CN112126652A - 水稻OsAUX3基因在调控水稻种子粒长中的应用 - Google Patents

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    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
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Abstract

本发明公开了水稻OsAUX3基因在调控水稻种子粒长中的应用，属于生物化学技术领域。本发明提供了一种长粒型种子水稻的育种方法，包括：利用CRISPR/Cas9技术定点编辑核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsAUX3基因的靶位点，所述靶位点的序列分别为：ACGAGCCTCCTGTGGCACGG，CCTCTCGCTCACATTTCGTT。利用CRISPR/Cas9系统构建水稻OsAUX3基因靶位点特异性敲除的植物重组表达载体，利用基因编辑获得纯合稳定的突变体，可用于分析OsAUX3基因在水稻中的生物学功能，为水稻粒型研究提供新方向，在提高水稻产量方面具有潜在的应用价值。

Description

水稻OsAUX3基因在调控水稻种子粒长中的应用
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及水稻OsAUX3基因在调控水稻种子粒长中的应用。
背景技术
水稻是我国的主要粮食作物之一，稻米一直是中国人的主粮，但是近年来随着人口数量的增长，自然灾害的频发以及生态环境的恶化，导致人均可用耕地面积不断减少。因此如何突破传统的遗传育种技术，利用分子遗传学等技术改良水稻育种，提高水稻的产量已经迫在眉睫。水稻产量性状是由多基因控制的复杂的数量性状，而水稻种子的粒长是决定产量的重要因素之一。
生长素是第一个发现的植物激素，生长素参与调控植物生长发育的许多方面，比如根和茎的生长发育、顶端优势、维管束组织的形成和分化、胚胎发育、器官的衰老以及植物的向地和向光运动等，促进细胞的伸长、分裂和分化，对基因的表达起特异的调控作用。
生长素是一个具有极性运输特性的植物激素，其极性运输依赖三类不同的载体蛋白：AUX1/LAX(Auxin Resistant1/Like Aux)家族载体、PIN(PIN-FORMED)家族载体以及ABCB/PGP(Multidrug-Resistant ABCB/P-glycoprotein)家族载体。拟南芥中，AUX/LAX家族是由四个高度保守的基因构成：AUX1和LAX(LIKE-AUX1)基因(LAX1、LAX2和LAX3)。目前发现水稻AUX/LAX家族有五个成员：OsAUX1、OsAUX2、OsAUX3、OsAUX4和OsAUX5。已发表的OsAUX1和OsAUX3主要参与水稻根的调控，而关于水稻AUX/LAX家族其他基因以及OsAUX3基因对水稻粒型方面的影响则还没有相关报道。
CRISPR/Cas9是新发展起来的一项有着巨大影响力的基因编辑技术，其简单的操作以及广泛的应用而受到青睐。CRISPR/Cas9体系中的载体主要由两大元件构成：sgRNA(single guide RNA)以及Cas9。sgRNA是一种非编码的小RNA，由U3或者U6启动子启动。Cas9编码核酸酶蛋白，分子量大于1000个氨基酸，可以切割DNA核酸序列。CRISPR/Cas9体系主要借助sgRNA来匹配到基因组的特定位置(靶点)，之后Cas9核酸酶将此处DNA切断，形成双链切口。在DNA损伤修复过程中，无论是同源重组修复(Homologous recombination-basedrepair,HR)还是非同源末端连接修复(Nonhomologous end-joining,NHEJ)，都会在切口处引入突变。目前CRISPR/Cas9系统已成功在拟南芥、烟草、甜橙、水稻、小麦、高粱、玉米以及苔藓植物地钱等植物中实现了定点基因组编辑，但对水稻育种中有重要价值的产量、品质、育性等关键基因的定向编辑的研究鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可调控水稻种子粒长的基因，通过基因编辑达到改良水稻种子粒型的目的。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种CRISPR/Cas9基因编辑敲除系统，对OsAUX3基因进行编辑，研究发现，对OsAUX3基因进行编辑获得的阳性纯合株系，表现出粒长变长的表型，表明OsAUX3基因的重新编辑在改良水稻粒型中具有一定应用价值。
因此，本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsAUX3基因在调控水稻种子粒长中的应用。
具体地，利用RNAi或CRISPR/Cas9技术降低水稻OsAUX3基因编码蛋白的表达或活性，进而获得长粒型种子的水稻突变体。
本发明获得一株长粒型种子的水稻突变体，水稻OsAUX3基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种长粒型种子水稻的育种方法，包括：利用CRISPR/Cas9技术定点编辑核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsAUX3基因的靶位点，所述靶位点的序列分别为：ACGAGCCTCCTGTGGCACGG，CCTCTCGCTCACATTTCGTT。
