CN102219841B - 与植物生物量相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与植物生物量相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明的蛋白是如下a)或b)的蛋白质：a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物生物量相关的由a)衍生的蛋白质。实验证明，本发明的蛋白及其编码基因能够增加植物的生物量，如使植物的种子数量增加，种子千粒重增加，使植物的花叶等器官面积增加，植株整体生长势增强。因此，本发明蛋白及其编码基因能够培育产量增高的农作物或者蔬菜等。本发明可用于农牧业生产所需的植物品种的培育与鉴定，同时也为植物中基因的分离和功能研究提供了重要手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种与植物生物量相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
植物器官和种子的大小是重要的农业性状。与分生能力相比，植物器官的大小有一个特定的界限，不能无限生长。植物器官的大小差异很大，即使在同一物种之内，遗传本质相似的植物个体之间器官大小的差异也非常明显。植物器官和种子的大小受到环境因素的影响，但具有相同遗传背景的个体之间在相同环境条件下大小基本一致，所以植物器官和种子的最终的大小受到遗传因素的严格控制。研究植物器官与种子大小的调控机制不仅具有理论上的意义，同时也具有重要的现实意义。通过调控植物种子的大小，可以增加粮食作物的产量，产生更多的食物。另外增加植物器官的大小，可以使总的生物产量增加，从而获得更多的生物能源。植物器官的生长分为两个密切相关的过程：在器官生长的初期阶段主要进行细胞分裂，产生足够数量的细胞；接下来细胞分裂逐渐停止，进入细胞扩展阶段，通过细胞膨大生长，到达器官的最终大小。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白及其编码基因。
本发明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物生物量相关的由a)衍生的蛋白质。
所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：
1)其核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
为了使1)中的CL-TRUNC便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述2)中的CL-TRUNC可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的CL-TRUNC的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围；所述引物对中的一条引物序列如SEQ ID NO：4所示，所述引物对中的另一条引物序列如SEQ ID NO：5所示。
上述蛋白在作为去泛素化酶中的应用也属于本发明的保护范围。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发明的保护范围。
所述重组载体为在表达载体pCAMBIA2300-35S的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。
本发明的另一个目的是提供一种培育生物量提高的植物的方法。
本发明所提供的培育生物量提高的植物的方法，包括如下步骤：将上述任一所述蛋白的编码基因导入出发植物，得到与所述出发植物相比生物量提高的目的转基因植物。
上述方法中，所述生物量提高为如下1)-6)中的至少一种：
1)种子千粒重增加；
2)种子数量增加；
3)株高增加；
4)叶片面积增加；
5)花瓣面积增加；
6)单个种子重量增加；
所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。
所述蛋白的编码基因是通过上述任一所述重组表达载体导入的；所述双子叶植物为拟南芥。
实验证明，本发明的蛋白及其编码基因能够增加植物的生物量，如使植物的种子数量增加，种子千粒重增加，使植物的花叶等器官面积增加，植株整体生长势增强。因此，本发明蛋白及其编码基因能够培育产量增高的农作物或者蔬菜等。本发明可用于农牧业生产所需的植物品种的培育与鉴定，同时也为植物中基因的分离和功能研究提供了重要手段。
附图说明
图1为CL-TRUNC蛋白的去泛素化酶活性检测。
图2为转CL-TRUNC基因的拟南芥的植株和花器官大小的比较。
图3为转CL-TRUNC基因的拟南芥的种子大小的比较。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、蛋白及其编码基因的制备与应用
一、目的基因的克隆
提取拟南芥(Col-0生态型)(公众可网上购自www.arabidopsis.org)(Arabidopsisthaliana，ecotype Columbia)的总RNA，并进行反转录反应获得cDNA，以其为模板，在引物1和引物2的引导下，进行PCR扩增。
