一组定制的质粒，可利用金门克隆(Golden Gate cloning)方法组装多个DNA片段。如其中所述，金门方法使用IIS型限制性内切核酸酶，该酶在其识别位点外切割以形成独特的4bp突出端。通过在同一反应混合物中消化和连接可以加快克隆速度，因为正确的组装消除酶识别位点。定制TALEN或TAL效应子构建体的组装涉及两个步骤：(i)将重复模块组装成1-10个重复的中间阵列，以及(ii)将中间阵列连接到骨架上以形成最终构建体。因此，使用本领域已知的技术，可以设计靶向如本文所述的OTUB1基因或启动子序列的TAL效应子。
可以根据本发明的各个方面使用的另一种基因组编辑方法是CRISPR。该技术在基因组编辑中的使用在本领域中有充分的描述，例如在US8,697,359和本文引用的参考文献中。简而言之，CRISPR是一种微生物核酸酶系统，参与防御入侵的噬菌体和质粒。微生物宿主中的CRISPR基因座包括CRISPR相关(Cas)基因以及能够编程CRISPR介导的核酸切割(sgRNA)特异性的非编码RNA元件的组合。已经在广泛的细菌宿主中鉴定出三种类型(I-III)的CRISPR系统。每个CRISPR基因座的一个关键特征是存在一组重复序列(直接重复)，这些重复序列由短段的非重复序列(间隔子)隔开。非编码CRISPR阵列被转录并在直接重复序列中切割成包括独立的间隔子序列的短crRNA，其将Cas核酸酶引导至靶位点(原间隔子)。II型CRISPR是最充分表征的系统之一，可按四个连续步骤进行靶向DNA双链断裂。首先，从CRISPR基因座转录两个非编码RNA，即pre-crRNA阵列和tracrRNA。第二，tracrRNA与pre-crRNA的重复区域杂交，并介导pre-crRNA加工为含有单个间隔子序列的成熟crRNA。第三，成熟的crRNA：tracrRNA复合体通过crRNA的间隔子和靶DNA上与原间隔子相邻基序(PAM)(这是对靶标识别的额外要求)相邻的原间隔子之间的Watson-Crick碱基配对将Cas9引导至靶DNA。最后，Cas9介导靶DNA的切割，从而在原间隔子内产生双链断裂。
与传统的基因靶向和其他可编程内切核酸酶相比，CRISPR-Cas9系统的一个主要优势是易于多路化，其中多个基因可以简单地通过使用分别靶向不同基因的多个sgRNA进行同时突变。另外，在基因组区域侧翼使用两个sgRNA的情况下，间插部分可以被缺失或倒置(Wiles等，2015)。
因此，Cas9是II型CRISPR-Cas系统的标志性蛋白，是一种大型单体DNA核酸酶，通过两个非编码RNA(CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA))的复合体引导至与PAM(原间隔子相邻基序)序列基序相邻的DNA靶序列。Cas9蛋白包括两个与RuvC和HNH核酸酶同源的核酸酶结构域。HNH核酸酶结构域切割互补DNA链，而RuvC样结构域切割非互补的链，结果，平端切割被引入到靶DNA中。Cas9与sgRNA一起的异源表达可以将位点特异性双链断裂(DSB)引入来自各种生物的活细胞的基因组DNA中。对于在真核生物中的应用，已经使用了最初来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)细菌的Cas9的密码子优化形式。
单向导RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas系统的第二个组成部分，其与Cas9核酸酶形成复合体。sgRNA是通过将crRNA与tracrRNA融合而产生的合成RNA嵌合体。位于其5'端的sgRNA向导序列赋予DNA靶标特异性。因此，通过修饰向导序列，可以创建具有不同靶标特异性的sgRNA。向导序列的标准长度是20bp。在植物中，已经使用植物RNA聚合酶III启动子(例如U6和U3)表达sgRNA。因此，使用本领域已知的技术，可以设计靶向如本文所述的OTUB1基因或启动子序列的sgRNA分子。在一个实施方案中，所述方法包括使用本文所述的任何核酸构建体或sgRNA分子。
可如本领域中所述构建用于本发明方法的Cas9表达质粒。
或者，可以使用更常规的诱变方法将至少一个突变引入OTUB1基因或OTUB1启动子序列。这些方法包括物理和化学诱变。技术人员将知道，可以使用更多的方法来产生这样的突变体，并且诱变和多核苷酸改变的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492；Kunkel等(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利第4,873,192号；Walker和Gaastra编辑(1983)Techniques in MolecularBiology(MacMillan Publishing Company,New York)和其中引用的参考文献。
在一个实施方案中，使用插入诱变，例如使用T-DNA诱变(其将来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-质粒的T-DNA片段插入DNA中，导致基因功能丧失或获得基因功能突变)、位点定向核酸酶(site-directed nuclease)(SDN)或转座子作为诱变剂。插入诱变是破坏基因功能的另一种方法，其基于将外源DNA插入目标基因中(参见Krysan等，The Plant Cell,Vol.11,2283–2290，1999年12月)。因此，在一个实施方案中，T-DNA用作插入诱变剂以破坏OTUB1基因或OTUB1启动子表达。T-DNA不仅破坏了其所插入基因的表达，而且还充当了随后鉴定突变的标记。由于插入元件的序列是已知的，因此可以使用各种克隆或基于PCR的策略回收发生插入的基因。插入一段长度为5到25kb的T-DNA通常会破坏基因功能。如果产生足够大的T-DNA转化株系，则有相当好的机会找到在任何目标基因内携带T-DNA插入片段的转基因植物。用农杆菌(Agrobacterium)介导的方法实现了用T-DNA转化孢子，所述方法涉及将植物细胞和组织暴露于农杆菌细胞的悬浮液中。
所述方法的细节是技术人员众所周知的。简而言之，农杆菌转化植物导致被称为T-DNA的序列整合到核基因组中，该序列被携带在细菌质粒上。T-DNA转化的使用导致稳定的单次插入。所得转化株系的进一步突变分析是直接的，并且可以通过对位于所述插入侧翼的DNA进行直接测序和分析来快速表征每个单独的插入株系。将突变体中的基因表达与野生型植株中OTUB1核酸序列的表达进行比较，并进行表型分析。
在另一个实施方案中，诱变是物理诱变，例如施加紫外线、X射线、γ射线、快速或热中子或质子。然后可以筛选靶向群体，以鉴定表达或活性降低的OTUB1突变体。
在本发明各个方面的另一个实施方案中，所述方法包括用诱变剂诱变植物种群。诱变剂可以是快速中子辐照或例如选自以下非限制性列表的化学诱变剂：甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-乙基-N-硝基脲(ENU)、三乙基三聚氰胺(1'EM)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、甲基苄肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、美法仑、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍(MNNG)、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7,12二甲基-苯并蒽(DMBA)、环氧乙烷、六甲基磷酰胺、白消安、二环氧烷烃(二环氧辛烷(DEO)、二环氧丁烷(BEB)等)、2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯乙基)氨基丙基氨基]吖啶二盐酸盐(ICR-170)或甲醛。同样，然后可以筛选靶向种群以鉴定OTUB1基因或启动子突变体。
在另一个实施方案中，用于产生和分析突变的方法是定向诱导基因组局部突变技术(TILLING)，其在Henikoff等，2004中进行了综述。在该方法中，用化学诱变剂例如EMS诱变种子。所得的M1植物自花授粉(self-fertilised)，M2代个体可用于制备用于突变筛选的DNA样品。合并DNA样品并在微量滴定板上形成阵列，然后进行基因特异性PCR。可以使用鉴定野生型和突变基因之间的异源双链体的任何方法，针对OTUB1靶基因中的突变筛选PCR扩增产物。例如但不限于，变性高压液相色谱法(dHPLC)，恒定变性剂毛细管电泳(CDCE)，温度梯度毛细管电泳(TGCE)或通过使用化学切割的断裂。优选地，将PCR扩增产物与内切核酸酶一起温育，所述内切核酸酶优先切割野生型和突变序列之间的异源双链体中的错配。使用自动测序凝胶设备对切割产物进行电泳，并借助标准的商业图像处理程序对凝胶图像进行分析。可以使用对OTUB1核酸序列具有特异性的任何引物来扩增合并的DNA样品中的OTUB1核酸序列。优选地，将引物设计为扩增最可能出现有用突变的OTUB1基因区域，特别是在OTUB1基因的高度保守和/或赋予如其他地方所述活性的区域。为了便于在凝胶上检测PCR产物，可以使用任何常规标记方法标记PCR引物。在备选实施方案中，用于产生和分析突变的方法是EcoTILLING。EcoTILLING是类似于TILLING的分子技术，除了它的目的是发现给定种群中的自然变异，而不是诱发突变。EcoTILLING方法的第一次公开在Comai等(2004年)中描述。
因此，快速的高通量筛选程序允许分析扩增产物，以鉴定与相应的未诱变的野生型植物相比赋予OTUB1基因表达降低或失活的突变。一旦在目标基因中鉴定出突变，携带该突变的M2植株的种子将生长为成年M3植株，并筛选与靶基因OTUB1相关的表型特征。因此可以鉴定出与对照相比具有增加的谷物产量的功能丧失和功能降低的突变体。
通过这种方法获得或可获得的在内源OTUB1基因或启动子基因座中携带功能突变的植物也在本发明的范围内。
在备选实施方案中，可以在转录或翻译水平上降低OTUB1基因的表达。例如，可以使用技术人员已知的多种基因沉默方法，例如但不限于使用针对OTUB1的小干扰核酸(siNA)，来减少或沉默本文定义的OTUB1核酸或OTUB1启动子序列的表达。“基因沉默”是一个通常用于指通过RNA分子介导的序列特异性相互作用抑制基因表达的术语。降低程度可以是为了完全消除所编码基因产物的产生，但更通常消除表达是部分的，并保留一定程度的表达。因此该术语不应被认为要求表达的完全“沉默”。
在一个实施方案中，siNA可包括能够介导RNA干扰的短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、antagomirs和短发夹RNA(shRNA)。
表达和/或活性的抑制可通过使用技术人员熟知的技术(例如Northern印迹，RT-PCR等)确定OTUB1转录物的存在和/或量来测量。
转基因可用于抑制内源植物基因。最初是在矮牵牛中的查尔酮合酶转基因引起内源查尔酮合酶基因的抑制并以易于观察到的色素沉着变化指示时发现的。随后描述了转基因可以沉默多少种植物基因(如果不是全部的话)。基因沉默需要转基因和被沉默的基因之间的序列相似性。这种序列同源性可涉及沉默的靶基因的启动子区或编码区。当涉及编码区时，可能已经用启动子构建了能够引起基因沉默的转基因，该启动子会转录编码序列RNA的有义或反义方向。基因沉默的各种例子可能涉及尚未充分理解的不同机制。在不同的例子中，可能存在转录或转录后基因沉默，并且两者均可根据本发明的方法使用。
文献中广泛地描述了基因沉默的机制及其在基因工程中的应用，这种机制在1990年代初期首先在植物中发现，然后在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中显示。
根据本发明的方法的RNA介导的基因抑制或RNA沉默包括共抑制，其中靶有义RNA或mRNA(即OTUB1有义RNA或mRNA)的过表达导致有关基因表达水平的降低。转基因和同源内源基因的RNA被协同抑制。本发明方法中使用的其他技术包括反义RNA以减少植物中内源靶基因的转录水平。在这种方法中，RNA沉默不会影响基因座的转录，而只会引起靶mRNA的序列特异性降解。“反义”核酸序列包括与编码OTUB1蛋白或该蛋白的一部分的“有义”核酸序列互补的核苷酸序列，即与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA转录序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选与待沉默的内源OTUB1基因互补。互补性可以位于基因的“编码区”和/或“非编码区”。术语“编码区”是指包括被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域。术语“非编码区”是指在编码区侧翼的5'和3'序列，其被转录但未翻译成氨基酸(也称为5'和3'非翻译区)。
可以根据Watson和Crick碱基配对的规则设计反义核酸序列。反义核酸序列可以与本文定义的整个OTUB1核酸序列互补，但是也可以是仅对一部分核酸序列(包括mRNA 5'和3'UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以与编码多肽的mRNA转录物的翻译起始位点周围的区域互补。合适的反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的，并且可以从约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸的长度或更短的核苷酸开始。可以使用本领域已知的方法，使用化学合成和酶促连接反应来构建根据本发明的反义核酸序列。例如，可以使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸化学合成反义核酸序列(例如，反义寡核苷酸序列)，所述修饰的核苷酸被设计成增加分子的生物学稳定性或增加在反义和有义核酸序列之间形成的双链体的物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例是本领域众所周知的。可以使用其中已经以反义方向亚克隆核酸序列的表达载体生物学地产生反义核酸序列(即，从插入的核酸转录的RNA将对目标靶核酸具有反义方向)。优选地，借助于稳定整合的核酸构建体在植物中产生反义核酸序列，所述核酸构建体包括启动子、可操作地连接的反义寡核苷酸和终止子。
在本发明的方法中用于沉默的核酸分子与mRNA转录物杂交或结合，和/或插入编码多肽的基因组DNA中，从而例如通过抑制转录和/或翻译来抑制蛋白质的表达。可以通过常规的核苷酸互补进行杂交以形成稳定的双链体，或者例如在与DNA双链体结合的反义核酸序列的情况下，通过双螺旋的大沟中的特异性相互作用来进行。反义核酸序列可以通过转化或在特定组织部位直接注射而引入植物中。或者，可以修饰反义核酸序列以靶向所选择的细胞，然后系统性施用。例如，对于系统性施用，可以修饰反义核酸序列，以使其特异性结合在所选细胞表面表达的受体或抗原，例如，通过将反义核酸序列与结合至细胞表面受体或抗原的肽或抗体连接。也可以使用载体将反义核酸序列递送至细胞。
RNA干扰(RNAi)是可根据本发明的方法使用的另一转录后基因沉默现象。这是由双链RNA诱导的，其中与dsRNA同源的mRNA被特异降解。它是指由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。当酶DICER遇到dsRNA并将其切成称为小干扰RNA(siRNA)的片段时，RNAi的过程便开始了。该酶属于RNase III核酸酶家族。蛋白质复合体收集这些RNA残留物，并使用其编码作为向导来寻找并破坏细胞中具有匹配序列(例如靶mRNA)的任何RNA。
人工和/或天然的microRNA(miRNA)可用于敲除基因表达和/或mRNA翻译。MicroRNA(miRNA)通常是单链小RNA，通常长19-24个核苷酸。大多数植物miRNA与它们的靶序列具有完美或接近完美的互补性。但是，有些自然靶标有多达五个错配。它们由Dicer家族的双链特异性RNase从具有特征性折返结构的较长非编码RNA加工而成。经过加工后，它们通过结合至其主要成分Argonaute蛋白而加入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。miRNA作为RISC的特异性成分，因为它们与细胞质中的靶核酸(主要是mRNA)碱基配对。随后的调节事件包括靶mRNA的切割和破坏和/或翻译抑制。因此，miRNA过表达的影响通常反映在靶基因的降低的mRNA水平上。人工microRNA(amiRNA)技术已应用于拟南芥(Arabidopsisthaliana)和其他植物中，以有效地沉默目标基因。amiRNA的设计原则已被概括并整合到基于Web的工具(http://wmd.weigelworld.org)中。
因此，根据本发明的各个方面，可以转化植物以引入已经设计用于靶向OTUB1核酸序列的表达并选择性地降低或抑制该基因的表达或其转录物的稳定性的RNAi、shRNA、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、amiRNA或共抑制分子。优选地、根据本发明的各个方面使用的RNAi、snRNA、dsRNA、shRNA siRNA、miRNA、amiRNA、ta-siRNA或共抑制分子包括至少17个nt，优选22至26个nt的片段，并且可以在SEQ ID NO：1至12中任何一个所示信息的基础上设计。用于设计有效siRNA的指导原则对于技术人员来说是已知的。简而言之，选择靶基因序列的短片段(例如，长度为19-40个核苷酸)作为本发明的siRNA的靶序列。靶基因序列的短片段是靶基因mRNA的片段。在优选的实施方案中，用于从靶基因mRNA中选择一个序列片段作为候选siRNA分子的标准包括：1)来自靶基因mRNA的序列，其距离天然mRNA分子的5'或3'端至少50-100个核苷酸；2)来自靶基因mRNA的序列，其G/C含量在30％至70％之间，最优选约为50％；3)来自靶基因mRNA的序列，其不包括重复序列(例如AAA、CCC、GGG、TTT、AAAA、CCCC、GGGG、TTTT)；4)来自靶基因mRNA的序列，其可在mRNA中接近；5)来自靶基因mRNA的序列，其是靶基因唯一的；6)避开起始密码子75个碱基内的区域。来自靶基因mRNA的序列片段可以满足上面鉴定的一个或更多个标准。在预测程序中将选定的基因作为核苷酸序列引入，该程序考虑了上述用于设计最佳寡核苷酸的所有变量。该程序扫描任何mRNA核苷酸序列以寻找易被siRNA靶向的区域。该分析的输出是可能的siRNA寡核苷酸的分数。最高分用于设计通常通过化学合成制备的双链RNA寡核苷酸。除了与mRNA靶区域互补的siRNA外，简并的siRNA序列可用于靶向同源区域。可以通过本领域已知的任何方法来合成根据本发明的siRNA。优选地，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪化学合成RNA。另外，可从商业RNA寡核苷酸合成供应商获得siRNA。
根据本发明方面的siRNA分子可以是双链的。在一个实施方案中，双链siRNA分子包括平末端。在另一个实施方案中，双链siRNA分子包括突出端核苷酸(例如1-5个核苷酸突出端，优选2个核苷酸突出端)。在一些实施方案中，siRNA是短发夹RNA(shRNA)；siRNA分子的两条链可以通过接头区域(例如核苷酸接头或非核苷酸接头)连接。本发明的siRNA可以包括一个或更多个修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯键。本领域众所周知的化学修饰能够增加siRNA的稳定性、可利用性和/或细胞摄取。技术人员将意识到可以掺入RNA分子的其他类型的化学修饰。
在一个实施方案中，可以使用如美国专利6,635,805中所述的重组DNA构建体，其通过引用并入本文。
使用常规方法，例如载体和农杆菌介导的转化，将沉默的RNA分子引入植物。产生稳定转化的植株，并且分析与野生型对照植株相比的OTUB1基因的表达。
使用病毒诱导的基因沉默也可以沉默或降低OTUB1核酸的表达水平。
因此，在本发明的一个实施方案中，植物表达一种核酸构建体，该核酸构建体包括靶向如本文所述的OTUB1核酸序列的RNAi、shRNA snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、amiRNA或共抑制分子，并降低内源性OTUB1核酸序列的表达。当例如与对照植株相比RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、shRNA miRNA、ta-siRNA、amiRNA或共抑制分子选择性地降低或抑制该基因的表达时，该基因就被靶向。或者，当RNAi、shRNA snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、amiRNA或共抑制分子在严格条件下与基因转录物杂交时，RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、amiRNA或共抑制分子靶向OTUB1核酸序列。在一个实例中，植物表达包括RNAi的核酸构建体，其中RNAi的序列包括本文所定义的SEQ ID NO：210或其功能变体或由其组成。还提供了这种包括RNAi的核酸构建体的用途，其中RNAi的序列包括SEQ IDNO：210或其功能变体或由其组成，以减少或消除(但优选减少)OTUB1的表达，并因此如上所述增加谷物产量。
基因沉默的另一种方法是靶向与OTUB1的基因调节区(例如，启动子和/或增强子)互补的核酸序列，以形成防止基因在靶细胞中转录的三螺旋结构。其他方法，例如使用针对内源多肽的抗体来抑制其在植物中的功能，或干扰涉及多肽的信号传导途径，对于技术人员来说是众所周知的。特别地，可以设想人造分子可用于抑制靶多肽的生物功能，或用于干扰涉及靶多肽的信号传导途径。
在一个实施方案中，抑制剂核酸可以是OTUB1多肽表达的反义抑制剂。在使用反义序列来下调基因表达时，将核苷酸序列以“反向”置于启动子的控制下，从而转录产生RNA，该RNA与从靶基因的“有义”链转录的正常mRNA互补。
反义抑制剂核酸可包括距靶核苷酸序列至少10个核苷酸的反义序列。尽管序列的完全互补或相似不是必需的，但优选用于下调靶序列表达的序列与靶序列具有完全的序列同一性。所用序列中的一个或更多个核苷酸可以与靶基因不同。因此，根据本发明用于下调基因表达的序列可以是选自可用序列的野生型序列(例如基因)或该序列的变体。
该序列无需包括开放阅读框或指定可翻译的RNA。对于各自的反义和有义RNA分子而言，优选具有足够的同源性以进行杂交。即使所用序列与靶基因之间存在约5％、10％、15％或20％或更高的错配，也可能会下调基因表达。有效地，同源性应该足以使基因表达下调发生。
抑制剂核酸可以可操作地连接到组织特异性或诱导型启动子。例如，可以使用珠被和种子特异性启动子来特异性下调发育中的胚珠和种子中的OTUB1核酸，以增加最终的种子大小。
可以将本文所述的抑制OTUB1多肽表达的核酸可操作地连接至异源调节序列，例如启动子，例如组成型、诱导型、组织特异性或发育特异性启动子。可以将构建体或载体转化到植物细胞中并如本文所述进行表达。包括此类载体的植物细胞也在本发明的范围内。
在另一方面，本发明涉及通过本文所述的方法可获得的或获得的沉默构建体，并涉及包括该构建体的植物细胞。
因此，本发明的方面涉及靶向诱变方法，特别是基因组编辑，并且在优选的实施方案中，排除了仅基于通过传统育种方法产生植物的实施方案。
在另一个实施方案中，所述方法可以包括降低和/或消除OTUB1的活性。在一个实例中，这可以包括通过降低和/或消除本文所述的抑制来降低OTUB1与UBC13相互作用的能力，和/或降低OTUB1对去泛素化酶SPL14的能力，从而导致SPL14的积累。
在另一方面，本发明涉及通过本文所述的方法获得的或可获得的植物。
在本发明的另一个方面，提供了一种优选地沿着谷粒长度方向增加植物的小穗壳中的细胞增殖和/或沿着谷粒宽度方向减少细胞数量的方法，从而导致细胞长度降低但细胞宽度增加，所述方法包括使用本文描述的任何方法在所述植物中减少或消除至少一种编码OTUB1多肽的核酸的表达和/或降低OTUB1多肽的活性。本文所用的术语“增加”、“改善”或“增强”是可互换的。在一个实施方案中，与对照植株相比，细胞增殖增加了至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％或50％。
基因改变或修饰的植物及生产这种植物的方法
在本发明的另一方面，提供了遗传改变的植物，其部分或植物细胞，其特征在于所述植物不表达OTUB1，具有降低的OTUB1表达水平，不表达功能性OTUB1蛋白或表达具有降低的功能和/或活性的OTUB1蛋白。例如，所述植物是功能降低(敲减)或功能丧失(敲除)突变体，其中与野生型对照植株相比，OTUB1核酸序列的功能降低或丧失。优选地，所述植物是敲减而不是敲除，意味着所述植物具有降低的OTUB1表达水平或表达具有降低的功能和/或活性的OTUB1蛋白。为此，将突变引入OTUB1基因序列或破坏该基因转录的相应启动子序列。因此，优选地，所述植物在OTUB1的启动子和/或基因中包括至少一个突变。在一个实施方案中，所述植物可以在OTUB1的启动子和基因中都包括突变。
在本发明的另一方面，提供了一种植物，其部分或植物细胞，其特征在于与野生型或对照植株相比，谷物产量增加，其中优选地，所述植物在OTUB1基因和/或其启动子中包括至少一个突变。优选地，所述谷物产量的增加包括谷粒数量、每穗谷粒数量、谷粒重量、谷粒宽度、谷粒厚度、千粒重的增加和/或谷粒长度的减少。