具体地，将所述水稻OsAUX3基因靶位点连入CRISPR/Cas9系统的表达载体中，构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到受体植物材料中，培育获得粒型改良的基因编辑植株。
作为优选，所述的表达载体为pRGEB32，所述受体植物为水稻。
所述的育种方法，包括以下步骤：
(1)针对所述的靶位点和pGTR质粒序列分段设计PCR引物，以pGTR质粒为模板进行PCR扩增，获得含有pGTR质粒不同分段的PCR产物，将PCR产物回收并连接获得含所述靶位点序列的线性化片段；
(2)以线性化片段为模块，PCR扩增获得含所述靶位点序列的目标产物，将目标产物连入终载体pRGEB质粒，构建得到CRISPR/Cas9重组载体；
(3)将CRISPR/Cas9重组载体转入待基因编辑的受体水稻中，进行植物组织培养，筛选获得含有Cas9序列标签的T0代阳性苗；
(4)T0代阳性苗自交一代得到T1代苗，通过筛选获得去除Cas9标签的T1代苗，即得具有长粒型种子表型的水稻植株。
步骤(1)中，采用的PCR引物为：
PCR引物为：
L5AD5-F：5’-CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG-3’；
gR3-R：5’-ATGGTCTCACAGGAGGCTCGTtgcaccagccgggaa-3’；
gR3-F：5’-TAGGTCTCCCCTGTGGCACGG gttttagagctagaa-3’；
gR4-R：5’-TCGGGTCTCAGTGAGCGAGAGGtgcaccagccggg-3’；
gR4-F：5’-TAGGTCTCCTCACATTTCGTT gttttagagctagaa-3’；
L3AD5-R：
5’-TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACC GACTCG-3’。
设计引物时，引入酶切位点，PCR扩增得到的三个片段，利用酶切产生粘性末端，在连接酶的作用下连接得到线性长片段。
步骤(2)中，采用的PCR引物为：
S5AD5-F：5’-CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCA-3’
S3AD5-R：5’-TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAAC-3’
步骤(3)中，将CRISPR/Cas9重组载体转化到受体水稻(如愈伤组织)中，培育获得基因编辑植株T0代，利用扩增编码Cas9蛋白基因序列的特异性引物，对基因编辑株系T0代基因组进行PCR扩增检测，从而筛选出含有Cas9序列标签的基因编辑苗。
作为优选，受体水稻为粳稻。
步骤(4)中，基因编辑苗自交一代得到T1代苗，利用扩增编码Cas9蛋白基因序列的特异性引物，对T1代苗进行PCR扩增检测，筛选出自交去除Cas9标签的T1代苗。进一步地，筛选获得稳定纯合的突变体水稻长粒型的植株。扩增编码Cas9蛋白基因序列的特异性引物序列如下：
promoter u3:5’-TGGGTACGTTGGAAACCACG-3’
pUBI10:5’-GTTTGTTGGTCGCCGTTAGG-3’。
本发明具备的有益效果：
本发明通过利用CRISPR/Cas9系统构建水稻OsAUX3基因靶位点特异性敲除的植物重组表达载体，利用基因编辑获得OsAUX3纯合稳定的突变体，可用于分析OsAUX3基因在水稻中的生物学功能；本发明还提供了水稻OsAUX3突变体植株在水稻粒型研究的新方向，在提高水稻产量方面具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为CRISPR/Cas9突变体osaux3-2在RNA和蛋白水平的编辑位点。
图2为OsAUX3基因野生型和CRISPR/Cas9突变体osaux3-2的跨膜结构；其中(A)为野生型的跨膜结构，(B)为突变体osaux3-2的跨膜结构。
图3为OsAUX3基因野生型和CRISPR/Cas9突变体osaux3-2的蛋白结构；其中(A)为野生型的蛋白结构，(B)为突变体osaux3-2的蛋白结构。
图4为OsAUX3基因在突变体的相对表达水平，以野生型Dongjin(WT/DJ)为背景(3个生物学重复的平均值)。
图5为稳定的OsAUX3纯合突变体成熟种子粒长的表型图。
图6为种子粒长统计结果(30个生物学重复的平均值)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
构建CRISPR/Cas9重组载体
1.从水稻基因数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中获得水稻OsAUX3基因的cDNA序列，在植物突变体编辑网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html设计分析出最佳两个靶位点，分别为ACGAGCCTCCTGTGGCACGG，CCTCTCGCTCACATTTCGTT。
根据CRISPR/Cas9系统要求设计引物：
gR3-F：5’-TA GGTCTCCCCTGTGGCACGG gttttagagctagaa-3’(SEQ ID NO.5)；
gR3-R：5’-AT GGTCTCACAGGAGGCTCGTtgcaccagccgggaa-3’(SEQ ID NO.6)；
gR4-F：5’-TA GGTCTCCTCACATTTCGTT gttttagagctagaa-3’(SEQ ID NO.7)；
gR4-R：5’-CG GGTCTCAGTGAGCGAGAGGtgcaccagccggg-3’(SEQ ID NO.8)；
