CN113265422A - 靶向敲除水稻粒型调控基因slg7的方法、水稻粒型调控基因slg7突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法、水稻粒型调控基因SLG7突变体及其应用，该方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，选取水稻粒型调控基因SLG7的靶位点序列以及相应的上游引物和下游引物，先后构建中间载体和最终载体；将最终载体转染到水稻愈伤组织中，获得2种水稻粒型调控基因SLG7的突变体和相应的小粒型转基因水稻植株，即完成水稻粒型调控基因SLG7的靶向敲除。该方法应用于短粒水稻品种的选育，可以免去杂交选育的工作，大大缩短短粒品种选育的周期。

Description

靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法、水稻粒型调控基因 SLG7突变体及其应用
技术领域
本发明属于水稻基因分子育种领域，特别是靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法、水稻粒型调控基因SLG7突变体及其应用。
背景技术
水稻是世界上主要的粮食作物之一，全球近三分之二人口以水稻为主食，世界各地均有栽培水稻的历史，是人类赖以生存，并且无法割舍的食物命脉。近年来，人们生活水平和消费水平不断提高，水稻产量也不断提高，科学家们将关注点放在了改善稻米品质上，尤其稻米的外观品质。稻米的外观品质主要包括粒型和垩白，改善稻米的粒型是科学家们不断追求的育种目标。近年来，有关水稻粒形调控相关基因的克隆与功能研究已取得了长足的进展，从不同的水稻种质资源中已经分离出至少几十个粒形相关基因或等位基因，分布在不同的染色体上，其遗传机制和效应也大不相同。例如GS3、GLW7、GS9、GL6、GW2、GW5、GS5和GW8等。
SLG7(Slender grain on chromosome 7)扬州大学梁国华教授团队利用美国超长粒粳稻品种Azucena和我国籼稻骨干品种9311构建遗传群体图位克隆的一个水稻重要粒形基因，形态学和细胞学机制研究表明，来源于Azucena的基因SLG7通过纵向增加细胞长度横向减少细胞宽度而产生纤细的颗粒，使谷粒变得细长，外观品质更好(Yong Zhou，etal.Natural variations in SLG7 regulate grain shape in rice.Genetics，2015，201：1591–1599)。基因SLG7编码了一个由941氨基酸组成的未知蛋白，与拟南芥中的LONGIFOLIA蛋白同源。进一步研究表明，该基因通过纵向增加细胞长度，横向减少细胞宽度而产生细粒。
CRISPR/Cas9系统是探究基因分子的生物学功能和分子互作机制的一个精准、高效的技术手段，通过向导RNA与基因靶位点序列结合，在Cas9蛋白的作用下对靶DNA分子进行剪切，DNA分子发生断裂后自动修复，在修复的过程中出现碱基插入、缺失或替换，导致翻译提前终止，最终使原有的基因丧失功能。
过去，水稻育种主要通过杂交和回交的方法将粒型基因导入到其它的水稻品种中，这个方法获得不同粒型的水稻株系的周期较长、工作量大、成本高。通过CRISPR/Cas9基因编辑系统直接对水稻的基因SLG7进行定点突变，创制不同粒型水稻株系，可以大大的缩短水稻育种的周期，目前，尚未有人针对水稻的基因SLG7，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻粒型进行研究。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法、水稻粒型调控基因SLG7突变体，以及创制新的水稻粒型的应用方法，可利用CRISPR/Cas9基因编辑技术简便、快速、高效的得到小粒粒型的粳稻品种，为不同粒形性状的水稻新种质创制提供一种快速、高效地分子育种方式，具体通过以下技术实现。
靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，选取水稻粒型调控基因SLG7的靶位点序列以及相应的上游引物和下游引物，先后构建中间载体和最终载体；将最终载体转染到水稻愈伤组织中，获得水稻粒型调控基因SLG7的突变体和相应的转基因水稻植株，即完成水稻粒型调控基因SLG7的靶向敲除；
所述靶位点序列为水稻粒型调控基因SLG7的第三外显子起始密码子的第609-628碱基序列的片段，所述靶位点序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述方法是针对水稻粒型调控基因SLG7的第三外显子起始密码子的第609-628碱基序列(SEQ ID NO.1)，将其作为靶位点序列，通过CRISPR/Cas9基因编辑(即基因敲除)技术制备获得含有所述靶位点序列的突变体的最终载体。上述方法为后续的简便、快速、高效的得到小粒型的转基因粳稻品种，为不同粒形性状的水稻新种质的创制，提供了一种快速、高效地分子育种方式。
上述方法采用的CRISPR/Cas9基因编辑技术，是采用基因技术领域常用的试剂、载体和具体编辑敲除方法进行。靶位点序列为5’-GAGAACCGACGACAGTCTCA-3’(即SEQ IDNO.1)
优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。上述这两种具体的上、下游引物用于将靶位点序列通过限制性内切酶处理后，
优选地，上述靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法，具体包括以下步骤：
