CN115747225B - 一种山新杨PdbGRF1基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种山新杨PdbGRF1基因及其应用，属于植物基因工程育种技术领域。为解决现有技术无法将山新杨的GRF转录因子应用于耐盐木本植物的培育的问题，本发明提供了一种山新杨PdbGRF1基因，其基因的cDNA序列如SEQ ID No：1所示。本发明提供的山新杨PdbGRF1基因可用于提高植物耐盐性或选育耐盐转基因植物。构建山新杨PdbGRF1基因的过表达载体，通过农杆菌介导法获得稳定转化的山新杨过表达PdbGRF1株系，通过盐胁迫下表型及相关生理指标测定结果证实，过表达PdbGRF1基因明显提高了山新杨的耐盐能力，因此将山新杨PdbGRF1基因用于选育耐盐转基因植物具有非常重要的应用前景。

Description

一种山新杨PdbGRF1基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程育种技术领域，尤其涉及一种山新杨PdbGRF1基因及其应用。

背景技术

植物为了适应逆境胁迫，进化出了由多基因参与的多种代谢途径和调控机制。其中，转录因子能够与功能基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合调控多个功能基因的表达，从而参与植物对逆境胁迫的响应。GRF(growth regulating factor)作为植物体内的一类独有转录因子，其蛋白N端包含QLQ，即Glu-Leu-Glu：谷氨酰胺，亮氨酸和谷氨酰胺，和WRC，即Trp-Arg-Cys：色氨酸，精氨酸和半胱氨酸两个保守结构域。QLQ结构域与酵母中SWI2/SNF2蛋白的N端区域极为相似，这一区域可结合SNF11形成染色质重塑复合物。随着研究的不断深入，发现QLQ结构域可以与GRF互作因子(GIF)的SNH结构域相互作用，从而行使转录激活功能。WRC结构域由一个功能性核定位信号区和一个能与DNA结合的锌指结构组成，该位点类似于Cys-Cys-Cys-His，参与DNA结合。GRF蛋白序列C端则是富含酸性氨基酸的转录激活域。由于蛋白与蛋白之间互作、识别及结合DNA的过程具有灵活多变的特性，故其作用机制多样。

已有研究表明GRF蛋白在植物中参与很多生理和生化过程，如调节叶片发育，叶片大小，根生长等等。如，拟南芥中，AtGRF1、AtGRF2和AtGRF3等基因的过表达会引起一系列生长表型的变化，尤其能促进拟南芥叶片和子叶的生长。在拟南芥中，AtGRF5能与AtGIF1形成大分子复合物通过促进和/或维持叶原基的细胞增殖活性而形成适当的叶片大小和形状；在杨树中PpnGRF5与PpnGIFs蛋白形成功能复合体通过抑制下游PpnCKX1基因的表达，导致细胞分裂素的积累，增强了顶芽和幼叶细胞分裂与扩张，进而提高杨树叶片的生长和扩展。

同时，也发现GRF蛋白参与了多种防御反应和胁迫反应。拟南芥中GRF基因的表达可通过被miR396调控，来抵抗高盐、干旱、低温和UV-B辐射的伤害。番茄中，SlGRF基因的表达不仅能在高盐、干旱、高温和低温处理下被显著诱导，还能在赤霉素、脱落酸和茉莉酸处理下显著上调，表明SlGRF可能参与植物随非生物胁迫的响应。

随着研究的不断深入，发现GRF蛋白的功能越来越多，在不同的物种甚至同一物种中，结构相似的GRF蛋白在调控方式和功能上也可能存在显著的差异。如在拟南芥中，AtGRF5除了能与AtGIF1形成大分子复合物通过促进和/或维持叶原基的细胞增殖活性正向调控叶片的大小；还能与DELLA互作通过GA通路，调控植物的叶片生长和根的伸长、发育进而参与寒冷刺激响应。此外与AtGRF5蛋白结构相似的小麦GRF4能与GIF1形成融合蛋白，从而极大增强小麦的再生效率和速度。

