CN116478956B - 棉花N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK、其编码基因及应用 - Google Patents
棉花N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK、其编码基因及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提出棉花N‑乙酰谷氨酸激酶GhNAGK、其编码基因及应用，该激酶为下述任一种：1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；2)由SEQ ID NO:2所示的核酸分子编码的氨基酸序列；3)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少91％同一性的氨基酸序列；4)在SEQ ID NO:1所示的序列的N端或/和C端连接标签得到的融合多肽；或5)在SEQ ID NO:1所示的序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基衍生的氨基酸序列。本申请对GhNAGK基因沉默后的转基因棉花抗逆性鉴定，结果转基因棉花的抗逆性降低，因此本申请的N‑乙酰谷氨酸激酶NAGK及其编码基因可调控植物的抗逆性。
Description
技术领域
本申请涉及农业生物技术领域，具体而言，涉及棉花N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK、其编码基因及应用。
背景技术
农业生产中，干旱常常导致农作物大面积减产，干旱条件下，棉花叶片萎蔫，植株生长发育受阻，棉铃脱落严重，极大影响了棉花的产量和品质。近年来，随着棉花抗逆功能基因的广泛研究，推动了抗病、抗旱以及耐盐棉花新种质的创制。鉴定功能稳定且显著的棉花抗旱基因在棉花抗旱栽培中具有极其重要的生产意义。目前，病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)技术成为棉花基因功能研究的有效技术手段。
脱落酸（Abscisic Acid, ABA）是调节干旱胁迫应答的关键植物激素。干旱条件下，ABA水平急剧上升，通过促进气孔关闭减少植物蒸腾失水。一氧化氮（Nitric oxide,NO）（作为一种气态小分子，不仅在植物发育、防御反应、激素反应和非生物胁迫反应等多种生理过程中发挥着重要作用，还是ABA诱导气孔关闭所必需的组分。研究表明，干旱胁迫可诱导NO水平的增加。精氨酸不仅是蛋白质合成过程中的一种必需氨基酸，更是NO合成的重要前体物质。NAGK是催化精氨酸生物合成的关键激酶，在拟南芥的大部分发育过程中都有表达。NAGK通过与PII信号蛋白相互作用调节氮和碳的平衡；OsNAGK1可与水稻中类似PII蛋白（OsGlnB)相互作用；AtNAGK与拟南芥中配子体功能和胚胎发育有关。目前关于NAGK在植物抗逆方面的研究鲜有报道，且GhNAGK在棉花耐旱中功能未知。因此，揭示GhNAGK在棉花耐旱中的作用可为棉花耐旱栽培提供优良的调控靶标和理论指导。
发明内容
本申请正是基于上述技术问题至少之一。
鉴于此，本申请提出了一种N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK，包含选自如下所示的氨基酸序列：
1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
2)由SEQ ID NO:2所示的核酸分子编码的氨基酸序列；
3)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；或
4)在SEQ ID NO:1所示的序列的N端或/和C端连接标签得到的融合多肽；
5)在SEQ ID NO:1所示的序列中缺失、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基衍生的氨基酸序列。
其中，N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK简称为蛋白GhNAGK，来源于棉花（Gossypium hirsutum, L）。上述蛋白GhNAGK可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述蛋白GhNAGK中同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。
在一些实施例中，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列由360个氨基酸残基组成。
在一些实施例中，所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK来源于棉花。
在一些实施例中，所述标签包括Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签。
其中，上述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK中的标签为是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪或纯化。
本申请的另一个目的是提供与上述任一实施例中所述的N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK相关的生物材料，所述生物材料为下述任一种：
B1)编码上述任一实施例所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
B8)含有B1)所述核酸分子的转基因植株、或含有B2)所述表达盒的转基因植株、或含有B3)所述重组载体的转基因植株；
B9)含有B8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；
B10)含有B9)所上述组织培养物产生的原生质体；
