CN113337482B - 大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2及其编码蛋白与应用 - Google Patents

大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2及其编码蛋白与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2‑1和GmDET2‑2及其编码蛋白与应用。本发明提供的大豆GmDET2‑1和GmDET2‑2蛋白具有如下任一种氨基酸序列：1)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；2)在SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的氨基酸序列；本发明同时提供了编码上述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示，过表达该基因能够增加种子大小及千粒重，提高植物产量，在农业生产中具有潜在的应用价值。

Description

大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2及其编码蛋 白与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及大豆油菜素内酯合成酶相关基因、其编码的蛋白及其在种子大小、千粒重、产量调控中的应用。
背景技术
大豆是中国的五大农作物之一。从全球来看，世界人口的增长导致2050年大豆产量必须翻倍才能满足总体需求，但是按照现阶段产量增加的幅度，预测2050年大豆产量仅能达到一半的需求(Tilman D,Balzer C,Hill J,&Befort BL(2011)Global food demandand the sustainable intensification of agriculture.Proc Natl Acad Sci U SA108(50):20260-20264.Ray DK,Mueller ND,West PC,&Foley JA(2013)Yield TrendsAre Insufficient to Double Global Crop Production by 2050.PloS one 8(6):e66428.)。然而，通过扩大种植面积提高产量既不现实也不可能，因为生态安全和土地沙漠化等因素迫使退耕还林已是大势所趋。因此提高大豆单产是必经之路，对大豆的安全生产具有重要的战略意义。
作物高产途径不外乎培育高产品种、施加有机肥和增产剂以及改善栽培耕作方式等。培育高产品种的手段有传统的杂交育种和现代的分子育种(包括转基因育种)。转基因育种是在对目标基因的功能及作用机制有较明确认识的前提下进行的，因而周期较短、增产效率较高。在大豆中也有很多通过转基因提高大豆产量和抗性的报道：如过表达Ncl基因(Na+、K+和Cl-转运蛋白)的大豆具有较高的耐盐性，在高盐地区的产量比野生型提高3.6～5.5倍(Do TD,et al.(2016)Ncl Synchronously Regulates Na(+),K(+),and Cl(-)inSoybean and Greatly Increases the Grain Yield in Saline FieldConditions.Scientific reports 6:19147.)；LOS5/ABA3(脱落酸醛脱氢氧化酶活性相关基因)转基因大豆在干旱条件下气孔开放大小及蒸腾速率降低，抗旱性明显增强，在干旱条件下的产量比野生型约提高21％(Li Y,et al.(2013)Expression of an Arabidopsismolybdenum cofactor sulphurase gene in soybean enhances drought tolerance andincreases yield under field conditions.Plant biotechnology journal 11(6):747-758.)；在美国和阿根廷等国家的实验表明，在大豆中过表达向日葵Hahb-4(乙烯信号转导途径基因)，能延缓大豆衰老，在干旱等逆境下产量提高7-15％(Waltz E(2014)Beatingthe heat.Nat Biotechnol 32(7):610-613.)；孟山都公司报道，在大豆中过表达拟南芥的BBX32开花基因，产量增加5-7％(Preuss SB,et al.(2012)Expression of theArabidopsis thaliana BBX32 gene in soybean increases grain yield.PloS one 7(2):e30717.)；过表达蓝细菌FBP/SBPase(Bifunctional fructose-1,6/sedoheptulose-1,7-bisphosphatase)基因的大豆，在高CO2浓度、高温等逆境(即：未来潜在的环境条件)下保持稳产(
Figure BDA0003071395230000021
Ruiz-Vera U M,Andy V L,et al.Expression of cyanobacterialFBP/SBPase in soybean prevents yield depression under future climateconditions[J].Journal of Experimental Botany,2016,68(3):715-726.)；下调大豆BS1(Big Seed 1)同源基因的表达，显著增加大豆种子大小，干重增加45％以上(Ge L,et al.(2016)Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legumespecies.Proc Natl Acad Sci U S A 113(44):12414-12419.)。APETALA2-like基因GmTOE4a的过表达转基因大豆具有株高及节间缩短、茎杆粗壮等高产潜质的农艺性状(ZhaoX,et al.(2015)Dual functions of GmTOE4a in the regulation of photoperiod-mediated flowering and plant morphology in soybean.Plant Mol Biol 88(4-5):343-355.)。
发明内容
本发明的目的是提供大豆油菜素内酯合成酶基因相关基因GmDET2-1和GmDET2-2、其编码的蛋白及其在种子大小、千粒重、产量等种子发育调控中的应用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供大豆GmDET2蛋白，其包括GmDET2-1蛋白和GmDET2-2蛋白，所述GmDET2-1蛋白具有如下任一种氨基酸序列：