山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)为以山杨为母本，新疆杨为父本的杂交子代，具有树干通直，树姿秀丽整洁美观，生长速度快，不飞絮等优良特点。目前对山新杨的GRF转录因子的耐盐功能了解较少，尚未得到其耐盐机理，因此还无法将其应用于培育耐盐能力优良的木本植物。

发明内容

为解决现有技术无法将山新杨的GRF转录因子应用于耐盐木本植物的培育的问题，本发明提供了一种山新杨PdbGRF1基因及其应用。

本发明的技术方案：

一种山新杨PdbGRF1基因，所述山新杨PdbGRF1基因的cDNA序列如SEQ ID No：1所示。

进一步的，所述cDNA序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种所述山新杨PdbGRF1基因的植物过表达载体。

一种含有所述植物过表达载体的重组基因工程菌。

山新杨PdbGRF1基因在提高植物耐盐性或选育耐盐性转基因植物中的应用。

进一步的，所述应用包括构建含有山新杨PdbGRF1基因的植物过表达载体，将所构建的植物过表达载体转化到木本植物中，培育得到耐盐转基因木本植物。

进一步的，所述木本植物为林木。

进一步的，所述林木为杨树或白桦。

进一步的，所述应用包括构建含有山新杨PdbGRF1基因的植物过表达载体，将所构建的植物过表达载体转化到草本植物中，培育得到耐盐转基因草本植物。

进一步的，所述草本植物为拟南芥或烟草。

本发明的有益效果：

本发明提供的山新杨PdbGRF1基因可用于提高植物耐盐性或选育耐盐转基因植物。构建山新杨PdbGRF1基因的过表达载体，通过农杆菌介导法获得稳定转化的山新杨过表达PdbGRF1株系，通过盐胁迫下表型及相关生理指标测定结果证实，过表达PdbGRF1基因明显提高了山新杨的耐盐能力，因此将山新杨PdbGRF1基因用于选育耐盐转基因植物，尤其是选育耐盐转基因林木具有非常重要的应用前景。

附图说明

图1为PdbGRF1基因保守区预测图；

图2为PdbGRF1蛋白与其他物种GRF蛋白的多序列比对图；

图3为PdbGRF1蛋白的进化树分析图；

图4为PdbGRF1基因的组织特异性表达模式分析图；

图5为不同NaCl胁迫时间下PdbGRF1基因在叶、茎和根的表达模式分析图；

图6为PdbGRF1-GFP融合蛋白与GFP构建示意图；

图7为PdbGRF1-GFP亚细胞定位结果；

图8为PdbGRF1转录激活活性分析图；

图9为山新杨过表达PdbGRF1株系选育流程图；

图10为DNA水平检测山新杨过表达PdbGRF1株系结果图；

图11为转录水平检测山新杨过表达PdbGRF1株系结果图；

图12为NaCl胁迫下野生型和过表达PdbGRF1株系的表型照片；

图13为NaCl胁迫下野生型和过表达PdbGRF1株系SOD含量的测定分析图；

图14为NaCl胁迫下野生型和过表达PdbGRF1株系POD含量的测定分析图；

图15为NaCl胁迫下野生型和过表达PdbGRF1株系脯氨酸含量的测定分析图；

图16为NaCl胁迫下野生型和过表达PdbGRF1株系H₂O₂含量的测定分析图；

图17为NaCl胁迫下野生型和过表达PdbGRF1株系MDA含量的测定分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例提供了山新杨PdbGRF1基因的克隆与序列分析方法与结果。

通过山新杨转录组与BLASTX联合分析，筛选获得具有完整ORF的PdbGRF1基因，进一步根据植物过表达载体pROKII的多克隆位点，在PdbGRF1基因的5’和3’端分别引入SmaI、KpnI酶切位点，引物序列见表1。以山新杨cDNA为模板进行PCR，扩增目的条带。