引物1：5′-CGGGATCCATGGAGCTCCTCCGATCCA-3′(上游引物，下划线部分碱基为BamHI识别位点)(SEQ ID NO：4)
引物2：5′-GCGTCGACAATCCCTCCTCCATCTGGTAA-3′(下游引物，下划线部分碱基为SalI识别位点)(SEQ ID NO：5)
反应结束后对PCR产物进行纯化，扩增得到2220bp的片段，经测序表明该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，为编码序列(cDNA序列)，编码SEQ ID NO：1所示蛋白质，即本发明的植物器官和种子大小调控蛋白，将该蛋白命名为CL-TRUNC，将该蛋白的编码基因命名为CL-TRUNC。
二、调节植物器官大小——过表达
1、重组表达载体的获得
载体pCAMBIA2300-35S在文献“Cloning，characterization，and transformation of thephosphoethanolamine N-methyltransferase gene(ZmPEAMT1)in maize(Zea mays L.).Mol Biotechnol.36：102-112”中公开过(Wu S，Yu Z，Wang F.2007)，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
将上述步骤一得到的PCR扩增产物用限制性内切酶BamHI和SacI进行双酶切，然后将经纯化的酶切产物与经BamHI和SacI酶切的载体pCAMBIA2300-35S连接。将连接产物转化大肠杆菌，抗性筛选培养，挑取单克隆，将单克隆进行液体培养，提取质粒进行测序，结果在载体pCAMBIA2300-35S的BamHI和SacI酶切位点间插入的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中第1-2220位核苷酸所示(沿着从BamHI到SacI的方向)，表明构建的重组表达载体正确，将鉴定表明含有CL-TRUNC的正确的重组表达载体命名为p2300-35S-CL-TRUNC。
2、获得转基因植物
将重组表达载体p2300-35S-CL-TRUNC在根癌农杆菌的介导下转化拟南芥野生型(Col-0生态型)，然后用选择性标记基因卡那霉素(在含50mg/L卡那霉素的MS培养基)进行抗性筛选，筛选得到在含50mg/L卡那霉素的MS培养基上能够生长的转p2300-35S-CL-TRUNC植株。抗性筛选得到的转p2300-35S-CL-TRUNC植株，用引物1和引物2对其进行PCR扩增鉴定，得到PCR鉴定正确的转p2300-35S-CL-TRUNC植株(即阳性转p2300-35S-CL-TRUNC植株)20株。
同时以转入载体pCAMBIA2300-35S的拟南芥为转空载体对照，以未经任何转化的拟南芥为野生型对照。CL-TRUNC-1和CL-TRUNC-6表示转CL-TRUNC基因植物1号和6号两个不同的株系。
3、转基因植物的器官和种子大小检测
将上述步骤2得到的阳性转p2300-35S-CL-TRUNC植株(CL-TRUNC-1和CL-TRUNC-6)的种子、空载体对照的种子、野生型种子分别播种在GM培养基上，4℃暗培养3天，然后转移至光照条件为16h光照/8h黑暗、光强12000LX、温度是22℃的培养箱里生长，将生长一周左右的苗子移到营养土和蛭石为2∶1的混合土里培养，培养条件为16h光照/8h黑暗、光强12000LX，培养35-70天后分别检测株高、花、叶片和种子的大小，并拍照。
GM培养基组成：溶剂为水，溶质及浓度如下：MS盐2.2g/L，Mes 0.5g/L，果糖10g/L，琼脂粉9.0g/L。
结果如图2和3所示。具体结果如下：
混合土培养50天的株高：CL-TRUNC-1：30.5cm，CL-TRUNC-6：35.3cm，转空载体对照：30.2cm，野生型对照：30.0cm；
混合土培养35天的花瓣长：CL-TRUNC-1：4.00mm，CL-TRUNC-6：3.37mm，转空载体对照：3.14mm，野生型对照：3.12mm；
混合土培养35天的花瓣宽：CL-TRUNC-1：1.66mm，CL-TRUNC-6：1.24mm，转空载体对照：0.98mm，野生型对照：0.96cm；
花瓣长/花瓣宽：CL-TRUNC-1：2.44，CL-TRUNC-6：2.74，转空载体对照：3.21，野生型对照：3.25；
混合土培养35天的花瓣面积：CL-TRUNC-1：4.71mm2，CL-TRUNC-6：2.51mm2，转空载体对照：1.93mm2；
混合土培养35天的叶片面积(第二片真叶)：CL-TRUNC-1：0.98cm2，CL-TRUNC-6：0.51cm2，转空载体对照：0.31cm2，野生型对照：0.30cm2；
混合土培养50天的每个果荚内的种子数目：CL-TRUNC-1：56，CL-TRUNC-6：62，转空载体对照：55，野生型对照：54；
混合土培养70天的千粒重：CL-TRUNC-1：26.4mg，CL-TRUNC-6：23.9mg，转空载体对照：18.1mg，野生型对照：18.0mg；
种子大小结果：CL-TRUNC-1：26.4mg，CL-TRUNC-6：23.9mg，转空载体对照：18.1mg，野生型对照：18.0mg；(图3).
