CN110862998A

CN110862998A - 紫苏fad8基因及其在提高植物不饱和脂肪酸含量和抗寒性能中的应用

Info

Publication number: CN110862998A
Application number: CN201911266687.2A
Authority: CN
Inventors: 张涛; 郭楠; 陆俊杏; 管丽
Original assignee: Chongqing Normal University
Current assignee: Chongqing Normal University
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2020-03-06

Abstract

本发明提供了紫苏FAD8基因及其在提高植物不饱和脂肪酸含量和抗寒性能中的应用，属于基因工程技术领域，所述紫苏FAD8基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。在植物体内过表达所述紫苏FAD8基因，能够显著提高植物不饱和脂肪酸含量以及植物的抗寒性能；过表达所述紫苏FAD8基因的烟草中的CAT、POD、SOD的活性显著高于野生型烟草；过表达所述紫苏FAD8基因的烟草中亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸的含量显著提高；抗寒性能显著提高。

Description

紫苏FAD8基因及其在提高植物不饱和脂肪酸含量和抗寒性能中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及紫苏FAD8基因及其在提高植物不饱和脂肪酸含量和抗寒性能中的应用。

背景技术

紫苏(Perilla frutescens(L.)Britt.)属唇形科紫苏属，是油料作物中的特种油料，适应性强，适于在西北大面积种植，在我国种植应用约有近2000年的历史，是国家卫生部首批颁布的食、药两用的60种作物之一。紫苏富含ALA，是目前发现的ALA含量最高的植物资源，具有较好的应用前景。

植物的生长环境对植物生长发育有很大的影响。植物受非生物胁迫是不可避免的，提高植物抗逆性是适应环境的最佳方法。植物亚麻酸是由ω-3脂肪酸脱氢酶催化亚油酸而来，脂肪酸脱氢酶以基因家族的形式存在，是一种膜结合蛋白，参与生物与非生物防御反应，为脂肪酸合成途径的关键酶，是植物油脂基因工程中的目标酶之一。ω-3脂肪酸脱氢酶可以提高植物膜脂不饱和指数，调控膜脂流动性并提高植物的抗逆性。ω-3脂肪酸脱氢酶共有三种基因编码：FAD3、FAD7、FAD8。目前尚没有紫苏ω-3脂肪酸脱氢酶基因FAD8在提高抗寒性能中的应用研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种紫苏FAD8基因及其在提高植物不饱和脂肪酸含量和抗寒性能中的应用；在植物体内过表达所述紫苏FAD8基因，能够显著提高植物不饱和脂肪酸含量以及植物的抗寒性能；本发明提供的应用对于进一步通过油料作物遗传改良生产植物ALA具有重要的理论和实际意义，同时为利用基因工程提高其它作物品种的低温抗性提供了理论依据。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种紫苏FAD8基因，所述紫苏FAD8基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1 所示。

本发明提供了一种重组载体，包括所述的紫苏FAD8基因和初始载体。

本发明提供了一种重组菌株，包括所述的紫苏FAD8基因和初始菌株。

优选的，所述初始菌株为大肠杆菌或根癌农杆菌。

本发明提供了所述的紫苏FAD8基因、所述的重组载体或所述的重组菌株在提高植物不饱和脂肪酸含量中的应用。

本发明提供了所述的紫苏FAD8基因、所述的重组载体或所述的重组菌株在提高抗寒性能中的应用。

优选的，所述植物包括紫苏和烟草。

优选的，在植物中过表达所述紫苏FAD8基因。

优选的，过表达所述紫苏FAD8基因植物的抗寒温度为5～12℃。

本发明的有益效果：本发明提供的紫苏FAD8基因编码区全长1317bp，有7个内含子，编码的氨基酸数目为438个，分子量为50013.2，等电点为9.13，为碱性氨基酸；所述FAD8基因编码的蛋白质含有36个带负电的氨基酸残基，45个带正电的氨基酸残基，脂肪系数为85.25，不稳定系数为38.43，为稳定蛋白质；细胞定位结果位于叶绿体中。过表达所述紫苏FAD8基因的烟草中的CAT、POD、SOD的活性显著高于野生型烟草；过表达所述紫苏FAD8基因的烟草中亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸的含量显著提高；抗寒性能显著提高。

附图说明

图1为紫苏茎总RNA(10℃处理2h、4h、6h；37℃处理2h、4h、6h)；

图2为FAD8基因cDNA全长电泳图；

图3为FAD8亲疏水性分析；

图4为FAD8跨膜结构预测；

图5为FAD8信号肽预测；

图6为FAD8亚细胞定位；

图7为紫苏FAD8基因的表达情况(a，b，c，d，e：差异极显著(P<0.01))；

图8为紫苏FAD8基因序列电泳图；

图9为双酶切pC2301M1DPB和重组质粒pGEm-T-FAD8(M：Marker；CK1： pC2301M1DPB质粒；1：双酶切的pC2301M1DPB质粒；CK2：重组质粒pGEm-T-FAD8； 2：双酶切重组质粒pGEm-T-FAD8)；

图10为大肠杆菌转化子中重组表达载体pC2301M1DPB-FAD8菌液PCR检测；

图11为PCR检测结果图，其中A：大肠杆菌转化子中提取的重组质粒 pC2301M1DPB-FAD8；B：pC2301M1DPB-FAD8(农杆菌GV3101)菌液PCR检测；