S1、选取SLG7基因的靶位点序列；以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列(GGCAGAGAACCGACGACAGTCTCA)作为上游引物的核苷酸序列，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列(AAACTGAGACTGTCGTCGGTTCTC)作为下游引物的核苷酸序列；
S2、选取SK-gRNA用限制性内切酶AarI酶切形成带有粘性末端的载体；将步骤S1的上游引物和下游引物混合后变性退火，形成带有粘性末端的片段，将所述载体和片段进行连接，转染大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到中间载体；
S3、选取pC1300-Cas9载体用限制性内切酶Kpn I和BamH I进行酶切，将步骤S2所得中间载体用限制性内切酶Kpn I和Bgl II进行酶切并回收片段，将所得片段连接到pC1300-Cas9载体上，获得含有所述靶位点序列的最终载体；
S4、将步骤S3获得的最终载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，并侵染水稻的愈伤组织，再生获得转基因水稻植株。具体而言，是将pCAMBIA1300-Cas9-SLG7质粒(即最终载体)转染到根癌农杆菌EHA105中，然后再转染到侵染水稻的愈伤组织，通过潮霉素筛选，再生获得转基因水稻植株。转基因水稻植株的基因SLG7的第三外显子起始密码子就完成了靶向敲除。
本发明还提供了一种采用上述方法获得的水稻粒型调控基因SLG7的突变体，水稻粒型调控基因SLG7的突变体为slg7-1；
所述slg7-1的第三外显子起始密码子的第626-627位的2个碱基缺失，所述slg7-1的第三外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了另一种采用上述方法获得的水稻粒型调控基因SLG7的突变体，水稻粒型调控基因SLG7的突变体为slg7-2；
所述slg7-2的第三外显子起始密码子的第622-625位的4个碱基的缺失，所述slg7-2的第三外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
通过采用上述CRISPR/Cas9基因编辑技术获得的水稻粒型调控基因SLG7突变体，共造成了2种突变。其中，slg7-1基因的第三外显子起始密码子的第626-627位的2个碱基“TC”缺失，slg7-2基因的第三外显子起始密码子的第622-625位的4个碱基“AGTC”缺失。这两种水稻突变株系均能够导致水稻籽粒变短。
本发明提供的上述方法能够应用在调控水稻粒型上。利用上述基因SLG7突变体所具有的显著减小粒长的功能，能够培育外观品质更好的优质粳稻品种。
优选地，调控水稻粒型(即筛选粒型改变的水稻突变株)的具体方法包括：
P1、选用含有所述靶位点序列的最终载体，转染根癌农杆菌EHA105感受态细胞，再进一步转染到水稻的愈伤组织中，通过潮霉素筛选，再生获得转基因水稻植株；
P2、利用SLG7测序-F特异引物和SLG7测序-R特异引物，扩增步骤P1获得的转基因水稻植株的基因组片段，测序，筛选水稻突变植株；
所述SLG7测序-F特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，即
AGGCTTGGTTTTCATTGCCG；所述SLG7测序-R特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，即GATAGGAGCACCAAGGTCCC；
P3、对步骤P2筛选出的各水稻突变植株进行粒型考察，获得粒型改变的水稻突变株，繁殖得到粒型改变的水稻突变株系，即完成水稻粒型调控。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：根据CRISPR/Cas9的设计原则，在水稻SLG7基因编码区确定CRISPR/Cas9系统编辑的靶位点，根据靶位点的序列设计引物，构建CRISPR/Cas9载体，用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织，通过筛选鉴定，最后获得SLG7突变的不含转基因DNA片段的短粒水稻品系。该方法应用于短粒水稻品种的选育，可以免去杂交选育的工作，大大缩短短粒品种选育的周期。
附图说明
图1为实施例1的水稻SLG7基因结构图以及sgRNA的靶序列；
图2为实施例1的野生型(苏垦118)和突变株系的SLG7靶序列核苷酸示意图；图中，“-”表示发生了删除突变的序列，“-”后面的数字表示删除的核苷酸数量；
图3为实施例1的野生型(苏垦118)和突变株系的SLG7靶序列测序图；
图4为实施例1的苏垦118(即图中的SK118)、缺失2个碱基的突变株系slg7-1(即slg7-1)和缺失4个碱基的突变株系slg7-2(slg7-2)的稻谷粒型对比图；
图5为实施例1的野生型(苏垦118)和突变株系SLG7基因粒型的统计比较，a-d分别为野生型苏垦118与突变株系粒长、粒宽、粒厚和长宽比的比较
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例所使用的水稻为粳稻(Oryza sativa subsp.geng)品种苏垦118(SK118，审定编号：苏审稻201605)，采购自江苏省苏垦种业有限公司。