结果表明，转p2300-35S-CL-TRUNC植株(CL-TRUNC-1和CL-TRUNC-6)的种子、花、叶片大小明显增加。与对照相比，CL-TRUNC过量表达的两个转p2300-35S-CL-TRUNC植株种子千粒重比野生型增加了32％和45％，6号株系种子数量也明显增加。这些数据说明，CL-TRUNC过量表达能明显提高植物的种子大小和生物产量。
实验二设3次重复，结果均一致。
实施例2、CL-TRUNC蛋白的酶活性检测
一、目的基因的克隆
根据实施例1获得的CL-TRUNC cDNA序列、原始的野生型基因序列及载体pMal-c2(购自NEB公司)和Pet28a适宜的酶切位点设计引物扩增CL-TRUNC和原始基因CL1。根据已经公开发表的信息设计引物扩增酶切底物蛋白基因UBP10。引物序列如下：
引物3：5′-CGggatccGAGCTCCTCCGATCCAACTTG-3′(上游引物，下划线部分碱基为BamHI识别位点)
引物4：5′-GCgtcgacATCAAGCCGCTGAAAGAAGT-3′(下游引物，下划线部分碱基为SalI识别位点)
引物5：5′-GCgtcgacTTCCCTCCTCCATCTGGTAA-3′(下游引物，下划线部分碱基为SalI识别位点)
引物6：5′-ggaattccatATGCAGATCTTTGTTAAGAC-3′(下游引物，下划线部分碱基为NdeI识别位点)
引物7：5′-cggaattcctaTTAAGCATAACAGAGACGAG-3′(下游引物，下划线部分碱基为EcoRI识别位点)
提取拟南芥Col-0的总RNA并反转录产生cDNA(CL1为野生型基因，CL-TRUNC为突变基因)，以其为模板，分别以如下引物对进行PCR扩增：引物3/引物4、引物3/引物5、引物6/引物7；反应结束后对PCR产物进行纯化，再测序。结果显示：引物3/引物5扩增得到2223bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，记作CL-TRUNC；引物3/引物4扩增得到2394bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，记作CL1；引物6/引物7扩增得到1395左右的片段，其核苷酸序列如Genbank accession numberNM_001084884所示已知的UBP10编码序列(www.Arabidopsis.org，At4g05320)，记作UBQ10。
二、重组载体的构建
载体pMal-c2购自NEB公司，货号为N8110S。
将CL-TRUNC用限制性内切酶BamHI和SalI进行双酶切，再与经BamHI和SalI酶切的pMal-c2连接，将连接产物转化大肠杆菌，抗性筛选培养，挑取单克隆，将单克隆进行液体培养，提取质粒进行测序，结果在载体pMal-c2的BamHI和SalI酶切位点间插入的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示(沿着从BamHI到SalI的方向)，表明构建的重组表达载体正确，将鉴定表明含有CL-TRUNC的正确的重组表达载体命名为pMal-c2-CL-TRUNC；
基于上述同样的方法，构建得到含有CL1的正确的重组表达载体，命名为pMal-c2-CL1。
基于上述相似的方法，构建得到含有UBQ10的正确的重组表达载体命名为pET28a-UBQ10；不同的是用到的限制性内切酶为NdeI和EcoRI，出发载体为pET28a。
三、重组菌株及供转化菌株的获得
将步骤二中得到的重组表达载体pMal-c2-CL-TRUNC、pMal-c2-CL1及pET28a-UBQ10转化大肠杆菌BL21，筛选转入了pMal-c2-CL-TRUNC、pMal-c2-CL1及pET8a-UBQ10的大肠杆菌BL21，将含有pMal-c2-CL-TRUNC、pMal-c2-CL1及pET28a-UBQ10的大肠杆菌BL21命名为BL-pMal-c2-CL-TRUNC、BL-pMal-c2-C1和BL-pET28a-UBQ10。
将BL-pET28a-UBQ10菌株制作成感受态细胞。把pMal-c2-CL-TRUNC和pMal-c2-CL1重组表达载体分别转化到BL-pET28a-UBQ10感受态细胞中，筛选得到共转化pMal-c2-CL-TRUNC和pET 28a-UBQ10，以及pMal-c2-C11和pET 28a-UBQ10的BL21菌株，分别命名为BL-CL-TRUNC-UBP10和BL-CL1-UBP10。