图12为农杆菌介导法转化的烟草；

图13为转基因植株的PCR鉴定(1-16：转基因烟草；17：野生型对照)；

图14为转基因烟草的定量分析；

图15为转基因烟草不同组织的GUS染色分析，其中A、B、C：转基因烟草的根、茎、叶；D、E、F：野生型对照的根、茎、叶；

图16为4℃低温胁迫下转基因烟草和野生型烟草可溶性蛋白含量变化；

图17为4℃低温胁迫下转基因烟草和野生型烟草游离脯氨酸含量变化；

图18为4℃低温胁迫下转基因烟草和野生型烟草丙二醛(MDA)含量变化；

图19为4℃低温胁迫下转基因烟草和野生型烟草过氧化氢酶(CAT)活性变化；

图20为4℃低温胁迫下转基因烟草和野生型烟草过氧化物酶(POD)活性变化；

图21为4℃低温胁迫下转基因烟草和野生型烟草超氧化物岐化酶(SOD)活性变化；

图22为转基因烟草和野生型烟草叶片脂肪酸含量。

具体实施方式

本发明提供了一种紫苏FAD8基因，所述紫苏FAD8基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1 所示。在本发明中，所述紫苏FAD8基因全长1317bp，有7个内含子，编码的氨基酸数目为438个，编码的氨基酸的具体序列如SEQ ID No.2所示，分子量为50013.2，等电点为9.13，为碱性氨基酸；所述FAD8基因编码的蛋白质含有36个带负电的氨基酸残基， 45个带正电的氨基酸残基，脂肪系数为85.25，不稳定系数为38.43，为稳定蛋白质；细胞定位结果位于叶绿体中。本发明中所述紫苏FAD8基因的核苷酸序列具体如下：

ATGGCGAGTTTCGTTATATCAGAATGTGGCTTGAAGCCACTTCCAAGAATCTAT CCCAAACCAAGAGCTGCCCAGCCTCTCTCGAGTTCTAATCTGAGATTTTCAAGAAC AAATCAACGGTTTAATTCTTCATTCTGTTCATCAACTGGGATTATTAAGGAACGGAAT TGGGCTTTGAGAGTGAGTGCCCCATTAAGAATTCAGCCAGTGGAAGAAGAGAACA GAGCGATAAACGGCGGCGAAGAATTCGACCCGGCGGCGCCGCCTCCGTTTAAGTTG TCCGATATAAAGGCAGCCATTCCGAAGCATTGTTGGGTGAAGGACCCATGGAGGTC TGTGAGCTATGTGGTGAGGGATGTGGTGGCGGTTTTTGGGATGGCGGCGGCGGCGG CCTATTTCAACAATTGGCTTGTTTGGCCTTTGTATTGGTTTGCTCAGAGCACCTTATT CTGGGCTCTCTTTGTTCTTGGCCATGACTGTGGTCATGGAAGCTTTTCAAACAACCC CAAGCTGAATAGTGTGTTTGGCCATCTTCTTCACTCTTCAATTCTGGTGCCCTACCAT GGATGGAGAATTAGCCATAGAACTCATCATCAGAACCATGGACATGTTGAGAATGAT GAATCTTGGCACCCGTTACCTGAGAAGATTTACAATAGCTTGGATAATAATACCAAG ATGTTGAGGTTCACATTGCCTTTCCCTATGTTGGCATACCCCTTTTATCTGTGGAGTA GAAGTCCCGGGAAGAAAGGCTCTCATTTCCACCCAGAGAGTGATTTGTTTGTGCCA AATGAGAGGAAAGACGTTATTACCTCAACAGTTTGTTGGACTGCAATGGCTGCATT GCTCGTAGGACTATCTTTTGTTATCGGTCCACTCCAGCTGCTCAAACTATACGGCGTT CCTTACTTGGGATTCGTAGCGTGGCTTGATCTTGTGACCTATTTGCATCACCACGGGCATGAAGATAAGCTCCCTTGGTACCGTGGAAAGGAATGGAGTTATCTGAGAGGGGGG CTCACGACACTTGATCGTGACTACGGATTGATCAACAACATCCACCATGACATAGGA ACTCATGTCATACACCACCTCTTCCCCCAAATCCCACACTACCATTTGATAGAAGCTA CTGAAGCAGCTAAGGGGGTATTAGGCAAGTACTACAGGGAGCCGAAAAAGTCGGGCCCTCTACCGTTACACTTGTTGGGAGACCTCCTGAGAAGCATGAAGAAGGATCACT ACGTGAGCGACACCGGCGACATTGTCTATTATCAGACAGATCCTCAGCTCAATGGA GGTCGCAAATCTTAG。

本发明还提供了一种重组载体，包括所述的紫苏FAD8基因和初始载体。在本发明中，所述初始载体优选为本领域常规的表达载体；在本发明具体实施过程中，所述初始载体优选为pC2301M1DPB质粒载体；在本发明中，将所述紫苏FAD8基因连接至所述pC2301M1DPB质粒载体的XbaI和SPeI酶切位点之间。在本发明中，优选的克隆所述紫苏FAD8基因后，将所述紫苏FAD8基因和pC2301M1DPB质粒载体进行双酶切后连接；本发明对所述双酶切和连接的具体步骤和参数没有特殊限定，采用本领域常规的双酶切和连接的步骤和参数即可。

本发明提供了一种重组菌株，包括所述的紫苏FAD8基因和初始菌株。在本发明中，所述初始菌株优选为大肠杆菌或根癌农杆菌。在本发明中，当所述初始菌株为大肠杆菌时，所述重组菌株用来进行紫苏FAD8基因的克隆；当所述初始菌株为根癌农杆菌时，所述重组菌株用来侵染植物，进行紫苏FAD8基因在植物体内的过表达。在本发明中，所述重组菌株优选的通过将上述重组载体转化到初始菌株中获得。在本发明中，所述转化优选为热激转化；所述初始菌株为感受态细胞；本发明对所述初始菌株的感受态细胞的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的感受态细胞制备方法即可；或者采用市售的感受态细胞即可。

