CN114456244B - 基因OsR498G1018986900.01及其编码的蛋白在调控水稻垩白中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基因OsR498G1018986900.01及其编码的蛋白在调控水稻垩白中的应用，涉及植物基因工程领域。本发明公开基因OsR498G1018986900.01编码的蛋白质如1)或2)或3)：1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与1)中所述蛋白质具有相同功能的蛋白质；3)在1)或2)的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。本发明发现敲除水稻中的OsR498G1018986900.01基因，可以显著降低水稻垩白度。

Description

基因OsR498G1018986900.01及其编码的蛋白在调控水稻垩白 中的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种基因OsR498G1018986900.01及其编码的蛋白在调控水稻垩白中的应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)原产于中国，是世界上重要的粮食作物之一。水稻作为中国最重要的粮食作物，产量居粮食作物首位，播种面积占粮食作物总面积的1/3。在我国，除了提高水稻产量外，改善稻米品质也是水稻育种的一个重要的目标。垩白是衡量稻米品质的重要性状之一，直接影响稻米的外观品质和商品流通，影响其加工品质。降低垩白是水稻品质育种的主要目标之一。进行品质基因功能研究，有助于推动水稻优质米新品种选育和稻米产业化，进一步提高粮食生产效益。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种调控水稻垩白的基因及其编码的蛋白质，该基因命名为OsR498G1018986900.01基因，其编码的蛋白质命名为蛋白质OsR498G1018986900.01，降低蛋白质OsR498G1018986900.01的表达量或阻断蛋白质OsR498G1018986900.01的表达，可以显著降低水稻垩白度。
本发明的第一个方面，提供1)-3)中任一种蛋白质在调控水稻垩白中的应用：
1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；
2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与1)中所述蛋白质具有相同功能的蛋白质；
3)在1)或2)的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。
在本发明的一些实施方式中，上述蛋白质中，1)中所述蛋白质的氨基酸序列如SEQID No.2所示，由319个氨基酸残基组成。
在本发明的一些实施方式中，上述蛋白质可以人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
在本发明的一些实施方式中，上述蛋白质中，3)中所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
在本发明的一些实施方式中，所述调控水稻垩白为降低水稻垩白度。
在本发明的一些实施方式中，所述水稻具体为湘早籼11号或OsR498G1018986900.01等位基因与湘早籼11号相同的其他水稻品种。
本发明的第二个方面，提供(1)-(4)中任一种生物材料在调控水稻垩白中的应用，
(1)编码本发明第一方面的所述蛋白质的核酸分子；
(2)含有(1)中所述核酸分子的表达盒；
(3)含有(1)中所述核酸分子或(2)中所述表达盒的重组载体；
(4)含有(1)中所述核酸分子或(2)中所述表达盒或(3)中所述重组载体的重组微生物。
在本发明的一些实施方式中，上述生物材料中，(1)中所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
在本发明的一些实施方式中，上述生物材料中，(1)中所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述核酸分子由960个核苷酸组成。
在本发明的一些实施方式中，上述生物材料中，(2)中的所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白质的DNA分子，该DNA分子可包括增强子序列。
在本发明的一些实施方式中，上述生物材料中，(3)中的所述重组载体包括如SEQID No.1所示的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，上述生物材料中，(3)中的所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
在本发明的一些实施方式中，上述生物材料中，(4)中所述重组微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
在本发明的一些实施方式中，上述生物材料中，(4)中所述重组微生物为大肠杆菌。
在本发明的一些实施方式中，上述生物材料中，(4)中所述重组微生物为大肠杆菌DH5α。
本发明的第三个方面，提供一种调控水稻垩白的产品，所述产品含有a1-a11中的任一种：