可以通过用任何上述方法将突变，优选是缺失、插入或取代引入OTUB1基因和/或启动子序列中来产生植物。优选地，将所述突变引入至少一个植物细胞中，并从至少一个突变的植物细胞中再生出植物。
或者，所述植物或植物细胞可包括表达如本文所述的靶向OTUB1基因的RNAi分子的核酸构建体。在一个实例中，RNAi的序列包括如本文所定义的SEQ ID NO：210或其变体或由其组成。在一个实施方案中，将所述构建体稳定地掺入植物基因组中。这些技术还包括使用靶向目标基因并允许在特定位点整合转基因的载体进行基因靶向。靶向构建体被工程化以与靶基因重组，这是通过将来自基因本身的序列掺入构建体中来实现的。然后重组发生在基因内该序列的区域中，导致插入外源序列以破坏该基因。由于其序列被破坏，如果它被翻译，则改变的基因将被翻译成无功能的蛋白质。
在本发明的另一方面，提供了一种生产本文所述的遗传改变的植物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使用本文所述的任何诱变技术将至少一个突变引入优选至少一个植物细胞的OTUB1基因和/或OTUB1启动子。优选地，所述方法进一步包括从突变的植物细胞再生植物。
该方法可以进一步包括选择一个或更多个突变植物，优选地用于进一步繁殖。优选地，所述选择的植物在OTUB1基因和/或启动子序列中包括至少一个突变。优选地，所述植物的特征在于OTUB1表达的消除或水平降低，和/或OTUB1多肽活性的水平降低。OTUB1的表达和/或活性水平可以通过技术人员已知的任何标准技术来测量。在一个实施方案中，可以测量OTUB1的去泛素酶活性。减少如本文所述。
所选择的植物可以通过多种手段繁殖，例如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，可以使第一代(或T1)转化的植株自交并选择纯合的第二代(或T2)转化株，然后可以通过经典育种技术进一步繁殖T2植株。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有细胞转化为包括表达盒)；转化和未转化组织的嫁接物(例如在植物中，将转化的砧木嫁接到未转化的接穗上)。
在本发明的另一方面，提供了一种通过上述方法获得的或可获得的植物。
为了本发明的目的，“遗传改变的植物”或“突变植物”是与天然存在的野生型(WT)植物相比已经遗传改变的植物。在一个实施方案中，突变植物是与天然存在的野生型(WT)植物相比已使用诱变方法(例如本文所述的任何诱变方法)改变的植物。在一实施方案中，诱变方法是靶向基因组修饰或基因组编辑。在一个实施方案中，与野生型序列相比，植物基因组已使用诱变方法改变。这样的植物具有如本文所述的改变的表型，例如增加的种子产量。因此，在该实例中，通过改变的植物基因组(例如，突变的内源OTUB1基因或OTUB1启动子序列)的存在而赋予了增加的种子产量。在一个实施方案中，使用靶向的基因组修饰来特异性地靶向内源启动子或基因序列，并且植物中表达的转基因的存在并不赋予突变的基因或启动子序列的存在。换句话说，遗传改变的植物可以描述为无转基因的。
根据本发明各个方面(包括本文所述的转基因植物、方法和用途)的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是农作物。农作物植物是指以商业规模生长以供人类或动物消费或使用的任何植物。在一个优选的实施方案中，植物是谷物。在另一个实施方案中，植物是拟南芥。
在最优选的实施方案中，植物选自水稻、小麦、玉米、大麦、芸苔属(brassica)(例如欧洲油菜(brassica napus))、大豆和高粱。在一实例中，小麦是野生的单粒小麦。在另一个实例中，植物是水稻，优选粳稻(japonica)或籼稻(indica)品种。在另一个实施方案中，植物携带突变的dep-1等位基因或其功能变体或同源物。优选地，植物(内源)携带或表达包括SEQ ID NO：156或158或由其组成的核酸序列，该核酸序列编码SEQ ID NO：157或159中定义的多肽。
本文所用的术语“植物”涵盖完整植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、果实、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，其中前述各项包括本文所述的核酸构建体。术语“植物”还涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚胎、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中前述各项都包括本文所述的核酸构建体。
本发明还扩展到本文所述的本发明植物的可收获部分、但不限于种子、叶子、果实、花、茎、根、根茎、块茎和鳞茎。本发明的方面还扩展到源自(优选直接源自)这种植物的可收获部分的产品，例如干颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。可以源自本发明植物的可收获部分的另一种产品是生物柴油。本发明还涉及包括本发明的植物或其部分的食品和食品补充剂。在一个实施方案中，食品可以是动物饲料。在本发明的另一方面，提供了源自本文所述植物或其一部分的产品。
在最优选的实施方案中，植物部分或可收获产品是种子或谷物。因此，在本发明的另一方面，提供了由如本文所述的遗传改变的植物产生的种子。在备选实施方案中，植物部分是本文所述的遗传改变植物的花粉、繁殖体或后代。因此，在本发明的另一方面，提供了如本文所述的遗传改变的植物的花粉、繁殖体或后代。
根据本发明所有方面的本文所用的对照植物是尚未根据本发明的方法修饰的植物。因此，在一个实施方案中，对照植物不具有降低的OTUB1核酸表达和/或降低的OTUB1多肽活性。在备选实施方案中，如上所述，对植物进行了基因修饰。在一个实施方案中，对照植物是野生型植物。对照植物通常属于相同的植物种类，优选具有与修饰的植物相同的遗传背景。
用于本文所述的靶向基因组修饰方法的基因组编辑构建体
“crRNA”或CRISPR RNA是指包括原间隔子元件以及与tracrRNA互补的其他核苷酸的RNA序列。
“tracrRNA”(反式激活RNA)是指与crRNA杂交并结合CRISPR酶(如Cas9)从而激活核酸酶复合体以在至少一个OTUB1核酸或启动子序列的基因组序列内的特定位点引入双链断裂的RNA序列。
“原间隔子元件”是指与基因组DNA靶序列互补的部分crRNA(或sgRNA)，通常长度约为20个核苷酸。这也可以称为间隔子或靶向序列。
“sgRNA”(单向导RNA)是指tracrRNA和crRNA在单个RNA分子中的组合，优选还包括连接环(将tracrRNA和crRNA连接成单个分子)。“sgRNA”也可以称为“sgRNA”，在本文中，术语“sgRNA”或“gRNA”是可互换的。sgRNA或gRNA提供针对Cas核酸酶的靶向特异性和支架/结合能力。gRNA可以指包括crRNA分子和tracrRNA分子的双重RNA分子。
“TAL效应子”(转录激活因子样(TAL)效应子)或TALE是指可以结合基因组DNA靶序列(OTUB1基因或启动子序列内的序列)并且可以融合至内切核酸酶(例如FokI)的切割结构域来生成TAL效应子核酸酶或TALENS，或融合至大范围核酸酶的切割结构域来生成megaTAL的蛋白质序列。TALE蛋白包括负责DNA结合的中央结构域、核定位信号和激活靶基因转录的结构域。DNA结合结构域由单体组成，每个单体可以结合靶核苷酸序列中的一个核苷酸。单体是33-35个氨基酸的串联重复序列，其中位于12和13位的两个氨基酸高度可变(重复可变双残基，RVD)。RVD负责识别单个特定核苷酸。HD靶向胞嘧啶，NI靶向腺嘌呤，NG靶向胸腺嘧啶，而NN靶向鸟嘌呤(尽管NN也可以较低的特异性结合腺嘌呤)。
在本发明的另一方面，提供了一种核酸构建体，其中所述核酸构建体包括编码至少一个DNA结合结构域的核酸序列。在一个实施方案中，DNA结合结构域可以结合OTUB1基因和/或启动子中的序列。优选地，所述序列选自SEQ ID NO：28、34、38、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142和146。在该实例中，SEQ ID NO：28(水稻)，34(水稻)，38(水稻)，102(小麦)，106(小麦)，110(大麦)，114(大麦)，118(玉米)，122(玉米)，126(高粱)，130(高粱)，134(大豆)，138(大豆)，142(芸苔属)和146(芸苔属)是OTUB1基因中的靶序列，SEQ ID NO：42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96和99是OTUB1启动子(优选水稻启动子)中的靶序列。在一个实施方案中，核酸构建体包括一个或更多个DNA结合结构域，使得该构建体可以结合OTUB1基因中的一个或更多个，优选至少两个或三个序列，其中所述序列选自：
(i)SEQ ID NO：28(水稻)，34(水稻)和38(水稻)；
(ii)SEQ ID NO：102(小麦)和106(小麦)；
(iii)SEQ ID NO：110(大麦)和114(大麦)；
(iv)SEQ ID NO：118(玉米)和122(玉米)；
(v)SEQ ID NO：126(高粱)和130(高粱)；
(vi)SEQ ID NO：134(大豆)和138(大豆)；或者
(vii)SEQ ID NO：142(芸苔属)和146(芸苔属)。
在备选或另外的实施方案中，核酸构建体包括一个或更多个DNA结合结构域，其中一个或更多个DNA结合结构域可结合选自SEQ ID NO：42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96和99中的至少一个序列。
在另一个实施方案中，所述构建体还包括编码SSN(例如FokI或Cas蛋白)的核酸。
在一个实施方案中，该核酸构建体编码至少一种原间隔子元件，其中该原间隔子元件的序列选自SEQ ID NO：29、35、39、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、82、85、88、91、94、97、100、103、107、111、115、119、123、127、131、135、139、143和147或其变体。在一个实例中，核酸构建体可以包括一个、两个或三个原间隔子序列，其中所述原间隔子序列的序列选自：
(i)SEQ ID NO：29(水稻)，35(水稻)和39(水稻)；
(ii)SEQ ID NO：103(小麦)和107(小麦)；
(iii)SEQ ID NO：111(大麦)和115(大麦)；
(iv)SEQ ID NO：119(玉米)和123(玉米)；
(v)SEQ ID NO：125(高粱)和131(高粱)；
(vi)SEQ ID NO：135(大豆)和139(大豆)；和
(vii)SEQ ID NO：143(芸苔属)和147(芸苔属)。
在另一个实施方案中，核酸构建体包括crRNA编码序列。如上文所定义，crRNA序列可包括如上文所定义的原间隔子元件，并且优选地包括与tracrRNA互补的额外核苷酸。额外核苷酸的合适序列是技术人员已知的，因为这些是通过选择Cas蛋白来定义的。
在另一个实施方案中，核酸构建体进一步包括tracrRNA序列。再次，合适的tracrRNA序列对于技术人员是已知的，因为该序列是通过选择Cas蛋白来定义的。然而，在一个实施方案中，所述序列包括如SEQ ID NO：30定义的序列或其变体或由其组成。
在另一个实施方案中，核酸构建体包括至少一个编码sgRNA(或gRNA)的核酸序列。再次，如已经讨论的，sgRNA通常包括crRNA序列或原间隔子序列和tracrRNA序列，和优选地接头环的序列。在一个优选的实施方案中，核酸构建体包括至少一个核酸序列，其编码如SEQ ID NO：31、36、40、44、47、50、53、56、59、62，65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144和148定义的sgRNA序列或其变体。
在另一个实施方案中，核酸构建体包括选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO：33、37、41、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145和149。
在另一个实施方案中，核酸构建体可以进一步包括至少一个编码内切核糖核酸酶切割位点的核酸序列。优选地，内切核糖核酸酶是Csy4(也称为Cas6f)。当核酸构建体包括多个sgRNA核酸序列时，所述构建体可以包括相同数目的内切核糖核酸酶切割位点。在另一个实施方案中，切割位点是sgRNA核酸序列的5'端。因此，每个sgRNA核酸序列的侧翼是内切核糖核酸酶切割位点。
术语“变体”是指核苷酸序列，其中核苷酸与上述序列之一基本相同。变体可以通过修饰(例如一个或更多个核苷酸的插入、取代或缺失)来实现。在优选的实施方案中，变体与任一个上述序列具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的同一性。在一实施方案中，序列同一性为至少90％。在另一个实施方案中，序列同一性是100％。序列同一性可以通过本领域中任何一个已知的序列比对程序来确定。
本发明还涉及包括与合适的植物启动子可操作连接的核酸序列的核酸构建体。合适的植物启动子可以是组成型或强启动子，或者可以是组织特异性启动子。在一个实施方案中，合适的植物启动子选自但不限于：洋丁香黄曲叶病毒(cestrum yellow leafcurling virus)(CmYLCV)启动子或柳枝稷泛素1启动子(PvUbi1)，小麦U6 RNA聚合酶III(TaU6)CaMV35S，小麦U6或玉米泛素(例如Ubi1)启动子。或者，可通过基因表达调节序列将表达特异性地定向于小麦种子的特定组织。在一个实施方案中，启动子选自U3启动子(SEQID NO：163)、U6a启动子(SEQ ID NO：164)、U6b启动子(SEQ ID NO：165)、双子叶植物中的U3b启动子(SEQ ID NO：166)和双子叶植物中的U6-1启动子(SEQ ID NO：167)。
本发明的核酸构建体还可以进一步包括编码CRISPR酶的核酸序列。“CRISPR酶”是指可以与CRISPR系统结合的RNA引导的DNA内切核酸酶。具体地，这种酶与tracrRNA序列结合。在一个实施方案中，CRIPSR酶是Cas蛋白(“CRISPR相关蛋白”)，优选Cas 9或Cpf1，更优选Cas9。在一个具体的实施方案中，Cas9是经密码子优化的Cas9(针对其在其中表达的植物而言是优化的)。在一个实例中，Cas9具有SEQ ID NO：150中描述的序列或其功能变体或同源物。在另一个实施方案中，CRISPR酶是来自2类候选x蛋白家族的蛋白，例如C2c1、C2C2和/或C2c3。在一实施方案中，Cas蛋白来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。在备选实施方案中，Cas蛋白可以来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)或齿垢密螺旋体(Treponema denticola)中的任何一个。
如本文中参考Cas9使用的术语“功能变体”是指保留完整的非变体序列的生物功能(例如充当DNA内切核酸酶，或识别或/和结合DNA)的变体Cas9基因序列或基因序列的一部分。功能变体还包括具有不影响功能的序列改变的目标基因的变体，例如非保守残基。还涵盖了基本上相同的变体，即与本文所示的野生型序列相比，仅具有一些序列变化，例如在非保守残基中，并且具有生物活性。在一个实施方案中，SEQ ID NO：150的功能变体与SEQID NO：150表示的氨基酸具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的总序列同一性。在另一个实施方案中，Cas9蛋白已被修饰以改善活性。
合适的同源物或直向同源物可以通过序列比较和保守结构域的识别来鉴定。同源物或直向同源物的功能可以如本文所述进行鉴定，因此技术人员将能够在植物中表达时确认其功能。
在另一个实施方案中，Cas9蛋白已经被修饰以改善活性。例如，在一个实施方案中，Cas9蛋白可包括D10A氨基酸取代，该切口酶仅切割与gRNA互补并被gRNA识别的DNA链。在一个备选的实施方案中，Cas9蛋白可以备选地或另外地包括H840A氨基酸取代，该切口酶仅切割不与sRNA相互作用的DNA链。在此实施方案中，Cas9可以与一对(即两个)sgRNA分子(或表达该对sgRNA分子的构建体)一起使用，因此可以切割相反DNA链上的靶区域，并有可能将特异性提高100-1500倍。在另一个实施方案中，cas9蛋白可包括D1135E取代。Cas 9蛋白也可以是VQR变体。或者，Cas蛋白可以在两个核酸酶结构域中都包括突变，HNH和RuvC0like abd因此是催化失活的。与其切割靶链，不如说该催化失活的Cas蛋白可用于防止转录延伸过程，从而导致与sgRNA分子共表达时翻译不完全的蛋白失去功能。催化失活蛋白的一个例子是由RuvC和/或HNH核酸酶结构域中的点突变引起的死亡Cas9(dCas9)(Komor等，2016和Nishida等，2016)。
在另一个实施方案中，可以将Cas蛋白(例如Cas9)与抑制效应子(例如组蛋白修饰/DNA甲基化酶或胞苷脱氨酶)进一步融合(Komor等，2016)以实现定点诱变。在后者中，胞苷脱氨酶不诱导dsDNA断裂，但介导胞苷向尿苷的转化，从而实现C到T(或G到A)的取代。这些方法对于靶向麦醇溶蛋白中的谷氨酰胺和脯氨酸残基，在保存麦醇溶蛋白功能性的同时打破毒性表位特别有用。
在另一个实施方案中，核酸构建体包括内切核糖核酸酶。优选地，内切核糖核酸酶是Csy4(也称为Cas6f)，并且更优选地是密码子优化的csy4，例如如SEQ ID NO：168所定义。在一个实施方案中，其中核酸构建体包括cas蛋白，核酸构建体可以包括用于表达内切核糖核酸酶的序列，例如Csy4，表达为与cas蛋白(例如Cas9)的5'末端P2A融合体(用作自切割肽)，例如，如SEQ ID NO：169所定义。
在一个实施方案中，可以将cas蛋白、内切核糖核酸酶和/或内切核糖核酸酶-cas融合序列可操作地连接至合适的植物启动子。合适的植物启动子已经在上面描述，但是在一个实施方案中，可以是玉米泛素1启动子。
用于产生CRISPR核酸和载体系统的合适方法是已知的，并且例如公开在Molecular Plant(Ma等，2015，Molecular Plant，DOI：10.1016/j.molp.2015.04.007)中，其通过引用并入本文。
在本发明的备选方面，核酸构建体包括至少一个编码TAL效应子的核酸序列，其中所述效应子靶向选自SEQ ID NO：28、34、38、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142和146的OTUB1基因和/或启动子序列。对于给定的靶序列，设计TAL效应子的方法对于技术人员来说是已知的。合适的方法的实例在Sanjana等和Cermak T等中给出，二者均通过引用并入本文。优选地，所述核酸构建体包括两个编码TAL效应子的核酸序列，以产生TALEN对。在另一个实施方案中，核酸构建体进一步包括序列特异性核酸酶(SSN)。优选地，这样的SSN是内切核酸酶，例如FokI。在另一个实施方案中，TALEN通过金门克隆方法组装在单个质粒或核酸构建体中。
在本发明的另一方面，提供了一种sgRNA分子，其中所述sgRNA分子包括crRNA序列和tracrRNA序列，并且其中所述crRNA序列可以结合选自SEQ ID NO：28、34、38、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142和146中的至少一个序列或其变体。在一个实施方案中，sgRNA分子的核酸序列定义在SEQ ID NO：31、36、40、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144和148中的任一项或其变体中。换句话说，sgRNA的RNA序列由选自SEQ ID NO：31、36、40、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144和148的核酸序列编码。仅在一个实例中，本发明的一个sgRNA的RNA序列定义在SEQ ID NO：32或其变体中。“变体”如本文所定义。在一实施方案中，sgRNA分子可包括至少一种化学修饰，例如增强其稳定性和/或对靶序列或crRNA序列与tracrRNA序列的结合亲和力。这样的修饰对于技术人员是众所周知的，并且包括例如但不限于Rahdar等，2015中描述的修饰，其通过引用并入本文。在该实例中，crRNA可以包括硫代磷酸酯骨架修饰，例如2′-氟(2′-F)，2′-O-甲基(2′-O-Me)和S-约束的乙基(cET)取代。
在本发明的另一方面，提供了分离的核酸序列，其编码原间隔子元件(如SEQ IDNO：29、35、39、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、82、85、88、91、94、97、100、103、107、111、115、119、123、127、131、135、139、143和147中任一项所定义)，或sgRNA(如SEQ IDNO：31、36、40、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144和148中任一项所述)。
在本发明的另一方面，提供了用本文所述的至少一种核酸构建体转染的植物或其部分或至少一种分离的植物细胞。Cas9和sgRNA可以组合或在单独的表达载体中(或核酸构建体，此类术语可互换使用)。换句话说，在一个实施方案中，分离的植物细胞用包括如上文所详细描述的sgRNA和Cas9的单个核酸构建体转染。在一个备选实施方案中，用两种核酸构建体转染分离的植物细胞，第一核酸构建体包括至少一个如上定义的sgRNA，第二核酸构建体包括Cas9或其功能变体或同源物。第二核酸构建体可以在第一核酸构建体之前，之后或同时转染。包括cas蛋白的单独的第二个构建体的优势在于，编码至少一个sgRNA的核酸构建体可以与如此处所述任何类型的cas蛋白配对，因此不限于单个cas功能(如当cas和sgRNA都在同一核酸构建体上被编码时的情况)。
在一个实施方案中，在用包括至少一个sgRNA核酸的核酸构建体进行第二次转染之前，首先转染包括cas蛋白的核酸构建体并将其稳定地掺入基因组中。在一个备选实施方案中，植物或其部分或至少一个分离的植物细胞用编码cas蛋白的mRNA转染，并用本文定义的至少一个核酸构建体共转染。
可如本领域中所述构建用于本发明的Cas9表达载体。在一个实例中，表达载体包括如SEQ ID NO：150所定义的核酸序列或其功能变体或同源物，其中所述核酸序列可操作地连接至合适的启动子。合适的启动子的实例包括肌动蛋白、CaMV35S、小麦U6或玉米泛素(例如Ubi1)启动子。
在本发明的备选方面，提供了用至少一个如本文所述的核酸构建体或sgRNA分子转染的分离的植物细胞。
在本发明的另一方面，提供了包括本文所述的转染细胞的遗传修饰或编辑的植物。在一个实施方案中，可以以稳定形式整合一个或更多个核酸构建体。在备选实施方案中，一个或多个核酸构建体不整合(即被瞬时表达)。因此，在一个优选的实施方案中，遗传修饰的植物不含任何sgRNA和/或Cas蛋白核酸。换句话说，植物是无转基因的。
如本文所指，术语“引入”、“转染”或“转化”涵盖外源多核苷酸向宿主细胞的转移，而与用于转移的方法无关。可以用本发明的遗传构建体转化能够随后通过器官形成或胚胎形成进行克隆繁殖的植物组织，并从中再生出整株植物。选择的特定组织将根据可用于且最适合于被转化的特定物种的克隆繁殖系统而变化。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、巨型配子体、愈伤组织、现有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)以及诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。然后可以以本领域技术人员已知的方式将所得的转化植物细胞用于再生转化植物。外来基因向植物基因组的转移称为转化。现在，植物转化是许多物种的常规技术。技术人员已知的几种转化方法中的任何一种都可用于将目标核酸构建体或sgRNA分子引入合适的祖细胞中。所描述的用于从植物组织或植物细胞转化和再生植物的方法可以用于瞬时或稳定转化。
转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、将DNA直接注入植物中(显微注射)、实施例中所述的基因枪(gene gun)(或生物射弹颗粒递送系统(基因枪法(biolistics)))、脂质转染、使用病毒或花粉的转化和显微注射。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法、超声介导的基因转染、光学或激光转染、使用碳化硅纤维的转染、原生质体的电穿孔、向植物材料的显微注射、DNA或RNA包被的颗粒轰击、用(非整合)病毒感染等。转基因植物也可以通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化产生，包括但不限于使用如Clough&Bent(1998)所述的花浸(floral dip)/农杆菌(Agrobacterium)真空渗透法，其通过引用并入本文。
因此，在一个实施方案中，可以使用任何上述方法将至少一个本文所述的核酸构建体或sgRNA分子引入至少一个植物细胞。在一个备选实施方案中，可以首先转录本文所述的任一个核酸构建体以形成预组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白，然后使用上述方法中的任一种(例如脂质转染、电穿孔或显微注射)将其递送至至少一个植物细胞。