本发明还提供了所述的紫苏FAD8基因、所述的重组载体或所述的重组菌株在提高植物不饱和脂肪酸含量和抗寒性能中的应用。本发明对所述植物的种类没有特殊限定，在本发明具体实施过程中，以紫苏和烟草为例。在本发明中，将所述紫苏FAD8基因在植物中进行过表达，能够提高植物不饱和脂肪酸含量和植物的抗寒性能。在本发明中，将所述紫苏FAD8基因转入植物中后，优选的对植物进行低温胁迫处理；所述低温胁迫处理的温度优选为8～12℃，更优选为10℃；所述低温胁迫处理的时间为1～6d。所述低温胁迫处理有利用提高所述紫苏FAD8基因的表达量，提高植物中不饱和脂肪酸的含量，同时能够增强植物的抗寒性能；在本发明中，过表达所述紫苏FAD8基因植物的抗寒温度优选为5～12℃，更优选为10℃。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

材料与方法

植物材料

紫苏(Perilla frutescens(L.))种子、美国烟草(Nicotiana tabacum)种子由重庆师范大学生命科学学院保存(市售购买)；紫苏的根、茎、叶、花蕾、果实等器官，采集后立即置于液氮中冷冻运输，然后保存于-80℃超低温冰箱中用于总RNA的提取。取T2代转基因烟草叶片，用于脂肪酸含量等研究与测定。

菌株和载体

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5a感受态购自大连TaKaRa生物工程有限公司，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，植物表达载体pCAMBiA1301、pC2301M1DPB等均为市售产品，由本实验组保存，TA克隆载体pGEm-T购自北京杰辉生物技术有限公司。

主要仪器设备

电热恒温鼓风干燥箱、高速冷冻离心机、超纯水仪、PCR仪、全温振荡培养箱、电泳仪、自动对焦凝胶成像分析仪、紫外可见分光光度计、超低温冰箱、台式高速离心机、 Bio-RadiQ5荧光定量PCR仪等。

主要试剂

5×TBE电泳缓冲液液，100mg/mL氨苄青霉素(Amp)，10mg/mL6-苄氨基嘌呤(6-BA)，10mg/mL萘乙酸(NAA)，100mmol/L乙酰丁香酮(AS)，50mg/mL卡那霉素(Kan)，250mg/mL 头孢霉素(Cef)，50mg/mL利福平(Rif)，50mg/mL潮霉素(Hyg)。

主要方法

(1)紫苏FAD8基因的克隆

紫苏总RNA的提取

采用Trizol法提取紫苏根、茎、叶总RNA(Trizol试剂盒购自TaKaRa生物有限公司)。

逆转录

采用大连大连TaKaRa生物工程有限公司RT Reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒对提取的RNA进行纯化和逆转录。

紫苏FAD8基因的克隆

以提取的紫苏cDNA分别为模板，设计引物克隆其全长基因。

(1)FAD8基因全长克隆引物：

Full-Fad8F：5’-ATGGCGAGTTTCGTTATATCAGAATGTG-3’(SEQ ID No.3)； Full-Fad8R：5’-GGGAAAAAGAGTTTCCCTTCAACAT-3’(SEQ ID No.4)。

(2)PCR反应

反应条件：94℃5min；94℃30sec；60℃30sec；72℃2min(30cycle)；72℃10min。反应结束后将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上检测分析，拍照并记录实验结果。

(3)胶回收：采用OMEGA公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行胶回收。

(4)目的片段与pGEm-T载体的连接。

(5)转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

(6)阳性克隆子的筛选与菌液PCR检测。在1％的琼脂糖凝胶电泳上检测PCR产物，挑选扩增片段分大小与预期大小一致的阳性克隆送上海英俊公司测序。

紫苏FAD8基因生物信息学分析

根据获得的FAD8cDNA序列，在NCBI中的ORFFinder中寻找最长的开放阅读框，并将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，应用Protparam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html)软件预测其相对分子质量、等电点、氨基酸数目等理化性质，应用在线分析软件(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)进行蛋白质疏水性分析，利用软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜区分析。根据软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测FAD8蛋白的信号肽，利用在线软件(http://psort.hgc.jp/form2.html)进行蛋白的亚细胞定位分析，应用软件SSpro 4.0(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/)预测蛋白质二级结构，采用ClustalX多重序列比对后应用软件MEGA5.0进行系统进化分析。

紫苏FAD8基因定量分析

FAD8基因荧光定量实验流程

提取紫苏RNA，逆转录为cDNA后用目的基因和内参基因进行PCR验证，制作标准曲线，目的基因进行荧光定量PCR，对数据进行处理与分析(采用2^-△△CT法处理数据)。荧光定量引物：内参引物：Β-actinF：5'-agaccttcaatgtgccagcca-3'(SEQ ID No.5)，Β-actinR：5'-cacgaccagcaagatccaacc-3'(SEQ ID No.6)。FAD8引物：FFAD8Q：5'-actgggattattaaggaacggaattggg-3'(SEQ ID No.7)，RFAD8Q：5'-ccgtttatcgctctgttctcttcttcc- 3'(SEQ ID No.8)。