表1

PCR反应体系见表2：

表2

对PCR产物进行凝胶电泳检测。用胶回收试剂盒回收大小正确的DNA片段，并与酶切后pROKII载体连接。混匀后16℃温育12～16h后转化Top10大肠杆菌感受态。通过菌液PCR及测序后检测分析，获得的山新杨PdbGRF1基因编码区长1833bp，编码如SEQ ID NO：2所示的610个氨基酸。

利用PROSITE对PdbGRF1蛋白序列进行预测，发现其含有如图1所示的WRC和QLQ两个典型GRF蛋白家族保守结构域。

对山新杨GRF蛋白和8个其他物种的GRF蛋白通过BioEdit软件进行多序列比对，所选择的8个物种分别为：

PaGRF：银白杨(Populus alba)、PtrGRF：毛果杨(Populus trichocarpa)、

PeGRF：胡杨(Populus euphratica)、SsGRF：簸箕柳(Salix suchowensis)、

TcGRF：可可树(Theobroma cacao)、HuGRF：哥伦比亚锦葵(Herrania umbratica)、HbGRF：橡胶树(Heveabrasiliensis)、MeGRF：木薯(Manihot esculenta)。

结果如图2所示，所有GRF蛋白的WRC和QLQ结构域都具有较高的相似性，说明这两个结构域在进化的过程中非常稳定和保守。

为进一步明确山新杨PdbGRF1蛋白与其他物种GRF蛋白之间的进化关系，构建了山新杨PdbGRF1蛋白、拟南芥AtGRF蛋白与上述8个其他物种GRF蛋白的系统进化树。进化树分析结果如图3所示，山新杨PdbGRF1基因与银白杨GRF基因的同源性相对较高。系统进化树构建所选的8个物种与进化树所选8个物种一致。

实施例2

本实施例提供了PdbGRF1基因表达模式分析结果。

利用实时荧光定量RT-PCR对PdbGRF1基因的组织特异性进行分析：首先利用RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司BioTeke)，提取山新杨各组织的总RNA。cDNA反转录使用miRNAFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech)试剂盒，操作过程按照试剂盒说明书进行。将反转录产物稀释10倍，用作qRT-PCR反应模板。选择山新杨Pdbactin(基因登录号：ON357379)作为内参基因。内参和PdbGRF1基因的qRT-PCR引物见表3。为了确保实验结果的重现性，qRT-PCR进行了3次独立的实验。

表3

结果如图4所示，PdbGRF1基因在根(Gs)、幼茎(YSs)、成熟茎(MSs)、幼叶(YLs)、成熟叶(MLs)中都有不同程度的表达。PdbGRF1基因表达量在YSs中最低，故设定其为参照量1，用作计算其他组织中PdbGRF1相对表达量。PdbGRF1在YLs中的表达量最高，为对照(YSs)的3.89倍，其次在在Gs中，是对照(YSs)的1.57倍。

图5为不同NaCl胁迫时间下PdbGRF1基因在叶、茎和根的特异性表达模式分析图；如图所示，在盐胁迫下，根中PdbGRF1基因在全部胁迫时间的表达均显著上调，胁迫24h时表达量最高，为对照(0h)的257.33倍。在茎中，PdbGRF1的表达在除6h时显著下调，为对照的2.36％外，其他时间的表达均显著上调或无明显变化。在胁迫的整个过程中，PdbGRF1在叶中的表达呈显著下调趋势，在24h时表达量最低，为对照的10.76％。以上结果表明PdbGRF1主要在YLs中表达，且受盐胁迫诱导，显示PdbGRF1可能参与山新杨对盐胁迫的调控。

实施例3

本实施例提供了PdbGRF1转录因子转录激活活性分析结果。

首先根据PdbGRF1基因及表达载体pBI121-GFP的序列特性，设计出包含同源序列片段的植物表达载体引物序列，如表4所示。以pROKII-PdbGRF1质粒为模板，PCR扩增获得PdbGRF1基因片段。