B11)抑制所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的基因的表达量和/或抑制所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的活性和/或降低所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的含量的重组载体或重组微生物。
在一些实施例中，所述核酸分子其包含选自以下的序列：
E1)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
E2)编码序列是SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
E3)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列；
E4)在严格条件下与SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列；且编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
E5)由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列通过缺失、取代、插入和/或添加一个或多个核苷酸而衍生的变体。
其中核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
在一些实施例中，所述的表达盒为能够在宿主细胞中表达N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的DNA，并包括启动GhNAGK基因转录的启动子和终止GhNAGK转录的终止子。
上述生物材料中，所述的表达盒的启动子包括但不限于：GhNAGK基因自身的启动子，组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。其中启动子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶（"LAP", Chao 等人(1999)Plant Physiol 120:979-992）；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)（由水杨酸和 BTH（苯并噻二唑-7-硫代羟酸 S-甲酯）诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子（PIN2）或 LAP启动子（均可用茉莉酮酸曱酯诱导）；热休克启动子（美国专利5，187，267）；四环素诱导型启动子（美国专利5，057，422）；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128（CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7）），种子贮存蛋白质特异的启动子（例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆 beta conglycin 的启动子（Beachy 等人(1985) EMBO J. 4:3047-3053）。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此处引用的所有参考文献均全文引用。
终止GhNAGK转录的终止子包括但不限于：GhNAGK基因自身的终止子、农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell 等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人（1987） Gene, 56:125； Guerineau等人 (1991) Mol. Gen. Genet , 262:141 ; Proudfoot (1991) Cell, 64:671; Sanfacon等人 Genes Dev., 5:141; Mogen等人(1990) Plant Cell, 2:1261；Munroe等人（1990) Gene, 91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res. 17:7891；Joshi等人 (1987) Nucleic Acid Res., 15:9627)。
在一些实施例中，所述表达盒还可包括增强子序列。
在一些实施例中，所述重组载体含有SEQ ID No.2所示的用于编码N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的DNA分子。
在一些实施例中，所述重组载体利用植物表达载体构建含有所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的基因或所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的基因表达盒的重组载体。
其中可用现有的植物表达载体构建含有所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的基因或所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的基因表达盒的重组载体。其中所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元表达载体等，如pMDC32、super1300、pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用GhNAGK构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子（pUbi）等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本申请的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、荧光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。