a1：破坏本发明第一方面的所述蛋白质的基因的表达量和/或抑制所述蛋白质的活性和/或降低所述蛋白质的含量的核酸分子；
a2：含有a1中所述核酸分子的表达盒；
a3：含有a1中所述核酸分子或a2中所述表达盒的重组载体；
a4：含有a1中所述核酸分子或a2中所述表达盒或a3中所述重组载体的重组微生物；
a5：氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；
a6：将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1中所述蛋白质具有相同功能的蛋白质；
a7：在a5或a6的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；
a8：编码本发明第一方面所述蛋白质的核酸分子；
a9：含有a8中所述核酸分子的表达盒；
a10：含有a8中所述核酸分子或a9中所述表达盒的重组载体；
a11：含有a8中所述核酸分子或a9中所述表达盒或a10中所述重组载体的重组微生物；
其中，含有a1-a4中任一种的所述产品用于降低水稻垩白度；
含有a5-a11中任一种的所述产品用于提高水稻垩白度。
在本发明的一些实施方式中，上述产品中，a1中所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
在本发明的一些实施方式中，上述产品中，a3中所述载体为pYLCRISPR/Cas9P35s-Hplasmid或LB-DNAi plasmid。
在本发明的一些实施方式中，上述产品中，a4中所述重组微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
在本发明的一些实施方式中，上述产品中，a4中所述重组微生物为大肠杆菌。
在本发明的一些实施方式中，上述产品中，a4中所述重组微生物为大肠杆菌DH5α。
在本发明的一些实施方式中，所述水稻具体为湘早籼11号或OsR498G1018986900.01等位基因与湘早籼11号相同的其他水稻品种。
本发明的第四个方面，提供本发明第三方面所述的产品在水稻育种中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述在水稻育种中的应用包括b1-b4中的任一种，
b1：在培育垩白度降低的基因敲除水稻植株中的应用；
b2：在制备培育垩白度降低的基因敲除水稻植株产品中的应用；
b3：在培育垩白度升高的基因敲除水稻植株中的应用；
b4：在制备培育垩白度升高的基因敲除水稻植株产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述水稻具体为湘早籼11号、湘早籼24号、湘早籼7号或OsR498G1018986900.01等位基因与湘早籼11号相同的其他水稻品种。
在本发明的一些实施方式中，所述在水稻育种中的应用具体为将破坏了本发明第一方面的蛋白质的基因的表达和/或抑制了本发明第一方面的蛋白质的活性和/或降低了本发明第一方面的蛋白质的含量的水稻与其它水稻进行杂交以进行水稻育种。
本发明的第五个方面，提供一种降低水稻垩白度的方法，所述方法包括破坏目的水稻植株中本发明第一方面的蛋白质的基因的表达量和/或抑制目的水稻植株中本发明第一方面的蛋白质的活性和/或降低目的水稻植株中本发明第一方面的蛋白质的含量，得到基因敲除水稻植株；所述基因敲除水稻植株比目的水稻植株的垩白度降低。
在本发明的一些实施方式中，破坏目的水稻植株中本发明第一方面的蛋白质的基因的表达量和/或抑制目的水稻植株中本发明第一方面的蛋白质的活性和/或降低目的水稻植株中本发明第一方面的蛋白质的含量的方法为通过对所述目的水稻植株中编码本发明第一方面的蛋白质的基因进行敲除或抑制或突变来实现。
在本发明的一些实施方式中，破坏目的水稻植株中本发明第一方面的蛋白质的基因的表达量和/或抑制目的水稻植株中本发明第一方面的蛋白质的活性和/或降低目的水稻植株中本发明第一方面的蛋白质的含量的方法，包括但不限于通过蛋白质OsR498G1018986900.01特异的抗体，针对OsR498G1018986900.01mRNA的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂或siRNA实现。
在本发明的一些实施方式中，破坏目的水稻植株中本发明第一方面的蛋白质的基因的表达量和/或抑制目的水稻植株中本发明第一方面的蛋白质的活性和/或降低目的水稻植株中本发明第一方面的蛋白质的含量的方法为通过CRISPR/Cas9技术对所述目的水稻植株中编码本发明第一方面的蛋白质的基因进行敲除来实现。
在本发明的一些实施方式中，所述CRISPR/Cas9技术中的靶标序列如SEQ ID No.3(对应SEQ ID No.1的第335-357位)和/或SEQ ID No.4(对应SEQ ID No.1的第403-425位)所示。
在本发明的一些实施方式中，所述CRISPR/Cas9技术中的gRNA包括gRNA1和gRNA2，gRNA1的序列如SEQ ID No.5所示，gRNA2的序列如SEQ ID No.8所示。
在本发明的一些实施方式中，所述CRISPR/Cas9技术包括d1-d3中任一种CRISPR/Cas9基因编辑重组载体：
d1：重组载体pYLCRISPR/Cas9-gRNA1，含有gRNA1和cas9编码基因，gRNA1的序列如SEQ ID No.5所示；