任选地，为了选择转化的植物，通常将转化中获得的植物材料置于选择条件下，以便可以将转化的植物与未转化的植物区分开。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并且在初始生长期之后，通过喷雾进行合适的选择。另一种可能性是，如果合适的话，在灭菌后使用合适的选择剂使其种子在琼脂平板上进行生长，以便只有转化的种子才能生长成植物。如实施例中所述，合适的标记物可以是bar-膦丝菌素或PPT。或者，筛选转化的植物以确定是否存在选择标记，例如但不限于GFP、GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)。其他示例对于技术人员是容易知道的。或者，不进行选择，并且以上述方式获得的种子被种植和生长，并且使用本领域的标准技术在适当的时间测量OTUB1表达或蛋白质水平。该备选方案避免引入转基因，对于产生无转基因的植物是优选的。
DNA转移和再生后，还可以评估推定转化的植物，例如使用PCR来检测目标基因的存在、拷贝数和/或基因组组织。备选地或另外地，可以使用Southern、Northern和/或Western分析来监测新引入的DNA的整合和表达水平，这两种技术对于本领域普通技术人员而言都是众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种手段繁殖，例如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，可以使第一代(或T1)转化的植物自交并选择纯合的第二代(或T2)转化株，然后可以通过经典育种技术进一步繁殖T2植株。
在本发明的另一个相关方面，还提供了一种获得本文所述的遗传修饰植物的方法，该方法包括：
a.选择植物的一部分；
b.使用上述转染或转化技术，用本文所述的至少一个核酸构建体或本文所述的至少一个sgRNA分子转染(a)中所述植物的一部分的至少一个细胞；
c.再生至少一个源自转染细胞的植物；
d.选择根据(c)获得的显示OTUB1沉默或表达降低的一个或多个植物。
在另一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：针对OTUB1基因或启动子序列中的SSN(优选CRISPR)诱导的突变筛选经遗传修饰的植物。在一个实施方案中，该方法包括从转化的植物中获得DNA样品，并进行DNA扩增以检测至少一个OTUB1基因或启动子序列中的突变。
在另一个实施方案中，所述方法包括产生稳定的T2植物，所述植物优选为突变(即在至少一个OTUB1基因或启动子序列中的突变)纯合的。
在至少一个OTUB1基因或启动子序列中具有突变的植株也可以与在至少一个OTUB1基因或启动子序列中也包括至少一个突变的另一植株杂交，以获得在OTUB1基因或启动子序列中具有额外突变的植株。这种组合对于技术人员是显而易见的。因此，当与如上所述转化的单个T1植株中同源突变的数目相比时，该方法可用于产生在全部或增加数目的同源物中具有突变的T2植株。
通过上述方法获得或可获得的植物也在本发明的范围内。
本发明的遗传改变的植物还可以通过转移本发明的任何序列来获得，例如通过杂交，例如，使用本文所述的遗传改变的植物的花粉对野生型或对照植株进行授粉，或利用在至少一个OTUB1基因或启动子序列中不包括突变的其他花粉对本文所述的植物的雌蕊进行授粉。获得本发明植物的方法不仅仅限于本段中描述的那些；例如，可以如前所述从小麦穗进行生殖细胞的遗传转化，但是此后不必再生植物。
筛选天然存在的增加的谷粒产量表型的植物的方法
在本发明的另一方面，提供了一种用于筛选植物种群并鉴定和/或选择具有降低的OTUB1表达和/或增加的谷物产量表型的植物的方法，所述增加的谷物产量表型优选为增加的谷粒数量、每穗谷粒数量、谷粒重量、谷粒宽度、谷粒厚度、千粒重和/或谷粒长度减少(与对照或野生型植株相比)，该方法包括在植物或植物种质中检测OTUB1基因的启动子或OTUB1基因中的至少一种多态性(优选“低OTUB1表达子多态性”)。优选地，所述筛选包括确定至少一种多态性的存在，其中所述多态性为至少一个插入和/或至少一个缺失和/或取代。
在一个特定的实施方案中，所述多态性可以包括以下至少之一的取代：
-SEQ ID NO：2或5的1135位的C取代为T；
-SEQ ID NO：2或5的1462位的G取代为C；和/或
-SEQ ID NO：2或5的1798位的G取代为C。
在另一个另外的或备选的实施方案中，所述多态性是在SEQ ID NO：2或5的2234位插入单个氨基酸，优选T。
在另一个另外的或备选的实施方案中，所述多态性可以是在SEQ ID NO：155的1824位上的G到A的取代。
结果，如上所述的植物将表现出如上所述的增加的谷物产量表型。
评估多态性存在的合适测试是技术人员众所周知的，并且包括但不限于同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、任意引发的聚合酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹图谱(DAF)、序列表征的扩增区(SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR-也称为微卫星)和单核苷酸多态性(SNP)。在一实施方案中，使用竞争性等位基因特异性PCR(KASP)基因分型。
在一个实施方案中，该方法包括：
a)从植物获得核酸样品，以及
b)使用一个或更多个引物对进行一个或更多个OTUB1启动子等位基因的核酸扩增。
在另一个实施方案中，该方法可以进一步包括将包括至少一种所述低OTUB1表达多态性的染色体区域或包括如上所述的重复序列缺失的染色体区域渐渗入第二植物或植物种质中以产生渐渗的植物或植物种质。优选地，所述第二植物中OTUB1的表达将被减少或消除(与对照或野生型植株相比)，并且更优选地，所述第二植物将显示出谷物产量的增加，优选为谷粒数量、每穗谷粒数量、谷粒重量、谷粒宽度、谷粒厚度、千粒重中至少一项的增加和/或谷粒长度的减小。
在一个实施方案中，植物可以内源表达SEQ ID NO：2或4，并且通过本文所述的任何方法降低或进一步降低OTUB1核酸的水平和/或OTUB1蛋白的活性。
因此，在本发明的另一方面，提供了一种用于增加植物的产量(优选为种子或谷物产量)的方法，该方法包括：
a.筛选植物种群以获得具有至少一种上述多态性的至少一种植物；
b.通过如本文所述将至少一个突变引入编码OTUB1的核酸序列或将至少一个突变引入OTUB1的启动子或使用如本文所述的RNA干扰，进一步降低或消除所述植物中至少一个OTUB1核酸的表达和/或降低OTUB1多肽的活性。
“进一步减少”是指将OTUB1表达水平降低至低于具有至少一种上述OTUB1多态性的植物中的水平。术语“减少”是指与对照植株中的水平相比，OTUB1表达和/或活性水平降低达到10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％。
UBC13
发明人还惊奇地发现，增加E2泛素缀合蛋白UBC13的表达会产生与携带npt1等位基因的植物中观察到的相似的表型，例如增加的谷粒数量、千粒重和茎秆直径和分蘖数量减少。因此，UBC13的过表达也将增加谷物产量。因此，在本发明的另一个方面，提供了一种改变(优选增加)至少一个SQUAMOSA启动子结合蛋白样(SBP-结构域)转录因子的水平的方法，该方法包括增加如本文所述的UBC13的表达或活性，或降低或消除如本文所述的OTUB1的表达或活性。在一个实施方案中，SBP结构域转录因子是SPL14。
本文所用的术语“增加”、“改善”或“增强”是可互换的。在一个实施方案中，与对照植株相比，谷粒长度增加了至少2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％、11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，30％，40％或50％。优选地，增加至少5-50％。
因此，在本发明的另一方面，提供了一种核酸构建体，其包括编码如SEQ ID NO：161所定义的多肽或其功能变体或同源物的核酸序列，其中所述序列可操作地连接至调节序列，其中优选地，所述调节序列是组织特异性启动子或组成型启动子。在另一个实施方案中，核酸构建体包括SEQ ID NO：160(cDNA)或162(基因组)中定义的核酸序列或其功能变体或同源物。功能变体或同源物如上文所定义。
如本文所用的术语“可操作地连接”是指启动子序列与目标基因之间的功能性连接，使得启动子序列能够启动目标基因的转录。
“植物启动子”包括调节元件，其在植物细胞中介导编码序列节段的表达。因此，植物启动子不必是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如源自攻击植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如，源自用将要在本发明方法中表达并在本文描述的核酸序列转化的植物。这也适用于其他“植物”调节信号，例如“植物”终止子。可通过一个或更多个核苷酸取代、插入和/或缺失来修饰可用于本发明方法的核苷酸序列上游的启动子，而不会干扰任一启动子、开放阅读框(ORF)或3'调节区，例如终止子或其他远离ORF的3'调节区的功能或活性。此外可能的是，启动子的活性通过其序列的修饰而增加，或者它们被更具活性的启动子，甚至是来自异源生物的启动子完全替代。为了在植物中表达，如上所述，核酸分子必须与合适的启动子可操作地连接或包括合适的启动子，所述启动子在正确的时间点以所需的空间表达模式表达基因。如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子序列与目标基因之间的功能性连接，使得启动子序列能够启动目标基因的转录。
在一个实施方案中，启动子是组成型启动子。“组成型启动子”是指在至少一个细胞、组织或器官中在生长和发育的大多数但不一定是所有阶段中以及在大多数环境条件下具有转录活性的启动子。组成型启动子的实例包括但不限于肌动蛋白、HMGP、CaMV19S、GOS2、水稻亲环蛋白、玉米H3组蛋白、苜蓿H3组蛋白、34S FMV、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)小亚基、OCS、SAD1、SAD2、nos、V-ATPase、超级启动子、G-box蛋白和合成启动子。
在本发明的另一方面，提供了一种包括上述核酸序列的载体。
在本发明的另一方面，提供了包括核酸构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌细胞，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，或分离的植物细胞。本发明还涉及培养基和包括培养基和如下所述的分离的宿主细胞的试剂盒。
在另一个实施方案中，提供了表达如上所述的核酸构建体的转基因植物。在一实施方案中，所述核酸构建体被稳定地掺入植物基因组中。
通过如上所述的称为转化的方法将核酸序列引入所述植物。
产生的转化植物可以通过多种手段繁殖，例如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，可以使第一代(或T1)转化的植物自交并选择纯合的第二代(或T2)转化株，然后可以通过经典育种技术进一步繁殖T2植株。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体；克隆转化株(例如，所有转化为包括表达盒的细胞)；转化和未转化组织的嫁接物(例如在植物中，将转化的砧木嫁接到未转化的接穗上)。
上文定义了合适的植物。
在另一方面，本发明涉及如本文所述的核酸构建体用于增加谷物产量(优选为谷粒数量和/或千粒重)的用途。
在本发明的另一方面，提供了增加谷物产量(优选为谷粒数量和/或千粒重)的方法，该方法包括在所述植物中引入并表达本文所述的核酸构建体。
在本发明的另一方面，提供了一种生产具有增加的谷物产量(优选为谷粒数量和/或千粒重)的植物的方法，该方法包括在所述植物中引入并表达本文所述的核酸构建体。
所述增加是相对于对照或野生型植物。
尽管前述公开内容提供了对本发明范围内包括的主题的一般描述，包括制造和使用本发明的方法及其最佳模式，但提供以下实施例以进一步使本领域技术人员能够实施本发明并提供其完整书面说明。然而，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应理解为对本发明的限制，本发明的范围应从所附于本公开的权利要求及其等同方案中理解。鉴于本公开，本发明的各种另外的方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。
在本文中使用的“和/或”应被视为两个指定的特征或组件中的每个与或不与有另一个的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，就像它们在本文中分别列出一样。
除非上下文另外指示，否则以上阐述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且等同地适用于所描述的所有方面和实施方案。
前述申请以及在其中或在其诉讼期间引用的所有文件和序列编号(“申请引用的文件”)以及在申请引用的文件中引用或参考的所有文件，以及在此引用或参考的所有文件(“在此引用的文件”)，以及本文引用的文件中引用或参考的所有文件，以及在本文中或通过引用并入本文的任何文件中提及的任何产品的任何制造商的说明、描述、产品说明书和产品单，均通过引用并入本文，并且可以用于实施本发明。更具体地，所有参考文献通过引用的方式并入，就好像每个单独文件被具体地和单独地指示通过引用并入一样。
现在在以下非限制性实施例中描述本发明。
实施例1
长期以来，实现谷物生产率的提高一直是谷物育种计划的重中之重。在这里我们显示了水稻谷物产量数量性状基因座qNPT1(其通过确定以较少的不育分蘖、结实的茎秆和较大的穗为特征的新植物类型(NPT)结构起作用)编码与人OTUB1具有同源性的去泛素化酶。下调OsOTUB1增强分生组织活性，导致每株分蘖数减少，每穗谷粒数量增加，谷粒重量增加，从而导致谷物产量增加。OsOTUB1与OsUBC13和SBP结构域转录因子OsSPL14相互作用，在OsSPL14上限制Lys63连接的泛素以调节其蛋白酶体依赖性降解。相反，OsOTUB1的功能丧失会导致高水平OsSPL14的积累，进而控制NPT结构并增加谷物产量。高产npt1和dep1-1等位基因的叠加(pyramiding)提供了一种新的策略，可将水稻的增产潜力提高到目前可实现的水平以上。
从粳稻品种Chunjiang06与选定的NPT品系(IR66167-27-5-1-6)的杂交中选育出一组670个重组自交系(RILs)，并根据其具有与增加的谷粒数量，减少的分蘖数和增粗的茎秆有关的NPT表型选出了RIL52(图1a-1e)。随后的QTL分析鉴定了基因座qNPT1(新植物类型1)对所有三个性状均具有多效性(图1f)。qNPT1的位置克隆是通过使用由RIL52与籼稻品种Zhefu802(回交亲本)回交产生的BC2F2和BC2F3后代进行的。候选区域缩小到～4.1Kbp片段，两侧是标记P139和P143，其在LOC_Os08g42540处具有该基因的启动子和部分编码序列(图1g)。预计该基因编码与人OTUB1(含卵巢肿瘤结构域的泛素醛结合蛋白1)具有同源性的去泛素化酶(图5)，该蛋白与p53稳定性和DNA损伤修复的调控有关9-12。在此基础上，LOC_Os08g42540在下文中称为OsOTUB1。序列比较显示，五个核苷酸变体区分了造成NPT与常规表型相关的等位基因(图1h)：其中三个是单核苷酸多态性(SNP)，一个是内含子序列中的插入缺失多态性(Indel)，一个是启动子区域中的SNP。
接下来，我们在粳稻品种Zhonghua11(ZH11)的背景下生成了一个近等基因系(NIL)ZH11-npt1，其具有～240Kbp的区段，其中包括来自IR66167-27-5-1-6的npt1等位基因(图6)。定量RT-PCR分析显示，在茎分生组织和幼穗中发现了OsOTUB1转录物的峰丰度(图2a)。靶向OsOTUB1启动子的组织化学GUS分析表明，该基因在维管组织以及根冠和静止中心(QC)细胞中强烈表达(图7)。ZH11-npt1中OsOTUB1转录物的丰度低于ZH11(图2a)。使用CRISPR/Cas913产生的OsOTUB1基因敲除的表型与ZH11-npt1的相似，导致分蘖数减少，谷粒数量增加，谷粒重量增加并因此增加了谷物产量(图6)。在携带pOsOTUB1::OsOTUB1-GFP构建体的转基因植物中，在根和叶鞘细胞的细胞核和细胞质中均检测到GFP信号(图8)。水稻注释项目数据库(Rice Annotation Project Database)预测，OsOTUB1基因会产生两个可变剪接的转录物(alternatively spliced transcript)(图1g)。由其天然启动子驱动的表达OsOTUB1.1 cDNA的转基因ZH11-npt1的表型与ZH11的相似，而过表达OsOTUB1.2的表型与ZH11-npt1的相似(图6)。此外，过表达OsOTUB1.1的转基因ZH11植株的株高矮小，谷粒少，显示出叶片坏死(图9)。这些结果表明，OsOTUB1的功能丧失与个体基因型结构有关。
单元型分析显示，npt1等位基因尚未被籼稻和温带粳稻品种的育种者利用(图1h)。由于高产的dep1-1等位基因已被中国育种者大量使用14，15，因此有必要评估将npt1和dep1-1结合使用的效果。在优良粳稻品种Wuyunjing7(携带NPT1和dep1-1等位基因，以下称为WYJ7-NPT1-dep1-1)中创建了qNPT1和qDEP1基因座等位基因组合的NIL。WYJ7-npt1-dep1-1和WYJ7-NPT1-dep1-1植株的抽穗期和株高无差异(图2b，2e和2f)，而WYJ7-npt1-dep1-1植株与WYJ7-NPT1-dep1-1相比，形成的分蘖数少，并且产生了更多的较重谷粒(图2g-2j)。WYJ7-npt1-dep1-1植株形成的茎顶端分生组织要比WYJ7-NPT1-dep1-1植株形成的茎顶端分生组织大(图2k)，这暗示npt1和dep1-1协同作用以增强分生组织活性5。WYJ7-npt1-dep1-1植株的特征还在于更多的维管束，更粗的茎秆以及更厚的薄壁组织和厚壁组织细胞壁(图21-2n)。重要的是，在连续三个季节中，WYJ7-npt1-dep1-1植株的总产量比WYJ7-NPT1-dep1-1植株的总产量高10.4％(图2o)。因此，npt1和dep1-1等位基因的叠加(pyramiding)代表了增加水稻谷物产量的有效手段。
给定OsOTUB1的预期去泛素酶活性，我们接下来检查了其切割线性Lys48和Lys63连接的四泛素的能力。与其人类同源物的行为一致，当以Lys48连接的四泛素16，17呈现时，它显示出强大的切割活性，但与OTUB1不同，当以Lys63连接的形式呈现时，它也显示出中等水平的活性(图10)。在OsOTUB1启动子的驱动下，表达OTUB1或其来自小鼠、玉米或大麦的直向同源物的ZH11-npt1植株表现出的表型与表达OsOTUB1.1的ZH11或转基因ZH11-npt1植株的表型不可区分(图11)，这表明来自所有这些物种的OTUB1直向同源物在功能上是可互换的。已知OTUB1与UBC13相互作用以抑制双链断裂诱导的染色质泛素化9，10，并且在OsOTUB1和OsUBC13之间建立了相同的体外和体内相互作用(图12)。OsUBC13的过表达产生的表型与携带npt1等位基因的植株至少在谷粒数量，分蘖数和茎秆直径方面相似(图12)。相反，针对OsUBC13的RNAi的组成型表达产生的表型让人联想到其中OsOTUB1.1 cDNA过表达的植物(图9和图12)。
靶向与OsOTUB1相互作用的蛋白质的酵母双杂交筛选确定了72个候选相互作用子，其中包括SQUAMOSA启动子结合蛋白样(SBP结构域)转录因子OsSPL14的水稻同源物，已知它可控制具有分蘖数减少，茎秆加粗和谷粒数量增加的植物结构18,19。双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀分析表明，在植物中明显发生了OsSPL14-OsOTUB1相互作用(图3a，3b)。缺失分析表明，保守的SBP结构域对于体外和体内相互作用都是必需和充分的(图3a和图13)。进一步的BiFC分析表明OsOTUB1能够与整套水稻SPL转录因子相互作用(图14)，这与数据一致，所述数据表明OsSPL7、OsSPL13、OsSPL14和OsSPL16转录物的丰度与分蘖数减少，谷粒数量增加或谷粒重量增加中的一个或更多个相关18-23。已显示与高OsSPL14转录水平19相关的npt1或OsSPL14WFP等位基因的存在会产生NPT的结构，而其中OsSPL14已被RNAi沉默的ZH11-npt1植株的表型与ZH11植株的表型相似(图3c-3h)。基于比较RNA-seq的ZH11、ZH11-npt1和ZH11-OsSPL14WFP的转录组分析揭示ZH11-npt1和ZH11-OsSPL14WFP中的453个共同靶基因的转录水平均高于ZH11中的水平(图15)，该结果用qRT-PCR进行了验证22-24。相反，在沉默了OsSPL14的ZH11-npt1中，检测到的靶基因的丰度大大降低了(图15)。因此，OsOTUB1和OsSPL14拮抗性作用以通过调节共同靶基因来控制植物的结构。
EMSA分析表明，OsOTUB1-OsSPL14相互作用不太可能影响OsSPL14与其靶向GTAC基序的结合亲和力(图16)。ZH11和ZH11-npt1之间的OsSPL14转录物丰度没有差异(图3e)，但是在后者基因型中OsSPL14的积累要高得多(图4a)。当暴露于蛋白酶体抑制剂MG132时，ZH11中OsSPL14的积累明显增加(图4b)。这些结果表明，与调节p53和SMAD蛋白的稳定性的OTUB1不同11，12，OsOTUB1促进了OsSPL14的降解。当用GST-OsSPL14攻击从ZH11幼穗制备的裂解物时，GST-OsSPL14的滴度随时间降低，但当包括MG132处理时则相反(图4c)。当从ZH11-npt1制备裂解物时，GST-OsSPL14的稳定积累大于从ZH11穗中制备的裂解物，而在存在His-OsOTUB1的情况下，由ZH11-npt1穗制备的裂解物中GST-OsSPL14的降解加速(图4c)。蛋白质印迹分析表明，通过使用识别总泛素、Lys48-多泛素或Lys63-多泛素缀合物的抗体，可以检测从幼穗中免疫沉淀的多泛素化形式的Myc-OsSPL14的存在(图4d)。这暗示着OsSPL14受Lys48和Lys63连接的泛素化的调节25。
该分析扩展到研究内源性E3连接酶介导的OsSPL14泛素化。在存在WT泛素的情况下，MG132处理表达Flag-OsSPL14的水稻原生质体导致多泛素化Flag-OsSPL14的积累增加；然而，在存在K48R泛素的情况下，MG132处理对多泛素化的Flag-OsSPL14的积累没有可觉察的作用(图4e)。该观察与OsSPL14的Lys48连接的泛素是其蛋白酶体介导的降解所需的观点是一致的。在存在Myc-OsOTUB1.1的情况下，在存在K48R或K63O突变的情况下，泛素化的Flag-OsSPL14的滴度明显降低，但仍不受存在的K48O或K63R突变的影响(图4f)。此外，Myc-OsOTUB1仅在存在WT-，K63O-或K48R连接的泛素的情况下才促进Flag-OsSPL14的降解(图4f)，这表明OsSPL14的稳定化与Lys63连接的泛素化相关。总的来说，这些结果表明，OsOTUB1介导的对OsSPL14的Lys63连接的泛素化的抑制对于其蛋白酶体依赖性降解是必需的。
靶向miR156的SBP结构域转录因子在调节植物干细胞功能和开花中起重要作用26-28。SBP结构域转录因子的非规范的OsOTUB1介导的调控建立了研究分生组织细胞命运、花序结构和花发育的新框架。我们的发现阐明了水稻育种计划中一种个体基因型方法(ideotype approach)的分子基础，OsOTUB1-OsSPL14模块的操作还提供了一种潜在的策略，以促进具有更高谷物生产率的新水稻品种的育种。
植物材料和生长条件。从中国温带粳稻品种Chunjiang06与NPT选择IR66167-27-5-1-6的杂交中选育了一组670个RIL种群。用于序列多样性分析的水稻品种已在其他地方中进行了描述14，21。携带npt1、OsSPL14WFP19，29或qNPT1和qDEP1基因座的等位基因组合的NIL植株是通过将RIL52与Zhonghua11或Wuyunjing7杂交7次而选育的。稻田生长的植物的间距为20cm，并在标准生长季节在三个实验站进行了种植，其中一个位于陵水(海南省)，一个位于合肥(安徽省)，另一个位于北京。
转基因构建体。从ZH11基因组DNA(gDNA)中扩增OsOTUB1.1和OsOTUB1.2编码序列，其UTR(5'：从转录起始位点至-2.8Kbp；3'：终止位点下游的1.5Kbp)，并引入pCAMBIA2300载体(CAMBIA)，以生成pOsOTUB1::OsOTUB1.1和pOsOTUB1::OsOTUB1.2。从相关的cDNA模板中扩增出全长的人OTUB1 cDNA(及其小鼠、大麦和玉米直向同源物)，然后亚克隆到pActin::nos载体14中，而将OsOTUB1.1 cDNA及其5'-UTR引入p35S::GFP-nos载体21中以生成pOsOTUB1::OsOTUB1.1-GFP-nos构建体。为了形成p35S::Myc-OsSPL14，从ZH11 cDNA的模板扩增OsSPL14cDNA，并将其克隆到p35S::Myc-nos中。如其他地方所述13，产生了OsOTUB1的CRISPR/Cas9敲除所需的gRNA构建体。从ZH11 cDNA扩增OsSPL14 cDNA的300bp片段和OsUBC13 cDNA的300bp片段，并用于构建pActin::RNAi-OsSPL14和pActin::RNAi-OsUBC13转基因，如其他地方所述14。如前所述5，通过农杆菌介导的转化产生了转基因水稻植株。相关的引物序列在图17中给出。