在一些实施例中，所述重组载体为重组表达载体pYL156-GhNAGK，所述pYL156-GhNAGK是按照包括如下步骤的方法制备得到的：在pYL156载体的EcoRI和KpnI酶切位点间的DNA片段替换为SEQ ID No.2第1-300位所示的DNA分子，且保持pYL156载体的其它序列不变。
在一些实施例中，所述重组微生物包括酵母、细菌、藻或真菌。其中细菌可以为农杆菌GV3101。
在一些实施例中，所述转基因植物器官为转基因植物的根、茎、叶、花、果实或种子。
在一些实施例中，所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚或花药。
在一些实施例中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本申请的又一个目的是提供如上述任一实施例所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK或如上述任一实施例所述的生物材料的应用，所述应用为下述任一种：
D1)在培育抗逆性增强的转基因植物中的应用；
D2)在制备培育抗逆性增强的转基因植物产品中的应用；
D3)在培育抗逆性降低的基因沉默植物中的应用；
D4)在制备培育抗逆性降低的基因沉默植物产品中的应用；
D5)在植物育种中的应用。
在上述应用中，植物育种中的应用具体可为将含有蛋白GhNAGK或与其相关的生物材料（例如蛋白GhNAGK的编码基因GhNAGK）的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。
本申请的又一个目的是提供一种抗逆性增强的转基因植物的培育方法，提高植物中GhNAGK基因的表达量和/或N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的活性和/或N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的含量，以使在目的植物中过表达N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK。
在一些实施例中，通过将携带GhNAGK基因的植物表达载体导入植物细胞或组织，并将所述植物细胞或组织培育成植株，以使在目的植物中过表达N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK。
其中，在目的植物中过表达N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的方法为：将蛋白GhNAGK的基因导入目的植物；其中所述蛋白GhNAGK的基因的核苷酸序列是SEQ ID No.2第1-1083位所示的DNA片段。上述将蛋白质GhNAGK的基因导入目的植物可通过携带有本申请基因GhNAGK的植物表达载体导入目的植物中。携带有本申请基因GhNAGK的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
本申请的又一个目的是提供一种抗逆性增强的基因沉默植物的培育方法，包括抑制植物中GhNAGK基因的表达量和/或N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的活性和/或N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的含量，以使得基因沉默植物的抗逆性增强。
在一些实施例中，通过在目的植物中导入抑制目的植物中GhNAGK基因表达的载体和辅助载体，实现抑制植物中GhNAGK基因的表达量和/或N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的活性和/或N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的含量。
在一些实施例中，抑制目的植物中GhNAGK基因表达的载体为含有SEQ ID No.2第1-300位所示的DNA分子的pYL156载体；所述辅助载体为pTRV-RNA1载体。
在一些实施例中，抑制目的植物中GhNAGK基因表达的载体为pYL156-GhNAGK，其构建方法为将pYL156载体的EcoRI和KpnI酶切位点间的DNA片段替换为SEQ ID No.2第1-300位所示的DNA分子，且保持pYL156载体的其它序列不变。
其中，抑制目的植物中GhNAGK基因表达的载体含有SEQ ID No.2第1-300位所示的DNA分子，其具体的构建方法为将pYL156载体的EcoRI和KpnI酶切位点间的DNA片段替换为SEQ ID No.2第1-300位所示的DNA分子，且保持pYL156载体的其它序列不变。
在一些实施例中，根据上述任一实施例中所述的应用，或上述任一实施例中所述的培育方法，所述抗逆性为抗旱性。
在一些实施例中，根据上述任一实施例中所述的应用，或上述任一实施例中所述的培育方法，所述植物为下述任一种：
G1)单子叶植物或双子叶植物；
G2)十字花科植物；
G3)拟南芥
G4)棉属植物；
G5)棉花。
通过以上技术方案，本申请提出了棉花N-乙酰谷氨酸激酶NAGK、其编码基因及应用，通过克隆棉花GhNAGK基因，利用VIGS技术构建了GhNAGK沉默植株，对GhNAGK进行了功能验证，明确了将基因GhNAGK在植物中抑制表达后，可以降低棉花的抗旱性，可为棉花耐旱栽培提供优良的调控靶标并为棉花抗旱机制研究提供一定的理论依据。
附图说明
图1为GhNAGK基因全长PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图2A为35S::GhNAGK-GFP重组载体结构示意图；
图2B为GhNAGK蛋白亚细胞定位图；
图3A为MBP-GhNAGK重组质粒结构示意图；
图3B为MBP-GhNAGK蛋白考马斯亮蓝染色图；
图4A为GhNAGK沉默区间PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图4B为GhNAGK基因沉默效率分析图；