本实施例采用的基因编辑方法是中国农科院水稻所王克剑课题组所提供的CRISPR/Csa9系统。选取SLG7基因启动子特异的靶序列，并根据gRNA引物设计原则，在正向序列前加GGCA，在反向互补序列前加AAAC，连入中间载体SK-gRNA中；再酶切中间载体，回收包含靶位点的gRNA片段连入最终载体pC1300-Cas9，测序无误后用农杆菌介导的遗传转化方法(Liu et al.1998)将重组载体转入水稻中。
具体的方法为：
S1、根据CRISPR/Csa9技术的设计靶位点的原则，选取SLG7基因的靶位点序列为5’-GAGAACCGACGACAGTCTCA-3’，位于SLG7基因第三外显子第609-628碱基处；选取的上、下游引物为：
上游引物-F：GGCAGAGAACCGACGACAGTCTCA，如SEQ ID NO.2所示；
下游引物-R：AAACTGAGACTGTCGTCGGTTCTC，如SEQ ID NO.3所示；
S2、将载体SK-gRNA在16℃下用限制性内切酶AarI酶切12h后，形成带有粘性末端的载体，具体酶切体系如下表1所示；
表1步骤S2的酶切体系
成分 加入量
10×buffer AarⅠ 2μl
50×oligonudeotide 0.4μl
AarⅠ 0.6μl
SK-gRNA 8μl
ddH2O 9μl
再将步骤S1的上游引物和下游引物各取10μl混合后在95℃下变性退火30s，在室温下冷却后形成带有粘性末端的片段，将酶切后的SK-gRNA载体和片段在22℃下进行连接1h，之后转染大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到中间载体，具体连接体系如下表2所示；
表2步骤S2的连接体系
Figure BDA0003081044950000051
S3、选取pC1300-Cas9载体用限制性内切酶Kpn I和BamH I在37℃下进行(第一次)酶切30min，具体第一次酶切体系如下表3所示；
表3步骤S3的第一次酶切体系
成分 加入量
pC1300-Cas9 10μl
Kpn I 0.5μl
BamH I 0.5μl
2×buffer 2μl
ddH2O 7μl
将步骤S2所得中间载体用限制性内切酶Kpn I和Bgl II在3℃下进行(第二次)酶切30min，并回收片段，具体第二次酶切体系如下表4所示；
表4步骤S3的第二次酶切体系
Figure BDA0003081044950000052
Figure BDA0003081044950000061
将所得片段在22℃下与pC1300-Cas9载体混合30min进行连接，获得含有所述靶位点序列的最终载体，具体连接体系如下表5所示；
表5步骤S3的连接体系
Figure BDA0003081044950000062
S4、将步骤S3获得的最终载体转染到根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，再进一步转染到水稻的愈伤组织中，通过潮霉素筛选，再生获得含有CRISPR元件T-DNA成分的纯合SLG7基因突变体的水稻植株。
获得的再生植株移栽成活后获得T0代转基因植株。用CTAB方法从T0代水稻叶片中快速提取基因组DNA后，用引物SLG7测序-F和SLG7测序-R引物PCR扩增再生植株启动子序列，并进行测序鉴定，测序结果如图3所示。鉴定所使用引物序列具体为：
SLG7测序-F：5’-AGGCTTGGTTTTCATTGCCG-3’，如SEQ ID NO.4所示；
SLG7测序-R：5’-GATAGGAGCACCAAGGTCCC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
将在T0代检测到有突变现象的植株进行收种，进行T1代的种植，采集T1代植株叶片提取DNA，使用上述检测引物进行检测，确定SLG7基因突变类型为纯合突变；同时设计潮霉素检测引物，引物序列为：
潮霉素检测-F：GGACTTCGGGGCAGTCCT，如SEQ ID NO.8所示；
潮霉素检测-R：CGATGTAGGAGGGCGTGG，如SEQ ID NO.9所示；
检测潮霉素片段的存在，以此确定外源载体T-DNA片段是否存在。最终筛选出2种SLG7突变类型(即slg7-1和slg7-2，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7)为纯合突变同时潮霉素检测为阴性的植株进行收种。
将T1代筛选出的植株进行收种，进行T2代的种植。理论上T2代为2种突变类型的纯合突变体。为了验证这一点，随机筛选部分植株进行了基因型检测，证明T2代植株确实为2种突变类型的纯合突变体。为了确定2种突变类型对粒型的影响，在T2代的成熟期，对每种基因型的粒长、粒宽和长宽比等粒型指标进行了统计，如图4、5所示，发现2种SLG7基因突变体与野生型相比，slg7-1株系粒长减少1.33％，长宽比减少5.07％，slg7-2株系粒长减少5.27％，长宽比减少8.60％，粒宽、粒厚等性状无显著差异。
相应突变体为，slg7-1：在SLG7基因第三外显子起始密码子后第626-627位造成TC2个碱基的缺失。第三外显子的碱基顺序如SEQ ID NO.6所示；
slg7-2：在SLG7基因第三外显子起始密码子后第622-626位造成AGTC 4个碱基的缺失。第三外显子的碱基顺序如SEQ ID NO.7所示
本发明根据CRISPR/Cas9的设计原则，在水稻SLG7基因编码区确定CRISPR/Cas9系统编辑的靶位点，根据靶位点的序列设计引物，构建CRISPR/Cas9载体，用农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织，通过筛选鉴定，最后获得两种SLG7突变的不含转基因DNA片段的短粒水稻品系。该方法应用于短粒粒型水稻品种的选育，可以免去杂交选育的工作，大大缩短不同粒型品种选育的周期。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法、水稻粒型调控基因SLG7突变体及其应用