d2：重组载体LB-DNAi/gRNA2，含有gRNA2，gRNA2的序列如SEQ ID No.8所示；
d3：重组载体pYLCRISPR/Cas9-OsR498G1018986900.01，含有gRNA1、gRNA2和cas9编码基因，gRNA1的序列如SEQ ID No.5所示，gRNA2的序列如SEQ ID No.8所示。
在本发明的一些实施方式中，所述gRNA1的接头引物对PF1和PR1的核苷酸分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。
在本发明的一些实施方式中，所述gRNA2的接头引物对PF2和PR2的核苷酸分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。
在本发明的一些实施方式中，所述水稻具体为湘早籼11号或OsR498G1018986900.01等位基因与湘早籼11号相同的其他水稻品种。
在本发明的第六方面，提供本发明第五方面的方法在水稻育种中的应用，
在本发明的一些实施方式中，所述在水稻育种中的应用具体为在培育垩白度降低的基因敲除水稻植株中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述在水稻育种中的应用具体为将通过本发明第五方面的方法得到的基因敲除水稻植株与其它水稻进行杂交以进行水稻育种。
在本发明的一些实施方式中，所述水稻具体为湘早籼11号或OsR498G1018986900.01等位基因与湘早籼11号相同的其他水稻品种。
本发明的有益效果是：
本发明发现水稻基因OsR498G1018986900.01及其编码蛋白与水稻垩白有关，对其进行敲除，可以显著降低水稻垩白度。因此，OsR498G1018986900.01基因可以作为水稻遗传育种的一个有效靶点，在水稻育种、提高稻米品质方面具有很好的应用前景。
本发明还提供了一种培育OsR498G1018986900.01基因敲除水稻植株的方法，该方法能够有效敲除OsR498G1018986900.01基因，通过该方法构建的OsR498G1018986900.01基因敲除水稻植株较野生型而言，垩白度显著降低，稻米品质得到有效改善。
附图说明
图1为本发明实施例中OsR498G1018986900.01基因的系统进化树。
图2为本发明实施例中pYLCRISPR/Cas9-OsR498G1018986900.01的质粒图谱。
图3为本发明实施例中OsR498G1018986900.01基因敲除植株(OsR498G1018986900.01)与野生型植株(X11)的外观形态比较图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
下列实施例中采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
下列实施例中所用HiPure Plasmid Micro Kit由广州美基生物科技有限公司提供；2×Taq mix由北京博凌科芮生物科技有限公司提供；pYLCRISPR/Cas9 P35s-H plasmid由武汉伯远生物科技有限公司提供；LB-DNAi plasmid由武汉伯远生物科技有限公司提供。
OsR498G1018986900.01基因的序列分析和系统进化分析
OsR498G1018986900.01基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第4-957个碱基，其中SEQ ID No.1的核苷酸序列为：5’-ATGGCCACGGCGGAGCAGCAGCAGCAGATCGAGCACGTCCACCTCCCCGTGCGGGGGCTCACCCTCCACGTCGCGCAAGCCGGCAAAGGCGAGCTCGGGACGGTGGTGTTCCTGCACGGGTTTCCGGAGATATGGTACTCGTGGCGCCACCAGATGCTCGCCGTCGCCGCCGCCGGGTACCGCGCCGTCGCGCCGGACTGGCGCGGGTACGGGCTCTCCGACCAGCCGCCGGAGCCGGAGGCGGCGGAGTACGACGACCTCGTCGAGGATCTCCTCGCCATCCTCGACGCCCTCGCCGTGCCCAAGGCCTTTCTTGTTGGGAAGGACTTTGGGGCCATGCCAGCTTATAGTTTTGCTCTCTGTCATCCAAATCGTACATGTGGTGTGATGTGTTTGGGCATCCCTTTCGGCGTTAATAGTTCATCCTTAAACACCTTACCAGAAGGATTCTACATTTTACGTTGGGCGCAACCAGGAAGAGCAGAAGCTGACTTTGGCAAGTATGATATCAGGAGAGTCGTGCGCACTATCTACATACTCTTCTCTAGGAACGAGATCCCCATAGCTAAGGAAGATCAAGAGATCATGGATCTTGCAGACTTATCGACACCCCTCCCCGAGTGGTTTAGTGAGGAGGATCTTGATGTCTACTCATCCCTCTATGAGAAGTCTGGTTTTCGATATCCGCTACAGATGCCATATAGGTCCATGCATCAAAACAAACCAATTGGAGATGCAAAATTTCAAGTCCCGGTGTTTGTTGTCATGGGAGAGAAAGATTATGTCTTCAAGATACCTGGTATCGAGTCTGTTATGAAAGACGGCAGCATGGAGAAGCATGCACCAGACCTAAAGATCACCTACATTCCTGAAGGAAGCCATTTTGTGCAGGAGCAGTTCCCTGAGTTTGTGAATGAGCTTCTTCTTAGCTTCTTGAAAGACCATCCTATGGCTGTTTGA-3’(SEQ ID No.1)；