定量实时PCR(qRT-PCR)分析。使用TRIzol试剂(Invitrogen)从植物组织中提取总RNA，并根据制造商的方案用无RNase的DNase I(Invitrogen)处理。使用cDNA合成试剂盒(TRANSGEN)将所得的RNA逆转录。随后的qRT-PCR如其他地方所述进行21，包括三个独立的RNA制备物作为生物学复制品。水稻Actin1用作参考。相关的引物序列在图17中给出。
酵母双杂交试验。如其他地方所述14，21，进行酵母双杂交试验。从ZH11 cDNA扩增出全长OsOTUB1.1 cDNA和OsOTUB1 C端片段，并将其插入pGBKT7(Takara Bio Inc.)，而将全长OsUBC13 cDNA和OsSPL14的C末端片段插入pGADT7(Takara Bio Inc.)。在转化到酵母菌株AH109中之前，通过测序验证了这些质粒的每一个。根据制造商(Takara Bio Inc.)的方案进行了所需的β-半乳糖苷酶试验。含有空pGBKT7或空pGADT7的细胞用作阴性对照。整个OsOTUB1序列或C端片段被用作诱饵来筛选cDNA文库，该文库由从水稻幼穗(长<0.2cm)中分离的含聚A的RNA制备。用于筛选和质粒分离的实验步骤遵循制造商(Takara Bio Inc.)的方案。相关引物序列列于图17。
BiFC试验。从ZH11 cDNA中扩增OsOTUB1.1、OsUBC13、OsSPL1至OsSPL13以及OsSPL15至OsSPL19全长cDNA，以及OsSPL14缺失和未缺失的形式，并将扩增子插入pSY-735-35S-cYFP-HA或pSY-736-35S-nYFP-EE载体30以生成一组融合构建体。将两个用于测试蛋白质与蛋白质相互作用的载体(例如nYFP-OsSPL14和cYFP-OsOTUB1)共转染到水稻原生质体中。在黑暗中温育14小时后，按照其他地方所述31，在共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)下检查YFP信号并拍照。每个BiFC试验至少重复3次。相关引物序列列于图17。
体外下拉(pull-down)。将重组GST-OsOTUB1融合蛋白固定在谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠上，并在4℃与His-OsUBC13温育30分钟。将谷胱甘肽琼脂糖珠洗涤3次，并用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0)洗脱。使用抗His和抗GST抗体(SantaCruz)对上清液进行免疫印迹分析。
免疫共沉淀和蛋白质印迹。使用由50mM HEPES(pH7.5)，150mM KCl，1mM EDTA，0.5％Trition-X 100，1mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物(Roche LifeScience,Basel,Switzerland)组成的缓冲液，从含有pActin::Myc-OsSPL14的转基因ZH11植株的幼穗(长度<0.2厘米)中提取Myc-OsSPL14。加入琼脂糖缀合的抗Myc抗体(Sigma-Aldrich)，将反应在4℃下保持至少4小时，然后用TBS-T缓冲液洗涤5～6次，并用2×上样缓冲液洗脱。将免疫沉淀物和裂解物进行SDS-PAGE，并将分离出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上(GEHealthcare)。通过使用抗Myc抗体(Santa Cruz)探测该膜以检测Myc-OsSPL14融合蛋白，而通过识别总泛素缀合物的抗体、特异性识别Lys48-多泛素缀合物的抗体和特异性识别Lys63-多泛素缀合物的抗体(Abcam)进行探测以检测其多泛素化形式。
OsSPL14降解的分析。在存在或不存在重组His-OsOTUB1融合蛋白的情况下，将从ZH11和ZH11-npt1植株收获的幼穗(长度小于0.2cm)获得的裂解液与合适的重组GST-OsSPL14融合蛋白一起温育。从已经暴露或未暴露于50μM MG132预设系列时间的裂解物中提取蛋白质，然后基于抗GST抗体(Santa Cruz)进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。作为内参(loading control)，通过用抗HSP90抗体(BGI)探测来检测HSP90的丰度。裂解缓冲液包括25mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM NaCl，10mM MgCl2，4mM PMSF，5mM DTT和10mM ATP，如其他地方所述32。
线性K48和K63连接的四泛素切割试验。将约1μg重组GST-OsOTUB1.1、GST-OsOTUB1.2或OTUB1的等分试样添加到20μL的50mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM NaCl，0.5mM二硫苏糖醇中，其中含有2.5μg线性K48-和K63-连接的四泛素(Boston Biochem)，并在37℃下保持1小时。如其他地方所述16，通过基于抗泛素抗体(Abcam)的蛋白质印迹分析反应产物。
体外泛素化分析。在存在或不存在质粒pUC19-35S-Myc-OsOTUB1-RBS的情况下，用质粒pUC19-35S-Flag-OsSPL14-RBS(33)和pUC19-35S-HA-Ubiq-RBS(HA标记的泛素(WT)，K48R(K48突变为精氨酸)，K63R(K63突变为精氨酸)，K48O(仅具有K48，其他赖氨酸残基突变为精氨酸的泛素)或K63O(仅具有K63，其他赖氨酸残基突变为精氨酸的泛素)转染由ZH11-npt1幼穗(长<0.2cm)制备的水稻原生质体。在15h后，将原生质体在含蛋白酶抑制剂混合物(Roche LifeScience)的提取缓冲液[50mM Tris-HCl(pH7.4)，150mM KCl，1mM EDTA，0.5％Trition-X 100，1mM DTT]中裂解。将所得裂解液用琼脂糖缀合的的抗-Flag抗体(Sigma-Aldrich)在4℃下攻击至少4h，然后在提取缓冲液中清洗5-6次，然后用3×Flag肽(Sigma-Aldrich)洗脱。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物并转移到硝酸纤维素膜(GE Healthcare)上，其用于使用抗HA和抗Flag缀合物抗体(Sigma-Aldrich)进行蛋白质印迹分析。
实施例2
结果
wtg1-1突变体产生宽、厚、短和重的谷粒
为了了解如何确定水稻中的粒度，我们用γ射线诱变了粳稻品种Zhonghuajing(ZHJ)，并在M2种群中分离出了一株宽而厚的谷物1(wtg1-1)突变体。wtg1-1谷粒比ZHJ谷粒宽(图18a，b，e)。ZHJ谷粒宽度为3.41mm，而wtg1-1谷粒宽度为3.84mm(图18e)。相比之下，与ZHJ相比，wtg1-1谷粒的长度减小(图18a，b，d)。ZHJ谷粒的长度为7.47mm，而wtg1-1谷粒的长度为6.89mm。wtg1-1谷粒明显比ZHJ谷粒厚(图18c)。ZHJ和wtg1-1谷粒的平均厚度分别为2.27mm和2.66mm(图18f)。重要的是，wtg1-1谷粒明显比ZHJ谷粒重(图18g)。ZHJ和wtg1-1的1000粒重分别为25.56g和29.09g。这些结果表明，WTG1影响谷粒的宽度、厚度和长度以及谷粒重量。
wtg1-1突变体增加每穗谷粒数量
与野生型植株相比，成熟的wtg1-1植株略短(图19a，b，f)。与ZHJ植株相比，wtg1-1植株产生的叶片较宽，而wtg1-1植株的叶片长度与ZHJ植株的叶片长度相似(图19c，d，g，h)。与野生型穗相比，wtg1-1穗短、厚且致密，显示出直立的穗表型(图19e，i)。与野生型穗相比，wtg1-1穗的轴长减小(图19j)，这表明WTG1影响穗的大小。因为穗枝决定穗的结构和形状，我们检查了野生型和wtg1-1的主穗枝和次穗枝。wtg1-1穗比ZHJ具有更多的主穗枝和次穗枝(图19k,l)。我们检查了ZHJ和wtg1-1中每穗谷粒数量。如图2M所示，wtg1-1中每穗谷粒数量高于ZHJ。因此，这些数据表明wtg1-1中主穗枝和次穗枝数目的增加导致每穗谷粒数量的增加。
WTG1基因的鉴定
我们试图使用MutMap方法(Abe等，2012)鉴定wtg1-1突变，该方法已用于克隆水稻中的基因。我们将wtg1-1与ZHJ杂交并产生了F2种群。在F2种群中，后代分离表明单个隐性突变决定wtg1-1的表型。我们从五十个表现出宽和粗粒表型的F2植株中提取了DNA，并混合了相同数量的DNA以进行全基因组测序。我们还对ZHJ进行了测序以作为对照。ZHJ和合并的F2植株分别产生了6.2Gbp和5.4Gbp的短读出(short read)。我们在合并的F2和ZHJ之间检测到1399个SNP和157个INDEL。然后，我们计算了合并的F2植株中的SNP/INDEL比例。考虑到F2种群中的所有突变植株都应具有成因性SNP/INDEL，因此合并的(bulked)F2植株中此成因性突变的SNP/INDEL比例应为1。其中，只有一个INDEL显示SNP/INDEL比例＝1。该INDEL在基因(LOC_Os08g42540)中包括一个4-bp的缺失(图a，23)。通过开发标记物dCAPS1，我们进一步证实了wtg1-1中的这种缺失(图20b)。因此，这些分析表明LOC_Os08g42540可能是WTG1基因。
为了确认WTG1是LOC_Os08g42540基因，我们进行了遗传互补测试。将包括2337bp的5'侧翼序列，LOC_Os08g42540基因和1706bp的3'侧翼序列(gWTG1)的基因组片段转化到wtg1-1突变体中。gWTG1构建体补充了wtg1-1突变体的表型(图20f-k)。gWTG1；wtg1-1转基因植物的谷粒宽度、谷粒厚度和谷粒长度与ZHJ相当。因此，该基因组互补实验证实了WTG1基因是LOC_Os08g42540。
WTG1编码具有去泛素化活性的otubain样蛋白酶
WTG1基因编码具有预期的otubain结构域的未知蛋白(图20d)。在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)、江南卷柏(Selaginella moellendorffii)、其他植物物种和动物中发现了WTG1同源物(图24)。禾本科(例如小麦、短柄草(Brachypodium)、玉米和高粱)中的同源物与WTG1具有高的氨基酸序列同一性(图24)。WTG1还与人的otubain 1/2蛋白(OTUB1/2)具有相似性(图25)，后者参与多种生理和发育过程(Nakada等，2010；Herhaus等，2013)。在wtg1-1中，4-bp缺失发生在第四内含子的外显子-内含子结合区(图20a)。wtg1-1突变导致WTG1的剪接发生改变，从而导致过早的终止密码子(图20c)。wtg1-1等位基因编码的蛋白质缺少一半预期的otubain结构域，并且还包括一个完全不相关的肽(图20e)，这表明wtg1-1是功能丧失的等位基因。
在动物中，已知otubain蛋白具有去泛素化活性，因为它们具有在半胱氨酸蛋白酶的保守催化结构域中具有组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸残基(图25)(Balakirev等，2003)。WTG1与人的otubain蛋白具有相似性，并且具有otubain样结构域(图20d，25)，这表明WTG1可能是otubain样蛋白酶。因此，我们仔细检查了WTG1的氨基酸序列，发现WTG1在预期的otubain结构域中包括保守的天冬氨酸(D68)、半胱氨酸(C71)和组氨酸(H267)残基，它们定义了动物中泛素蛋白酶的催化三联体(图20d，25)(Balakirev等，2003)。然后，我们调查了WTG1是否具有去泛素化活性。我们将WTG1、由wtg1-1等位基因编码的WTG1wtg1-1和在保守氨基酸中具有突变的WTG1D68E；C71S；H267R表达为MBP(麦芽糖结合蛋白)标记的蛋白(MBP-WTG1、MBP-WTG1wtg1-1和WTG1D68E；C71S；H267R)并将UBQ10(六聚体聚泛素)表达为His标记的蛋白(His-UBQ10)。去泛素化试验显示MBP-WTG1能够切割His-UBQ10，但是MBP-WTG1wtg1-1，MBP-WTG1D68E ；C71S；H267R和MBP不切割His-UBQ10(图20l)。这些结果表明，WTG1具有去泛素化活性，WTG1wtg1-1缺乏去泛素化活性，而保守的天冬氨酸(D68)、半胱氨酸(C71)和组氨酸(H267)残基对于WTG1的去泛素化活性至关重要。因此，WTG1是一种具有去泛素化活性的otubain样蛋白酶。
WTG1的表达和亚细胞定位
我们使用定量实时RT-PCR分析检查了WTG1的表达。如图21a所示，WTG1基因在叶片、发育中的穗和根中表达。我们生成了WTG1启动子：GUS转基因植物(proWTG1:GUS)，并检查了WTG1在不同组织中的表达模式。我们在proWTG1:GUS幼苗的叶片和根中发现了GUS染色(图21b)。发育中的穗中的GUS染色也是可检测的(图21d)。幼穗中的GUS活性强于老穗中的GUS活性(图21d)，这与WTG1在影响穗分枝数方面的功能一致。在小穗壳发育过程中，WTG1的表达从尖端开始，然后向下扩散到整个小穗壳，最后在以后的发育阶段消失。因此，WTG1的表达模式支持其在穗和小穗壳发育中的功能。
然后，我们生成了pro35S:GFP-WTG1转基因植物，并研究了WTG1的亚细胞定位。如图5e-g所示，pro35S:GFP-WTG1根中的GFP信号主要在细胞核中检测到。我们进一步确认GFP-WTG1是否可以专门定位于细胞核。我们从pro35S:GFP-WTG1转基因植物中制备了细胞质和核蛋白部分。出乎意料的是，GFP-WTG1融合蛋白同时存在于核部分和细胞质部分，尽管在细胞质中没有明显观察到pro35S:GFP-WTG1植物中的GFP信号(图21h)。因此，这些发现表明WTG1定位于水稻的细胞核和细胞质中。
因为小穗壳中狭长的细胞，WTG1的过表达导致窄、薄和长的谷粒
为了进一步揭示WTG1在粒度和形状控制中的功能，我们构建了proActin:WTG1构建体并将其转化到野生型(ZHJ)。如图22g所示，proActin:WTG1转基因株系的WTG1表达水平高于野生型(ZHJ)。然后，我们研究了proActin:WTG1转基因株系的粒度和形状表型。如图22a-f所示，与ZHJ相比，proActin:WTG1转基因株系形成窄、薄和长的谷粒。proActin:WTG1转基因株系中WTG1的表达水平与粒度和形状表型有关(图22d-g)。这些数据进一步揭示了WTG1的作用是影响粒度和形状。
考虑到proActin:WTG1转基因株系显示出狭窄而长的颗粒，我们确认了WTG是否会影响细胞扩增。我们检查了ZHJ和proActin:WTG1小穗壳的外表皮细胞的大小。与ZHJ小穗壳相比，proActin:WTG1小穗壳的外表皮包括狭窄和长的细胞(图26a，b)。相比之下，proActin:WTG1小穗壳的外表皮在谷粒宽度和谷粒长度方向上的表皮细胞数量与野生型小穗壳相似(图26c，d)。这些结果进一步表明，WTG1通过影响小穗壳中的细胞大小和形状来确定粒度和形状。
讨论
粒度和形状对于作物的谷物产量和谷粒外观至关重要。谷粒宽度、厚度和长度共同决定了水稻的粒度和形状。但是，水稻中决定粒度和形状的分子机制仍然有限。在这项研究中，我们分离出一个宽而厚的谷物突变体(wtg1-1)，与野生型相比，该突变体显示出厚、宽、短和重的谷粒。WTG1编码具有去泛素化活性的otubain样蛋白酶。WTG1的过表达会导致狭窄、薄和长的谷粒。因此，我们的发现确定了otubain样蛋白酶是影响水稻粒度和形状的重要因素，这表明它具有增加谷物产量和改善粒度和形状的潜力。
wtg1-1突变体形成了粗、宽和短的谷粒(图18a-f)，这表明WTG1充当影响水稻粒度和形状的因素。wtg1-1谷粒比ZHJ谷粒重(图18g)，这表明WTG1在确定谷粒重量中起关键作用。与野生型相比，wtg1-1突变体显示出短、厚和致密的穗(图19e)，这表明WTG1在影响穗的大小和形状方面发挥了作用。wtg1-1突变导致每穗谷粒数量增加，这是因为主穗枝和次穗枝都增加(图19k，l，m)。以前的研究表明，每穗谷粒数量的增加通常会导致粒度和重量的减小(Huang等，2009)。相比之下，已经描述了几种水稻突变体，它们可以增加粒度和每穗谷粒数量(Li等，2011a，Hu等，2015)。在这里，我们的结果表明wtg1-1突变体产生了较重的谷粒并增加了每穗谷粒数量。
WTG1基因编码otubain样蛋白酶。WTG1的同源物发现于植物和动物中。人中WTG1的同源物是去泛素化酶(DUB)的卵巢肿瘤结构域蛋白酶(OTU)家族的成员。OTUB1参与DNA损伤修复和转化生长因子b(TGFb)信号通路(Nakada等，2010；Herhaus等，2013)。OTUB1具有去泛素化活性，并具有从其靶标中去除附着的泛素链或分子的功能。OTUB1的OUT结构域具有三个保守氨基酸(D88/C91/H265)(Balakirev等，2003)。类似地，WTG1在预期的otubain结构域中包括预期的催化三联体(D68/C71/H267)，这表明WTG1可能具有去泛素化活性。与此相符，我们的生化数据显示WTG1可以切割聚泛素，这表明WTG1是一种功能性的去泛素化酶。相比之下，预期的催化三联体(WTG1D68E；C71S；H267R)中的突变破坏了WTG1的去泛素化活性(图20l)，这表明这些保守的氨基酸对于去泛素化活性至关重要。此外，由wtg1-1等位基因(WTG1wtg1 -1)编码的蛋白质没有显示任何去泛素化活性，这表明wtg1-1是功能丧失的等位基因。WTG1可能会从其靶标去除泛素链并阻止其靶标降解。
wtg1-1突变体产生宽、厚和短的谷粒，而WTG1的过表达导致狭窄、薄和长的谷粒。此外，wtg1-1谷粒比野生型显著更重，wtg1-1突变体显示出每穗谷粒数量增加，这表明它具有增加谷物产量的潜力。因此，值得测试作物(例如玉米和小麦)中的WTG1及其同源物将来是否可用于改善谷物产量，粒度和形状。众所周知，农作物育种者已经在驯化过程中选择了粒度和形状性状。我们发现水稻品种在WTG1基因区域(http://ricevarmap.ncpgr.cn)中包括多个SNP。
材料和方法
植物材料和生长条件
用γ射线照射了粳稻Zhonghuajing(ZHJ)的谷粒，并从该M2种群中鉴定出宽而厚的谷物1(wtg1-1)突变体。水稻植物以密度20cm×20cm在稻田中生长。将总共48棵水稻幼苗从育苗床移栽到每块稻田(1.92m2)中。分别于2015年12月至2016年4月在陵水(110°03′E，18°51′N，海拔10m，中国海南)和2016年7月至2016年11月在杭州(119°95′E，30°07′，海拔12m，中国浙江)的稻田上种植水稻。陵水的土壤类型为沙壤土，杭州的土壤类型为黏土壤土。在生长季节中，陵水的温度在9℃到32℃之间，杭州的温度在12℃到39℃之间(http://data.cma.cn/site/index.html)。在水稻的生长周期中施用氮、磷和钾肥(各自每公顷120kg)。
形态和细胞分析
将稻田中生长的ZHJ和wtg1-1植株挖出并放入盆中拍照。MICROTEK Scan Markeri560(MICROTEK，中国上海)用于扫描成熟谷物。WSEEN水稻测试系统(WSeen，中国浙江)用于自动测量谷粒的宽度和长度。使用数字卡尺(JIANYE TOOLS，中国浙江)测量谷粒厚度。使用来自30个主穗的谷粒来测量谷粒重量。使用电子分析天平称重总共1000个干种子。用三个重复样本研究了谷粒重量。
WTG1的鉴定
为了克隆WTG1基因，我们将wtg1-1与ZHJ杂交以产生F2种群。在F2种群中，我们选择了显示wtg1-1表型的50株植物，并使用NextSeq 500(Illumina，美国)以相等的比例合并了它们的DNA，以进行全基因组重测序。根据先前的研究(Abe等人，2012)进行MutMap，根据先前的报告(Fang等，2016)计算SNP/INDEL比例。只有一个INDEL显示SNP/INDEL比例＝1。此INDEL具有4-bp缺失，这种缺失发生在LOC_Os08g42540的第四个内含子的外显子-内含子结合区。基于该4bp缺失进一步开发了dCAPS1标记。因此，LOC_Os08g42540是WTG1的候选基因。
构建体和植物转化
使用引物C99-WTG1-GF和C99-WTG1-GR扩增WTG1的基因组序列，该序列包括2337bp的5'侧翼序列、WTG1基因和1706bp的3'侧翼序列。然后使用GBclonart Seamless CloneKit(GB2001-48，Genebank Biosciences)将基因组序列插入PMDC99载体，以生成gWTG1构建体。引物003-CDSWTG1-F和003-CDSWTG1-R用于扩增WTG1基因的CDS。使用GBclonartSeamless Clone Kit(GB2001-48，Genebank Biosciences)将CDS插入带有ACTIN启动子的pIPKb003载体，以构建proACTIN:WTG1质粒。使用引物C43-CDSWTG1-F和C43-CDSWTG1-R来扩增WTG1基因的CDS。使用GBclonart Seamless Clone Kit(GB2001-48，GenebankBiosciences)将CDS插入PMDC43载体，以产生pro35S:GFP-WTG1质粒。引物proWTG1-F和proWTG1-R用于扩增WTG1的3798bp的5'侧翼序列。然后使用GBclonart Seamless CloneKit(GB2001-48，Genebank Biosciences)将启动子序列插入pMDC164载体，以产生proWTG1:GUS质粒。将质粒gWTG1、proACTIN:WTG1、pro35S:GFP-WTG1和proWTG1:GUS分别引入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101中。如先前所述(Hiei等，1994)，将gWTG1转移到wtg1-1中，并且将proACTIN:WTG1，pro35S:GFP-WTG1和proWTG1:GUS转移到ZHJ中。
GUS染色和WTG1的亚细胞定位
如先前所述(Xia等，2013；Fang等，2016)，对不同组织(proWTG1:GUS)进行GUS染色。使用pro35S:GFP-WTG1转基因株系的根来观察GFP荧光。用Zeiss LSM 710共聚焦显微镜观察GFP荧光。根细胞核标记有4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)(DAPI)(1μg/ml)。
RNA分离，逆转录和定量实时RT-PCR
使用RNA提取试剂盒(Tiangen，中国)分离ZHJ和wtg1-1的幼穗以及ZHJ和proACTIN:WTG1转基因株系的幼苗的总RNA。根据用户手册，使用FastQuant RT试剂盒(Tiangen，中国)将RNA(2μg)逆转录成互补DNA。如前所述(Wang等，2016)进行定量实时RT-PCR。测试每个样品的三个重复样本。引物列表见补充表1。
去泛素化测定
使用引物MBP-WTG1-F/R和MBP-WTG1-F/MBP-wtg1-R将从幼穗总RNA转录的互补DNA中扩增WTG1和wtg1-1的编码序列，并使用GBclonart Seamless Clone Kit(GB2001-48，Genebank Biosciences)将其克隆至载体pMAL-C2以分别构建MBP-WTG1和MBP-WTG1wtg1-1质粒。对于MBP-WTG1D68E；C71S；H267R构建体，使用引物MBP-WTG1-MutF和MBP-WTG1-MutR1(具有两个突变位点)扩增WTG1D68E；C71S；H267R的第一部分，以及使用引物MBP-WTG1-MutF1(具有两个突变位点)和MBP-WTG1-MutR(具有一个突变位点)扩增WTG1D68E；C71S；H267R的第二部分。然后将这两种产物作为模板混合，并使用引物MBP-WTG1-MutF和MBP-WTG1-MutR扩增WTG1D68E；C71S；H267R的完整序列。最后，使用GBclonart Seamless Clone Kit(GB2001-48，GenebankBiosciences)将WTG1D68E；C71S；H267R的序列克隆到载体pMAL-C2，以构建MBP-WTG1D68E；C71S；H267R质粒。根据先前的研究(Xu等，2016)构建His-UBQ10质粒。将MBP-WTG1、MBP-WTG1wtg1-1和MBP-WTG1D68E；C71S；H267R质粒转移到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中。根据先前的研究(Xia等，2013)，对MBP-WTG1、MBP-WTG1wtg1-1和MBP-WTG1D68E；C71S；H267R蛋白进行了诱导、分离和纯化。将15μl His-UBQ10与2μl纯化的MBP、MBP-WTG1、MBP-WTG1wtg1-1和WTG1D68E；C71S；H267R在100μl反应缓冲液(50mM Tris-HCl，PH 7.4、100mM NaCl，1mM DTT)中分别在30℃下温育20分钟。通过SDS-PAGE分析了切割的泛素产物MBP-WTG1、MBP-WTG1wtg1-1和WTG1D68E；C71S；H267R。使用抗His和抗MBP抗体分别检测切割的泛素和带有MPB标签的蛋白。