紫苏FAD8基因过表达载体的构建

构建紫苏FAD8过表达载体序列的克隆：以克隆的FAD8cDNA全长的菌液为模板，扩增PfFAD8 cDNA(1317bp)，用于构建过表达载体，引物序列为：

FovFAD8-Xba：’-tctagaatggcgagtttcgttatatcagaatgtg-3’(SEQ ID No.9)，

RovFAD8-SpeI：’-actagtctaagatttgcgacctccattgagctg-3’(SEQ ID No.10)。

构建重组表达载体pC2301M1DPB-FAD8

(1)转化重组子的质粒抽提

采用天根高纯度质粒小提中量试剂盒(DP107)抽提质粒。

(2)双酶切pC2301M1DPB和目的重组质粒pGEm-T-FAD8

a.pC2301M1DPB和目的重组质粒pGEm-T-FAD8的双酶切体系均如下：

依次加入上述试剂后，放置在37℃的水浴锅中酶切2-3h。

b.利用胶回收试剂盒法将酶切后的片段回收。

双酶切产物连接体系如下：

依次加入上述试剂后，4℃过夜连接。

(3)转化大肠杆菌DH5α并挑选重组转化子

利用热激法将过夜连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在LB固体平板上(Kan⁺)进行筛选，37℃倒置过夜培养，利用特异性引物FovFAD8-XbaI与RovFAD8-SpeI 进行菌液PCR鉴定。菌液PCR的反应体系与反应条件同2.2.3(6)，挑取检验合格的单菌落于1mLLB液体培养基(Kan⁺)中，37℃过夜摇菌。

(4)从阳性转化子中提取重组质粒pC2301M1DPB-FAD8

方法同上。

根癌农杆菌GV3101介导的烟草遗传转化

采用改进的氯化钙二次重悬法制备农杆菌农杆菌GV3101感受态细胞；并利用过表达载体重组质粒pC2301M1DPB-FAD8转化农杆菌GV3101感受态细胞。对GV3101菌液进行PCR检测，挑选阳性菌液加入50％甘油至终浓度12.5％-15％，于-80℃保存备用。

农杆菌介导的烟草遗传转化

(1)工程菌液的制备

吸取经验证的农杆菌菌液200μL于5mLYEP液体培养基中，加Kan 50mg/L、Rif50mg/L和Gen 50mg/L于210rpm，28℃条件下振荡培养过夜，即一活培养；吸取500μL 一活菌液于30mLYEP液体培养基中，条件同上扩大培养，即二活培养；待菌液培养到 OD600＝0.5，将二活菌液4000rpm离心10min，弃上清，菌体用等体积MS液体培养基悬浮，稀释至OD600＝0.1，即用于烟草遗传转化。

(2)烟草遗传转化

a.预培养：MS分化培养基，将叶片洗净→75％乙醇消毒15s→无菌水冲洗3次→0.1％升汞消毒2min→无菌水冲洗3次→切成0.5cm×0.5cm大小，接种于MS分化培养基上，25℃暗培养2天，光照强度为2000×；

b.共培养：共培养基，将预培养的外植体放入制备好的农杆菌工程菌液中浸泡约10min，每2-3min轻微摇动培养瓶，使叶片与菌液充分接触。将外植体转移到无菌滤纸上吸干残留的菌液，叶片背面向下放置在共培养基上，25℃暗培养2天，使转化农杆菌的T-DNA完全转移到植物细胞的基因组上；

c.选择培养：选择培养基，取出共培养的叶盘，转移至选择培养基上，背面向下，将边缘压入培养基中，25℃培养，光周期为16h/8h，进行抗性筛选，一周更换一次培养基，并及时清理农杆菌污染的叶盘材料；

d.生根培养：生根培养基，经3-4周，待分化出的芽长至2-3cm时，切下插入生根培养基中，约一周即可长出不定根；2-3周后对生长良好的转化苗进行炼苗，并移植于花盆中栽种。

转基因植株的筛选与鉴定

采用PCR检测和GUS组织化学染色的方法筛选与鉴定阳性植株。

转基因植株的GUS组织化学染色分析

(1)GUS染色液的配制

1mL GUS染液包括：0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.2)830μL，0.1mol/L铁氰化钾母液50μL，0.1mol/L亚铁氰化钾母液50μL，0.5mol/LEDTA母液(pH8.0)50μL，X-Gluc母液20μL；

(2)GUS染色方法

取T1代转基因植株(转基因后再生的当代植株)的根、茎、叶，剪成小片放入1.5mL离心管中，加入预先制备好的GUS染液，37℃染色过夜。染色后的叶片浸入75％的乙醇溶液中脱色过夜，用野生型烟草的相应组织器官作为对照，拍照记录染色结果，对比分析得出结论。

转基因植株的PCR检测

(1)基因组DNA的提取

在转基因烟草生根移栽到花盆中后，采取转基因烟草的叶片，提取基因组DNA。

(2)PCR检测

阳性转基因烟草中含有FAD8基因序列，而野生型烟草中不含此序列，因此用FAD8基因的特异性引物FovFAD8-XbaI和RovFAD8-SpeI，并以提取的待检测的转基因烟草基因组DNA作为模板，进行PCR扩增来鉴定阳性植株，并以野生型基因组DNA作为对照，保留鉴定呈阳性的植株。

低温胁迫下转基因植株的生理指标测定

取T1代的转基因烟草放入4℃培养箱，低温胁迫处理时间依次为0、2、4、6天，每个处理3个重复，取同一位置叶片用于试验测定。测定试剂和测定方法均参照南京建成生物科技有限公司购买的试剂盒说明书测定。

蛋白质测定(考马斯亮蓝法)

(1)样本前处理

准确称取烟草叶片，按重量(g)：体积(mL)＝1：9的比例加入9倍体积的生理盐水，4℃，5000rpm离心10min，取上清液用生理盐水按1：9比例稀释成1％浓度组织匀浆，待测。

(2)操作方法将步骤(1)中的组织匀浆混匀，静置10min，波长595nm，1cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光值。

(3)计算公式

脯氨酸(PRO)测定(酸性茚三酮法)

(1)样本前处理

准确称取烟草叶片，按重量(g)：体积(mL)＝1：9的比例加入9倍体积的匀浆介质，制成10％的匀浆介质，4℃，5000rpm离心10min，取上清液待测。5μg/mL标准品应用液的配制：按标准品贮液：植物提取液＝1：19的比例进行配制，即5μg/mL标准品应用液。