L5AD5-F：5’-CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG-3’(SEQ IDNO.9)；
L3AD5-R：5’-TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG-3’(SEQ ID NO.10)；
2.以CRISPR/Cas9系统提供的pGTR质粒为模板进行PCR扩增。
PCR扩增体系：
Figure BDA0002689623090000051
每个反应体系所用的上下游引物为：
P1(L5AD-gR3)：L5AD5-F、gR3-R；
P2(gR3-gR4)：gR3-F、gR4-R；
P3(gR4-L3AD)：gR4-F、L3AD5-R。
PCR产物加loading buffer后进行凝胶电泳，得到三个小片段，条带大小为100-200bp，紫外下切下相应的胶块，利用BioTeke公司的DNA快速琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物。
3.将步骤2回收产物的三个片段连接过夜，所用连接酶为T7 DNA Ligase(3000U/μl,NEB)。
连接体系：
Figure BDA0002689623090000061
4.将步骤3连接产物作为底物进行PCR扩增。
PCR引物：
S5AD5-F：5’-CG GGTCTC A GGCA GGATG GGCAGTCTG GGCA-3’(SEQ ID NO.11)；
S3AD5-R：5’-TA GGTCTC C AAAC GGATG AGCGACAGC AAAC-3’(SEQ ID NO.12)。
扩增体系：
Figure BDA0002689623090000062
PCR产物加loading buffer后进行凝胶电泳，用BioTeke公司的DNA快速琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。
5.将步骤4PCR回收纯化产物用Fok I(NEB)酶切，同时将终载体pRGEB质粒用BsaI(NEB)酶切，凝胶电泳回收酶切产物。酶切产物回收采用BioTeke公司的DNA快速琼脂糖凝胶回收试剂盒。
用T4 DNA ligase(NEB)将两个回收产物连接。
6.将步骤5连接产物热击转化DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素(Kan)平板，37℃培养10小时以上，挑取单克隆，用pRGE32载体两端通用引物通过PCR检测，提取的质粒送到上海生工生物工程公司测序。
载体两端通用引物UGW-U3-F和UGW-gRNA-R:
UGW-U3-F:5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTAAGGAATCTTTAAACATACG-3’(SEQ IDNO.13)；
UGW-gRNA-R:5’-GGACCTGCAGGCATGCACGCGCTAAAAACGGACTAGC-3’(SEQ ID NO.14)；
所得突变体的编辑情况见图1。
实施例2
获得水稻基因编辑株系
1.将阳性克隆质粒通过电击的方法导入农杆菌EHA105感受态细胞，涂布卡那霉素(Kan)和链霉素(Str)的平板，28℃培养30个小时以上。挑取单克隆，提取质粒，鉴定阳性克隆。将阳性克隆放入-80℃保存。
2.取DJ的成熟胚诱导的愈伤组织，将步骤1所得阳性克隆运用农杆菌侵染水稻愈伤的方法(Hiei等，1994)将其整合到水稻基因组上。经过脓杆菌共培养、阳性愈伤的筛选、愈伤分化出苗、小苗生根和炼苗后，培育获得基因编辑植株T0代。
3.提取突变体幼苗基因组DNA，利用CRISPR/Cas9系统扩增编码Cas9蛋白基因序列的特异性引物，PCR鉴定出含有Cas9序列标签的T0代阳性苗，野生型Dongjin(WT/DJ)为对照，移到大田繁种。
引物序列如下：
promoter u3：5’-TGGGTACGTTGGAAACCACG-3’(SEQ ID NO.15)；
pUBI10：5’-GTTTGTTGGTCGCCGTTAGG-3’(SEQ ID NO.16)。
T0代基因编辑阳性苗自交一代得到T1代苗，利用上述的扩增编码Cas9蛋白基因序列的特异性引物，PCR筛选出自交去除Cas9标签的T1代苗，WT/DJ为对照。
然后针对OsAUX3基因靶位点两端设计特异性引物，对去除标签的阳性苗基因组进行PCR，引物为：
OsAUX3(gRNA3,4)-FP：5’-GTCTCCTCACTCTCGACTAC-3’(SEQ ID NO.17)；
OsAUX3(gRNA3,4)-RP：5’-TGACGCGAAGATGTGCAAGG-3’(SEQ ID NO.18)。
将对应的PCR产物送到上海生工生物工程公司测序，将测序结果与OsAUX3基因原始序列(SEQ ID NO.1)比对，确定各个株系的OsAUX3基因编辑情况，筛选出了在OsAUX3特异性多肽序列上进行编辑的突变体株系：
osaux3-2：以WT/DJ为背景，对比原始序列，突变体在OsAUX3在编码框128-129bp处缺失两个碱基AC，在221bp-222bp之间插入一个碱基A(SEQ ID NO.3)；蛋白水平上，从第43个氨基酸开始发生改变，蛋白翻译提前遇到终止密码子，丧失了跨膜结构域(SEQ IDNO.4)。
突变体的跨膜结构见图2。
突变体的蛋白结构见图3。
4.在RNA水平上，分别取野生型(WT/DJ)和突变体(osaux3-2)T2代幼穗的RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，OsACTIN基因作为内参，荧光定量PCR的引物如下：