<141> 2021-05-24
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 水稻(Rice)
<400> 1
gagaaccgac gacagtctca 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 水稻(Rice)
<400> 2
ggcagagaac cgacgacagt ctca 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 水稻(Rice)
<400> 3
aaactgagac tgtcgtcggt tctc 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggcttggtt ttcattgccg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gataggagca ccaaggtccc 20
<210> 6
<211> 1678
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagaaaacat tcagcaagag catgaccgag aacagtagcc tttcaataga gtcatcaagg 60
gcttcctgtt cttcctcctc atgctcatcc ttttcatcac ttgatggcaa caaatcgatc 120
caacaagagc tgccatacat caacgagcag ctctttgtac agaggccact gaagagctca 180
ccaagtctga aggacccagt catggacacc aggtctggac agtcaaacat tggcttcaga 240
gacattgtga aggactccat taaccgggac accggaggcc ttactgtcaa gacctcggtg 300
aaggatgcaa ggaggaatgg gcagtacaaa gactcaccaa ggcccttgct gctctccaaa 360
tcaatggatg ggacctacgt catcgggatc gataggagca ccaaggtccc tgctaatgct 420
gttgaatcca gcaggcgatt cccagagcag tcgcgcttct catgcgatga tcggcggctc 480
ctgaggccag ttgaagctca agagaacaag aagccttcca caaggctcaa agagcttccc 540
agactgtcct tggacagtag gaaagaaacc ctgagctcga gttctcgcca gaagaccttc 600
agttacagga gaaccgacga cagtcatgga cgctcttagg cctcaagatt ccccaggcca 660
taggcgtgcc agcagtgtca ttgccaagct gatggggttg gaagaagcac ccaatgctac 720
aggggtgcta actgttgata gctacgagcc tgaaagatca ccaagaccag cagaagacac 780
acagaaggag catccagtac cttcccctag aagattttgt caggatccac gcgagtcgct 840
gccaaaagat gagtctccgg caatgaaaac caagccttct ccaagaattc ttactgaatc 900
tgctccttgg aggcagcagg agaagattgc caccagtagc aaggcttcac aatgccgaga 960
tgctgaagtt cgaccaagga ctgcatctct ctatgcctac attgagagaa ggggcggggg 1020
gcttgagttc ttggagtgca acaaggactt cagggctctc aggatactgg aagcgctgca 1080
cgcaaaggat gccaagcgcc agaacgatgg caatggcgca ttaacagtgg ctgctcagca 1140
ggcaggggat gcactgaaca ccagttccag acacttccag cctcccattg tagtcatgaa 1200
gccagcaaga agcactgaga agcagccagg ggtttcactt gcttcagttg atccccttgc 1260
agggttcaga aacctcagga agctgcaggc cagagatgcg ccttgcattg gcgagcatga 1320
gaccagcaca aatgagaagg tccattctcg catttcaagg gcacaatcca agtccgatga 1380
acctgctagc cgtgcaagct ctccaaggcc tacaggatca tcaagcccca ggacagtgca 1440
gcggaaggca gagtcagaaa ggaggtctcg tccacctgtc tcaccgaagt ccccaagcaa 1500
gaagtccagt gaagcagcct ctcctggagg aagaacaaga acaaagcctt ctcaagggaa 1560
