CN104497111B - 一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122及其编码基因和应用。一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。编码该小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供了一种新的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122及其编码基因。通过基因工程的方法将本发明提供的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122编码基因转入小麦中，可以提高小麦的千粒重。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可在作物育种中应用。

Description

一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122及其编码基因和应用。

背景技术

小麦是世界上最主要的粮食作物之一，其提供的热量占人类所需总热量的17%以上(Khush et al.2003)，养活了大约40%的全球人口(Gupta et al.2008)。不断提高小麦产量是世界范围内小麦育种的最基本目标。

富含脯氨酸的蛋白质(proline‐rich proteins，PRPs)代表一类富含proline(Pro‐)和hydroxyproline(Hyp‐)的结构蛋白，这类蛋白质在双子叶植物如大豆、胡萝卜和紫花苜蓿及单子叶植物如玉米和小麦等植物中广泛存在，研究显示，它们在很多植物中表达，参与植物发育的不同方面.例如，种子发育，豆荚形成，早期结瘤等.PRPs基因的表达还受伤害、真菌、乙烯、细胞培养、干旱和光照影响，富脯氨酸类蛋白种类繁多，结构的多样性决定了功能的多样性，但对于它们的确切功能知之甚少，富脯氨酸类蛋白在种子发育过程中的功能还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122。

本发明的另一目的是提供该小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122的编码基因。

本发明的又一目的是提供编码基因的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该蛋白包含173个氨基酸，等电点为4.86，脯氨酸占35.3%。在NCBI网站上进行序列比对没有发现与该多肽链具有同源性蛋白序列公布，因此麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122是一类新的富脯氨酸类蛋白。

编码所述的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122的基因。

所述的编码权利要求1所述的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122的基因，优选核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

含有小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122编码基因的重组表达载体。

所述的重组表达载体，优选出发载体为任何一种可以引导外源基因在植物中超量表达的载体。

所述的重组表达载体，进一步优选将所述的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122编码基因插入PBI121表达载体PstI酶切位点所得。

本发明所述的编码小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122的基因在品种改良中的应用；优选所述的基因在提高小麦千粒重中的应用。

本发明所述的重组表达载体在品种改良中的应用；优选在提高小麦千粒重中的应用。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中超量表达的载体，将本发明所提供的富脯氨酸类基因Tazmh122导入植物细胞，可获得改变植物千粒重的转基因细胞系及转基因植株。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行筛选，可以对载体进行加工，如加入抗生素标记基因（如：潮霉素、卡那霉素和庆大霉素），加入抗生素标记基因之后的载体用于转化，可以在转化后的植物培养基中加入抗生素，抑制非转基因细胞系和植株的生长，有助于快速和有效的获得转基因植株。为了便于观察外源基因的表达，可以在载体中启动子和外源基因之间加入报告基因（GUS基因、GFP和荧火虫荧光素酶报告基因），构建报告基因和外源基因融合表达的载体，该载体用于遗传转化，可以通过观察报告基因的表达与否和表达量高低，推测外源基因在植物体内表达情况。为了转基因植物释放的安全性，也可以构建载体时不携带任何筛选标记基因，而在苗期进行PCR检测。含有本发明的Tazmh122表达载体可通过使用基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道，电击，显微注射，Ti质粒，Ri质粒或植物病毒等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化后的植物细胞培育成完整的植株。被转化的植株材料既可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，如：水稻、棉花、小麦、大豆、烟草、拟南芥、大麦、高粱、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等。

有益效果：

本发明提供了一种新的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122及其编码基因。通过基因工程的方法将本发明提供的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122编码基因转入小麦中，可以提高小麦的千粒重。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可在作物育种中应用。

附图说明

图1转基因小麦的PCR检测。

其中B、C、D、E为不同的转基因株系，Bobwhite表示进行转基因实验时的受体材料，为进行小麦遗传转化的常用基因型，阳性对照为携带有小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122编码基因的表达载体。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1Tazmh122蛋白的获得。