OsAUX3-RT-FP:5’-TTGGAATTTTGCAGGTGGCG-3’(SEQ ID NO.19)；
OsAUX3-RT-RP:5’-ACCACTGGATGACGTGGTTC-3’(SEQ ID NO.20)。
OsAUX3基因在突变体和野生型中的相对表达水平见图4。
实施例3
成熟种子籽粒长度的统计
分别取野生型(WT/DJ)和突变体(osaux3-2)T2代的成熟种子，进行粒长的统计。
显示粒长的照片见图5，粒长统计结果见图6。
统计结果显示，对比野生型(WT/DJ)的粒长，突变体株系osaux3-2的粒长变长了7％。
序列表
<110> 内蒙古大学
中国水稻研究所
<120> 水稻OsAUX3基因在调控水稻种子粒长中的应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1512
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
atggtgccgg ccggcgacca ggcggaggag gccatcgtgg cggacgccgg gaaggaggag 60
gcggaggtgc gcgcggccat gggcgtcgag caggacggca agttcagcat gacgagcctc 120
ctgtggcacg gcggctccgt ctgggacgcc tggttcagct gcgcctccaa ccaggtacga 180
ccaaccacga acgacctcgt catgcctctc gctcacattt cgtttggaat tttgcaggtg 240
gcgcaggtgc tcctgacgct gccgtactcc ttctcgcagc tcgggatgct ctcgggcctg 300
ctgctgcagg tgttctacgg cctcatgggc agctggaccg cctacctcat cagcgtcctc 360
tacgtcgagt accgcgcccg caaggagaag gaaggcgtca gcttcaagaa ccacgtcatc 420
cagtggttcg aagttcttga tgggctcttg ggcccgtact ggaaggcggc cggcctcgcc 480
ttcaactgca ccttcctgct cttcggctcc gtcatccagc tgatcgcctg tgcaagtaac 540
atatactaca tcaacgaccg gctggacaag aggacatgga cgtacatatt cggggcgtgc 600
tgctccacca cggtgttcat cccctccttc cacaactacc gcatctggtc cttccttggc 660
ctcggcatga ccacctacac cgcctggtac ctcgccatcg ccgccgccgt ccacggccag 720
gtcgacggcg tgacgcactc gggcccgagc aagatggtgc tctacttcac tggcgccacc 780
aacatcctct acactttcgg cggacacgcc gtcactgtag agatcatgca cgcgatgtgg 840
aagccgcaga agttcaagta catctacctg gtggcgacgc tgtacgtgtt cacgctgacg 900
ctgccgtcgg cgtcggccat gtactgggcg ttcggcgacg cgctgctgac gcactcgaac 960
gccttctcgc tgctgccgcg gtccgggtgg cgcgacgcgg cggtgatcct gatgctgatc 1020
caccagttca tcacgttcgg gttcgcgtgc accccgctct acttcgtgtg ggagaaggcg 1080
atcggcatgc acggcacccg cagcgtcctc acccgcgcgc tcgcccgcct ccccatcgtc 1140
gtgcccatct ggttcctcgc catcatcttc cccttcttcg gccccatcaa ctccgccgtc 1200
ggcgcgctcc tcgtcagctt caccgtctac atcatcccct ccctctccca catcctcacg 1260
taccgctccg cctccgccag attgaatgcg gcggagaagc cgccgccgtt cctgccgagc 1320
tggagcggga tgttcgtggt gaacgtgttc gtggtggcgt gggtgctggt ggtcgggttc 1380
ggcctcggcg gctgggccag cgtcaccaac ttcatcaagc agatcgacac gttcgggctc 1440
ttcgccaagt gctaccagtg cccacccagg gcgcacgccg gggcgcccct gccggctccg 1500
ccgcgccact ag 1512
<210> 2
<211> 503
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 2
Met Val Pro Ala Gly Asp Gln Ala Glu Glu Ala Ile Val Ala Asp Ala
1 5 10 15
Gly Lys Glu Glu Ala Glu Val Arg Ala Ala Met Gly Val Glu Gln Asp
20 25 30