表4

PCR反应体系见表5：

表5

反应程序：

将获得的PdbGRF1基因片段与SmaI单酶切后pBI121-GFP片段连接，转化。使用pBI121-GFP载体引物进行菌液PCR检测，挑选条带正确的菌液送测序，测序结果比对无误的菌液命名为pBI121-PdbGRF1-GFP。

将PdbGRF1-pBI121-GFP与pBI121-GFP空载通过基因枪法瞬时转入洋葱表皮细胞。

具体操作如下：

1、DNA微弹的制备：

1)称取30mg钨粉(Bio-Rad)置1.5mL Eppendorf管中；

2)加入1mL 70％乙醇，充分涡旋15min，静置1min，10,000rpm离心10s，使钨粉沉淀，弃上清；

3)加入1mL无菌水，振荡1min，10,000rpm离心10s；

4)弃上清，加入无菌水1mL，充分震荡1min，震荡结束后静置1min；

5)重复步骤4两次；

6)在微载体沉淀中加入500μL无菌的50％甘油，充分震荡混匀；

7)取50μL制备好的钨粉颗粒混合液于1.5mL离心管中，依次加入5-8μL质粒DNA(1μg/μL)、50μL CaCl₂(2.5M)、20μL亚精胺(0.1M)的，每加完一种震荡2-3s；

8)震荡结束后，冰上静置10min，10,000rpm离心10s，弃上清；

9)加140μL 70％乙醇，混匀，瞬时离心2s，弃上清；

10)向管内加入140μL无水乙醇，混匀，瞬时离心2s，弃上清；

11)向管内加入48μL无水乙醇，混匀，即得到DNA微弹。

2、洋葱表皮受体的制备：

取新鲜洋葱的第4～7层鳞茎内表皮，并用刀片将其分切割为2～3cm2的小块，平铺于1/2MS固体培养基平板中央，每盘大约铺4-5片，暗培养12h备用。

3、瞬时转化洋葱表皮：

1)将载体膜安装在载体膜支架上，分别取5μL重悬好的DNA微弹PdbGRF1-pBI121-GFP和阴性对照pBI121-GFPP均匀地滴在载体膜中央约1cm2范围内，放置2～3min，使乙醇完全挥发；

2)将可裂膜(1350psi)在70％异丙醇中沾1s消毒，放置于可裂膜固定帽中，然后安装到基因枪相应位置上；

3)依次放入终止屏和载体膜，并安装到基因枪对应位置上；

4)将铺有洋葱受体的平板置于基因枪支架上，然后进行轰击。

5)用封口膜将培养皿封好，暗培养24～48h，使用激光共聚焦显微镜，在激发波长488nm和发射波长525nm下观察并拍照。

结果如图6、图7所示，PBI121-GFP在洋葱表皮细胞膜和细胞核中均有绿色荧光信号；而PdbGRF1-pBI121-GFP只在细胞核中有荧光信号，说明PdbGRF1蛋白仅在细胞核中表达。

为了探究PdbGRF1是否具有转录激活活性，构建了pGBKT7-PdbGRF1重组载体，通过酵母双杂交实验验证PdbGRF1蛋白的转录激活活性，并对其转录激活核心区进行进一步鉴定。根据PdbGRF1基因和pGBKT7载体的序列特性，将SmaI(CCCGGG)酶切位点引入引物序列中，如表6所示。

以pROKII-PdbGRF1质粒为模板，PCR扩增PdbGRF1。此外，为进一步探究PdbGRF1蛋白的转录激活核心区，将其分成不同长度的10个片段(1：1-263aa；2：150-610aa；3：1-149aa；4：150-263aa；5：264-610aa；6：264-511aa；7：380-610aa；8：264-379aa；9：380-511aa；10：512-610aa)，引物序列引入SmaI酶切位点，以pGBKT7-PdbGRF1质粒为模板进行PCR扩增。回收纯化PCR产物，将其与SmaI酶切后的pGBKT7线性载体相连接，连接产物转化Top10，挑取单克隆菌落PCR检测后送生物公司测序，保存测序结果正确菌种并提取质粒。