1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
2)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的氨基酸序列；
所述GmDET2-2蛋白具有如下任一种氨基酸序列：
1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
2)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的氨基酸序列。
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明的大豆GmDET2-1和GmDET2-2蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有大豆GmDET2-1和GmDET2-2蛋白同等活性的由大豆GmDET2-1和GmDET2-2蛋白衍生得到的蛋白质。
本发明的另一个目的是提供编码上述的大豆GmDET2-1和GmDET2-2蛋白的GmDET2-1和GmDET2-2基因。
GmDET2-1和GmDET2-2(全称为Glycine max DE-ETIOLATED2)基因具有如SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，或者具有与SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。
本发明所述的基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明的另一个目的是提供携带GmDET2-1和GmDET2-2基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
所述载体可为表达载体、克隆载体。所述表达载体包括但不限于植物表达载体pSoy2。
所述宿主细胞包括微生物细胞或植物细胞。
本发明还提供含有GmDET2-1和GmDET2-2核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。
本发明将GmDET2-1和GmDET2-2基因构建到表达载体pSoy2上，并在大肠杆菌DH5α中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将pSoy2携带的GmDET2-1和GmDET2-2基因拟南芥Col-0中，获得过表达GmDET2-1和GmDET2-2的转基因拟南芥。结果表明，GmDET2-1和GmDET2-2具有促进种子变大、千粒重增加、提高植物产量的功能。
本发明的另一个目的是提供GmDET2-1和GmDET2-2基因及其编码蛋白GmDET2-1和GmDET2-2在植物种子发育调控中的应用。
本发明提供了大豆GmDET2-1和GmDET2-2蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在增加植物种子大小或千粒重中的应用。
本发明所述的增加植物种子大小可为增加种子的宽度、长度和/或面积。
利用GmDET2-1和GmDET2-2蛋白促进种子变大、增加千粒重的功能能够提高植物产量。
本发明提供了大豆GmDET2-1和GmDET2-2蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在提高植物产量中的应用。
本发明提供了大豆GmDET2-1和GmDET2-2蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在植物种质资源改良或杂交育种中的应用。
本发明提供了大豆GmDET2-1和GmDET2-2蛋白或其编码基因或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。
所述转基因植物为相对于野生型植物的种子大小增加、千粒重增加和/或产量提高的转基因植物。
本发明还提供了一种制备增加种子大小、增加千粒重和/或产量提高的转基因植物的方法，是在植物基因组中引入或过表达本发明所述的大豆GmDET2-1和GmDET2-2基因。
本发明所述的植物优选为拟南芥或大豆。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了大豆GmDET2-1和GmDET2-2基因及其编码蛋白GmDET2-1和GmDET2-2；
(2)通过在植物中过表达GmDET2-1和GmDET2-2基因能够促进植物种子变大、千粒重增加，进而提高植物产量。因此，GmDET2-1和GmDET2-2基因及其编码的蛋白可以用于调控种子发育、促进种子变大和千粒重增加，提高产量。
附图说明
图1为本发明实施例1中大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2编码蛋白的氨基酸序列与拟南芥DET2基因编码蛋白的氨基酸序列的比较。
图2为本发明实施例2的克隆中间载体FU28的结构示意图。
图3为本发明实施例3的植物表达载体pSoy2的结构示意图。
图4为本发明实施例4中大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2编码的蛋白在烟草中的亚细胞定位，从左到右图示依次为GmDET2-1和GmDET2-2-GFP在细胞核中的定位；细胞核marker基因AHL22-RFP的定位；叶绿体；明场；前四个图像的叠加图。
图5为本发明实施例5中大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2的组织表达水平分析，其中，A，GmDET2-1和GmDET2-2半定量PCR的琼脂糖凝胶电泳图；B，GmDET2-1和GmDET2-2半定量PCR的量化数据图表。
图6为本发明实施例6中大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2转化拟南芥Col-0，导致种子变大、千粒重增加，其中，A和B，Col-0和GmDET2的转基因株系的种子；C，Col-0与GmDET2转基因株系种子长度的统计分析；D，Col-0与GmDET2转基因株系种子宽度的统计分析；E，Col-0与GmDET2转基因株系干重种子的千粒重；F，Col-0与GmDET2转基因株系种子面积；标尺：1mM。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2的克隆