Gly Lys Phe Ser Met Thr Ser Leu Leu Trp His Gly Gly Ser Val Trp
35 40 45
Asp Ala Trp Phe Ser Cys Ala Ser Asn Gln Val Arg Pro Thr Thr Asn
50 55 60
Asp Leu Val Met Pro Leu Ala His Ile Ser Phe Gly Ile Leu Gln Val
65 70 75 80
Ala Gln Val Leu Leu Thr Leu Pro Tyr Ser Phe Ser Gln Leu Gly Met
85 90 95
Leu Ser Gly Leu Leu Leu Gln Val Phe Tyr Gly Leu Met Gly Ser Trp
100 105 110
Thr Ala Tyr Leu Ile Ser Val Leu Tyr Val Glu Tyr Arg Ala Arg Lys
115 120 125
Glu Lys Glu Gly Val Ser Phe Lys Asn His Val Ile Gln Trp Phe Glu
130 135 140
Val Leu Asp Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Trp Lys Ala Ala Gly Leu Ala
145 150 155 160
Phe Asn Cys Thr Phe Leu Leu Phe Gly Ser Val Ile Gln Leu Ile Ala
165 170 175
Cys Ala Ser Asn Ile Tyr Tyr Ile Asn Asp Arg Leu Asp Lys Arg Thr
180 185 190
Trp Thr Tyr Ile Phe Gly Ala Cys Cys Ser Thr Thr Val Phe Ile Pro
195 200 205
Ser Phe His Asn Tyr Arg Ile Trp Ser Phe Leu Gly Leu Gly Met Thr
210 215 220
Thr Tyr Thr Ala Trp Tyr Leu Ala Ile Ala Ala Ala Val His Gly Gln
225 230 235 240
Val Asp Gly Val Thr His Ser Gly Pro Ser Lys Met Val Leu Tyr Phe
245 250 255
Thr Gly Ala Thr Asn Ile Leu Tyr Thr Phe Gly Gly His Ala Val Thr
260 265 270
Val Glu Ile Met His Ala Met Trp Lys Pro Gln Lys Phe Lys Tyr Ile
275 280 285
Tyr Leu Val Ala Thr Leu Tyr Val Phe Thr Leu Thr Leu Pro Ser Ala
290 295 300
Ser Ala Met Tyr Trp Ala Phe Gly Asp Ala Leu Leu Thr His Ser Asn
305 310 315 320
Ala Phe Ser Leu Leu Pro Arg Ser Gly Trp Arg Asp Ala Ala Val Ile
325 330 335
Leu Met Leu Ile His Gln Phe Ile Thr Phe Gly Phe Ala Cys Thr Pro
340 345 350
Leu Tyr Phe Val Trp Glu Lys Ala Ile Gly Met His Gly Thr Arg Ser
355 360 365
Val Leu Thr Arg Ala Leu Ala Arg Leu Pro Ile Val Val Pro Ile Trp
370 375 380
Phe Leu Ala Ile Ile Phe Pro Phe Phe Gly Pro Ile Asn Ser Ala Val
385 390 395 400
Gly Ala Leu Leu Val Ser Phe Thr Val Tyr Ile Ile Pro Ser Leu Ser
405 410 415
His Ile Leu Thr Tyr Arg Ser Ala Ser Ala Arg Leu Asn Ala Ala Glu
420 425 430
Lys Pro Pro Pro Phe Leu Pro Ser Trp Ser Gly Met Phe Val Val Asn
435 440 445
Val Phe Val Val Ala Trp Val Leu Val Val Gly Phe Gly Leu Gly Gly
450 455 460
Trp Ala Ser Val Thr Asn Phe Ile Lys Gln Ile Asp Thr Phe Gly Leu
465 470 475 480
Phe Ala Lys Cys Tyr Gln Cys Pro Pro Arg Ala His Ala Gly Ala Pro
485 490 495
Leu Pro Ala Pro Pro Arg His
500
<210> 3
<211> 1511
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggtgccgg ccggcgacca ggcggaggag gccatcgtgg cggacgccgg gaaggaggag 60
gcggaggtgc gcgcggccat gggcgtcgag caggacggca agttcagcat gacgagcctc 120