记录小麦品种望水白每穗小花开花时间，取开花后3天，10天的种子，取材后立即用液氮冷冻。取700mg冻存的种子，加入70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL10%三氯醋酸/丙酮振荡混匀、‐20℃沉淀1小时；4℃15,000g离心15min，沉淀重新悬浮于5mL冷丙酮中，‐20℃放置2小时；4℃15,000g离心15min，沉淀悬浮于80%的冷丙酮中，‐20℃放置1小时，离心去丙酮，将沉淀干燥成粉。按每mg干粉加入10μL裂解液（7M脲，2M硫脲，4%CHAPS，1%CA，0.3%蛋白酶抑制剂，50U/mL DNase I）的比例加入裂解液，4℃搅拌抽提15min后加入14mM的DTT；4℃再搅拌20min，然后35,000g离心10min，上清即为蛋白抽提液。将蛋白提取液进行等电聚焦后，进行SDS‐PAGE电泳。电泳缓冲液用Tris‐Glycine‐SDS缓冲液，温度设为17℃；先用2.5W/胶预电泳30min后，再用5W/胶电泳至溴酚蓝到玻璃板下缘为止。电泳结束后，取下凝胶进行银染。取一个分子量为18.045千道尔顿，等电点为4.86的蛋白点即为Tazmh122蛋白。

实施例2：编码Tazmh122蛋白的cDNA序列的获得。

对实施例1得到的蛋白点进行质谱分析获得其氨基酸组成信息，根据对应肽片段的EST用来搜索小麦EST数据库，得到了4条EST序列：BM135088.1，BJ250155.1，CN007768.1和BJ244353.1，将上述4条EST序列进行拼接，然后用MacVector软件设计引物P1，P1引物对如下：F-5'-ATGGCGGGTGGCAAAGCCGCTCTGC-3'（SEQ ID NO.3）；R：5'-CTAGACATTGGGCTTGTAGGCAGGC-3'（SEQ ID NO.4）。以望水白开花后3天的种子cDNA作为模板，用英俊公司的Trizol试剂盒提取小麦种子的总RNA，采用Promega公司的反转录试剂盒进行反转录，合成单链cDNA。用引物P1进行PCR扩增，扩增体系为25μL，包括5ng模板，F和R引物各5pmol，dATP,dTTP,dCTP和dGTP各5nmol，37.3nmol MgCl2,0.5单位的DNA聚合酶，1xPCR缓冲液。扩增的程序是：94℃变性3分钟；30个循环，94℃变性20秒，51℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后72℃延伸5分钟。通过PCR扩增，获得了包含开放读码框的522bp的核苷酸序列，将该核苷酸与T-载体在16℃连接30min，连接体系为10μL，包括T-载体1μL，PCR产物4μL，连接酶1μL，连接酶缓冲液1μL，ddH2O3μL。连接产物通过42℃热击40秒，转化到大肠杆菌细胞中，送至华大基因公司测序，所得序列如SEQ ID NO：1所示。该序列编码173个氨基酸，如SEQ ID NO：2所示，等电点为4.86。

实施例3：转Tazmh122基因小麦的千粒重得到提高。

以望水白开花后3天的种子cDNA作为模板，利用引物P2进行PCR扩增，P2引物对如下：F‐5'‐GTACCTGCAGATGAAGATGGGCCCGT‐3'（SEQ ID NO.5）；R‐5'‐TGCACTGCAGTCAAACCCCAAGTTTG‐3'（SEQ ID NO.6）。将扩增得到的PCR产物用限制性内切酶PstI进行酶切后，与经过同样限制性内切酶进行酶切的PBI121表达载体进行连接，获得由CaMV35S启动子启动的TaJRL2超量表达的质粒载体。构建好的载体通过热击法转化到DH5α大肠杆菌菌株中，通过含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行筛选，获得阳性克隆。参照1993年Weeks发表在Plant Physiol第102期1077‐1084页上的文章中的材料与方法，以幼胚短暂培养产生的可以较高频率再生出可育植株的愈伤组织为受体，采用基因枪法将Actin启动子控制下的Tazmh122基因导入小麦材料Bobwhite中，将基因枪转化后的愈伤放置于含有30mg/L G418的1/2MS培养基上进行筛选，剪取获得的再生苗叶片，提取DNA进行PCR检测，获得Tazmh122超量表达的转基因小麦。统计T3代转基因小麦和非转基因小麦千粒重数据。结果表明，以未进行转化的小麦材料Bobwhite为对照，转基因植株千粒重得到提高(表1)。

表1

表中，TGW1,TGW2,TGW3:千粒重的3个重复，B、C、D、E为不同的转Tazmh122基因株系。

Claims (8)

1.一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.编码权利要求1所述的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122的基因。

3.根据权利要求2所述的编码权利要求1所述的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于出发载体为任何一种可以引导外源基因在植物中超量表达的载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于将所述的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122编码基因插入PBI121表达载体PstI酶切位点所得。

7.权利要求2所述的基因在提高小麦千粒重中的应用。

8.权利要求4~6中任一项所述的重组表达载体在提高小麦千粒重中的应用。