四、MBP-CL-TRUNC和MBP-CL1融合蛋白的获得
将步骤三中得到的大肠杆菌BL-CL-TRUNC-UBP10和BL-CL1-UBP10接种于LB培养基，挑选单克隆在37℃摇培过夜，第二天按照1/100转接到LB培养基中，摇菌培养至OD600为0.5时候，加入终浓度为1毫摩尔/升IPTG诱导，继续培养3小时，收集菌体，取部分裂解后上样SDS-PAGE胶电泳，考马斯亮蓝染色后分析。按照pMal-c2载体说明书纯化CL-TRUNC和CL1蛋白。
根据电泳迁移速率结果表明，诱导培养后的BL-CL-TRUNC-UBP10和BL-CL1-UBP10菌体纯化得到的是MBP-CL-TRUNC和MBP-CL1融合蛋白(图1A)。
图1中A第1条和第2条泳道分别为CL1蛋白和CL-TRUNC蛋白在E.coli中诱导表达模式。
五、CL-TRUNC的去泛素化酶活性的功能检测
(1)挑选共转化菌BL-CL-TRUNC-UBP10、共转化菌BL-CL1-UBP10、对照菌的单克隆，分别接入1ml含有表达载体对应的抗生素的LB培养基，37℃震荡培养过夜；
(2)取50μl过夜培养物接入5ml含相应抗生素的LB培养基，28℃震荡培养至对数中期(OD600值约0.6)
(3)加入IPTG至终浓度0.8mmol/L，28℃继续震荡培养3小时；
(4)将适量菌液加入蛋白上样缓冲液煮沸变性上样，SDS-PAGE电泳，转膜，用Ubiquitin抗体Western blotting杂交检测。
结果如图1B所示，在共转化CL-TRUNC蛋白和UBP10的时候，UBP10被明显切割，产生了较强的单泛素蛋白条带(泳道3)，而在共转化cl1蛋白与UBQ10的时候，没有产生单泛素条带(泳道4)。这说明cl1的点突变致使最后一个内含子编码的蛋白序列被删除的确影响了自身的酶活性。泳道1为pMal-c2空载体和UBP10共转化对照，泳道2为pMal-c2空载体单独转化对照。
上述结果表明，CL-TRUNC的去泛素化酶活性与野生型CL1蛋白有明显差异，比CL1相比明显提高。
实施例2包括两个部分，一是野生型CL1和突变CL-TRUNC的蛋白表达验证，证明蛋白的表达和大小与预期相符，为在植物中鉴定CL-TRUNC蛋白的表达提供参考依据。二是通过与已知的野生型CL1蛋白去泛素化酶活性(UBP10为酶切底物)进行比较，表明突变后CL-TRUNC蛋白与野生型CL1蛋白功能有所不同。
Claims (10)
1.一种蛋白，是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因是SEQ ID NO：2所示DNA分子。
4.扩增权利要求2或3所述编码基因全长的引物对；所述引物对中的一条引物序列如SEQ ID NO：4所示，所述引物对中的另一条引物序列如SEQ ID NO：5所示。
5.权利要求1所述蛋白作为去泛素化酶的应用。
6.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在表达载体pCAMBIA2300-35S的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。
8.一种培育生物量提高的植物的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述蛋白的编码基因导入出发植物，得到与所述出发植物相比生物量提高的目的转基因植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述生物量提高为如下1）-6）中的至少一种：
1）种子千粒重增加；
2）种子数量增加；
3）株高增加；
4）叶片面积增加；
5）花瓣面积增加；
6）单个种子重量增加；
所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述权利要求1所述蛋白的编码基因是通过权利要求6或7所述重组表达载体导入的；所述双子叶植物为拟南芥。
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