gaaccaccgt gacaatgagg tctcgaagag tccaagaagc agaatcagca tggtgaagga 1620
gatcgacata agcatcatgg attttcaaaa gcccctagca tcgacaccaa gtcacaag 1678
<210> 7
<211> 1676
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagaaaacat tcagcaagag catgaccgag aacagtagcc tttcaataga gtcatcaagg 60
gcttcctgtt cttcctcctc atgctcatcc ttttcatcac ttgatggcaa caaatcgatc 120
caacaagagc tgccatacat caacgagcag ctctttgtac agaggccact gaagagctca 180
ccaagtctga aggacccagt catggacacc aggtctggac agtcaaacat tggcttcaga 240
gacattgtga aggactccat taaccgggac accggaggcc ttactgtcaa gacctcggtg 300
aaggatgcaa ggaggaatgg gcagtacaaa gactcaccaa ggcccttgct gctctccaaa 360
tcaatggatg ggacctacgt catcgggatc gataggagca ccaaggtccc tgctaatgct 420
gttgaatcca gcaggcgatt cccagagcag tcgcgcttct catgcgatga tcggcggctc 480
ctgaggccag ttgaagctca agagaacaag aagccttcca caaggctcaa agagcttccc 540
agactgtcct tggacagtag gaaagaaacc ctgagctcga gttctcgcca gaagaccttc 600
agttacagga gaaccgacga ctcatggacg ctcttaggcc tcaagattcc ccaggccata 660
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agaaggagca tccagtacct tcccctagaa gattttgtca ggatccacgc gagtcgctgc 840
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ctccttggag gcagcaggag aagattgcca ccagtagcaa ggcttcacaa tgccgagatg 960
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caggggatgc actgaacacc agttccagac acttccagcc tcccattgta gtcatgaagc 1200
cagcaagaag cactgagaag cagccagggg tttcacttgc ttcagttgat ccccttgcag 1260
ggttcagaaa cctcaggaag ctgcaggcca gagatgcgcc ttgcattggc gagcatgaga 1320
ccagcacaaa tgagaaggtc cattctcgca tttcaagggc acaatccaag tccgatgaac 1380
ctgctagccg tgcaagctct ccaaggccta caggatcatc aagccccagg acagtgcagc 1440
ggaaggcaga gtcagaaagg aggtctcgtc cacctgtctc accgaagtcc ccaagcaaga 1500
agtccagtga agcagcctct cctggaggaa gaacaagaac aaagccttct caagggaaga 1560
accaccgtga caatgaggtc tcgaagagtc caagaagcag aatcagcatg gtgaaggaga 1620
tcgacataag catcatggat tttcaaaagc ccctagcatc gacaccaagt cacaag 1676
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggacttcggg gcagtcct 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgatgtagga gggcgtgg 18

Claims (7)

1.靶向敲除水稻粒型调控基因SLG7的方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，选取水稻粒型调控基因SLG7的靶位点序列以及相应的上游引物和下游引物，先后构建中间载体和最终载体；将最终载体转染到水稻愈伤组织中，获得水稻粒型调控基因SLG7的突变体和相应的转基因水稻植株，即完成水稻粒型调控基因SLG7的靶向敲除；
所述靶位点序列为水稻粒型调控基因SLG7的第三外显子起始密码子的第609-628碱基序列的片段，所述靶位点序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、选取SLG7基因的靶位点序列；以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列作为上游引物的核苷酸序列，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列作为下游引物的核苷酸序列；