图4C为VIGS-GhNAGK沉默植株的抗旱表型图；
图4D为VIGS-GhNAGK沉默植株的叶片相对含水量图；
图4E为VIGS-GhNAGK沉默植株的叶绿素含水量图；
图5A为VIGS-GhNAGK沉默植株的热红外成像分析图；
图5B为VIGS-GhNAGK沉默植株的失水速率图；
图5C为VIGS-GhNAGK沉默棉花植株气孔密度分析图；
图5D为VIGS-GhNAGK对棉花植株气孔开闭的影响图；
图6A为NO与L-精氨酸处理棉花幼苗抗旱表型图；
图6B为NO与L-精氨酸处理对棉花幼苗SPAD值的影响图；
图6C为NO与L-精氨酸处理对棉花幼苗相对含水量的影响图；
图6D为VIGS-GhNAGK沉默植株的L-精氨酸含量图；
图6E为VIGS-GhNAGK沉默植株的NO含量图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本申请的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施方式对本申请进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请，但是，本申请还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本申请的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1
GhNAGK蛋白及其编码基因的发现及克隆
一、GhNAGK蛋白及其编码基因的发现
对VIGS cDNA文库干旱相关基因进行筛选，利用棉花数据库进行检索获得一个新的蛋白，将其命名为GhNAGK蛋白，所述GhNAGK蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，由360个氨基酸残基组成；将编码GhNAGK蛋白的基因命名为GhNAGK基因，所述GhNAGK基因的开放阅读框如SEQ ID No.2所示，由1083个核苷酸组成。
二、GhNAGK基因的克隆
使用艾德莱试剂盒抽提棉花叶片RNA（试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司，抽提按照提供的说明书操作），用M-MLV反转录试剂盒（购自Takara公司，按照试剂盒说明书操作）合成第一链cDNA，所得的第一链cDNA作为模板用于扩增GhNAGK基因全长。根据GhNAGK基因序列，设计两条特异性引物（上游引物F1：gtaccagattacgctcatatgATGGGCGCAACAGCCACC和下游引物R1： actggcctccatggccatatgTTAACCGGTGATCATTGTGCC）进行PCR扩增，获得PCR产物，其中，利用诺唯赞的Planta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase 试剂盒扩增GhNAGK基因全长。50μLPCR 反应体系包括：2×Phanta Max Buffer 25μL、dNTP Mix(10mM）1μL、cDNA 2μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL、上游引物 2μL、下游引物2μL、ddH2O 17μL。PCR 扩增程序为：95℃ 3min；95℃ 15s、58℃ 15s、72℃ 40s，35个循环；72℃ 5min。取PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳如图1所示。电泳完毕在紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（购自康为生物科技有限公司，操作步骤参照该试剂盒的使用说明书）回收，纯化，得到纯化后的片段。回收完的片段与 pGADT7 载体重组连接，其中10μL的重组反应体系为：回收后的GhNAGK基因片段1μL、pGADT7 3μL、5XCEIIBuffer 2μL，Exnase® II 1μL、ddH2O 补足至 10 μL；于 37℃连接 30min。取5 μL连接产物，采用热击法（参照J. 萨姆布鲁克，等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002版）转化大肠杆菌DH5α，在含有50 mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序（测序工作由北京擎科测序公司完成），获得所需的全长基因CDS，即获得了GhNAGK基因。测序结果表明，该基因的序列全长1083bp、编码360个氨基酸的完整的ORF阅读框。
实施例2
GhNAGK蛋白特性分析
一、GhNAGK亚细胞定位
利用原生质体来研究GhNAGK蛋白的亚细胞定位。根据表达载体pHBT-GFP的多克隆位点和GhNAGK基因的编码区序列设计出扩增GhNAGK基因整个编码区的正向引物和反向引物，得到35S::GhNAGK-GFP重组载体，具体方法为以实施例1中获得的GhNAGK基因为模板，利用上游引物F2和下游引物R2进行PCR扩增，获得包含GhNAGK基因与载体同源臂的产物；利用BamHI和StuI酶切载体pHBT-GFP，回收、纯化得到载体框架；将PCR纯化回收产物和载体框架连接得到的35S::GhNAGK-GFP重组载体如图2A所示，即将pHBT-GFP的BamHI和StuI酶切位点间的DNA片段替换为SEQ ID No.2的GhNAGK基因后，且保持pHBT-GFP的其他序列不变得到的重组载体。
其中，所述引物如下：
上游引物F1：5’- ctccccttgctccgtggatccATGGGCGCAACAGCCACC -3’ （下划线为BamHI的酶切位点）；
下游引物R1：5’-ctcgcccttgctcacaggcctACCGGTGATCATTGTGCCAG -3’ （下划线为StuI的酶切位点）。
拟南芥原生质体分离与转化方法如下：
拟南芥原生质体分离（Cellulase R10及Macerozyme R10购自Onozuka，其他试剂购自Sigma-Aldrich）