表6

将成功获得的pGBKT7-PdbGRF1及pGBKT7-dC1-10转化到酵母细胞Y2H中，分别涂布于SD/-Trp和SD/-Trp/-His/X-α-Gal筛选培养基上，30℃倒置培养3-5d，观察酵母的生长和在SD/-Trp/-His/X-α-Gal的培养基上是否变蓝来确定PdbGRF1的转录激活活性及其区域。

结果如图8所示，PdbGRF1蛋白全长序列能在SD/-Trp/-His/X-a-Gal培养基上生长并变蓝，说明PdbGRF1蛋白具有转录激活活性。为了进一步确定PdbGRF1蛋白所具有的转录激活核心区，将PdbGRF1蛋白序列分段，分别构建到pGBKT7载体上，验证各个片段(dC1-dC10)是否包含PdbGRF1蛋白的转录激活核心区域。结果表明pGBKT7-dC9(380-511aa)转化后的酵母细胞可以在SD/-Trp、SD/-Trp/-His培养基上正常生长且能在SD/-Trp/-His/X-a-Gal筛选培养基上产生蓝斑。表明PdbGRF1蛋白的转录激活核心区位于380-511aa区段。以上结果表明PdbGRF1转录因子具有转录激活活性，且转录激活核心区位于380-511aa区段。

实施例4

本实施例提供了过表达PdbGRF1山新杨株系获得的方法。

以山新杨叶片为外植体，利用农杆菌介导的叶盘法，将过表达pROKII-PdbGRF1农杆菌转入山新杨，具体步骤如下：

(1)取山新杨无菌组培苗鲜嫩的叶片，将其在叶片基部主叶脉和顶部切出伤口，平铺于分化培养基上，预培养1天，作为山新杨遗传转化的外植体；

(2)将pROKII-PdbGRF1农杆菌菌株划线活化培养，挑取单菌落于50mL液体LB摇至OD₆₀₀为0.5-0.7，3000g离心10min收集菌体后用1/2MS+120μMAS+0.02％Tween液体培养基重悬菌体至OD₆₀₀为0.4，作为山新杨遗传转化的侵染液；

(3)于侵染液中浸泡山新杨外植体5min，期间不时轻轻晃动；

(4)浸泡结束后，取出外植体，用无菌滤纸吸干多余液体，展开平铺于共培养固体培养基，避光培养48h；

(5)暗培养结束后，将外植体转移至筛选固体培养基，于组培室下进行筛选培养；

(6)待叶片的伤口处分化出抗性芽，将其转移至新的筛选固体培养基；

(7)待抗性芽长到大约3cm时，将其放至筛选生根培养基上，使其壮苗生根，即得到转基因山新杨阳性植株。

流程如图9所示，在含有25mg/L Kan的分化培养基中诱导抗性芽的形成，然后在含有抗性的生根培养基中继续筛选获得PdbGRF1过表达转基因山新杨抗性苗。

从获得的抗性株系中选择2个在生根培养基上长势良好的PdbGRF1过表达株系，利用PCR方法，使用pROKII-F/R引物对其基因组DNA进行检测，结果如图10所示，阴性对照PCR检测后无目的条带，而过表达株系则在2000bp左右发现单一目的条带，条带大小符合预期。

为进一步鉴定过表达PdbGRF1山新杨株系，利用qRT-PCR对其转录水平进行检测，结果如图11所示，PdbGRF1基因在OE1和OE2中的表达量显著上调，分别为对照的6.28倍和22.15倍。综上结果显示，本实施例成功获得了2个过表达PdbGRF1山新杨株系。