S2、选取SK-gRNA用限制性内切酶AarI酶切形成带有粘性末端的载体；将步骤S1的上游引物和下游引物混合后变性退火，形成带有粘性末端的片段，将所述载体和片段进行连接，转染大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到中间载体；
S3、选取pC1300-Cas9载体用限制性内切酶Kpn I和BamH I进行酶切，将步骤S2所得中间载体用限制性内切酶Kpn I和Bgl II进行酶切并回收片段，将所得片段连接到pC1300-Cas9载体上，获得含有所述靶位点序列的最终载体；
S4、将步骤S3获得的最终载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，并侵染水稻的愈伤组织，再生获得转基因水稻植株。
4.一种采用权利要求1所述的方法获得的水稻粒型调控基因SLG7突变体，其特征在于，水稻粒型调控基因SLG7的突变体为slg7-1；
所述slg7-1的第三外显子起始密码子的第626-627位的2个碱基缺失，所述slg7-1的第三外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.一种采用权利要求1所述的方法获得的水稻粒型调控基因SLG7突变体，其特征在于，水稻粒型调控基因SLG7的突变体为slg7-2；
所述slg7-2的第三外显子起始密码子的第622-625位的4个碱基的缺失，所述slg7-2的第三外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.权利要求1所述的方法在调控水稻粒型上的应用。
7.根据权利要求6所述在调控水稻粒型上的应用，其特征在于，包括以下步骤：
P1、选用含有所述靶位点序列的最终载体，转染根癌农杆菌EHA105感受态细胞，再进一步转染到水稻的愈伤组织中，通过潮霉素筛选，再生获得转基因水稻植株；
P2、利用SLG7测序-F特异引物和SLG7测序-R特异引物，扩增步骤P1获得的转基因水稻植株的基因组片段，测序，筛选水稻突变植株；
所述SLG7测序-F特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述SLG7测序-R特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
P3、对步骤P2筛选出的各水稻突变植株进行粒型考察，获得粒型改变的水稻突变株，繁殖得到粒型改变的水稻突变株系，即完成水稻粒型调控。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113817767A (zh) * 2021-08-19 2021-12-21 西北农林科技大学 利用创制小麦TaOTUB1基因功能缺失纯合突变体提高小麦产量的方法
CN114672514A (zh) * 2022-05-05 2022-06-28 河南师范大学 一种耐盐水稻品种的育种方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106957855A (zh) * 2017-02-16 2017-07-18 上海市农业科学院 使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻矮杆基因SD1的方法
CN111032684A (zh) * 2017-05-25 2020-04-17 中国科学院遗传与发育生物学研究所 提高谷物生产率的方法
CN112126652A (zh) * 2020-09-18 2020-12-25 内蒙古大学 水稻OsAUX3基因在调控水稻种子粒长中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106957855A (zh) * 2017-02-16 2017-07-18 上海市农业科学院 使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻矮杆基因SD1的方法
CN111032684A (zh) * 2017-05-25 2020-04-17 中国科学院遗传与发育生物学研究所 提高谷物生产率的方法
CN112126652A (zh) * 2020-09-18 2020-12-25 内蒙古大学 水稻OsAUX3基因在调控水稻种子粒长中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHOU,Y. ET AL: "Natural Variations in SLG7 Regulate Grain Shape in Rice", 《GENETICS,》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113817767A (zh) * 2021-08-19 2021-12-21 西北农林科技大学 利用创制小麦TaOTUB1基因功能缺失纯合突变体提高小麦产量的方法
CN113817767B (zh) * 2021-08-19 2023-09-12 西北农林科技大学 利用创制小麦TaOTUB1基因功能缺失纯合突变体提高小麦产量的方法
CN114672514A (zh) * 2022-05-05 2022-06-28 河南师范大学 一种耐盐水稻品种的育种方法

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