酶解液(10 mL)：1 % Cellulase R10, 0.2 % Macerozyme R10, 0.4 Mmannitol, 20 mM KCl, 20 mM MES pH 5.7，10 mM CaCl2。
WI 溶液：20 mM KCl, 0.5 M mannitol, 4 mM MES pH 5.7。
W5 溶液：125 mM CaCl2, 154 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MES pH 5.7。
MMg 溶液：0.4 M mannitol, 15 mM MgCl2, 4 mM MES pH 5.7。
40 % (w/v) PEG 转化液：0.2 M mannitol，100 mM CaCl2，4g PEG 4000。
用“三明治法”撕去棉花子叶下表皮，用刀片将幼嫩的棉花子叶切成宽1 mm,长约1cm的长条，将切好的条状叶片迅速转入并浸没在酶解液中，避光抽真空2h，避光静置酶解3h；加入与酶解液等体积的W5溶液，用200目尼龙膜过滤酶解溶液以除去未酶解的残渣，后用400目细胞筛二次过滤，过滤液即为棉花的原生质体；700rpm离心2 min，弃去上清液。用W5溶液重悬原生质体并700rpm离心2 min，弃去上清液，加入W5溶液重悬原生质体，置于冰上30 min；吸去W5溶液，并加入MMg 溶液重悬原生质体，调整原生质体终浓度约为2×105个/mL用于转化。
吸取100μL的原生质体于2mL圆底离心管中，并加入5μL35S::GhNAGK-GFP重组质粒和5μL带有红色荧光蛋白RFP的核定位marker质粒NLS-RFP，轻弹使混匀，向离心管中加入110 μL 40% PEG溶液，迅速轻弹离心管使其混匀，室温下静置5 min；向离心管中加入800 μL的W5溶液终止反应。700rpm离心2 min，弃上清，用WI溶液重悬原生质体；将原生质体转移至培养板中，室温弱光培养8-10 h。700rpm离心2 min，吸去WI溶液，向其中加入110 μL WI溶液，轻弹混匀。
用剪去尖部的枪头吸取少量原生质体滴加在载玻片上，于激光共聚焦显微镜下观察GFP和RFP的表达情况。
结果显示，在原生质体叶绿体、细胞核、细胞质中观察到GFP绿色荧光信号，在细胞核观察到RFP红色荧光信号，两者重叠；在叶绿体观察到GFP绿色荧光信号，与叶绿体自发荧光信号重叠。GhNAGK定位于叶绿体、细胞质、细胞核如图2B所示。
二、GhNAGK蛋白纯化
F3: GAGGGAAGGATTTCAGAATTCATGGGCGCAACAGCCACC
R3:CAAGCTTGCCTGCAGGTCGACACCGGTGATCATTGTGCCAG
以实施例1中获得的GhNAGK基因为模板，利用上游引物F3和下游引物R3进行PCR扩增，获得包含GhNAGK基因与载体同源臂的产物；利用EcoRI和SalI酶切载体pMAL-C2X，回收纯化产物得到基因片段和线性载体；将基因片段和线性载体连接得到MBP-GhNAGK重组质粒如图3A所示，即将pMAL-C2X的EcoRI和SalI酶切位点间的DNA片段替换为SEQ ID No.2的GhNAGK基因且保持pMAL-C2X的其他序列不变得到的重组质粒。
将重组质粒以热激转化法转入大肠杆菌BL21，37℃过夜培养后挑取阳性单克隆接种至4mL含抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。将菌液接种至100 mL含抗生素的LB液体培养基，37℃，200rpm培养直至OD600介于0.5-1.0之间。将菌液转移至16 ℃摇床，约15 min降温后加入终浓度0.2mM 的IPTG，16 ℃，120rpm诱导过夜。
收集菌液于50ml圆底管中，4 ℃ 4000 rpm离心15 min，弃上清收集菌体，加入蛋白裂解缓冲液10 mL（20mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA(pH8.0)，2.3gNaCl，加水至200ml），重悬菌体，加入终浓度100 µg/mL的裂解酶，混匀后冰浴15 min。将圆底管转移置于冰盒中便于超声破碎时导热，设置超声破碎仪程序：功率30%，10min，间隔5s超声5 s（根据裂解菌液是否变清亮调整超声破碎时长）。4 ℃，12000 rpm离心20 min。转移上清至干净的15 mL离心管，加入100 μL经蛋白裂解缓冲液平衡后的MBP-beads，加入终浓度0.5 %的Triton X-100，混匀后置于4 ℃旋转仪孵育2-3 h。
孵育后4000rpm离心2 min，弃上清，用裂解缓冲液洗涤beads 3次。离心收集beads转移到干净的1.5 mL EP管，加入适量洗脱缓冲液（0.36g Maltose至100ml裂解液），室温10-15 min或4 ℃洗脱2-3 h后离心转移上清至干净的1.5 mL EP管，取5μL进行蛋白电泳和考马斯亮蓝染色如图3B所示，其余纯化蛋白加入终浓度15 %的甘油，混匀后分装至离心管，-80 ℃保存。
实施例3
VIGS沉默植株胁迫表型
一、VIGS-GhNAGK沉默载体的构建
步骤1：提取棉花品种“欣试17”叶片的总RNA并反转录为cDNA。
步骤2：以步骤1得到的cDNA为模板，用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并纯化回收如图4A所示。其中F3和R3组成的引物对如下所示：
F3:5’-gtgagtaaggttaccgaattcATGGGCGCAACAGCCACC-3’（下划线为EcoRI的酶切位点）；
R3:5’- gagacgcgtgagctcggtaccGGTTTTTCCCCTAAATTTCTGAATG-3’（下划线为KpnI的酶切位点）。
步骤3：用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切pYL156(pTRV2:RNA2)载体回收载体骨架，其中用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切pYL156(pTRV2:RNA2)载体为本领域公开的技术手段可参考“Gao X，2013，Functional genomic analysis of cotton genes withagrobacterium-mediated virus-induced gene silencing”中的步骤，不再赘述。