蛋白质提取和蛋白质印迹分析
根据以前的方法(Alvarez-Venegas和Avramova，2005年)，使用来自pro35S:GFP-WTG1转基因植物的叶片制备细胞质和核蛋白级分。使用抗GFP(Beyotime)、抗Bip(Abcam)和抗H4(Active Motif)抗体分别检测GFP-WTG1、Bip和组蛋白H4。
实施例3
为了获得敲除OsOTUB1的转基因植物，采用了RNAi策略。我们将OsOTUB1编码区的两个相同区段头对头地插入中间载体pUCCRNAi中，该载体具有来自马铃薯GA20氧化酶的内含子。借助于pUCCRNAi-OsOTUB1，将RNA干扰结构引入植物二元载体pCambia-actin-2300中，以生成pActin::OsOTUB1-RNAi构建体。然后使用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的转化系统将OsOTUB1-RNAi构建体转化到水稻中。在含有50mg/L G418的半强度Murashige和Skoog(MS)培养基中选择转基因植物，将抗G418的植物移植到土壤中并在田间生长。使用qRT-PCR鉴定OsOTUB1敲减的T2纯合转基因植物。如图28a所示，OsOTUB1的RNAi沉默表现出ZH11-npt1样表型。此外，如图28b所示，表达RNAi的植物显示出增加的每穗主枝数、每穗次枝数、每穗谷粒数量，并且重要的是，每株植物的增加的总谷物产量。
序列表
拟南芥(Arabidopsis thaliana)(AtOTUB1),
大豆(GmOTUB1),
玉米(ZmOTUB1),
高粱(SbOTUB1),
大麦(HvOTUB1),
野生单粒小麦(TuOTUB1)
水稻(OsOTUB1)
SEQ ID NO:1 OsOTUB1多肽
MGGDYYHSCCGDPDPDLRAPEGPKLPYVGDKEPLSTLAAEFQSGSPILQEKIKLLGEQYDALRRTRGDGNCFYRSFMFSYLEHILETQDKAEVERILKKIEQCKKTLADLGYIEFTFEDFFSIFIDQLESVLQGHESSIGAEELLERTRDQMVSDYVVMFFRFVTSGEIQRRAEFFEPFISGLTNSTVVQFCKASVEPMGEESDHVHIIALSDALGVPIRVMYLDRSSCDAGNISVNHHDFSPEANSSDGAAAAEKPYITLLYRPGHYDILYPK
SEQ ID NO:2 OsOTUB1核酸(来自Zhefu802的cDNA)
atgggcggggactactaccactcgtgctgcggcgaccccgaccccgacctccgcgcgcccgaggggcccaagctgccgtacgtcggggacaaggaacctctctccactttagccgctgagtttcagtctggcagccccattttacaggagaaaataaagttgcttggtgaacagtatgatgctttaagaaggacacgaggagatggaaactgcttttatcgaagctttatgttttcctacttggaacatatcctagagacacaagacaaagctgaggttgagcgcattctaaaaaaaattgagcagtgcaagaagactcttgcagatcttggatacattgagttcacctttgaagatttcttctctatattcattgatcagctggaaagtgttctgcagggacatgaatcctccataggggccgaagagcttctagaaagaaccagggatcagatggtttctgattatgttgtcatgttctttaggtttgtcacctctggtgaaatccaaaggagggctgagttcttcgaaccattcatctctggcttgacaaattcgactgtggttcagttctgcaaggcttccgtggagccgatgggcgaggaaagtgaccatgtccacataattgccctatcagatgcgttgggtgtgccaatccgtgtgatgtacctagacagaagctcatgtgatgctggaaatataagtgtgaaccaccatgatttcagccctgaggccaattcatcggacggtgctgctgctgctgagaaaccttacattactttgctctaccgtcctggtcactacgacattctctacccgaagtga
SEQ ID NO:3 OsOTUB1核酸(来自Zhefu802的基因组的)
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SEQ ID NO:4 OsOTUB1核酸(来自IR66167-27-5-1-6的cDNA)
atgggcggggactactaccactcgtgctgcggcgaccccgaccccgacctccgcgcgcccgaggggcccaagctgccgtacgtcggggacaaggaacctctctccactttagccgctgagtttcagtctggcagccccattttacaggagaaaataaagttgcttggtgaacagtatgatgctttaagaaggacacgaggagatggaaactgcttttatcgaagctttatgttttcctacttggaacatatcctagagacacaagacaaagctgaggttgagcgcattctaaaaaaaattgagcagtgcaagaagactcttgcagatcttggatacattgagttcacctttgaagatttcttctctatattcattgatcagctggaaagtgttctgcagggacatgaatcctccataggggccgaagagcttctagaaagaaccagggatcagatggtttctgattatgttgtcatgttctttaggtttgtcacctctggtgaaatccaaaggagggccgagttcttcgaaccattcatctctggcttgacaaattcgactgtggttcagttctgcaaggcttccgtggagccgatgggcgaggaaagtgaccatgtccacataattgccctatcagatgcgttgggtgtgccaatccgtgtgatgtacctagacagaagctcatgtgatgctggaaatataagtgtgaaccaccatgatttcagccctgaggccaattcatcggacggtgctgctgctgctgagaaaccttacattactttgctctaccgtcctggtcactacgacattctctacccgaagtga
SEQ ID NO:5 OsOTUB1核酸(来自IR66167-27-5-1-6的基因组的)
atgggcggggactactaccactcgtgctgcggcgaccccgaccccgacctccgcgcgcccgaggggcccaagctgccgtacgtcggggacaaggtgagatgttgacgcctctctctctctctgtctctctcgctcgctttgactcatctgcgctttgactcatctgcggtcgatagatttgttcatgtggtagaaatgggtctgaatcgtggtaagacgcccagtgttgccatgccagtatccgctagttgtgccagcaggtgaggcgatagatcagtcctgttagtctagttggatgctgattgttggtcatcattactgttgtattggtgctccatttctatgtgaattgacattttaaggcgtctatacaagcagtggggactagaatttggataacaagtaacaatttccccttattgcgtcatcttaaaggataagaggagttatcagatgctggattttctcctttatttttagtcgtggtgcctggaataatggagattggctgaacaagttcatatcagttgtgtccattttcatcctctggatggtcagtccttaagtattgtcaggcgctattgttgtgagttgtaactgttgtacttgattttttagcttcgttggtgaactgatgtttggaggttcatgcagaagtcagaaccatggggaattagaatttggatgaacagacagcaattacctttcgtgttctcttctaggaaaagaagggtttatctgttatcatttgctggatgtgctccttacttaatatttatgcatggaataatagagatggccaaacaagtttgctccatagcgtattatgattctaggataaaagtggtgtcatcctttaatcgtcacacctaggacaataaatgtgaaggacgaacttgttgatgcagaataatagcctatgctagtcaattcagcacagaaactgaggttaaatgtgtcccaaaagtttcagttaaggttcacactaggatttacacgaacagaacaaatctgcaaatatagtccatatgagaaggtggagagctacatacacacaatttcatatgaaatggaaaatgatgttggcactaaacttggatttaggtcaagtagttagatatttgatgcctcaaatttattttgttctgttaattgcaagcaccttttcacaatggaggacactaatgcattgctatgattatctctgtgtttgtacagttattttaggctatcgtatgactttcttctgctttcatttgtgttcattattgatatcttttgaaccttgcaggaacctctctccactttagccgctgagtttcagtctggcagccccattttacaggagaaaataaaggtccatatggatttggcagttataatatgtaatagacatattttggttgatctatcgtatcaatggatggtgcttcaatttgttcttataatttcttgcttggtctccagttgcttggtgaacagtatgatgctttaagaaggacacgaggagatggaaactgcttttatcgaagctttatgttttcctacttggtattatttttggtctgtttccatacaaactttgactattttataagctgatgatcttatcatttgcttctaggaacatatcctagagacacaagacaaagctgaggttgagcgcattctaaaaaaaattgagcagtgcaagaagactcttgcagatcttggatacattgagttcacctttgaagatttcttctctgtaagtctttattgttactttgtgtggtcctccttacttatcctgttcaatttctgttttgcaacttatgccagatgtattccctctgaatagtatgaagatctgtccgattattttcatgtatgcttgtttgcatttcctttttagatgttcctggaataatttttgtatgagctagttataatgagagcttgtgcattttcctgtcatgcaacaaattaaatactagtgtctaatccttgtgcattgttaataactttgaaaatgattagccttgaagattggtccattatatatatgttcacttgtttcttagttaggatcactcaccagtcacccttctgaagttcataatgtatcacttataagtaagctagcaaaacaaaatttggactgtttgtagccacccagaacccaaatagatggatttcacattattttctactggctttgggagttatttgatcgatgctagtacaacgttgaaattttgggtagttgagatgcatttttcacaaaggactcctttattggtgcttgatctacaactggtgttttacttttttacaaaaaaatgtaatctccttgcagtgcactcaaattattgcaacctccttccttatgttcccaccctcattattttcagatattcattgatcagctggaaagtgttctgcagggacatgaatcctccatagggtaaatatcctagagttatatttgtatccttaatgcatatgaccaataatcatgtattaacaacaaagcattttttgtaattgtttataaagtatggcatgtccatcataaatgttttccttctgtagtgaatctattttgttttcctgtatccttagggccgaagagcttctagaaagaaccagggatcagatggtttctgattatggtttgtacatccagatatgtgtagtatgcctttctctgctttgctctcattatttaactatgtcttctttagttgtcatgttctttaggtttgtcacctctggtgaaatccaaaggagggccgagttcttcgaaccattcatctctggcttgacaaattcgactgtggttcaggttagctccatacttccattgtatgagggtttgtacagttgttggggaggtattatgaggtacaatacctccaggtaccgggagttaccacacataagcataaaatgtgtggtgcctctccaaggaccacaagaaatctcttcattatatttgtaatgcacagagcagagagtacagacaaatagacctgcactctgcattttcattaagtatttagatgtgagattattctatgttttatctctcttgttagtattttttgctctgttttataatggaagttcattttcttgggaactgtcattcacaaaacaatgagttatcgtaccctgccatttagtagggaatttggtggtaaaaaaccattaactttttcttcaattttgtgccttctgcacaaggtgggatagggcatatattgtggaacaaaagagtgcacaatgactaattatttagtatgcatcacactggagtatgatatactagtggaaaggttatggcaaaataccatgatagtagcttgatagattagcaggtccgtaagtatttttccaatgataatgttttattcattaaactgtagcaggataaaatctacttatgcacctttttttcatgagtagcaaacaatgcattctctggtttgaaaaacttgttcaagttgcagtgtgttattccaatccgtgtttgtgtgacaagcaattgctggagttactgatcctgagttcaattcaatttgcagttctgcaaggcttccgtggagccgatgggcgaggaaagtgaccatgtccacataattgccctatcagatgcgttgggtgtgccaatccgtgtgatgtacctagacagaagctcatgtgatgctggaaatataagtgtgaaccaccatgatttcagccctgaggccaattcatcggacggtgctgctgctgctgagaaaccttacattactttgctctaccgtcctggtcactacgacattctctacccgaagtga
SEQ ID NO:6来自Zhefu802的OsOTUB1启动子序列
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SEQ ID NO:7 TuOTUB1 cDNA序列
Atgggcggggactactaccacgcctgctgcggcgacccggaccccgaccacaagcccgagggaccccaggtgccgtacatcggtaacaaggaacctctctccgccttagcagcagagttccagtctggcagccccattttacaggagaaaataaagttgcttggtgaacaatatgatgctttaaggcgaacacgaggagatggaaactgcttttatcgaagctttatgttctcctacctggaacatatcctagagacacaagatagagctgaggttgagcgcatcctaaaaaacattgaacagtgcaagatgacactttcaggtcttggatacattgaattcacttttgaagacttcttctctatgttcattgaggagctgcaaaatgttctgcagggacacgaaacttctattgggcctgaagaacttctagaaagaaccagggatcaaacgacttctgattatgttgtcatgttctttaggtttgttacctctggtgaaattcaaaggagggctgagttctttgaaccatttatttctggcttgacaaattcgaccgtggctcagttttgcaagtcttctgtggagccaatgggcgaggaaagcgaccatgtgcacattattgctctgtcagatgcgttaggggtgccaatccgcgtgatgtacctagaccgaagctcctgtgacacaggcaatctaagtgtgaaccaccatgatttcattcctgcagccaattcctctgaaggtgatgctgcaatgggattaaatccggctgaggagaaaccttacattactctgctctaccggcctggtcactatgatattctctacccaaag
SEQ ID NO:8 HvOTUB1 cDNA序列
Atgggcggggactactaccacgcctgctgcggcgaccccgaccccgaccccaagcccgagggaccccaggtgccgtacatcggtaacaaggaacctctctccgccttagcagcagagttccagtctggcagccccattttacaggagaaaataaagttgcttggtgaacaatatgatgctttaagacggacacgaggagatggaaactgcttttatcgaagctttatgttctcctacctggaacatatccttgagacacaagacagagctgaggttgagcgcatcctaaaaaacattgaacaatgcaagaagacactttcaggtcttggatacattgagttcacttttgaggacttcttctctatgttcattgaggagctgcaaaatgttctgcagggacacggaacttctattgggcctgaagaacttctagaaagaaccagggatcagacgacttctgattatgttgtcatgttctttagatttgttacctctggtgaaattcaaaggagggctgagttctttgaaccatttatttctggcttgacaaattcgaccgtggttcagttttgcaagtcttctgtggagccaatgggcgaggaaagtgaccatgtgcacattattgctctgtcagatgcgttaggggtgccaatccgcgtgatgtacctagaccgaagctcttgtgacacaggcaatctaagtgtgaaccaccatgatttcatccctgcagccaattcctctgaaggtgatgctgcaatgggattaaatcctgctgatgagaaaccttacattactctgctctaccggcctggtcactatgacattctctacccgaagtga
SEQ ID NO:9 ZmOTUB1 cDNA序列
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SEQ ID NO:10 SbOTUB1 cDNA序列
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SEQ ID NO:11 AtOTUB1 cDNA序列
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SEQ ID NO:12 GmOTUB1 cDNA序列
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SEQ ID NO:13欧洲油菜(brassica napus)cDNA序列
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SEQ ID NO:14 TuOTUB1氨基酸
MGGDYYHACCGDPDPDHKPEGPQVPYIGNKEPLSALAAEFQSGSPILQEKIKLLGEQYDALRRTRGDGNCFYRSFMFSYLEHILETQDRAEVERILKNIEQCKMTLSGLGYIEFTFEDFFSMFIEELQNVLQGHETSIGPEELLERTRDQTTSDYVVMFFRFVTSGEIQRRAEFFEPFISGLTNSTVAQFCKSSVEPMGEESDHVHIIALSDALGVPIRVMYLDRSSCDTGNLSVNHHDFIPAANSSEGDAAMGLNPAEEKPYITLLYRPGHYDILYPK
SEQ ID NO:15 HvOTUB1氨基酸
MGGDYYHACCGDPDPDPKPEGPQVPYIGNKEPLSALAAEFQSGSPILQEKIKLLGEQYDALRRTRGDGNCFYRSFMFSYLEHILETQDRAEVERILKNIEQCKKTLSGLGYIEFTFEDFFSMFIEELQNVLQGHGTSIGPEELLERTRDQTTSDYVVMFFRFVTSGEIQRRAEFFEPFISGLTNSTVVQFCKSSVEPMGEESDHVHIIALSDALGVPIRVMYLDRSSCDTGNLSVNHHDFIPAANSSEGDAAMGLNPADEKPYITLLYRPGHYDILYPK
SEQ ID NO:16 ZmOTUB1氨基酸
MGDVPQAPHAAGGGEEWAGPDPNPSPSLGGCSDPVSVELSMGGDYYRACCGEPDPDIPEGPKLPCVGDKEPLSSLAAEFQSGSPILQEKIKLLGEQYGALRRTRGDGNCFYRSFMFSYLEHILETQDKAEADRIMVKIEECKKTLLSLGYIEFTFEDFFSIFIELLESVLQGHETPIGFVTSGEIQRRSDFFEPFISGLTNSTVVQFCKASVEPMGEESDHVHIIALSDALGVPIRVMYLDRSSCDTGNLSVNHHDFIPSANDSEGDAATTPAPATEKPYITLLYRPGHYDILYPK
SEQ ID NO:17 SbOTUB1氨基酸
MGDVPQAPHAAEGGGGGLEEGAVPDPNPSPSLSLGGCSDPVSLELSMGGDYYRACCGDPDPDIPEGPKLPCVGEKEPLSSLAAEFQSGSPILQEKIKLLGEQYGALRRTRGDGNCFYRSFMFSYLEHILETQDKAEADRIMVKIEDCKKTLLSLGYIEFTFEDFFAIFIDMLESVLQGHETPIGFVTSGEIQRRSDFFEPFISGLTNSTVVQFCKASVEPMGEESDHVHIIALSDALGVPIRVMYLDRSSCDTGNLSVNHHDFIPSSNASEGDAAMTSTPDAEKPYITLLYRPGHYDILYPK
SEQ ID NO:18 AtOTUB1氨基酸
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SEQ ID NO:19 GmOTUB1氨基酸
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SEQ ID NO:20欧洲油菜(brassica napus)氨基酸
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SEQ ID NO:21 TuOTUB1启动子序列:
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SEQ ID NO:22 HvOTUB1启动子序列:
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SEQ ID NO:24:.ZmOTUB1启动子序列:
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SEQ ID NO:26:GmOTUB1启动子序列:
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SEQ ID NO:27:BnOTUB1启动子序列:
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CRISPR序列信息
·水稻
实施例I；OTUB1基因
SEQ ID NO:28:OsOTUB1 CRISPR靶序列