ctgtggcggc ggctccgtct gggacgcctg gttcagctgc gcctccaacc aggtacgacc 180
aaccacgaac gacctcgtca tgcctctcgc tcacatttca gtttggaatt ttgcaggtgg 240
cgcaggtgct cctgacgctg ccgtactcct tctcgcagct cgggatgctc tcgggcctgc 300
tgctgcaggt gttctacggc ctcatgggca gctggaccgc ctacctcatc agcgtcctct 360
acgtcgagta ccgcgcccgc aaggagaagg aaggcgtcag cttcaagaac cacgtcatcc 420
agtggttcga agttcttgat gggctcttgg gcccgtactg gaaggcggcc ggcctcgcct 480
tcaactgcac cttcctgctc ttcggctccg tcatccagct gatcgcctgt gcaagtaaca 540
tatactacat caacgaccgg ctggacaaga ggacatggac gtacatattc ggggcgtgct 600
gctccaccac ggtgttcatc ccctccttcc acaactaccg catctggtcc ttccttggcc 660
tcggcatgac cacctacacc gcctggtacc tcgccatcgc cgccgccgtc cacggccagg 720
tcgacggcgt gacgcactcg ggcccgagca agatggtgct ctacttcact ggcgccacca 780
acatcctcta cactttcggc ggacacgccg tcactgtaga gatcatgcac gcgatgtgga 840
agccgcagaa gttcaagtac atctacctgg tggcgacgct gtacgtgttc acgctgacgc 900
tgccgtcggc gtcggccatg tactgggcgt tcggcgacgc gctgctgacg cactcgaacg 960
ccttctcgct gctgccgcgg tccgggtggc gcgacgcggc ggtgatcctg atgctgatcc 1020
accagttcat cacgttcggg ttcgcgtgca ccccgctcta cttcgtgtgg gagaaggcga 1080
tcggcatgca cggcacccgc agcgtcctca cccgcgcgct cgcccgcctc cccatcgtcg 1140
tgcccatctg gttcctcgcc atcatcttcc ccttcttcgg ccccatcaac tccgccgtcg 1200
gcgcgctcct cgtcagcttc accgtctaca tcatcccctc cctctcccac atcctcacgt 1260
accgctccgc ctccgccaga ttgaatgcgg cggagaagcc gccgccgttc ctgccgagct 1320
ggagcgggat gttcgtggtg aacgtgttcg tggtggcgtg ggtgctggtg gtcgggttcg 1380
gcctcggcgg ctgggccagc gtcaccaact tcatcaagca gatcgacacg ttcgggctct 1440
tcgccaagtg ctaccagtgc ccacccaggg cgcacgccgg ggcgcccctg ccggctccgc 1500
cgcgccacta g 1511
<210> 4
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Val Pro Ala Gly Asp Gln Ala Glu Glu Ala Ile Val Ala Asp Ala
1 5 10 15
Gly Lys Glu Glu Ala Glu Val Arg Ala Ala Met Gly Val Glu Gln Asp
20 25 30
Gly Lys Phe Ser Met Thr Ser Leu Leu Trp Arg Arg Leu Arg Leu Gly
35 40 45
Arg Leu Val Gln Leu Arg Leu Gln Pro Gly Thr Thr Asn His Glu Arg
50 55 60
Pro Arg His Ala Ser Arg Ser His Phe Ser Leu Glu Phe Cys Arg Trp
65 70 75 80
Arg Arg Cys Ser
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taggtctccc ctgtggcacg ggttttagag ctagaa 36
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggtctcac aggaggctcg ttgcaccagc cgggaa 36
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taggtctcct cacatttcgt tgttttagag ctagaa 36
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgggtctcag tgagcgagag gtgcaccagc cggg 34