步骤4：将步骤2的回收产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pYL156- GhNAGK。对重组质粒pYL156-GhNAGK进行测序验证，结果表明：重组质粒pYL156-GhNAGK为将pYL156载体的EcoRI和KpnI酶切位点间的DNA片段替换为SEQ ID No.2第1-300位所示的部分GhNAGK基因片段后，且保持pYL156载体的其他序列不变得到的载体。
二、VIGS-GhNAGK沉默植株的获得
步骤1：将pYL156-GhNAGK、pYL156-GFP、pTRV-RNA1和pYL156-GhCLA1（pYL156-GFP、pTRV1(pTRV-RNA1)和pYL156-GhCLA1记载于非专利文献“Gao X，2013，Functional genomicanalysis of cotton genes with agrobacterium-mediated virus-induced genesilencing.”中）分别化学转化农杆菌GV3101，得到重组菌pYL156-GhNAGK/GV3101、重组菌pYL156-GFP/GV3101、重组菌pTRV1/GV3101和重组菌pYL156-GhCLA1/GV3101，分别于28 ℃在LB液体培养基（含50 μg/mL卡那霉素，25 μg/mL 庆大霉素，10 mM MES pH 5.6-5.7，20 μM 乙酰丁香酮）中培养12-14 h，收集重组菌pYL156-GhNAGK/GV3101、重组菌pYL156-GFP/GV3101、重组菌pTRV1/GV3101和重组菌pYL156-GhCLA1/GV3101；
步骤2：重组菌pYL156-GhNAGK/GV3101、重组菌pYL156-GFP/GV3101、重组菌pTRV1/GV3101和重组菌pYL156-GhCLA1/GV3101用VIGS溶液（10 mM MES pH 5.6，10 mM MgCl2，200μM乙酰丁香酮，溶剂为水）分别重悬菌体并将菌液浓度调整到OD600=1.5，将重组菌pYL156- GhNAGK/GV3101、pYL156-GFP/GV3101和pYL156-GhCLA1/GV3101分别与重组菌pTRV1/GV3101的菌液按照1:1的比例混合，得到混合液一、混合液二和混合液三；
步骤3：用1ml无针头注射器将混合液一注射棉花“欣试17”子叶的下表面，以获得VIGS-GhNAGK沉默植株；
用1 ml 无针头注射器将混合液二注射棉花 “欣试17”子叶的下表面，以获得VIGS-GFP对照植株；
用1 ml无针头注射器将混合液三注射棉花 “欣试17”子叶的下表面，培养两周后分别获得VIGS-GhCLA1指示植株；
待注射混合液三的植株出现白化表型约两周后，对注射混合液一和混合液二的植株分别提取叶片部位RNA（使用艾德莱试剂盒抽提棉花RNA，抽提按照提供的说明书操作），并反转录cDNA（M-MLV反转录试剂盒，购自Takara公司，按照试剂盒说明书操作），通过荧光实时定量PCR进行基因沉默效率分析：所用的引物对为5’- CGCCTTCGTCTTTCCATTAG-3’和5’-GGAGTGATTCAGAGAGGATTCG-3’，PCR程序：94 ℃变性30 s；94 ℃变性5 s、60 ℃退火34s、40个循环；以棉花GhActin 9基因作为对照（用于鉴定棉花GhActin9基因的引物对为：5’-GCCTTGGACTATGAGCAGGA-3’和5’-AAGAGATGGCTGGAAGAGGA-3’），相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算。
结果显示，注射混合液一（含有pYL156-GhNAGK/GV3101和pTRV1/GV3101菌液）的植株的GhNAGK基因表达量显著低于注射混合液二（含有pYL156-GFP/GV3101和pTRV1/GV3101菌液）的植株，如图4B所示，即通过上述方法获得了沉默GhNAGK基因的VIGS-GhNAGK沉默植株（注射混合液一的植株）以及VIGS-GFP对照植株（注射混合液二的植株）。
三、VIGS沉默GhNAGK的棉花植株对干旱胁迫敏感
通过对步骤二得到的沉默GhNAGK基因的VIGS-GhNAGK沉默植株和VIGS-GFP对照植株进行控水干旱胁迫处理，发现VIGS-GhNAGK沉默植株与VIGS-GFP对照植株相比，对干旱胁迫更敏感如图4C所示。
四、VIGS-GhNAGK沉默植株的叶片相对含水量测定
对步骤二得到的沉默GhNAGK基因的VIGS-GhNAGK沉默植株和VIGS-GFP对照植株进行干旱胁迫处理，分别剪取VIGS-GFP、VIGS-GhNAGK棉花植株的第二真叶，记录叶片鲜重(FW)，将叶片浸泡在去离子水中，约4-5 h后取出叶片并用吸水纸擦干，称量叶片重量(TW)。将叶片放入75℃烘箱约1-2 d进行烘干，称取叶片干重（Dry Weight，DW)。叶片相对含水量(Relative Water Content，RWC)通过计算公式：RWC(%) =(FW-DW)/(TW-DW)X100计算得出。结果显示在干旱胁迫下，VIGS-GhNAGK沉默植株比VIGS-GFP对照植株具有更低的叶片相对含水量如图4D所示。
五、VIGS-GhNAGK沉默植株的叶绿素含量测定
对步骤二得到的沉默GhNAGK基因的VIGS-GhNAGK沉默植株和VIGS-GFP对照植株进行干旱胁迫处理，分别剪取VIGS-GFP、VIGS-GhNAGK棉花植株的第二真叶，量取单位面积的叶片，用刀片切成宽1 mm，长1 cm的细条，加入 95%乙醇溶液中，避光浸提至叶片完全脱色，使用分光光度计测定663 nm 和 645 nm 处的吸光值，按照下列公式计算叶绿素含量：叶绿素a浓度Ca＝12.72*OD663-2.59*OD645；叶绿素 b 浓度Cb=22.88*OD645-4.67*OD663；叶绿素含量（%）=色素浓度*提取液体积*稀释倍数/样品面积。结果显示，VIGS-GhNAGK沉默植株比VIGS-GFP对照植株具有更低的叶绿素含量如图4E。