(2)操作方法：沸水浴30min，流水冷却，双蒸水调零，1cm光径，520nm比色。

(3)计算公式

丙二醛(MDA)测定(TBA法)

(1)样本前处理

准确称取烟草叶片，按重量(g)：体积(mL)＝1：9的比例加入9倍体积的生理盐水，制成10％的组织匀浆，4℃，5000rpm离心10min，取上清液待测。

(2)操作方法：旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷却，然后5000rpm离心10min，取上清，532nm处，1cm 光径，双蒸水调零，测定各管吸光值。

(3)计算公式：

过氧化氢酶(CAT)测定(可见光法)

(1)样本前处理

准确称取烟草叶片，按重量(g)：体积(mL)＝1：9的比例加入9倍体积的生理盐水，制成10％的组织匀浆，4℃，5000rpm离心10min，取上清，再用生理盐水稀释成0.5％的浓度，待测。

(2)操作方法：混匀，波长405nm，光径1cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

(3)计算公式：

过氧化物酶(POD)测定

(1)样本前处理

准确称取烟草叶片，按重量(g)：体积(mL)＝1：9的比例加入9倍体积的生理盐水，制成10％的组织匀浆，4℃，5000rpm离心10min，取上清液进行测定。

(2)操作方法：混匀后，5000rpm离心10min，取上清于波长420nm处，1cm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

(3)计算公式

总超氧化物歧化酶(SOD)的测定(羟胺法)

(1)样本前处理

(2)操作方法：混匀室温放置10min，波长550nm处，1cm光径，双蒸水调零，比色。

(3)计算公式

转基因烟草脂肪酸组成成分测定

(1)提取脂肪酸

将处理后的转基因烟草的根、叶烘干，用索式提取法提取脂肪酸。

(2)脂肪酸成分分析

①脂肪酸甲酯化

称约0.1g油脂于10mL离心管中，加入2mL异辛烷，震荡涡旋至完全溶解，再加入2mL 0.4mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，振荡2min，室温下静置10min，再加入2mL异辛烷，振荡2min，再加入8％NaCl溶液至10mL刻度线，2000r/min离心10min，吸取上清液， 0.22μm过滤后，进行气相色谱-质谱分析。

②气相色谱质谱条件

GC条件：色谱柱TG-WAXMS(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：高纯氮气，流速 1.0mL/min；程序升温：起始温度150℃，保持1min，以10℃/min升温至230℃，保持 10min；进样口温度250℃；进样方式：脉冲分流进样，分流比35:1，脉冲压力120kPa；进样量1μL。

MS条件：接口温度230℃；离子源温度230℃；扫描范围：40-400amu；四级杆温度150℃；电子能量70eV；溶剂延迟6min。

结果与分析

紫苏FAD8基因的克隆

采用Trizol法抽提紫苏茎的总RNA，在1％的琼脂糖凝胶电泳上检测分析显示提取的RNA28S和18S清晰明显，且28S的亮度在18S条带的两倍以上，说明提取的RNA 质量较好，可以满足后续试验。其提取结果如图1所示。在5’端设计上游引物，3’端设计下游引物，以提取的紫苏cDNA为模板克隆FAD8基因，得到cDNA序列(如图2所述)。

紫苏FAD8基因生物信息学分析

基本特征

(1)FAD8蛋白质理化性质分析

蛋白质理化性质分析包括：氨基酸组成、分子量、等电点、不稳定系数、脂肪系数等，利用ProtParam对FAD8的理化性质进行分析，结果表明，FAD8基因编码的氨基酸数目为438个，分子量为50013.2，等电点为9.13，由此可以看出FAD8为碱性氨基酸。 FAD8含有36个带负电的氨基酸残基，45个带正电的氨基酸残基，其脂肪系数为85.25，不稳定系数为38.43，因此FAD8编码的蛋白质为稳定蛋白质。

(2)FAD8亲疏水性分析

使用ProtScale预测氨基酸的亲疏水性。在图示中，Y轴上正值越大，表明疏水性越强；负值越大，表明亲水性越强。由图3可以看到，FAD8的亲水区域和疏水区域交替排列。

(3)FAD8跨膜结构预测

利用TMHMM对FAD8进行跨膜结构的预测(如图4所示)，结果显示：FAD8有3 个跨膜结构，这些跨膜区域所在位置与3.2.3中所预测的疏水区域位置一致。

(4)FAD8信号肽预测

使用Sigalp 4.1对FAD8氨基酸序列进行信号肽预测，结果表明：FAD8没有信号肽，(如图5)，因此不是分泌蛋白。

(5)FAD8蛋白质亚细胞定位

蛋白质总是在一定的部位发挥着重要的作用，因此对于蛋白质的定位成了生物信息学分析的重点。用Targetp对FAD8的亚细胞进行定位，结果显示FAD8定位于叶绿体中(如图6)。

紫苏FAD8基因荧光定量分析结果

提取常温下紫苏的根、茎、叶、花、果实的总RNA并逆转录为cDNA，提取的RNA 结果同上。选取FAD8基因对逆转录的cDNA进行检验，经检验条带单一、大小与预期大小一致，用于荧光定量PCR。首先选取茎作为模板，对其进行5倍稀释(即1、1/5、 1/25、1/125、1/625)，选取内参基因β-actin和FAD8基因通过荧光定量PCR制作的标准曲线来检验内参和FAD8基因的引物特异性是否较高，实验要求理想的内参基因和目的基因的扩增效率E值为90％～110％，R²值>0.980。检验结果表明内参基因β-actin和FAD8 基因的特异性均较高，扩增效率E值和R²值均可以满足实验要求。