水稻OsR498G1018986900.01基因编码的蛋白质的氨基酸序列为：MATAEQQQQIEHVHLPVRGLTLHVAQAGKGELGTVVFLHGFPEIWYSWRHQMLAVAAAGYRAVAPDWRGYGLSDQPPEPEAAEYDDLVEDLLAILDALAVPKAFLVGKDFGAMPAYSFALCHPNRTCGVMCLGIPFGVNSSSLNTLPEGFYILRWAQPGRAEADFGKYDIRRVVRTIYILFSRNEIPIAKEDQEIMDLADLSTPLPEWFSEEDLDVYSSLYEKSGFRYPLQMPYRSMHQNKPIGDAKFQVPVFVVMGEKDYVFKIPGIESVMKDGSMEKHAPDLKITYIPEGSHFVQEQFPEFVNELLLSFLKDHPMAV(SEQ ID No.2)。
OsR498G1018986900.01基因全长954个碱基，编码318个氨基酸。构建系统进化树，分析OsR498G1018986900.01基因与粳稻、拟南芥中相关基因的进化关系，如图1所示。结果表明，OsR498G1018986900.01基因与粳稻、拟南芥中的α/β折叠水解酶家族亲缘关系较近。
构建OsR498G1018986900.01基因敲除水稻植株
在湘早籼11号(X11)中利用CRISPR/Cas9系统构建OsR498G1018986900.01基因敲除水稻植株。
1、构建方法
a.设计靶标
通过在线设计工具(http://skl.scau.edu.cn/home/)针对OsR498G1018986900.01基因设计两个特异性靶标(Target 1和Target 2)，具体序列如下：
Target 1：5’-AGCAAAACTATAAGCTGGCATGG-3’(SEQ ID No.3，即对应SEQ ID No.1
的第335-357位)；
Target 2：5’-GATGAACTATTAACGCCGAAAGG-3’(SEQ ID No.4，对应SEQ ID No.1的第403-425位)。
b.含gRNA1和gRNA2的重组载体的构建
针对两条靶标序列(Target 1和Target 2)分别设计gRNA并合成gRNA的接头引物。其中，针对Target 1的gRNA1及其接头引物PF1/PR1的序列如下：
gRNA1：5’-TGCAAGCAAAACTATAAGCTGGCAGTTT-3’(SEQ ID No.5)；
PF1：5’-cagtGGTCTCatgcaagcaaaactataagctggca-3’(SEQ ID No.6)；
PR1：5’-cagtGGTCTCaaaactgccagcttatagttttgct-3’(SEQ ID No.7)。
针对Target 2的gRNA2及其接头引物PF2/PR2的序列如下：
gRNA2：5’-TGCAGATGAACTATTAACGCCGAAGTTT-3’(SEQ ID No.8)；
PF2：5’-cagtGGTCTCatgcagatgaactattaacgccgaa-3’(SEQ ID No.9)；
PR2：5’-cagtGGTCTCaaaacttcggcgttaatagttcatc-3’(SEQ ID No.10)。
将PF1和PR1分别溶于ddH2O得到浓度为10μM的母液，各取5μL加入到40μL ddH2O中，混匀后反应，反应程序为：95℃预变性10min，55℃变性10min，14℃退火5min，即得gRNA1。
PF2和PR2的操作步骤同上，即得gRNA2。
将退火后的引物链进行酶切连接，gRNA1和gRNA2的酶切连接体系分别如表1和表2所示。
表1
组分 体积
gRNA1 2μL
pYLCRISPR/Cas9 P35s-H plasmid 1.5μL
T4 DNA ligase 0.5μL
10×Buffer 1μL
Eco31I 0.5μL
ddH2O 4.5μL
总量 10μL
表2
组分 体积
gRNA2 2μL
LB-DNAi plasmid 1.5μL
T4 DNA ligase 0.5μL
10×Buffer 1μL
Eco31I 0.5μL
ddH2O 4.5μL
总量 10μL
将gRNA1和gRNA2的酶切连接体系分别于37℃酶切连接反应2h，分别得到连接产物1和连接产物2。将连接产物1和连接产物2分别转化入DH5α感受态细胞，并提取质粒，分别得到pYLCRISPR/Cas9-gRNA1和LB-DNAi/gRNA2，送往擎科生物进行测序。具体步骤如下：
(1)转化：向离心管中加入5μL连接产物、10μLKCM(含有0.5M KCl，0.15MCaCl2和0.25M MgCl2)和35μL ddH2O。从-80℃取出DH5α感受态细胞50μL，置于冰上，待其完全融化后迅速加入上述离心管中，并用枪头轻轻吹打混匀，随后将离心管依次于冰上静置30min，42℃水浴热激30s，冰上静置5min，随后在超净工作台中向离心管中加入500μL LB液体培养基，于37℃、180rpm条件下培养1h后，在6000×g条件下离心5min。在超净工作台中弃去部分上清，留取200μL上清将菌体重悬，随后将菌悬液均匀涂布在LB固体培养基(含50mg/L的卡那霉素)上，37℃倒置培养12h。