实施例4
GhNAGK调控干旱胁迫下气孔的开闭
一、VIGS-GhNAGK沉默植株的热红外结果
通过对实施例3中步骤二得到的沉默GhNAGK基因的VIGS-GhNAGK沉默植株和VIGS-GFP对照植株进行脱水胁迫处理，并用vario CAM HD 红外相机对植物叶片表面温度实时拍照记录，发现在脱水胁迫下，VIGS-GhNAGK沉默植株比VIGS-GFP对照植株具有更低的叶片温度。叶片温度越低，蒸腾失水越剧烈，说明VIGS-GhNAGK沉默植株存在比对照植株VIGS-GFP更剧烈的蒸腾失水如图5A所示。
二、VIGS-GhNAGK沉默植株的失水速率测定
通过对实施例3中步骤二得到的沉默GhNAGK基因的VIGS-GhNAGK沉默植株和VIGS-GFP对照植株进行离体干旱处理，取植株地上部，在不同时间点称取植株鲜重，检测失水速率变化如图5 B所示，发现VIGS-GhNAGK沉默植株相较于VIGS-GFP对照植株，失水速率更高。
三、VIGS-GhNAGK沉默植株的气孔密度测定
对实施例3中步骤二得到的沉默GhNAGK基因的VIGS-GhNAGK沉默植株和VIGS-GFP对照植株的第二真叶进行处理，用脱脂棉球清洗叶片背面下表皮，然后用尖头镊子将叶表皮薄膜从叶子表面剥离，放在滴有ddH2O的玻璃载玻片上，立即盖上盖子，然后用细尖镊子轻轻按压，以稳定表皮。在带有计算机附件的光学显微镜系统(奥林巴斯BX53)下计算气孔密度。结果显示，VIGS-GhNAGK沉默棉花植株与VIGS-GFP对照植株在气孔密度上无明显差异如图5C所示。
四、VIGS沉默GhNAGK对棉花叶片气孔开闭的影响
选取实施例3中步骤二得到的沉默GhNAGK基因的VIGS-GhNAGK沉默植株和VIGS-GFP对照植株的第二真叶, 然后用镊子尽量撕取不同植株同一部位的叶背表皮浸泡在MES-KOH (10 mM MES-KOH, 10 mM KCl, 0.05 mM CaCl2) 缓冲液3h，放置于光照培养箱中，确保气孔完全打开。之后加入200μM SNP、1mM L-Arg 在 MES-KOH 缓冲液中在光照培养箱中处理3 h,用毛笔刷去表皮的叶绿体放置于载玻片上, 盖上盖玻片, 用拇指轻轻按压的同时用吸水纸吸取多余水分，在20倍物镜下拍照记录经不同处理的不同材料的气孔开度， 操作过程尽量迅速。用Image J 软件测量气孔开度。结果显示，VIGS沉默GhNAGK抑制了ABA诱导的气孔关闭；且NO和精氨酸处理可以恢复气孔对ABA的敏感表型如图5D所示。
实施例5
GhNAGK通过调控精氨酸和NO合成影响棉花耐旱
一、NO与L-精氨酸处理增强棉花幼苗耐旱性
将欣试17号棉花种子浸种12h后，点于营养土中。待萌发出苗后用改良Hoagland营养液定期浇灌，于光照培养室进行培养。于棉花幼苗二叶期，叶面分别喷施浓度为 500μM的一氧化氮供体硝普钠SNP（Na2 [Fe(CN)5NO]2H2O），1mM的L-精氨酸L-Arginine（C6H14N4O2）以等量清水为对照，喷至叶片完全湿润。之后不再浇水进行干旱处理，直至棉花幼苗出现干旱表型，进行观察和拍照记录。发现，NO与L-Arg处理增强了棉花幼苗对干旱胁迫的耐受性如图6A所示。
二、NO与L-精氨酸处理棉花叶片相对含水量测定
对步骤一的棉花幼苗，分别剪取棉花植株的第二真叶，记录叶片鲜重(FW)，将叶片浸泡在去离子水中，约4-5 h后取出叶片并用吸水纸擦干，称量叶片重量(TW)。将叶片放入75℃烘箱约1-2 d进行烘干，称取叶片干重(DW)。叶片相对含水量RWC (Relative watercontent)通过计算公式：RWC(%) =(FW-DW)/(TW-DW)X100计算得出。结果显示，NO与L-Arg处理显著提高了棉花幼苗叶片相对含水量如图6B所示。
三、NO与L-精氨酸处理棉花叶片SPAD值测定
对步骤一的棉花幼苗第二片真叶，用日本KONICA MINOLTA 公司生产的叶绿素计SPAD-502 Plus，在随机选取的叶片上避开叶脉均匀取10个点以上进行测量，使用仪器自带的AVERAGE功能计算平均值，作为该片叶的SPAD值，并记录数据。结果显示，NO与L-Arg处理显著提高了棉花幼苗叶绿素含量如图6C所示。
四、VIGS-GhNAGK沉默植株的L-精氨酸测定
棉花叶片精氨酸含量的测定采用甲萘酚-双乙酰法。选取实施例3中步骤二得到的沉默GhNAGK基因的VIGS-GhNAGK沉默植株和VIGS-GFP对照植株的第二真叶，用刀片切成长1cm宽1mm的细条，称取50mg，加入5ml 50%乙醇浸泡3h，将处理好的样品倒入研钵中充分研磨，用10ml的50%乙醇将研磨好的样品洗到离心管中，4000rpm离心10min。取上清自然晾干。将干燥的样品用3ml的蒸馏水溶解，移至试管中，向试管中依次加入1ml的40g/L NaOH溶液，80g/L甲萘酚正丙醇溶液，0.5ml/L的双乙酰正丙醇溶液。再向其中加入2ml待测提取液，震荡摇匀。最后将试管放入30℃水浴加热15min，于540nm波长下测吸光值，绘制标准曲线，根据标曲计算棉花叶片精氨酸含量。结果可以看出，无论在干旱还是正常条件下，VIGS-GhNAGK沉默植株相较于VIGS-GFP对照植株，精氨酸含量更低如图6D所示。
五、VIGS-GhNAGK沉默植株的NO测定
用NO特异性荧光探针DAF-FM DA进行NO测定。将不同植株同一部位的叶背表皮浸泡在PBS（pH7.4）缓冲液，加入DAF-FM DA，使终浓度为5μM/L。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用PBS(pH7.4)洗涤三次，以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA然后用激光共聚焦显微镜(激发波长488 nm，发射波长515-560 nm)成像。结果显示，干旱胁迫下VIGS-GhNAGK沉默植株相较于VIGS-GFP对照植株，NO含量更低如图6E所示。
以上仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (16)