紫苏FAD8基因常温下在根、茎、叶、花、果实中的表达情况如图7中的(A)，FAD8 基因在根、茎、叶、花、果实中的表达量均表现出显著性水平。以根作为对照，FAD8基因在茎中的表达量是根中的3.0倍，且在茎中的表达量最高，其次是在根和叶中，在花和果实中的表达量最少。选取常温时表达量最高的茎，10℃低温处理2h、4h、6h，以没做任何处理的0h作为对照，结果显示如图7中的(B)，FAD8基因10℃低温处理0h，2h、 4h、6h后其表达量差异极显著。10℃低温处理2h的茎中FAD8的表达量是处理0h的5.2 倍，处理4h的茎中FAD8的表达量是处理0h的5.6倍，随着低温处理时间的增加，FAD8 的表达量先增加后减少，即10℃低温处理4h的茎中FAD8的表达量最高。

37℃高温处理2h、4h、6h，仍以没做任何处理的0h作为对照，结果显示如图7中的(C)，分析发现FAD8基因37℃高温处理0h，2h、4h、6h后其表达量差异极显著。处理 0h的FAD8的表达量是37℃高温处理2h的3.0倍，是处理4h的10倍，随着高温处理时间的增加，FAD8的表达量先减少后增加，即37℃高温处理4h的茎中FAD8的表达量最低。选取10℃低温处理和37℃高温处理时表达量最高和最低的4h与不做任何处理的0h 做对比，结果显示如图7中的(D)，分析发现紫苏常温4h，10℃4h，37℃4h后FAD8基因的表达量差异极显著。10℃低温处理4hFAD8的表达量是37℃高温处理4h的56倍，由此可以看出FAD8是一个低温诱导型基因，低温促进表达，高温抑制表达。其低温处理时的表达量与高温处理时的表达量差别非常明显。

图7中：A：常温下在根、茎、叶、花、果实等组织中的表达情况；B：10℃低温处理0h、2h、4h、6h的表达情况；C：37℃高温处理0h、2h、4h、6h的表达情况；D：不同温度处理时的表达情况。

紫苏FAD8基因过表达载体的构建

(1)构建FAD8基因过表达载体序列的克隆

克隆紫苏FAD8基因全长cDNA序列，选取开放阅读框(1317bp)设计引物用于构建表达载体列，PCR结果如图8所示，PCR扩增的条带大小合适，之后通过胶回收、4℃ 过夜连接、转化大肠杆菌DH5α、挑取阳性克隆摇菌、菌液PCR等检测后送公司测序。

(2)双酶切pC2301M1DPB和目的重组质粒pGEm-T-FAD8

实验结果表明成功获得pC2301M1DPB质粒载体和重组质粒pGEm-T-FAD8，如图9 中的CK1和CK2，通过XbaⅠ和SpeⅠ限制性内切酶，分别对pC2301M1DPB空载质粒载体和阳性重组质粒pGEm-T-FAD8进行双酶切，获得含有CaMV35S启动子的 pC2301M1-DPB质粒载体和带有酶切位点的目的基因片段(如图9中的1和2)，以应用于下一步的重组载体的连接转化。

(3)pC2301M1DPB-FAD8转化大肠杆菌DH5α感受态

用T₄DNA连接酶将酶切后的目的基因片段连接到pC2301M1DPB载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行菌液PCR，电泳结果(如图3-10)表明，目的 DNA片段在大肠杆菌感受态的转化中存在阳性克隆，即重组表达载体构建成功。选取其中的某个阳性克隆摇菌，提取重组质粒pC2301M1DPB-FAD8，以待转化农杆菌。

根癌农杆菌介导的烟草遗传转化

从阳性大肠杆菌转化子中提取重组质粒pC2301M1DPB-FAD8，在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行检测，结果如图11中的A所示，将重组质粒pC2301M1DPB-FAD8转入农杆菌GV3101感受态中，培养2天后挑取单菌落，用特异性引物FovFAD8-

XbaI和RovFAD8-SpeI进行菌液PCR验证(如图11中的B所示)，结果表明目的基因DNA在农杆菌感受态的转化中存在阳性克隆，即重组质粒pC2301M1DPB-FAD8转化农杆菌GV3101感受态成功，且转化效率很高，有利于后续试验的进行。

转基因烟草的获得

采用农杆菌浸染叶盘法转化烟草，获得转基因再生苗(图12)。待苗炼苗之后移栽到花盆中；约一个月后，将成熟的幼苗转移至自然环境中生长，直至收集到种子。

转基因烟草阳性植株的筛选与鉴定

PCR分子检测结果

用特异性引物FovFAD8-XbaI和RovFAD8-SpeI在转基因植株中扩增出阳性条带(图13)，而从野生型对照植株中未扩增出该大小的条带，即证明构建转基因烟草成功，并从中筛选出24株转基因烟草。

转基因烟草FAD8基因表达分析

从24株转基因烟草中选取11株长势一致的转基因烟草提取其RNA，之后进行定量分析。结果(图14)表明，即使是同一批转FAD8基因的烟草，其表达量也表现出一定的差异，这可能是由植株间的差异所导致。

GUS染色分析结果

为了检测转基因植株的瞬时表达活性，对转基因阳性植株和野生型对照进行了GUS 组织化学染色分析，结果(图15)表明，FAD8基因转化后的阳性植株在根(A)、茎(B)、叶(C)中都可以检测到GUS活性，而野生型对照的根(A)、茎(B)、叶(C)中均检测不到活性，进一步证明FAD8转基因烟草获得成功。

转基因烟草生理指标测定

低温胁迫下可溶性蛋白含量变化

由图16可知，低温处理可使烟草叶片内可溶性蛋白含量升高，未经低温处理时对照植株的可溶性蛋白含量较转基因烟草高，达到了极显著。随着低温处理时间的延长，转基因烟草和野生型烟草可溶性蛋白含量都呈回升趋势，在6天时，转基因植株恢复至0 天水平，而对照植株比0天时低，但差异不显著。