利用正向引物5’-CCCAAGCTTATGATCCCAGAACACTACTC-3’和反向引物5’-CCGGGGATCCATACAAGTAAGGAATAACAG-3’从大豆天隆1号(Glycine max L.Tianlong 1)中克隆并测序获得GmDET2-1和GmDET2-2基因，其基因序列如SEQ ID NO.3和4所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和2所示。
PCR反应程序为:95℃5min预变性，94℃30s，55℃35s，72℃1min，30个循环，72℃10min延伸。
通过核酸序列比对发现GmDET2-1和GmDET2-2同源性达98％，而AtDET2与GmDET2-1和GmDET2-2的同源性分别是67％和68％。而进行氨基酸序列比对发现GmDET2-1和GmDET2-2同源性达98％，AtDET2与GmDET2-1和GmDET2-2氨基酸序列同源性均为61％(图1)。
实施例2大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2的克隆载体的构建
将实施例1中扩增获得的PCR产物直接按照酶切连接的方法克隆到如图2所示的FU28载体上。先将FU28载体和PCR产物用HindIII和BamHI酶切回收后，回收产物于16℃进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩增，筛选阳性克隆并测序。
实施例3大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2的植物表达载体的构建
将从实施例2中得到的大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1、连有GmDET2-1启动子的克隆载体以及及如图3所示的植物表达载体pSoy2等比例混合后通过LR反应(质粒各50ng，LR酶1μl，补H2O至终体积5μl，混匀后25℃反应6小时以上)，将GmDET2-1和自身启动子构建在pSoy2上，用于在植物中过表达大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1，研究其功能。GmDET2-2的植物表达载体的构建方法同上。植物的转化方法采用农杆菌介导法进行。植物中的筛选标记为Bar。
实施例4大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2编码蛋白在转基因植物中的定位
对大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2编码蛋白在转基因植物中的定位进行分析，具体方法如下：
(1)挑取-80℃保存的含有目标载体GmDET2-1和GmDET2-2-GFP的农杆菌于3mL含有相应抗性的液体LB培养基，28℃、200rpm震荡培养过夜；
(2)用移液器吸取200μL菌液接种到50mL含有相应抗性的液体LB培养基，28℃、200rpm震荡培养过夜，此时菌液OD600值约为1；
(3)将菌液分装于灭菌的50mL离心管，室温4000rpm离心10min，弃上清；
(4)用注射buffer(10mM MES；150μM AS；100mM MgCl2)重悬菌体使最终菌液的OD600值约为1；
(5)用1mL的注射器吸取部分菌液，在烟草的背面进行注射。注射完成后用黑色塑料袋将烟草罩上，第二天揭去塑料袋移至光下再培养两天后，用激光共聚焦显微镜ZeissLSM700观察YFP荧光信号。结果显示GmDET2-1和GmDET2-2定位于细胞核(图4)。
实施例5大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2的组织表达特异性分析
提取大豆各组织的总RNA，逆转录得到cDNA。以逆转录得到的cDNA为模板，分别采用GmDET2与内参基因UKN1的半定量引物，配制表1所示的反应体系：
表1半定量PCR反应体系
Figure BDA0003071395230000081
PCR反应程序为:95℃2min预变性，98℃10s，54℃30s，72℃1min，32个循环，72℃10min延伸。配制1.6％的琼脂糖凝胶电泳，通过电泳反应观察分析目的基因的表达量变化。结果如图5所示。
实施例6大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2促进种子变大、千粒重增加和产量提高
采用农杆菌介导法将实施例3构建的大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1的植物表达载体和GmDET2-2的植物表达载体分别转化至拟南芥中，分别获得转GmDET2-1基因的拟南芥转基因株系(GmDET2-1pro：GmDET2-1:GFP)和转GmDET2-2的拟南芥转基因株系(GmDET2-2pro：GmDET2-2:GFP)。
选取GmDET2-1pro：GmDET2-1:GFP和GmDET2-2pro：GmDET2-2:GFP转基因株系各3个line进行实验。分别统计各株系种子的千粒重发现，与野生型相比，GmDET2-1和GmDET2-2转基因植株的种子重量均显著增加(图6)。同时，在每个转基因株系中分别随机挑选50粒种子，利用ImageJ软件测量每粒种子的长度和宽度及面积，发现GmDET2-1和GmDET2-2转基因植株的种子相较于野生型种子，其长度和宽度及面积都明显变大(图6)。
综上所述，结果表明GmDET2-1和GmDET2-2参与调控种子的生长发育，过表达GmDET2-1、GmDET2-2能够增加种子的大小以及重量，提高产量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 大豆油菜素内酯合成酶基因GmDET2-1和GmDET2-2及其编码蛋白与应用
<130> KHP211114086.4
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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20 25 30
Leu Gln Ala Pro Tyr Gly Lys His His Arg Pro Gly Trp Gly Pro Asn
35 40 45
Leu Pro Pro Pro Leu Ala Trp Leu Leu Met Glu Ser Pro Thr Leu Trp
50 55 60
Leu Thr Leu Leu Leu Phe Pro Leu Gly Leu His Ser His Asn Pro Lys
65 70 75 80
Ala Gln Ala Leu Ile Thr Pro Phe Leu Ile His Tyr Phe Asn Arg Thr
85 90 95
Ile Leu Tyr Pro Leu His Leu Leu Leu Thr Pro Ser Lys Lys Thr Thr