tcagctggaaagtgttctgcagg
SEQ ID NO:29:OsOTUB1 CRISPR原间隔子序列
tcagctggaaagtgttctgc
SEQ ID NO:30:tracrRNA核苷酸序列
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
SEQ ID NO:31:完整Os sgRNA核苷酸序列
tcagctggaaagtgttctgcGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
SEQ ID NO:32:OTUB1 Os sgRNAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC
SEQ ID NO:33:完整OTUB1 CRISPR核酸构建体
TGGAATCGGCAGCAAAGGATTTTTTCCTGTAGTTTTCCCACAACCATTTTTTACCATCCGAATGATAGGATAGGAAAAATATCCAAGTGAACAGTATTCCTATAAAATTCCCGTAAAAAGCCTGCAATCCGAATGAGCCCTGAAGTCTGAACTAGCCGGTCACCTGTACAGGCTATCGAGATGCCATACAAGAGACGGTAGTAGGAACTAGGAAGACGATGGTTGATTCGTCAGGCGAAATCGTCGTCCTGCAGTCGCATCTATGGGCCTGGACGGAATAGGGGAAAAAGTTGGCCGGATAGGAGGGAAAGGCCCAGGTGCTTACGTGCGAGGTAGGCCTGGGCTCTCAGCACTTCGATTCGTTGGCACCGGGGTAGGATGCAATAGAGAGCAACGTTTAGTACCACCTCGCTTAGCTAGAGCAAACTGGACTGCCTTATATGCGCGGGTGCTGGCTTGGCTGCCGtcagctggaaagtgttctgcGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
实施例II；OTUB1基因
SEQ ID NO:34:OsOTUB1 CRISPR靶核酸
gactactaccactcgtgctgcgg
SEQ ID NO:35:OsOTUB1原间隔子序列
gactactaccactcgtgctg
SEQ ID NO:36:OsOTUB1 sgRNA核酸序列
gactactaccactcgtgctgGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
SEQ ID NO:37:OsOTUB1 U3-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710000911
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
实施例III；OTUB1基因
SEQ ID NO:38:OsOTUB1 CRISPR靶序列
ccaccatgatttcagccctgagg
SEQ ID NO:39:OsOTUB1原间隔子序列
ccaccatgatttcagccctg
SEQ ID NO:40:OsOTUB1 sgRNA核酸序列
ccaccatgatttcagccctgGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCT
SEQ ID NO:41OsOTUB1 U6b-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710000921
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
实施例IV；OTUB1启动子
SEQ ID NO:42:靶序列
agcggcggtgggggaggaggtgg
SEQ ID NO:43；原间隔子序列
agcggcggtgggggaggagg
SEQ ID NO:44:全长sgRNA序列(突出显示的原间隔子序列(以下序列相同))
Figure BDA0002378288710000922
实施例V；OTUB1启动子
SEQ ID NO:45:靶序列
Gggaggaggaggggggggggagg
SEQ ID NO:46原间隔子序列
gggaggaggagggggggggg
SEQ ID NO:47:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000931
实施例VI；OTUB1启动子
SEQ ID NO:48:靶序列
Ggggggaggaggagggggggggg
SEQ ID NO:49原间隔子序列
Ggggggaggaggaggggggg
SEQ ID NO:50:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000932
实施例VII；OTUB1启动子
SEQ ID NO:51:靶序列
tcgaggggggaggaggagggggg
SEQ ID NO:52；原间隔子序列
tcgaggggggaggaggaggg
SEQ ID NO:53:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000933
Figure BDA0002378288710000941
实施例VIII；OTUB1启动子
SEQ ID NO:54:靶序列
Gtcgtcgaggggggaggaggagg
SEQ ID NO:55；原间隔子序列
gtcgtcgaggggggaggagg
SEQ ID NO:56:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000942
实施例IX；OTUB1启动子
SEQ ID NO:57:靶序列
ggcagccgcggcccccgagccgg
SEQ ID NO:58；原间隔子序列
ggcagccgcggcccccgagc
SEQ ID NO:59:全长sgRNA序列
TGGAATCGGCAGCAAAGGATTTTTTCCTGTAGTTTTCCCACAACCATTTTTTACCATCCGAATGATAGGATAGGAAAAATATCCAAGTGAACAGTATTCCTATAAAATTCCCGTAAAAAGCCTGCAATCCGAATGAGCCCTGAAGTCTGAACTAGCCGGTCACCTGTACAGGCTATCGAGATGCCATACAAGAGACGGTAGTAGGAACTAGGAAGACGATGGTTGATTCGTCAGGCGAAATCGTCGTCCTGCAGTCGCATCTATGGGCCTGGACGGAATAGGGGAAAAAGTTGGCCGGATAGGAGGGAAAGGCCCAGGTGCTTACGTGCGAGGTAGGCCTGGGCTCTCAGCACTTCGATTCGTTGGCACCGGGGTAGGATGCAATAGAGAGCAACGTTTAGTACCACCTCGCTTAGCTAGAGCAAACTGGACTGCCTTATATGCGCGGGTGCTGGCTTGGCTGCCGggcagccgcggcccccgagcGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
实施例X；OTUB1启动子
SEQ ID NO:60:靶序列
tcccggaggaggcggtgatgggg
SEQ ID NO:61；原间隔子序列
tcccggaggaggcggtgatg
SEQ ID NO:62:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000951
实施例XI；OTUB1启动子
SEQ ID NO:63:靶序列
cgcccggaagcgcaaggcggcgg
SEQ ID NO:64；原间隔子序列
cgcccggaagcgcaaggcgg
SEQ ID NO:65:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000952
实施例XII；OTUB1启动子
SEQ ID NO:66:靶序列
gaagagaagaacacgcaccgcgg
SEQ ID NO:67；原间隔子序列
gaagagaagaacacgcaccg
SEQ ID NO:68:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000953
Figure BDA0002378288710000961
实施例XIII；OTUB1启动子
SEQ ID NO:69:靶序列
cccttacggcctccactctgagg
SEQ ID NO:70；原间隔子序列
cccttacggcctccactctg
SEQ ID NO:71:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000962
实施例XIV；OTUB1启动子
SEQ ID NO:72:靶序列
cactttctccttatgacacgtgg
SEQ ID NO:73；原间隔子序列
cactttctccttatgacacg
SEQ ID NO:74:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000963
Figure BDA0002378288710000972
实施例XV；OTUB1启动子
SEQ ID NO:75:靶序列
tatataagctcgtcagaatgtgg
SEQ ID NO:76；原间隔子序列
tatataagctcgtcagaatg
SEQ ID NO:77:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000971
实施例XVI；OTUB1启动子
SEQ ID NO:78:靶序列
cgagaagcactggatctgatcgg
SEQ ID NO:79；原间隔子序列
cgagaagcactggatctgat
SEQ ID NO:80:全长sgRNA序列
TGGAATCGGCAGCAAAGGATTTTTTCCTGTAGTTTTCCCACAACCATTTTTTACCATCCGAATGATAGGATAGGAAAAATATCCAAGTGAACAGTATTCCTATAAAATTCCCGTAAAAAGCCTGCAATCCGAATGAGCCCTGAAGTCTGAACTAGCCGGTCACCTGTACAGGCTATCGAGATGCCATACAAGAGACGGTAGTAGGAACTAGGAAGACGATGGTTGATTCGTCAGGCGAAATCGTCGTCCTGCAGTCGCATCTATGGGCCTGGACGGAATAGGGGAAAAAGTTGGCCGGATAGGAGGGAAAGGCCCAGGTGCTTACGTGCGAGGTAGGCCTGGGCTCTCAGCACTTCGATTCGTTGGCACCGGGGTAGGATGCAATAGAGAGCAACGTTTAGTACCACCTCGCTTAGCTAGAGCAAACTGGACTGCCTTATATGCGCGGGTGCTGGCTTGGCTGCCGcgagaagcactggatctgatGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
实施例XVII；OTUB1启动子
SEQ ID NO:81:靶序列
gagaggaggaagtagagcgcggg
SEQ ID NO:82；原间隔子序列
gagaggaggaagtagagcgc
SEQ ID NO:83:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000981
实施例XVIII；OTUB1启动子
SEQ ID NO:84:靶序列
taaacccaaaccacaaatcacgg
SEQ ID NO:85；原间隔子序列
taaacccaaaccacaaatca
SEQ ID NO:86:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000982
实施例XIX；OTUB1启动子
SEQ ID NO:87:靶序列
atgtacccattcctcctcgacgg
SEQ ID NO:88；原间隔子序列
atgtacccattcctcctcga
SEQ ID NO:89:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000983
Figure BDA0002378288710000991
实施例XX；OTUB1启动子
SEQ ID NO:90:靶序列
aacgtacatcgcgtcgcagctgg
SEQ ID NO:91；原间隔子序列
aacgtacatcgcgtcgcagc
SEQ ID NO:92:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000992
实施例XXI；OTUB1启动子
SEQ ID NO:93:靶序列
actatcttactacttgtgcatgg
SEQ ID NO:94；原间隔子序列
actatcttactacttgtgca
SEQ ID NO:95:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710000993
实施例XXII；OTUB1启动子
SEQ ID NO:96靶序列
tcggaagaataattacaaccagg
SEQ ID NO:97；原间隔子序列
tcggaagaataattacaacc
SEQ ID NO:98:全长sgRNA序列
TGGAATCGGCAGCAAAGGATTTTTTCCTGTAGTTTTCCCACAACCATTTTTTACCATCCGAATGATAGGATAGGAAAAATATCCAAGTGAACAGTATTCCTATAAAATTCCCGTAAAAAGCCTGCAATCCGAATGAGCCCTGAAGTCTGAACTAGCCGGTCACCTGTACAGGCTATCGAGATGCCATACAAGAGACGGTAGTAGGAACTAGGAAGACGATGGTTGATTCGTCAGGCGAAATCGTCGTCCTGCAGTCGCATCTATGGGCCTGGACGGAATAGGGGAAAAAGTTGGCCGGATAGGAGGGAAAGGCCCAGGTGCTTACGTGCGAGGTAGGCCTGGGCTCTCAGCACTTCGATTCGTTGGCACCGGGGTAGGATGCAATAGAGAGCAACGTTTAGTACCACCTCGCTTAGCTAGAGCAAACTGGACTGCCTTATATGCGCGGGTGCTGGCTTGGCTGCCGtcggaagaataattacaaccGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
实施例XXIII；OTUB1启动子
SEQ ID NO:99:靶序列
gtaggcagcaacctcaaacttgg
SEQ ID NO:100；原间隔子序列
gtaggcagcaacctcaaact
SEQ ID NO:101:全长sgRNA序列
Figure BDA0002378288710001001
·野生单粒小麦
实施例I；OTUB1基因
SEQ ID NO:102 TuOTUB1 CRISPR靶序列
ttaaggcgaacacgaggagatgg
SEQ ID NO:103:原间隔子序列；TuOTUB1(双靶标)
ttaaggcgaacacgaggaga
SEQ ID NO:104:TuOTUB1 sgRNA核酸
ttaaggcgaacacgaggagaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
SEQ ID NO:105 TuOTUB1；U6a-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710001011
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
实施例II；OTUB1基因
SEQ ID NO:106 TuOTUB1 CRISPR靶序列
attgctctgtcagatgcgttagg
SEQ ID NO:107:原间隔子序列；TuOTUB1(双靶标)
attgctctgtcagatgcgtt
SEQ ID NO:108:TuOTUB1 sgRNA核酸
AttgctctgtcagatgcgttGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
SEQ ID NO:109 TuOTUB1；U3-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710001012
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
·大麦
实施例I；OTUB1基因
SEQ ID NO:110:HvOTUB1 CRISPR靶序列
ttaagacggacacgaggagatgg
SEQ ID NO:111:Hv OTUB1原间隔子
ttaagacggacacgaggaga
SEQ ID NO:112:Hv OTUB1 sgRNA核酸
ttaagacggacacgaggagaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
SEQ ID NO:113:Hv OTUB1 U6a-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710001021
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
实施例II；OTUB1基因
SEQ ID NO:114:HvOTUB1 CRISPR靶序列
Attgctctgtcagatgcgttagg
SEQ ID NO:115:Hv OTUB1原间隔子
attgctctgtcagatgcgtt
SEQ ID NO:116:Hv OTUB1 sgRNA核酸
attgctctgtcagatgcgttGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
SEQ ID NO:117:Hv OTUB1 sgRNA核酸U3-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710001022
Figure BDA0002378288710001031
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
·玉米
实施例I；OTUB1基因
SEQ ID NO:118:ZmOTUB1 CRISPR靶序列
aagctttatgttttcctacctgg
SEQ ID NO:119:ZmOTUB1原间隔子序列
aagctttatgttttcctacc
SEQ ID NO:120:ZmOTUB1 sgRNA核酸序列
aagctttatgttttcctaccGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
SEQ ID NO:121:ZmOTUB1 U6a-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710001032
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
实施例II；OTUB1基因
SEQ ID NO:122:ZmOTUB1 CRISPR靶序列
attgccctatcagatgcactagg
SEQ ID NO:123:ZmOTUB1原间隔子序列
attgccctatcagatgcact
SEQ ID NO:124:ZmOTUB1 sgRNA核酸序列
attgccctatcagatgcactGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
SEQ ID NO:125:ZmOTUB1 U3-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710001041
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
·高粱
实施例I；OTUB1基因
SEQ ID NO:126:SbOTUB1 CRISPR靶序列
aagctttatgttctcctacttgg
SEQ ID NO:127:SbOTUB1原间隔子序列
aagctttatgttctcctact
SEQ ID NO:128:SbOTUB1 sgRNA核酸序列
aagctttatgttctcctactGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
SEQ ID NO:129:SbOTUB1 U6a-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710001042
Figure BDA0002378288710001051
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
实施例II；OTUB1基因
SEQ ID NO:130:SbOTUB1 CRISPR靶序列
tgttcacataattgccctatcgg
SEQ ID NO:131:SbOTUB1原间隔子序列
tgttcacataattgccctat
SEQ ID NO:132:SbOTUB1 sgRNA核酸序列
tgttcacataattgccctatGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTT
SEQ ID NO:133:SbOTUB1 U3-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710001052
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
·大豆
实施例I；OTUB1基因
SEQ ID NO:134:GmOTUB1 CRISPR靶序列
attcgtcgtactcgaggagatgg
SEQ ID NO:135:GmOTUB1原间隔子序列
attcgtcgtactcgaggaga
SEQ ID NO:136:GmOTUB1 sgRNA核酸序列
attcgtcgtactcgaggagaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCT
SEQ ID NO:137:GmOTUB1 U3b-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710001061
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
实施例II；OTUB1基因
SEQ ID NO:138:GmOTUB1 CRISPR靶序列
tactgccctttcagatgcattgg
SEQ ID NO:139:GmOTUB1原间隔子序列
tactgccctttcagatgcat
SEQ ID NO:140:GmOTUB1 sgRNA核酸序列
tactgccctttcagatgcatGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCT
SEQ ID NO:141:GmOTUB1 U6-1-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710001062
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
·芸苔(Brassica)
实施例I；OTUB1基因
SEQ ID NO:142:BnOTUB1 CRISPR靶序列
atcaggcgaacaagaggagatgg
SEQ ID NO:143:BnOTUB1原间隔子序列
atcaggcgaacaagaggaga
SEQ ID NO:144:BnOTUB1 sgRNA核酸序列
atcaggcgaacaagaggagaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCT
SEQ ID NO:145:BnOTUB1 U3b-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710001071
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
实施例II；OTUB1基因
SEQ ID NO:146:BnOTUB1 CRISPR靶序列
tattcacataacagctttgtcgg
SEQ ID NO:147:BnOTUB1原间隔子序列
tattcacataacagctttgt
SEQ ID NO:148:BnOTUB1 sgRNA核酸序列
tattcacataacagctttgtGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCT
SEQ ID NO:149:BnOTUB1 U6-1-sgRNA盒单子叶植物,核酸构建体
Figure BDA0002378288710001072
Figure BDA0002378288710001081
(非大写字母是结合靶序列的原间隔子序列.突出显示的序列是sgRNA编码序列).