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggc aacaaagcac cagtgg 46
<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa caaaaaaaaa agcaccgact cg 52
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggc a 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa c 31
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaccatgatt acgccaagct taaggaatct ttaaacatac g 41
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggacctgcag gcatgcacgc gctaaaaacg gactagc 37
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgggtacgtt ggaaaccacg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtttgttggt cgccgttagg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtctcctcac tctcgactac 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgacgcgaag atgtgcaagg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttggaatttt gcaggtggcg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
accactggat gacgtggttc 20

Claims (8)

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsAUX3基因在调控水稻种子粒长中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：利用RNAi或CRISPR/Cas9技术降低水稻OsAUX3基因编码蛋白的表达或活性，进而获得长粒型种子的水稻突变体。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水稻突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
4.一种长粒型种子水稻的育种方法，其特征在于，包括：利用CRISPR/Cas9技术定点编辑核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsAUX3基因的靶位点，所述靶位点的序列分别为：ACGAGCCTCCTGTGGCACGG，CCTCTCGCTCACATTTCGTT。
5.如权利要求4所述的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对所述的靶位点和pGTR质粒序列分段设计PCR引物，以pGTR质粒为模板进行PCR扩增，获得含有pGTR质粒不同分段的PCR产物，将PCR产物回收并连接获得含所述靶位点序列的线性化片段；
(2)以线性化片段为模块，PCR扩增获得含所述靶位点序列的目标产物，将目标产物连入终载体pRGEB质粒，构建得到CRISPR/Cas9重组载体；
(3)将CRISPR/Cas9重组载体转入待基因编辑的受体水稻中，进行植物组织培养，筛选获得含有Cas9序列标签的T0代阳性苗；
(4)T0代阳性苗自交一代得到T1代苗，通过筛选获得去除Cas9标签的T1代苗，即得具有长粒型种子表型的水稻植株。
6.如权利要求5所述的育种方法，其特征在于，步骤(1)中，采用的PCR引物为：
L5AD5-F：5’-
CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG-3’；
gR3-R：5’-ATGGTCTCACAGGAGGCTCGTtgcaccagccgggaa-3’；
gR3-F：5’-TAGGTCTCCCCTGTGGCACGG gttttagagctagaa-3’；
gR4-R：5’-TCGGGTCTCAGTGAGCGAGAGGtgcaccagccggg-3’；
gR4-F：5’-TAGGTCTCCTCACATTTCGTT gttttagagctagaa-3’；
L3AD5-R：
5’-TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACC GACTCG-3’。
7.如权利要求5所述的育种方法，其特征在于，步骤(2)中，采用的PCR引物为：
S5AD5-F：
5’-CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCA-3’；
S3AD5-R：
5’-TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAAC-3’。
8.如权利要求5所述的育种方法，其特征在于，步骤(3)中，受体水稻为粳稻。
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