(2)提取质粒：挑取步骤(1)中的单菌落溶于20mL LB液体培养基中(含50mg/L的卡那霉素)，在37℃、180rpm条件下培养至菌液OD600约为0.6。采用HiPure Plasmid Micro Kit处理上述菌液以提取质粒，操作均严格按照说明书进行。
将测序正确的pYLCRISPR/Cas9-gRNA1和LB-DNAi/gRNA2进行酶切连接，以得到含有gRNA1和gRNA2的重组载体pYLCRISPR/Cas9-OsR498G1018986900.01。反应体系如表3所示。pYLCRISPR/Cas9-OsR498G1018986900.01的质粒图谱如图2所示。
表3
组分 体积
测序正确的pYLCRISPR/Cas9-gRNA1 1μL
测序正确的LB-DNAi/gRNA2 1.5μL
LguI 0.5μL
T4 DNA ligase 0.5μL
10×Buffer 1μL
ddH2O 5.5μL
总量 10μL
上述反应体系于37℃酶切连接反应2h，即得连接产物(pYLCRISPR/Cas9-OsR498G1018986900.01)。
将上述连接产物转化入DH5α感受态细胞，鉴定阳性克隆，并提取质粒，送往擎科生物进行测序。其中，连接产物转化入DH5α感受态细胞和提取质粒的步骤同上，鉴定阳性克隆的步骤具体如下：
在超净工作台中，用枪头轻轻沾取步骤(1)中LB固体培养基上的单菌落，溶于4μLddH2O中，随后加入5μL 2×Taq mix、0.5μL F3(10μM)和0.5μL R3(10μM)，混匀后，按如下反应程序进行扩增，即得PCR产物。
反应程序为：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，35cycles；72℃5min。
PF3的核苷酸序列为：5’-GCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG-3’(SEQ ID No.11)；
PR3的核苷酸序列为：5’-ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGT-3’(SEQ ID No.12)。
将PCR产物跑1％琼脂糖凝胶电泳，有大小约为995bp的单一目的条带的样品鉴定为阳性克隆。
c.构建OsR498G1018986900.01基因敲除水稻植株
将步骤b中测序正确的菌液中提取得到的pYLCRISPR/Cas9-OsR498G1018986900.01质粒送往武汉伯远生物科技有限公司进行遗传转化实验，以构建得到OsR498G1018986900.01基因敲除水稻植株(T0代)。
2.OsR498G1018986900.01基因敲除水稻植株的鉴定
将上述步骤c中构建得到的T0代水稻进行自交，得到T1代水稻，提取T1代水稻的叶片的基因组DNA，用引物PF4/PR4扩增上述基因组DNA，产物送往擎科生物进行测序，并将测序结果与转基因前的野生型植株序列(SEQ ID No.1)比较。其中，引物PF4/PR4的序列具体如下：
PF4：5’-ATTTCTCCATAATGAAACCAGC-3’(SEQ ID No.13)；
PR4：5’-GACGAGTTCTTCCACTGTCAC-3’(SEQ ID No.14)；
反应程序为：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，35cycles；72℃5min。
与野生型植株序列(SEQ ID No.1)相比，T1代水稻(记为：pYLCRISPR/Cas9-OsR498G1018986900.01-1)中，Target 1(SEQ ID No.3)对应的位点序列为5’-GAGAGCAAAACTATAAGCTG-CATGGCCCCAAAGTC-3’，缺少一个核苷酸——G；Target 2(SEQ IDNo.4)对应的位点序列为5’-GTTTAAGGATGAACTATTAA--------GGGATGCCCAAACAC-3’，缺失8个核苷酸——CGCCGAAA。这表明OsR498G1018986900.01基因敲除水稻植株构建成功。
OsR498G1018986900.01基因敲除水稻植株的垩白性状鉴定
将野生型水稻(X11)和上述实施例中鉴定正确的OsR498G1018986900.01基因敲除水稻植株(T1代水稻，记为：OsR498G1018986900.01)分别培养至成熟，观察不同时期的植株形态，并分别依据国家大米标准GB/T 1354-2018和3D测定法(CN111024737A，一种基于Micro-CT的水稻垩白三维测定方法)测定X11和OsR498G1018986900.01基因敲除水稻植株的垩白粒率和垩白度。
植株形态比较结果如图3所示。
由图3可知，与野生型水稻植株相比，OsR498G1018986900.01基因敲除水稻植株营养生长没有差异。
垩白粒率和垩白度分别统计如表4所示。
表4
由表4可知，两种方法对水稻垩白粒率和垩白度的统计结果均表明敲除OsR498G1018986900.01基因后，水稻垩白度极显著降低。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 基因OsR498G1018986900.01及其编码的蛋白在调控水稻垩白中的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccacgg cggagcagca gcagcagatc gagcacgtcc acctccccgt gcgggggctc 60