实施例5

本实施例提供了过表达PdbGRF1山新杨株系耐的盐能力分析结果。

选择长势一致、生长状态良好的过表达和野生型山新杨土培苗，用200mM NaCl溶液处理5天。结果如图12显示，野生型山新杨的叶片枯黄卷曲，出现叶片大量脱落的现象，其生长受到了严重抑制。而与野生型相比，过表达株系的生长受到的抑制较轻，仅有少量叶片边缘发黄卷曲，并出现轻微的脱落现象。

超氧化物歧化酶SOD，POD，能够清除ROS，并在机体的氧化还原平衡过程中扮演重要角色，可作为衡量植物抗逆性的生理指标。

如图13和图14所示，正常条件下，过表达和野生型植株的SOD，POD活性差异不显著。但经盐胁迫处理后，所有植株的SOD，POD活性均有所提高。与野生型相比，过表达株系(OE1、OE2)的SOD，POD活性显著增强，分别为对照的1.06倍、1.13倍和1.02倍、1.05倍。说明PdbGRF1基因的过表达能够正向调控转基因山新杨体内SOD活性，通过增强ROS的清除能力来减少高盐环境对植株损伤，从而提高植株的耐盐性。

脯氨酸具有维持生物膜的稳定性并清除细胞中自由基的功能。当植物遭受渗透胁迫伤害时，会增加脯氨酸的含量。因此，可通过脯氨酸的含量的变化来反映植物的抗逆能力。为了探究过表达PdbGRF1基因植株在盐胁迫下的生理变化是否与脯氨酸含量有关，比较了200mM NaCl胁迫下过表达和野生型山新杨的脯氨酸含量。如图15所示，在正常条件下，野生型和过表达株系脯氨酸的含量无明显差异。但在盐胁迫下，过表达株系(OE1、OE2)的脯氨酸含量明显高于野生型，分别为对照的1.49倍、1.89倍。结果表明，过表达PdbGRF1山新杨可以通过增加脯氨酸含量，提高对高盐环境的抵抗能力。

植物在受到逆境胁迫伤害时，会积累大量的H₂O₂。因此，植物体内H₂O₂的含量，可作为判断植物抗逆性的重要依据之一。为研究盐胁迫下过表达植株体内H₂O₂的积累程度，分析比较了200mM NaCl处理下过表达PdbGRF1株系(OE1、OE2)和野生型山新杨的H₂O₂含量。如图16所示，未经胁迫处理时，2个转基因株系和野生型的H₂O₂含量无明显差异。盐胁迫后，OE株系的H₂O₂含量明显低于野生型，分别为对照的63％和58％。上述结果表明PdbGRF1基因的过表达能使盐胁迫下转基因山新杨体内的H₂O₂含量明显减少，从而提高其在高盐环境下的存活能力。

丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标。植物在遭受不良环境带来的伤害时，会导致MDA的含量发生变化。因此，MDA通常被用来判断植物的抗逆性。如图17所示，在正常条件下，野生型和2个过表达株系的MDA含量相差无几。经NaCl处理后，野生型植株的MDA含量显著增加，2个OE株系的MDA含量虽略有增加，但相比于野生型增加幅度较小，仅为对照的66％、56％。由此可知，盐胁迫下，过表达PdbGRF1山新杨的细胞膜脂过氧化程度较低，受到的损伤较轻，耐盐能力较强。

综上结果显示，过表达PdbGRF1明显提高了山新杨的耐盐能力，因此将该基因用于制备转基因植物尤其是转基因林木具有非常重要的应用前景。

Claims (2)

1.山新杨PdbGRF1基因在提高植物耐盐性或选育耐盐性转基因植物中的应用，其特征在于，所述山新杨PdbGRF1基因的cDNA序列如SEQ ID No：1所示，所述植物为山新杨。

2.如权利要求1所述山新杨PdbGRF1基因的应用，其特征在于，所述应用包括构建含有山新杨PdbGRF1基因的植物过表达载体，将所构建的植物过表达载体转化到山新杨中，培育得到耐盐转基因山新杨。