SEQ ID NO:150；Cas 9
atggctcctaagaagaagcggaaggttggtattcacggggtgcctgcggctgacaagaagtactccatcggcctcgacatcggcaccaacagcgtcggctgggcggtgatcaccgacgagtacaaggtcccgtccaagaagttcaaggtcctgggcaacaccgaccgccactccatcaagaagaacctcatcggcgccctcctcttcgactccggcgagacggcggaggcgacccgcctcaagcgcaccgcccgccgccgctacacccgccgcaagaaccgcatctgctacctccaggagatcttctccaacgagatggcgaaggtcgacgactccttcttccaccgcctcgaggagtccttcctcgtggaggaggacaagaagcacgagcgccaccccatcttcggcaacatcgtcgacgaggtcgcctaccacgagaagtaccccactatctaccaccttcgtaagaagcttgttgactctactgataaggctgatcttcgtctcatctaccttgctctcgctcacatgatcaagttccgtggtcacttccttatcgagggtgaccttaaccctgataactccgacgtggacaagctcttcatccagctcgtccagacctacaaccagctcttcgaggagaaccctatcaacgcttccggtgtcgacgctaaggcgatcctttccgctaggctctccaagtccaggcgtctcgagaacctcatcgcccagctccctggtgagaagaagaacggtcttttcggtaacctcatcgctctctccctcggtctgacccctaacttcaagtccaacttcgacctcgctgaggacgctaagcttcagctctccaaggatacctacgacgatgatctcgacaacctcctcgctcagattggagatcagtacgctgatctcttccttgctgctaagaacctctccgatgctatcctcctttcggatatccttagggttaacactgagatcactaaggctcctctttctgcttccatgatcaagcgctacgacgagcaccaccaggacctcaccctcctcaaggctcttgttcgtcagcagctccccgagaagtacaaggagatcttcttcgaccagtccaagaacggctacgccggttacattgacggtggagctagccaggaggagttctacaagttcatcaagccaatccttgagaagatggatggtactgaggagcttctcgttaagcttaaccgtgaggacctccttaggaagcagaggactttcgataacggctctatccctcaccagatccaccttggtgagcttcacgccatccttcgtaggcaggaggacttctaccctttcctcaaggacaaccgtgagaagatcgagaagatccttactttccgtattccttactacgttggtcctcttgctcgtggtaactcccgtttcgcttggatgactaggaagtccgaggagactatcaccccttggaacttcgaggaggttgttgacaagggtgcttccgcccagtccttcatcgagcgcatgaccaacttcgacaagaacctccccaacgagaaggtcctccccaagcactccctcctctacgagtacttcacggtctacaacgagctcaccaaggtcaagtacgtcaccgagggtatgcgcaagcctgccttcctctccggcgagcagaagaaggctatcgttgacctcctcttcaagaccaaccgcaaggtcaccgtcaagcagctcaaggaggactacttcaagaagatcgagtgcttcgactccgtcgagatcagcggcgttgaggaccgtttcaacgcttctctcggtacctaccacgatctcctcaagatcatcaaggacaaggacttcctcgacaacgaggagaacgaggacatcctcgaggacatcgtcctcactcttactctcttcgaggatagggagatgatcgaggagaggctcaagacttacgctcatctcttcgatgacaaggttatgaagcagctcaagcgtcgccgttacaccggttggggtaggctctcccgcaagctcatcaacggtatcagggataagcagagcggcaagactatcctcgacttcctcaagtctgatggtttcgctaacaggaacttcatgcagctcatccacgatgactctcttaccttcaaggaggatattcagaaggctcaggtgtccggtcagggcgactctctccacgagcacattgctaaccttgctggttcccctgctatcaagaagggcatccttcagactgttaaggttgtcgatgagcttgtcaaggttatgggtcgtcacaagcctgagaacatcgtcatcgagatggctcgtgagaaccagactacccagaagggtcagaagaactcgagggagcgcatgaagaggattgaggagggtatcaaggagcttggttctcagatccttaaggagcaccctgtcgagaacacccagctccagaacgagaagctctacctctactacctccagaacggtagggatatgtacgttgaccaggagctcgacatcaacaggctttctgactacgacgtcgaccacattgttcctcagtctttccttaaggatgactccatcgacaacaaggtcctcacgaggtccgacaagaacaggggtaagtcggacaacgtcccttccgaggaggttgtcaagaagatgaagaactactggaggcagcttctcaacgctaagctcattacccagaggaagttcgacaacctcacgaaggctgagaggggtggcctttccgagcttgacaaggctggtttcatcaagaggcagcttgttgagacgaggcagattaccaagcacgttgctcagatcctcgattctaggatgaacaccaagtacgacgagaacgacaagctcatccgcgaggtcaaggtgatcaccctcaagtccaagctcgtctccgacttccgcaaggacttccagttctacaaggtccgcgagatcaacaactaccaccacgctcacgatgcttaccttaacgctgtcgttggtaccgctcttatcaagaagtaccctaagcttgagtccgagttcgtctacggtgactacaaggtctacgacgttcgtaagatgatcgccaagtccgagcaggagatcggcaaggccaccgccaagtacttcttctactccaacatcatgaacttcttcaagaccgagatcaccctcgccaacggcgagatccgcaagcgccctcttatcgagacgaacggtgagactggtgagatcgtttgggacaagggtcgcgacttcgctactgttcgcaaggtcctttctatgcctcaggttaacatcgtcaagaagaccgaggtccagaccggtggcttctccaaggagtctatccttccaaagagaaactcggacaagctcatcgctaggaagaaggattgggaccctaagaagtacggtggtttcgactcccctactgtcgcctactccgtcctcgtggtcgccaaggtggagaagggtaagtcgaagaagctcaagtccgtcaaggagctcctcggcatcaccatcatggagcgctcctccttcgagaagaacccgatcgacttcctcgaggccaagggctacaaggaggtcaagaaggacctcatcatcaagctccccaagtactctcttttcgagctcgagaacggtcgtaagaggatgctggcttccgctggtgagctccagaagggtaacgagcttgctcttccttccaagtacgtgaacttcctctacctcgcctcccactacgagaagctcaagggttcccctgaggataacgagcagaagcagctcttcgtggagcagcacaagcactacctcgacgagatcatcgagcagatctccgagttctccaagcgcgtcatcctcgctgacgctaacctcgacaaggtcctctccgcctacaacaagcaccgcgacaagcccatccgcgagcaggccgagaacatcatccacctcttcacgctcacgaacctcggcgcccctgctgctttcaagtacttcgacaccaccatcgacaggaagcgttacacgtccaccaaggaggttctcgacgctactctcatccaccagtccatcaccggtctttacgagactcgtatcgacctttcccagcttggtggtgataagcgtcctgctgccaccaaaaaggccggacaggctaagaaaaagaagtag
SEQ ID NO:151 Cys4-P2A-TaCas9核酸序列
Figure BDA0002378288710001091
Figure BDA0002378288710001101
SEQ ID NO:152；Outubain样结构域
PYVGDKEPLSTLAAEFQSGSPILQEKIKLLGEQYDALRRTRGDGNCFYRSFMFSYLEHILETQDKAEVERILKKIEQCKKTLADLGYIEFTFEDFFSIFIDQLESVLQGHESSIGAEELLERTRDQMVSDYVVMFFRFVTSGEIQRRAEFFEPFISGLTNSTVVQFCKASVEPMGEESDHVHIIALSDALGVPIRVMYLDRSSCDAGNISVNHHDFSPEANSSDGAAAAEKPYITLLYRPGHYDILYP
SEQ ID NO:153；突变的OsOTUB1
ATGGGCGGGGACTACTACCACTCGTGCTGCGGCGACCCCGACCCCGACCTCCGCGCGCCCGAGGGGCCCAAGCTGCCGTACGTCGGGGACAAGGAACCTCTCTCCACTTTAGCCGCCGAGTTTCAGTCTGGCAGCCCCATTTTACAGGAGAAAATAAAGTTGCTTGGTGAACAGTATGATGCTTTAAGAAGGACACGAGGAGATGGAAACTGCTTTTATCGAAGCTTTATGTTTTCCTACTTGGAACATATCCTAGAGACACAAGACAAAGCTGAGGTTGAGCGCATTCTAAAAAAAATTGAGCAGTGCAAGAAGACTCTTGCAGATCTTGGATACATTGAGTTCACCTTTGAAGATTTCTTCTCTGTCTTTATTGT TACTTTGTGTGGCCCTCCTTACTTATCCTGTTCAATTGCTGTTTTGCAACTTATGCCAGATGTATTCCCTCTGAATA GTATGAAGATCTGTCCGATTATTTTCATGTATGCTTGTTTGCATTTCCTTTTTAGATGTTCCTGGAATAATTTTTGT ATGAGCTAGTTATAATGAGAGCTTGTGCATTTTCCTGTCATGCAACAAATTAAATACTAGTGTCTAATCCTTGTGCA TTGTTAATAACTTTGAAAATGATTAGCCTTGAAGATTGGTCCATTATATATATGTTCACTTGTTTCTTAGTTAGGAT CACTCACCAGTCACCCTTCTGAAGTTCATAATGTATCACTTATAAGTAAGCTAGCAAAACAAAATTTGGACTGTTTG TAGCCACCCAGAACCCAAATAGATGGATTTCACATTATTTTCTACTGGCTTTGGGAGTTATTTGATCGATGCTAGTA CAACGTTGAAATTTGGGTAGTTGAGATGCATTTTTCACAAAGGACTCCTTTATTGGTGCTTGATCTACAACTGGTGT TTTACTTTTTTACAAAAAAATGTAATCTCCTTGCAGTGCACTCAAATTATTGCAACCTCCTTCCTTATGTTCCCACC CTCATTATTTTCAGATATTCATTGATCAGCTGGAAAGTGTTCTGCAGGGACATGAATCCTCCATAGGGGCCGAAGAGCTTCTAGAAAGAACCAGGGATCAGATGGTTTCTGATTATGTTGTCATGTTCTTTAGGTTTGTCACCTCTGGTGAAATCCAAAGGAGGGCCGAGTTCTTCGAACCATTCATCTCTGGCTTGACAAATTCGACTGTGGTTCAGTTCTGCAAGGCTTCCGTGGAGCCGATGGGCGAGGAAAGTGACCATGTCCACATAATTGCCCTATCAGATGCGTTGGGTGTGCCAATCCGTGTGATGTACCTAGACAGAAGCTCATGTGATGCTGGAAATATAAGTGTGAACCACCATGATTTCAGCCCTGAGGCCAATTCATCGGACGGTGCTGCTGCTGCTGAGAAACCTTACATTACTTTGCTCTACCGTCCTGGTCACTACGACATTCTCTACCCGAAGTGA
SEQ ID NO:154；OsOTUB1 wtg突变
MGGDYYHSCCGDPDPDLRAPEGPKLPYVGDKEPLSTLAAEFQSGSPILQEKIKLLGEQYDALRRTRGDGNCFYRSFMFSYLEHILETQDKAEVERILKKIEQCKKTLADLGYIEFTFEDFFSVFIVTLCGPPYLSCSIAVLQLMPDVFPLNSMKICPIIFMYACLHFLFRCSWNNFCMS
SEQ ID NO:155:来自IR66167-27-5-1-6的NPT1 2.5kb启动子序列
gagttgaagttgttgctgctgtcataagtactatctgctaaatgggcacactcctagcattattagaactgagaaatatcccaagcaatgaaagcgacaaaaaagtacccgtttgaagacatgattgacatggtcacatcaaacaccggacatcaacatctaaatgtacataacaaggccaaaataattttcgatgctggttggtgctaccaagtcccacgtatgatacttaagaatcaatcatgaatattacaaatcaagtcaaactacgttatgtattgaactcttataattactgcaacatatcacactggaatttcctatggtaattcctcgccagccttatcctacccatcccttgcagtatattaagagcatcaacaacaaacatgattcaagacaacttttattaacactgaacaacataaattgggaacaaaacaaaccacttggaggcatgattaggataatcggtattaaagaactggacatcacaattcacaactagatgttgaaataatacctgtctcttctttggctcatggcaggtgtcagtgaaatatactgatgctccaagagagctggaagcaccgtttccacgtaatcaaaatgtccttttcgtttgctgcaatcaaccttaaagggctcttttgatgctatctcttcaggcatgtccttcacaacttccacataacctctggtttgctcaatgaagtaatcaacatcgaaaacgtctgcaaatccactgacagagaataccaataagtgatgaactaccttttgaacagaaataaactgcataactacaagtagcacagtcgttcatcttgtagagtgattctcatacctagattcattccagtaggcagcaacctcaaacttgggcagaaccattgttgcgttgagaaggcgcgcaaccgcaattccatcacatagctgaagaaacattcggaagaataattacaaccaggagtaacataataacatagccagttgaaatcacattcgccttgcaatgtgaaaattttcataaataatctgaaaatttagttatgccactatatatcatgcaacctgcctccacgacattttaatcatggagtagaagataaaacatatgatccccctcattgaccctactatcttactacttgtgcatggccgaacgatctaacagcgaaatccagaaagccaacactcatttgatcccactaacaacggaagagagaaacgctagccgagatcgcttaacgtacatcgcgtcgcagctggttgagcccgccgtagcagtcgatccggatgtacccattcctcctcgacggagctgcagaagaagaggaggttcaaaaccgcaatcaccaccacagtctcaagcagagatgtccactacccggatccttaaacccaaaccacaaatcacggcgaggtctcacccggcattgccgcccgccaccacccgcacgaccgccactccgccacccgccgctgcgcccatatgacccgcgaccccgacgccgacggcgactcctccctaaagaccaaaagcgagtaagcgagatccgtaagcttctggaacaatctcgagcatcagctgcaagaggtgaggctgggccgcgtacctggaggtgggaagagtgaagaagaaaggcggagaggagggtggagagaggaggaagtagagcgcgggggcgaggaagatgaccggtaggaggatgcggacgcggctgcgcgcccaccacgccgccggcgacgccgacgacgacatcgcctcgccgcgagaagcactggatctgatcggccgccgcctccacgccggagtggagagcatatataagctcgtcagaatgtgggcccgtggctatgtgggcccaccatgtcatcgacgcttatcaagatcgagcggtggcgtgaggaaaccggtaggggtgggggggctaaccaatcggaaacgcgtaataactcacccgcggttcactttctccttatgacacgtgggcccatctcttcctggacccacctgtcagttacccttacggcctccactctgaggatctaaacgtaaaaacgaatttatcggagggcttatccgcgaggggaaaaaaacgcgcacttatttctcgccttcgccgagatctcggaagagaagaacacgcaccgcggggagaggggagagaagcggaaagctccaccgaatcgaagcccccacacacgcgaagctggcgcgggaggcggccgacgcgagcgcccggaagcgcaaggcggcggacggcggcggggagggcgacgccgcggcgacggtcccggaggaggcggtgatgggggaggcggcggcggcagccgcggcccccgagccggtcgtcgaggggggaggaggggggggggaggggttgaatcctaaccctagcggcggtgggggaggaggtggtggagggtgctcggactccgtgtcggtcgagctctcg
SEQ ID NO:156DEP1 cDNA序列:
atgggggaggaggcggtggtgatggaggcgccgaggcccaagtcgccgccgaggtacccggacctgtgcggccggcggcggatgcagctggaggtgcagatcctgagccgcgagatcacgttcctcaaggatgagcttcacttccttgaaggagctcagcccgtttctcgttctggatgcattaaagagataaatgagtttgttggtacaaaacatgacccactaataccaacaaagagaaggaggcacagatcttgccgtctttttcggtggatcggatcaaaattgtgtatctgcatttcatgtctttgctactgttgcaagtgctcacccaagtgcaaaagaccaaggtgcctcaattgttcttgcagctcatgctgcgacgagccatgctgtaagccaaactgcagtgcgtgctgcgctgggtcatgctgtagtccagactgctgctcatgctgtaaacctaactgcagttgctgcaagaccccttcttgctgcaaaccgaactgctcgtgctcctgtccaagctgcagctcatgctgcgatacatcgtgctgcaaaccgagctgcacctgcttcaacatcttttcatgcttcaaatccctgtacagctgcttcaagatcccttcatgcttcaagtcccagtgcaactgctctagccccaattgctgcacttgcacccttccaagctgtagctgcaagggctgtgcctgtccaagctgtggatgcaacggctgtggctgtccaagctgcggatgcaacggttgtggctgtccaagctgcggttgcaacggctgtggccttccaagctgcggttgcaacggctgcggctcgtgctcttgcgcccaatgcaaacccgattgtggctcgtgctctaccaattgctgtagctgcaagccaagctgcaacggctgctgcggcgagcagtgctgccgctgcgcggactgcttctcctgctcgtgccctcgttgctccagctgcttcaacatcttcaaatgctcctgcgctggctgctgctcgagcctgtgcaagtgcccctgcacgacgcagtgcttcagctgccagtcgtcatgctgcaagcggcagccttcgtgctgcaagtgccagtcgtcttgctgcgaggggcagccttcctgctgcgagggacactgctgcagcctcccgaaaccgtcgtgccctgaatgttcctgtgggtgtgtctggtcttgcaagaattgtacagagggttgtcgatgcccacggtgtcgtaacccatgctgtctcagtggttgcttatgttga
SEQ ID NO:157DEP1蛋白:
mgeeavvmeaprpkspprypdlcgrrrmqlevqilsreitflkdelhflegaqpvsrsgcikeinefvgtkhdpliptkrrrhrscrlfrwigsklcicisclcycckcspkckrprclncscssccdepcckpncsaccagsccspdccscckpncsccktpscckpncscscpscssccdtscckpsctcfnifscfkslyscfkipscfksqcncsspncctctlpscsckgcacpscgcngcgcpscgcngcgcpscgcngcglpscgcngcgscscaqckpdcgscstnccsckpscngccgeqccrcadcfscscprcsscfnifkcscagccsslckcpcttqcfscqsscckrqpscckcqssccegqpscceghccslpkpscpecscgcvwscknctegcrcprcrnpcclsgclc
SEQ ID NO:158:dep1 cDNA序列:
ATGGGGGAGGAGGCGGTGGTGATGGAGGCGCCGAGGCCCAAGTCGCCGCCGAGGTACCCGGACCTGTGCGGCCGGCGGCGGATGCAGCTGGAGGTGCAGATCCTGAGCCGCGAGATCACGTTCCTCAAGGATGAGCTTCACTTCCTTGAAGGAGCTCAGCCCGTTTCTCGTTCTGGATGCATTAAAGAGATAAATGAGTTTGTTGGTACAAAACATGACCCACTAATACCAACAAAGAGAAGGAGGCACAGATCTTGCCGTCTTTTTCGGTGGATCGGATCAAAATTGTGTATCTGCATTTCATGTCTTTGCTACTGTTGCAAGTGCTCACCCAAGTGCAAAAGACCAAGGTGCCTCAATTGTTCTTGCAGCTCATGCTGCGACGAGCCATGCTGTAAGCCAAACTGCAGTGCGTGCTGCGCTGGGTCATGCTGCAGTCCAGACTGCTGCTCATGCTGTAAACCTAACTGCAGTTGCTGCAAGACCCCTTCTTGCTGCAAACCGAACTGCTCGTGCTCCTGTCCAAGCTGCAGCTCATGCTGCGATACATCGTGCTGCAAACCGAGCTGCACCTGCTTCAACATCTAG
SEQ ID NO:159dep1蛋白:
mgeeavvmeaprpkspprypdlcgrrrmqlevqilsreitflkdelhflegaqpvsrsgcikeinefvgtkhdpliptkrrrhrscrlfrwigsklcicisclcycckcspkckrprclncscssccdepcckpncsaccagsccspdccscckpncsccktpscckpncscscpscssccdtscckpsctcfnif