accctccacg tcgcgcaagc cggcaaaggc gagctcggga cggtggtgtt cctgcacggg 120
tttccggaga tatggtactc gtggcgccac cagatgctcg ccgtcgccgc cgccgggtac 180
cgcgccgtcg cgccggactg gcgcgggtac gggctctccg accagccgcc ggagccggag 240
gcggcggagt acgacgacct cgtcgaggat ctcctcgcca tcctcgacgc cctcgccgtg 300
cccaaggcct ttcttgttgg gaaggacttt ggggccatgc cagcttatag ttttgctctc 360
tgtcatccaa atcgtacatg tggtgtgatg tgtttgggca tccctttcgg cgttaatagt 420
tcatccttaa acaccttacc agaaggattc tacattttac gttgggcgca accaggaaga 480
gcagaagctg actttggcaa gtatgatatc aggagagtcg tgcgcactat ctacatactc 540
ttctctagga acgagatccc catagctaag gaagatcaag agatcatgga tcttgcagac 600
ttatcgacac ccctccccga gtggtttagt gaggaggatc ttgatgtcta ctcatccctc 660
tatgagaagt ctggttttcg atatccgcta cagatgccat ataggtccat gcatcaaaac 720
aaaccaattg gagatgcaaa atttcaagtc ccggtgtttg ttgtcatggg agagaaagat 780
tatgtcttca agatacctgg tatcgagtct gttatgaaag acggcagcat ggagaagcat 840
gcaccagacc taaagatcac ctacattcct gaaggaagcc attttgtgca ggagcagttc 900
cctgagtttg tgaatgagct tcttcttagc ttcttgaaag accatcctat ggctgtttga 960
<210> 2
<211> 319
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Thr Ala Glu Gln Gln Gln Gln Ile Glu His Val His Leu Pro
1 5 10 15
Val Arg Gly Leu Thr Leu His Val Ala Gln Ala Gly Lys Gly Glu Leu
20 25 30
Gly Thr Val Val Phe Leu His Gly Phe Pro Glu Ile Trp Tyr Ser Trp
35 40 45
Arg His Gln Met Leu Ala Val Ala Ala Ala Gly Tyr Arg Ala Val Ala
50 55 60
Pro Asp Trp Arg Gly Tyr Gly Leu Ser Asp Gln Pro Pro Glu Pro Glu
65 70 75 80
Ala Ala Glu Tyr Asp Asp Leu Val Glu Asp Leu Leu Ala Ile Leu Asp
85 90 95
Ala Leu Ala Val Pro Lys Ala Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Gly Ala
100 105 110
Met Pro Ala Tyr Ser Phe Ala Leu Cys His Pro Asn Arg Thr Cys Gly
115 120 125
Val Met Cys Leu Gly Ile Pro Phe Gly Val Asn Ser Ser Ser Leu Asn
130 135 140
Thr Leu Pro Glu Gly Phe Tyr Ile Leu Arg Trp Ala Gln Pro Gly Arg
145 150 155 160
Ala Glu Ala Asp Phe Gly Lys Tyr Asp Ile Arg Arg Val Val Arg Thr
165 170 175
Ile Tyr Ile Leu Phe Ser Arg Asn Glu Ile Pro Ile Ala Lys Glu Asp
180 185 190
Gln Glu Ile Met Asp Leu Ala Asp Leu Ser Thr Pro Leu Pro Glu Trp
195 200 205
Phe Ser Glu Glu Asp Leu Asp Val Tyr Ser Ser Leu Tyr Glu Lys Ser
210 215 220
Gly Phe Arg Tyr Pro Leu Gln Met Pro Tyr Arg Ser Met His Gln Asn
225 230 235 240