低温胁迫下游离脯氨酸含量变化

由图17可知，低温处理使烟草叶片内游离脯氨酸含量显著升高，野生型烟草和转基因烟草的游离脯氨酸含量差异极显著。

低温胁迫下丙二醛(MDA)含量变化

如图18所示，未经低温处理时转基因烟草和野生型烟草的MDA含量一样，当低温胁迫2天时，野生型烟草和转基因烟草的MDA含量均有升高，只是野生型烟草上升的幅度较转基因大些，达到了显著水平；当低温胁迫4天时，转基因烟草和野生型烟草的 MDA含量均下降，但野生型烟草下降的幅度大于转基因烟草；当低温胁迫6天时，转基因烟草与野生型烟草的MDA含量继续升高，且两者之间MDA含量差异显著，由此说明在低温胁迫下，野生型烟草膜脂过氧化与恢复的幅度较转基因烟草明显。

低温胁迫下过氧化氢酶(CAT)活性变化

从图19可以看出，在非胁迫条件下野生型烟草CAT的活性是转基因烟草的4.0倍且两者之间差异显著。低温胁迫2天时，野生型烟草CAT活性下降，与非胁迫下相比降低了8倍，而转基因烟草与非胁迫下相比升高了9.6倍，两者之间差异极显著。在低温胁迫 4天时两者都达到最大值，野生型烟草CAT活性是非胁迫下的7.7倍；转基因烟草是非胁迫下的29.2倍。随后两者活性均下降，低温处理6天时，两者的活性虽下降但仍高于非胁迫前的水平。低温胁迫时，转基因烟草和野生型烟草CAT活性均升高，但转基因烟草上升的幅度明显大于野生型烟草。转基因烟草CAT活性升高，提高了活性氧的清除能力，从而能缓解低温胁迫对植株的伤害。

低温胁迫下过氧化物酶(POD)活性变化

由图20可知，在非胁迫条件下转基因烟草POD活性是野生型烟草的2.1倍，差异极显著，随着低温处理时间的延长，转基因烟草和野生型烟草的POD活性都呈上升趋势，但野生型烟草POD活性上升幅度较转基因烟草明显。低温处理2天时，野生型烟草POD 活性是非胁迫下的3.6倍，转基因烟草是非胁迫下的1.4倍。低温处理4天时，野生型烟草POD活性是非胁迫下的13.4倍，转基因烟草是非胁迫下的6.3倍，差异达到极显著水平。低温处理6天时，野生型烟草POD活性是非胁迫下的24.3倍，转基因烟草是非胁迫下的9.9倍，差异极显著。转基因烟草的抗氧化酶活性的稳定性比野生型烟草高，说明转基因烟草具有较稳定的活性氧清除酶系统，耐低温性较强。

低温胁迫下超氧化物岐化酶(SOD)活性变化

由图21可知，在非胁迫条件下，转基因烟草SOD活性较野生型烟草高且差异极显著；当低温处理2天时，转基因烟草和野生型烟草SOD活性均升高，但转基因烟草SOD 活性高于野生型烟草且表现出差异极显著；当低温处理4天时，野生型烟草和转基因烟草SOD活性均下降，转基因烟草SOD活性下降较为缓慢，野生型烟草下降较为明显，但此时仍然是转基因烟草SOD活性高于野生型烟草且两者之间差异极显著；当低温处理 6天时，两者SOD活性又均有上升，且野生型烟草上升较为明显，转基因烟草上升较为缓慢，但转基因烟草SOD活性却仍然高于野生型烟草许多。

转基因烟草叶片脂肪酸含量变化

结果表明(如图22)，转PfFAD8烟草叶片中亚麻酸等不饱和脂肪酸含量显著高于野生型烟草。表明可能是PfFAD8基因提高了烟草叶中亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸的含量，从而提高了烟草的抗逆性。

本发明上述图中*表示差异显著，**表示差异极显著。

由上述实施例可知，过表达本发明提供的紫苏FAD8基因，能够提高植物的抗寒性能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 重庆师范大学

<120> 紫苏FAD8基因及其在提高植物不饱和脂肪酸含量和抗寒性能中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1317

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggcgagtt tcgttatatc agaatgtggc ttgaagccac ttccaagaat ctatcccaaa 60