100 105 110
Pro Gly Phe Pro Leu Ser Val Ala Leu Met Ala Phe Ala Phe Asn Val
115 120 125
Leu Asn Ser Tyr Leu Gln Ala Arg Thr Val Ser His Tyr Asn Asn His
130 135 140
Tyr Asp Asp Ser Gly Phe Phe Trp Phe Arg Phe Leu Cys Gly Leu Leu
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Leu Phe Glu Leu Val Ala Cys Pro Asn Tyr Phe Gly Glu Ile Val Glu
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225 230 235 240
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<211> 263
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aattactttg gggagattgt cgagtggctc ggctgggccg tgatgacttg gtcatgggcc 660
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgatcccag aacactactc cgactcatct ctcttccacc gctccctcct taccctcttc 60
ctaatcgcac cccccacctt cctctccctc accttcctcc aggcccccta cggcaagcac 120
cacaggcccg gctgggggcc caacctccct ccccccttag cctggctctt catggaaagc 180
ccaaccctct ggctcaccct cctcctcttc ccactgggcc tccactccca caaccccaaa 240
gcccaagccc tcatcacccc cttcctaatc cactacttca accgcaccat cctctaccct 300
ctccacctcc tcctcactcc ttcaaagaaa accccaacgg gcttccccct cggcgtagcc 360
ctaatggcct tcgccttcaa cgttctcaat tcctacctcc aggcccgaac ggtctctcac 420
tacatcaatc actatgatga ctcgggtttt ttctggttcc ggtttttgtg tgggcttttg 480
gtgtttttat tggggatggg gattaatgta tgggctgata gggttttgtt gcggctcaag 540
agcgagggga agggctacgt ggtgccgcgc ggtgggttgt tcgagctcgt ggcgtgtccg 600
aattactttg gggagattgt cgagtggctg ggctgggccg tgatgacttg gtcatgggcc 660
gggctgggct tttttgttta cacttttgct aatttgggtc caagggcccg ggccaaccgg 720
aggtggtatt tggagaagtt tggggaggat tatcccaagg agaggaaggc tgttattcct 780
tacttgtatt ga 792
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccaagctta tgatcccaga acactactc 29
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccggggatcc atacaagtaa ggaataacag 30

Claims (10)

1.大豆GmDET2蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在增加拟南芥或大豆的种子大小或千粒重中的应用；
所述大豆GmDET2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示；
所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3或4所示。
3.大豆GmDET2蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在提高拟南芥或大豆的产量中的应用；
所述大豆GmDET2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示；
所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3或4所示。
5.大豆GmDET2蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在以增加植物种子大小或千粒重或产量为目的的拟南芥或大豆的种质资源改良或杂交育种中的应用；
所述大豆GmDET2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示；
所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3或4所示。
7.大豆GmDET2蛋白或其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在制备相对于野生型植物的种子大小增加、千粒重增加和/或产量提高的转基因拟南芥或大豆的中的应用；
所述大豆GmDET2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示；
所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3或4所示。
9.一种制备种子大小增加、千粒重增加和/或产量提高的转基因拟南芥或大豆的方法，其特征在于，在拟南芥基因组中引入编码大豆GmDET2蛋白的基因，或者，在大豆的基因组中过表达编码大豆GmDET2蛋白的基因；
所述大豆GmDET2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述编码大豆GmDET2蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示。
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