SEQ ID NO:160OsUBC13 cDNA
atggccaacagcaacctcccccggcgaatcatcaaggagacgcagcgactcctcagcgagccagcgccgggaatcagcgcgtctccgtcggaggagaacatgcgctacttcaacgtcatgatccttggcccggcacagtccccctatgaaggtggagtttttaagcttgaactctttttacctgaggaatatcctatggctgctccaaaggttaggttcctgaccaaaatataccaccccaacattgacaagcttggtaggatatgccttgacattctcaaggacaaatggagcccagcccttcagattcggacagttcttttgagtatccaggcactcctaagtgcaccaaaccctgatgatcctctctctgataacattgcaaagcactggaaagccaatgaagcagaagctgttgaaacagcaaaggagtggactcgcctgtatgccagcggtgcataa
SEQ ID NO:161OsUBC13蛋白:
Mansnlprriiketqrllsepapgisaspseenmryfnvmilgpaqspyeggvfklelflpeeypmaapkvrfltkiyhpnidklgricldilkdkwspalqirtvllsiqallsapnpddplsdniakhwkaneaeavetakewtrlyasga
SEQ ID NO:162OsUBC13 gDNA
atggccaacagcaacctcccccggcgaatcatcaaggtcgcgcctccgatctgattgcctgggcgtagatctccccacgcctctaacccgattccccccttttcttttctttttttttttattttccctttctgtgctgattttttgtttttgctgtctgtgtgttcgcgtctggtttggatctgcgcaggagacgcagcgactcctcagcgagccaggtgcgggcggttttttttttttttatgtatcgcggattttggcgatggtgttgtgtttttccgtggtttgggttcgtgttgttctgatggttttgggttggtttgtttgtgcagcgccgggaatcagcgcgtctccgtcggaggagaacatgcgctacttcaacgtcatgatccttggcccggcacagtccccctatgaaggtacggcacccgatggatacgttatttgttgtagagggtgttacggctcccgatggatatgttatttgttgtagagggtggtcgattagggcgtttctaggtataccgcagaattgggtgattctgtataaacccaattactagaagtgttaattatgtgtcagtcatggacgggcacgcatttcgtaagcctgcttttgcttgattaggctggttcttttgcacttaccagttttagtttctcgggcggcgggcacttgcatgttctatgtgtctcatattccctttctagtatgaagttagtaatgctaaaacactagtgacttttagcaataatgttctaaactcggattatatacgtgacttataagtgcttttcttttatgtgttaacttgtttgatgctttgtgcggcaaaggttgcccttgattttccataaccaaattgatctcttcgatttatttgattagactaattatgagtattgatattgttggcttttcatgttgtggtgtataatttaaatatttcctttcttaaaccctttttgcgttaattcgggttggatatataatgggtgttaacagttagtagctttagatggtttattctattatcatttggcttcctgatattgttctttctatcaggtggagtttttaagcttgaactctttttacctgaggaatatcctatggctgctccaaaggtaacaagacatagataaactttggttatgttttatatgatattatggggactgtataccttcaagctaattatgtcgtatttagaattgcgtgtggttatatactcatattaaaagtcaggacatttctgcattcattgacttgtgttgtgaagcggagcattaatttggtgacattggactcatgcatataaccaaatacaggaaagtagctgaaacatttaatttgtttgaaccattctttggcaaaaaaaaatttttattctttatagcctaatttttagttacccatatttaatcgtgtcgctctggaaccatcgttggttttatatgttatatgtgatgtcttgttggtaatagttttgttacatttgcttgatttccttttagggataatgcaaaccctgcctatttgagatgtaatttgcaatgagatcctgtgccaaggaccaaggttgtaagatatacttttggtcctgtgggaacttttagctgtgtcctgagcatcagcacgccattgcttctcttgaccgtctttttgcttcaagttcttaaaggtgttcttaacatcacattgttcgtttggtgttcagccaaattataccttgattagttatttttttagtctgtttggcttgacaatgtcatagattggaagggtgaagaaatattactcatatgttatacaaccataccggattattgtctacttcagtctccctaagtgtaaagctatataattcattattgtctacctcagtctccattttttctttgttgcgtatgcaggttaggttcctgaccaaaatataccaccccaacattgacaaggtttgcagtcacattcctctttgttatttagtttacttcgtaatacattgtttattcattaataggtttacttttgtagcttggtaggatatgccttgacattctcaaggacaaatggagcccagcccttcagattcggacagttcttttgaggtctctcccccgttgcctgcacatgtgtattagctttttatatcctgcacaaattccttgtctgctaagctgttgtcttattacgattgacatgatttctgttgaatttgaattatttgttagcttacctgcatttagtaattttatcactgcccttgatgtgtttttccaacaaaaactcttgagcattgtcaactattggaagttaggggtatcactttgctatacttaccttgtgacaacactcttttttttcagtatccaggcactcctaagtgcaccaaaccctgatgatcctctctctgataacattgcaaagcactggaaagccaatgaagcagaagctgttgaaacaggtaaattgaagctagcaatccagttaacagtgtctcccctcacactctgattttattggttgcctgataagcgatggtctggcatttgcagcaaaggagtggactcgcctgtatgccagcggtgcataa
SEQ ID NO:163U3启动子序列：
AAAGGAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCA
SEQ ID NO:164U6a启动子序列：
TTTTTTCCTGTAGTTTTCCCACAACCATTTTTTACCATCCGAATGATAGGATAGGAAAAATATCCAAGTGAACAGTATTCCTATAAAATTCCCGTAAAAAGCCTGCAATCCGAATGAGCCCTGAAGTCTGAACTAGCCGGTCACCTGTACAGGCTATCGAGATGCCATACAAGAGACGGTAGTAGGAACTAGGAAGACGATGGTTGATTCGTCAGGCGAAATCGTCGTCCTGCAGTCGCATCTATGGGCCTGGACGGAATAGGGGAAAAAGTTGGCCGGATAGGAGGGAAAGGCCCAGGTGCTTACGTGCGAGGTAGGCCTGGGCTCTCAGCACTTCGATTCGTTGGCACCGGGGTAGGATGCAATAGAGAGCAACGTTTAGTACCACCTCGCTTAGCTAGAGCAAACTGGACTGCCTTATATGCGCGGGTGCTGGCTTGGCTGCCG
SEQ ID NO:165U6b启动子序列:
TGCAAGAACGAACTAAGCCGGACAAAAAAAAAAGGAGCACATATACAAACCGGTTTTATTCATGAATGGTCACGATGGATGATGGGGCTCAGACTTGAGCTACGAGGCCGCAGGCGAGAGAAGCCTAGTGTGCTCTCTGCTTGTTTGGGCCGTAACGGAGGATACGGCCGACGAGCGTGTACTACCGCGCGGGATGCCGCTGGGCGCTGCGGGGGCCGTTGGATGGGGATCGGTGGGTCGCGGGAGCGTTGAGGGGAGACAGGTTTAGTACCACCTCGCCTACCGAACAATGAAGAACCCACCTTATAACCCCGCGCGCTGCCGCTTGTGTTG
SEQ ID NO:166双子叶植物中的U3b
TTTACTTTAAATTTTTTCTTATGCAGCCTGTGATGGATAACTGAATCAAACAAATGGCGTCTGGGTTTAAGAAGATCTGTTTTGGCTATGTTGGACGAAACAAGTGAACTTTTAGGATCAACTTCAGTTTATATATGGAGCTTATATCGAGCAATAAGATAAGTGGGCTTTTTATGTAATTTAATGGGCTATCGTCCATAGATTCACTAATACCCATGCCCAGTACCCATGTATGCGTTTCATATAAGCTCCTAATTTCTCCCACATCGCTCAAATCTAAACAAATCTTGTTGTATATATAACACTGAGGGAGCAACATTGGTCA
SEQ ID NO:167双子叶植物中的U6-1
AGAAATCTCAAAATTCCGGCAGAACAATTTTGAATCTCGATCCGTAGAAACGAGACGGTCATTGTTTTAGTTCCACCACGATTATATTTGAAATTTACGTGAGTGTGAGTGAGACTTGCATAAGAAAATAAAATCTTTAGTTGGGAAAAAATTCAATAATATAAATGGGCTTGAGAAGGAAGCGAGGGATAGGCCTTTTTCTAAAATAGGCCCATTTAAGCTATTAACAATCTTCAAAAGTACCACAGCGCTTAGGTAAAGAAAGCAGCTGAGTTTATATATGGTTAGAGACGAAGTAGTGATTG
SEQ ID NO:168；Cys4-P2A-TaCas9核酸序列
Figure BDA0002378288710001151
Figure BDA0002378288710001161
Figure BDA0002378288710001171
SEQ ID NO:169:Cys 4内切核糖核酸酶核酸序列
5’ATGGACCACTACCTCGACATCAGGCTCAGGCCAGACCCAGAGTTCCCACCAGCCCAGCTCATGTCCGTCCTCTTCGGCAAGCTCCACCAGGCCCTCGTGGCCCAGGGCGGCGACAGGATCGGCGTGTCCTTCCCAGACCTCGACGAGTCCAGGTCCAGGCTCGGCGAGAGGCTCCGCATCCACGCCTCCGCCGACGACCTCAGGGCCCTCCTCGCCAGGCCGTGGCTGGAGGGCCTCAGGGACCACCTCCAGTTCGGCGAGCCAGCCGTGGTGCCACACCCAACCCCATACAGGCAAGTGTCCAGGGTGCAAGCCAAGTCCAACCCAGAGAGGCTCAGGAGGAGGCTCATGAGGAGGCACGACCTCTCCGAGGAAGAGGCCAGGAAGCGCATCCCAGACACCGTGGCCAGGGCCCTCGACCTCCCATTCGTGACCCTCAGGTCCCAGTCCACCGGCCAGCACTTCCGCCTCTTCATCAGGCACGGCCCACTCCAGGTGACCGCCGAGGAGGGCGGCTTTACCTGCTACGGCCTCTCCAAGGGCGGCTTCGTGCCGTGGTTC 3’
表I:用于sgRNA构建体的引物
Figure BDA0002378288710001172
Figure BDA0002378288710001181
SEQ ID NO:210RNAi核酸序列
TCTGGTGAAATCCAAAGGAGGGCCGAGTTCTTCGAACCATTCATCTCTGGCTTGACAAATTCGACTGTGGTTCAGTTCTGCAAGGCTTCCGTGGAGCCGATGGGCGAGGAAAGTGACCATGTCCACATAATTGCCCTATCAGATGCGTTGGGTGTGCCAATCCGTGTGATGTACCTAGACAGAAGCTCATGTGATGCTGGAAATATAAGTGTGAACCACCATGATTTCAGCCCTGAGGCCAATTCATCGGACGGTGCTGCTGCTGCTGAGAAACCTTACATTACTTTGCTCTACCGTCCTGGTCACTACG
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Claims (74)

1.一种增加植物中谷物产量的方法，该方法包括降低至少一种编码otubain样蛋白酶(OTUB1)的核酸的表达和/或降低OTUB1的活性。
2.权利要求1的方法，其中所述谷物产量的增加包括谷粒数量、每穗谷粒数量、谷粒重量、谷粒宽度、谷粒厚度、千粒重中至少一项的增加和/或谷粒长度的减小。
3.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法包括将至少一个突变引入至少一个编码OTUB1多肽和/或所述OTUB1多肽的启动子的核酸序列中。
4.权利要求3的方法，其中所述突变是功能部分丧失突变。
5.权利要求4的方法，其中所述突变是插入、缺失和/或取代。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸编码OTUB1多肽，其中所述OTUB1多肽包含SEQ ID NO：1或其功能同源物或变体。
7.权利要求6的方法，其中所述核酸包含选自SEQ ID NO：2至5的序列或其功能变体或同源物。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中编码OTUB1启动子的核酸包含SEQ ID NO：6或其功能变体或同源物。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中通过使用靶向基因组修饰，优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9引入所述突变。
10.权利要求1至7中任一项的方法，其中通过诱变，优选TILLING或T-DNA插入引入所述突变。
11.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述方法包括使用RNA干扰来减少至少一个OTUB1核酸的表达。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述产量的增加是相对于野生型或对照植物。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述突变降低OTUB1的去泛素酶活性。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述植物选自水稻、小麦、玉米、高粱、大麦、大豆和芸苔。
15.权利要求14的方法，其中所述植物是水稻。
16.一种遗传改变的植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物在至少一个编码OTUB1多肽和/或OTUB1启动子的核酸中包括至少一个突变。
17.权利要求16的遗传改变的植物，其中所述植物的特征在于OTUB1多肽表达的降低。
18.权利要求16或17的遗传改变的植物，其中所述植物的特征在于OTUB1去泛素酶活性的降低。
19.权利要求16的遗传改变的植物，其中所述植物的特征在于谷物产量的增加，优选地，当将所述植物与对照或野生型植物进行比较时谷物产量的增加。
20.权利要求19的遗传改变的植物，其中，所述谷物产量的增加包括谷粒数量、每穗谷粒数量、谷粒重量、谷粒宽度、谷粒厚度、千粒重中至少一项的增加和/或谷粒长度的减小。
21.权利要求16至20中任一项的遗传改变的植物，其中所述突变是功能部分丧失的突变。
22.权利要求21的遗传改变的植物，其中所述突变是插入、缺失和/或取代。
23.权利要求16至20中任一项的遗传改变的植物，其中使用靶向基因组修饰，优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9引入所述突变。
24.权利要求16至20中任一项的遗传改变的植物，其中使用诱变，优选TILLING或T-DNA插入引入所述突变。
25.权利要求16至24中任一项的遗传改变的植物，其中编码OTUB1多肽的核酸包含SEQID NO：1或其功能同源物或变体。
26.权利要求25的遗传改变的植物，其中所述核酸包含选自SEQ ID NO：2至5的序列或其功能变体或同源物。
27.权利要求16至24中任一项的遗传改变的植物，其中所述编码OTUB1启动子的核酸包含SEQ ID NO：6或其功能变体或同源物。
28.权利要求16至24中任一项的遗传改变的植物，其中所述植物包含降低OTUB1多肽表达的RNA干扰构建体。
29.权利要求16至28中任一项的遗传改变的植物，其中所述植物选自水稻、小麦、玉米、高粱、大麦、大豆和芸苔。
30.权利要求16至29中任一项的植物部分，其中所述植物部分是谷物或种子。
31.一种生产具有增加的谷物产量的植物的方法，所述方法包括将至少一个突变引入至少一个编码OTUB1多肽和/或所述OTUB1多肽的启动子的核酸序列中。
32.权利要求31的方法，其中所述突变是功能部分丧失突变。
33.权利要求32的方法，其中所述突变是插入、缺失和/或取代。
34.权利要求31至33中任一项的方法，其中使用靶向基因组修饰，优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9引入所述突变。
35.权利要求31至33中任一项的方法，其中使用诱变，优选TILLING或T-DNA插入引入所述突变。
36.权利要求31至35中任一项的方法，其中所述核酸编码OTUB1多肽，其中所述OTUB1多肽包含SEQ ID NO：1或其功能同源物或变体。
37.权利要求36的方法，其中所述核酸包含选自SEQ ID NO：2至5的序列或其功能变体或同源物。
38.权利要求31至35中任一项的方法，其中所述编码OTUB1启动子的核酸包含SEQ IDNO：6或其功能变体或同源物。
39.一种生产具有增加的谷物产量的植物的方法，所述方法包括在所述植物中引入并表达降低OTUB1核酸表达的RNA干扰构建体。
40.权利要求31至39中任一项的方法，其中所述方法进一步包括测量至少一种谷物产量的增加，优选为谷粒数量、每穗谷粒数量、谷粒重量、谷粒宽度、谷粒厚度、千粒重中至少一项的增加和/或谷粒长度的减小。
41.权利要求31至39中任一项的方法，其中所述方法进一步包括测量OTUB1核酸表达的降低和/或测量OTUB1多肽的活性，优选去泛素酶活性的降低。
42.权利要求31至41中任一项的方法，其中所述方法进一步包括再生植物并筛选谷物产量的增加。
43.权利要求31至42中任一项的方法，其中所述植物选自水稻、小麦、玉米、高粱、大麦、大豆和芸苔。
44.通过权利要求31至43中任一项的方法获得或可获得的植物、植物部分或植物细胞。
45.一种鉴定和/或选择植物的方法，所述植物优选地，与野生型或对照植物相比，将具有增加的谷物产量，所述方法包括在植物或植物种质中检测OTUB1基因和/或OTUB1启动子的至少一个多态性并选择所述植物或其后代。
46.权利要求45的方法，其中所述多态性是插入、缺失和/或取代。
47.权利要求45的方法，其中所述方法进一步包括将包含OTUB1基因和/或OTUB1启动子的至少一个多态性的染色体区域渐渗到第二植物或植物种质中以产生渐渗的植物或植物种质。
48.一种核酸构建体，其包含编码能够与OTUB1基因和/或启动子中的至少一个靶序列结合的至少一个DNA结合结构域或原间隔子元件的核酸序列，其中优选地，所述靶序列选自SEQ ID NO：28、34、38、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142和146或其变体。
49.权利要求48的核酸构建体，其中所述原间隔子元件的序列选自SEQ ID NO：20、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66和69或其变体。
50.权利要求48或49的核酸构建体，其中所述构建体还包含编码CRISPR RNA(crRNA)序列的核酸序列，其中所述crRNA序列包含至少一个原间隔子元件序列和额外的核苷酸。
51.权利要求48至50中任一项的核酸构建体，其中所述构建体还包含编码反式激活RNA(tracrRNA)的核酸序列，其中优选地，所述tracrRNA在SEQ ID NO：30或其功能变体中定义。
52.权利要求48至51中任一项的核酸构建体，其中所述构建体编码至少一个单向导RNA(sgRNA)，其中所述sgRNA包含tracrRNA序列和crRNA或原间隔子序列，其中所述sgRNA包含选自SEQ ID NO：31、36、40、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144和148的序列或由其组成。
53.权利要求48至52中任一项的核酸构建体，其中所述构建体可操作地连接至启动子。
54.权利要求53的核酸构建体，其中所述启动子是组成型启动子。
55.权利要求48至54中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含编码CRISPR酶的核酸序列。
56.权利要求55的核酸构建体，其中所述CRISPR酶是Cas或Cpf1蛋白。
57.权利要求56的核酸构建体，其中所述Cas蛋白是Cas9或其功能变体。
58.权利要求48的核酸构建体，其中所述核酸构建体编码TAL效应子。
59.权利要求48或58的核酸构建体，其中所述核酸构建体进一步包含编码内切核酸酶或其DNA切割结构域的序列。
60.权利要求59的核酸构建体，其中所述内切核酸酶是FokI。
61.单向导(sg)RNA分子，其中所述sgRNA包含crRNA序列和tracrRNA序列，其中所述crRNA序列能够结合选自SEQ ID NO：28、34、38、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142和146中的至少一个序列或其变体。
62.用权利要求48至60中任一项所定义的至少一个核酸构建体或权利要求61的sgRNA分子转染的分离的植物细胞。
63.用权利要求48至54中任一项的至少一个核酸构建体和第二核酸构建体转染的分离的植物细胞，其中所述第二核酸构建体包含编码Cas蛋白，优选Cas9蛋白或其功能变体的核酸序列。
64.权利要求63的分离的植物细胞，其中所述第二核酸构建体在权利要求48至54中任一项的核酸构建体之前、之后或同时转染。
65.遗传修饰的植物，其中所述植物包含权利要求62至64中任一项所定义的转染的细胞。
66.权利要求65的遗传修饰的植物，其中所述编码sgRNA的核酸和/或编码Cas蛋白的核酸以稳定形式整合。
67.一种增加植物中谷物产量的方法，所述方法包括在植物中引入并表达权利要求48至60中任一项的核酸构建体或权利要求61的sgRNA分子，其中优选地，所述增加是相对于对照或野生型植物。
68.通过权利要求67的方法获得或可获得的植物。
69.权利要求48至60中任一项所定义的核酸构建体或权利要求61的sgRNA分子在增加植物中谷物产量中的用途。
70.权利要求69的用途，其中所述核酸构建体减少植物中OTUB1的表达。
71.一种用于获得权利要求16至29中任一项的遗传修饰的植物的方法，所述方法包括：
a.选择植物的一部分；
b.用权利要求48至60中任一项所定义的核酸构建体或权利要求61的sgRNA分子转染(a)段中的植物的一部分的至少一个细胞；
c.再生至少一个源自所转染细胞或多个细胞的植物；
选择根据(c)段获得的一个或多个植物，其在所述植物中显示至少一个OTUB1核酸的降低的表达。
72.一种改变，优选增加至少一个SQUAMOSA启动子结合蛋白样(SBP-结构域)转录因子的水平的方法，该方法包括增加UBC13的表达或活性，或减少或消除OTUB1的表达或活性。
73.一种核酸构建体，其包含编码RNAi的核酸，其中所述RNAi的序列包含SEQ ID NO：210或其功能变体。
74.权利要求73的核酸构建体在减少植物中OTUB1表达中的用途。
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