1.N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK或与N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
D1)在培育抗旱性降低的基因沉默棉花中的应用；
D2)在制备培育抗旱性降低的基因沉默棉花产品中的应用；
其中N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述生物材料编码所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的核酸分子；
所述生物材料为下述任一种：
B1)含有编码所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的核酸分子的表达盒；
B2)含有编码所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B3)含有编码所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的核酸分子的重组微生物、或含B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B4)抑制所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的基因的表达量和/或抑制所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的活性和/或降低所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的含量的重组载体或重组微生物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK选自如下所示的氨基酸序列：
1)由SEQ ID NO:2所示的核酸分子编码的氨基酸序列；
2)在SEQ ID NO:1所示的序列的N端或/和C端连接标签得到的融合多肽。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列由360个氨基酸残基组成。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK来源于棉花。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述标签包括Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核酸分子如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的表达盒为能够在宿主细胞中表达N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的DNA，并包括启动GhNAGK基因转录的启动子和终止GhNAGK转录的终止子。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述表达盒还可包括增强子序列。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组载体含有SEQ ID No.2所示的用于编码N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的DNA分子。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述重组载体利用棉花表达载体构建含有所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的基因或所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的基因表达盒的重组载体。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述重组载体为重组表达载体pYL156-GhNAGK，所述pYL156-GhNAGK是按照包括如下步骤的方法制备得到的：在pYL156载体的EcoRI和KpnI酶切位点间的DNA片段替换为SEQ ID No.2第1-300位所示的DNA分子，且保持pYL156载体的其它序列不变。
12.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组微生物包括酵母、细菌、藻或真菌。
13.一种抗旱性降低的基因沉默棉花的培育方法，其特征在于，包括抑制棉花中GhNAGK基因的表达量和/或N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的活性和/或N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的含量，以使得基因沉默棉花的抗旱性降低；所述N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的培育方法，其特征在于，通过在目的棉花中导入抑制目的棉花中GhNAGK基因表达的载体和辅助载体，实现抑制棉花中GhNAGK基因的表达量和/或N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的活性和/或N-乙酰谷氨酸激酶GhNAGK的含量。
15.根据权利要求14所述的培育方法，其特征在于，抑制目的棉花中GhNAGK基因表达的载体为含有SEQ ID No.2第1-300位所示的DNA分子的pYL156载体；所述辅助载体为pTRV- RNA1载体。
16.根据权利要求14所述的培育方法，其特征在于，抑制目的棉花中GhNAGK基因表达的载体为pYL156-GhNAGK，其构建方法为将pYL156载体的EcoRI和KpnI酶切位点间的DNA片段替换为SEQ ID No.2第1-300位所示的DNA分子，且保持pYL156载体的其它序列不变。
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