ccaagagctg cccagcctct ctcgagttct aatctgagat tttcaagaac aaatcaacgg 120

tttaattctt cattctgttc atcaactggg attattaagg aacggaattg ggctttgaga 180

gtgagtgccc cattaagaat tcagccagtg gaagaagaga acagagcgat aaacggcggc 240

gaagaattcg acccggcggc gccgcctccg tttaagttgt ccgatataaa ggcagccatt 300

ccgaagcatt gttgggtgaa ggacccatgg aggtctgtga gctatgtggt gagggatgtg 360

gtggcggttt ttgggatggc ggcggcggcg gcctatttca acaattggct tgtttggcct 420

ttgtattggt ttgctcagag caccttattc tgggctctct ttgttcttgg ccatgactgt 480

ggtcatggaa gcttttcaaa caaccccaag ctgaatagtg tgtttggcca tcttcttcac 540

tcttcaattc tggtgcccta ccatggatgg agaattagcc atagaactca tcatcagaac 600

catggacatg ttgagaatga tgaatcttgg cacccgttac ctgagaagat ttacaatagc 660

ttggataata ataccaagat gttgaggttc acattgcctt tccctatgtt ggcatacccc 720

ttttatctgt ggagtagaag tcccgggaag aaaggctctc atttccaccc agagagtgat 780

ttgtttgtgc caaatgagag gaaagacgtt attacctcaa cagtttgttg gactgcaatg 840

gctgcattgc tcgtaggact atcttttgtt atcggtccac tccagctgct caaactatac 900

ggcgttcctt acttgggatt cgtagcgtgg cttgatcttg tgacctattt gcatcaccac 960

gggcatgaag ataagctccc ttggtaccgt ggaaaggaat ggagttatct gagagggggg 1020

ctcacgacac ttgatcgtga ctacggattg atcaacaaca tccaccatga cataggaact 1080

catgtcatac accacctctt cccccaaatc ccacactacc atttgataga agctactgaa 1140

gcagctaagg gggtattagg caagtactac agggagccga aaaagtcggg ccctctaccg 1200

ttacacttgt tgggagacct cctgagaagc atgaagaagg atcactacgt gagcgacacc 1260

ggcgacattg tctattatca gacagatcct cagctcaatg gaggtcgcaa atcttag 1317

<210> 2

<211> 438

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Ala Ser Phe Val Ile Ser Glu Cys Gly Leu Lys Pro Leu Pro Arg

1 5 10 15

Ile Tyr Pro Lys Pro Arg Ala Ala Gln Pro Leu Ser Ser Ser Asn Leu

20 25 30

Arg Phe Ser Arg Thr Asn Gln Arg Phe Asn Ser Ser Phe Cys Ser Ser

35 40 45

Thr Gly Ile Ile Lys Glu Arg Asn Trp Ala Leu Arg Val Ser Ala Pro

50 55 60

Leu Arg Ile Gln Pro Val Glu Glu Glu Asn Arg Ala Ile Asn Gly Gly

65 70 75 80

Glu Glu Phe Asp Pro Ala Ala Pro Pro Pro Phe Lys Leu Ser Asp Ile

85 90 95

Lys Ala Ala Ile Pro Lys His Cys Trp Val Lys Asp Pro Trp Arg Ser

100 105 110

Val Ser Tyr Val Val Arg Asp Val Val Ala Val Phe Gly Met Ala Ala

115 120 125

Ala Ala Ala Tyr Phe Asn Asn Trp Leu Val Trp Pro Leu Tyr Trp Phe

130 135 140

Ala Gln Ser Thr Leu Phe Trp Ala Leu Phe Val Leu Gly His Asp Cys

145 150 155 160

Gly His Gly Ser Phe Ser Asn Asn Pro Lys Leu Asn Ser Val Phe Gly

165 170 175

His Leu Leu His Ser Ser Ile Leu Val Pro Tyr His Gly Trp Arg Ile

180 185 190

Ser His Arg Thr His His Gln Asn His Gly His Val Glu Asn Asp Glu

195 200 205

Ser Trp His Pro Leu Pro Glu Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Asp Asn Asn

210 215 220

Thr Lys Met Leu Arg Phe Thr Leu Pro Phe Pro Met Leu Ala Tyr Pro

225 230 235 240

Phe Tyr Leu Trp Ser Arg Ser Pro Gly Lys Lys Gly Ser His Phe His

245 250 255

Pro Glu Ser Asp Leu Phe Val Pro Asn Glu Arg Lys Asp Val Ile Thr

260 265 270

Ser Thr Val Cys Trp Thr Ala Met Ala Ala Leu Leu Val Gly Leu Ser

275 280 285

Phe Val Ile Gly Pro Leu Gln Leu Leu Lys Leu Tyr Gly Val Pro Tyr

290 295 300

Leu Gly Phe Val Ala Trp Leu Asp Leu Val Thr Tyr Leu His His His

305 310 315 320

Gly His Glu Asp Lys Leu Pro Trp Tyr Arg Gly Lys Glu Trp Ser Tyr

325 330 335

Leu Arg Gly Gly Leu Thr Thr Leu Asp Arg Asp Tyr Gly Leu Ile Asn

340 345 350

Asn Ile His His Asp Ile Gly Thr His Val Ile His His Leu Phe Pro

355 360 365

Gln Ile Pro His Tyr His Leu Ile Glu Ala Thr Glu Ala Ala Lys Gly

370 375 380

Val Leu Gly Lys Tyr Tyr Arg Glu Pro Lys Lys Ser Gly Pro Leu Pro

385 390 395 400

Leu His Leu Leu Gly Asp Leu Leu Arg Ser Met Lys Lys Asp His Tyr

405 410 415

Val Ser Asp Thr Gly Asp Ile Val Tyr Tyr Gln Thr Asp Pro Gln Leu

420 425 430

Asn Gly Gly Arg Lys Ser

435

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atggcgagtt tcgttatatc agaatgtg 28

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gggaaaaaga gtttcccttc aacat 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

agaccttcaa tgtgccagcc a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cacgaccagc aagatccaac c 21

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

actgggatta ttaaggaacg gaattggg 28

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ccgtttatcg ctctgttctc ttcttcc 27

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

tctagaatgg cgagtttcgt tatatcagaa tgtg 34

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

actagtctaa gatttgcgac ctccattgag ctg 33

Claims

1.一种紫苏FAD8基因，其特征在于，所述紫苏FAD8基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1中所述的紫苏FAD8基因和初始载体。

3.一种重组菌株，其特征在于，包括权利要求1中所述的紫苏FAD8基因和初始菌株。

4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述初始菌株为大肠杆菌或根癌农杆菌。

5.权利要求1所述的紫苏FAD8基因、权利要求2所述的重组载体或权利要求3所述的重组菌株在提高植物不饱和脂肪酸含量中的应用。

6.权利要求1所述的紫苏FAD8基因、权利要求2所述的重组载体或权利要求3所述的重组菌株在提高抗寒性能中的应用。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述植物包括紫苏和烟草。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在植物中过表达所述紫苏FAD8基因。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，过表达所述紫苏FAD8基因植物的抗寒温度为5～12℃。