Lys Pro Ile Gly Asp Ala Lys Phe Gln Val Pro Val Phe Val Val Met
245 250 255
Gly Glu Lys Asp Tyr Val Phe Lys Ile Pro Gly Ile Glu Ser Val Met
260 265 270
Lys Asp Gly Ser Met Glu Lys His Ala Pro Asp Leu Lys Ile Thr Tyr
275 280 285
Ile Pro Glu Gly Ser His Phe Val Gln Glu Gln Phe Pro Glu Phe Val
290 295 300
Asn Glu Leu Leu Leu Ser Phe Leu Lys Asp His Pro Met Ala Val
305 310 315
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcaaaacta taagctggca tgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatgaactat taacgccgaa agg 23
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgcaagcaaa actataagct ggcagttt 28
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagtggtctc atgcaagcaa aactataagc tggca 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagtggtctc aaaactgcca gcttatagtt ttgct 35
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcagatgaa ctattaacgc cgaagttt 28
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagtggtctc atgcagatga actattaacg ccgaa 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagtggtctc aaaacttcgg cgttaatagt tcatc 35
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgattaagt tgggtaacgc caggg 25
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
accggtaagg cgcgccgtag t 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atttctccat aatgaaacca gc 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gacgagttct tccactgtca c 21

Claims (6)

1.1）或3）中任一种蛋白质在调控水稻垩白中的应用，其特征在于，
1）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；
3）在1）的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；
所述调控水稻垩白通过对目的水稻植株中编码1）或3）中所述蛋白质的基因进行敲除或抑制，实现降低水稻垩白度。
2.一种产品在水稻育种中的应用，其特征在于，
所述产品含有a1-a4中的任一种生物材料：
a1：破坏权利要求1中所述蛋白质的基因的表达量和/或降低所述蛋白质的含量的核酸分子；
所述核酸分子为能够对目的水稻植株中编码权利要求1中所述蛋白质的基因进行敲除或抑制的核酸分子；
a2：含有a1中所述核酸分子的表达盒；
a3：含有a1中所述核酸分子或a2中所述表达盒的重组载体；
a4：含有a1中所述核酸分子或a2中所述表达盒或a3中所述重组载体的重组微生物；
其中，含有a1-a4中任一种生物材料的所述产品用于降低水稻垩白度。
3.一种降低水稻垩白度的方法，其特征在于，所述方法包括通过对目的水稻植株中编码权利要求1中所述蛋白质的基因进行敲除或抑制，来实现破坏目的水稻植株中权利要求1中所述蛋白质的基因的表达量和/或降低目的水稻植株中所述蛋白质的含量，得到转基因水稻植株；所述转基因水稻植株比所述目的水稻植株的垩白度降低。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述破坏目的水稻植株中权利要求1中所述蛋白质的基因的表达量和/或降低目的水稻植株中权利要求1中所述蛋白质的含量的方法为通过CRISPR/Cas9技术对所述目的水稻植株中编码权利要求1中所述蛋白质的基因进行敲除来实现。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9技术中的靶标序列为SEQID No.3和/或SEQ ID No.4。
6.权利要求3-5任一项所述的方法在水稻育种中的应用。
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