CN111378021B - 蛋白质IbEGF及其相关生物材料和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白质IbEGF及其相关生物材料和应用。本发明首先公开了一种蛋白质，该蛋白质为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质或SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白。本发明进一步公开了上述蛋白质相关的生物材料及应用。本发明发现了IbEGF蛋白及其编码基因，并将IbEGF蛋白的编码基因导入甘薯中，得到过表达IbEGF的转基因甘薯植株，将转基因植株进行干旱胁迫处理，转基因株系抗旱性增强，在提高植物抗旱研究中具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质IbEGF及其相关生物材料和应用。
背景技术
非生物胁迫给中国农业带来的危害非常严重，其中干旱与土壤盐碱化是限制中国农业可持续性发展的主要因素，是导致作物减产甚至绝产的两个重要环境因素。中国的干旱面积占国土面积的50％，因此，培育抗干旱品种是抵御干旱、保证产量和品质的有效途径。转基因分子育种技术是植物在胁迫条件下通过分子手段来提高植物对逆境抗性的重要手段。这种方法具有选育速度快，易于获得阳性植株，且具有较好的遗传稳定性等优点，已成为获得高抗植株的主要手段。但是到目前为止，获得的植物抗干旱基因还是太少，还不能满足改良植株产量和品质分子设计的需要。所以植物抗干旱基因工程在农业生产和商业上的应用受到很大限制。
因此，克隆获得高效的抗干旱基因，并分析其对植物抗干旱能力的影响是植物抗干旱基因工程的研究重点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何有效提高植物抗旱性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，名称为IbEGF蛋白或蛋白质IbEGF，来源于甘薯(Ipomoea batatas)，为如下A1)或A2)或A3)任一所示：
A1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；
A2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
A3)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
其中，SEQ ID NO.1由83个氨基酸残基组成。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
本发明还提供蛋白质IbEGF的下述任一中的应用：
B1)调控植物抗旱性；
B2)制备调控植物抗旱性的产品；
B3)提高植物抗旱性；
B4)制备提高植物抗旱性的产品；
B5)提高干旱胁迫条件下植物的根长；
B6)制备提高干旱胁迫条件下植物的根长的产品；
B7)提高干旱胁迫条件下植物的根数；
B8)制备提高干旱胁迫条件下植物的根数的产品；
B9)提高干旱胁迫条件下植物的鲜重；
B10)制备提高干旱胁迫条件下植物的鲜重的产品；
B11)提高干旱胁迫条件下植物脯氨酸含量；
B12)制备提高干旱胁迫条件下植物脯氨酸含量的产品；
B13)降低干旱胁迫条件下植物丙二醛含量；
B14)制备降低干旱胁迫条件下植物丙二醛含量的产品；
B15)提高干旱胁迫条件下植物SOD活性；
B16)制备提高干旱胁迫条件下植物SOD活性的产品；
B17)降低干旱胁迫条件下植物H2O2含量；
B18)制备降低干旱胁迫条件下植物H2O2含量的产品；
B19)提高干旱胁迫条件下植物脱落酸(ABA)含量；
B20)制备提高干旱胁迫条件下植物脱落酸(ABA)含量的产品；
B21)提高干旱胁迫条件下植物茉莉酸类物质(JAs)含量；
B22)制备提高干旱胁迫条件下植物茉莉酸类物质(JAs)含量的产品；
B23)提高干旱胁迫条件下植物油菜素内酯(BR)含量；
B24)制备提高干旱胁迫条件下植物油菜素内酯(BR)含量的产品。
上述蛋白质IbEGF相关生物材料也属于本发明的保护范围，本发明还提供了蛋白质IbEGF相关生物材料的新用途。
本发明蛋白质IbEGF相关生物材料的下述任一种中的应用也在本发明的保护范围之内：
B1)调控植物抗旱性；
B2)制备调控植物抗旱性的产品；
B3)提高植物抗旱性；
B4)制备提高植物抗旱性的产品；
B5)提高干旱胁迫条件下植物的根长；
B6)制备提高干旱胁迫条件下植物的根长的产品；
B7)提高干旱胁迫条件下植物的根数；
B8)制备提高干旱胁迫条件下植物的根数的产品；
B9)提高干旱胁迫条件下植物的鲜重；
B10)制备提高干旱胁迫条件下植物的鲜重的产品；
B11)提高干旱胁迫条件下植物脯氨酸含量；
B12)制备提高干旱胁迫条件下植物脯氨酸含量的产品；
B13)降低干旱胁迫条件下植物丙二醛含量；
B14)制备降低干旱胁迫条件下植物丙二醛含量的产品；
B15)提高干旱胁迫条件下植物SOD活性；
B16)制备提高干旱胁迫条件下植物SOD活性的产品；
B17)降低干旱胁迫条件下植物H2O2含量；
B18)制备降低干旱胁迫条件下植物H2O2含量的产品；
B19)提高干旱胁迫条件下植物脱落酸(ABA)含量；
B20)制备提高干旱胁迫条件下植物脱落酸(ABA)含量的产品；
B21)提高干旱胁迫条件下植物茉莉酸类物质(JAs)含量；
B22)制备提高干旱胁迫条件下植物茉莉酸类物质(JAs)含量的产品；
B23)提高干旱胁迫条件下植物油菜素内酯(BR)含量；
B24)制备提高干旱胁迫条件下植物油菜素内酯(BR)含量的产品。
本发明中，所述植物茉莉酸类物质具体为茉莉酸甲酯(MeJA)。
上述应用中，所述相关生物材料为下述C1)-C10)中的任一种：
C1)编码蛋白质IbEGF的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C3)所述重组载体的转基因植物组织；
C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C3)所述重组载体的转基因植物器官；
C8)含有C1)所述核酸分子的转基因植株、或含有C2)所述表达盒的转基因植株、或含有C3)所述重组载体的转基因植株；
C9)由C8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；
C10)由C9)所述组织培养物产生的原生质体。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述相关生物材料中，C1)编码蛋白质IbEGF的核酸分子具体可为如下D1)或D2)或D3)中任一所示：
D1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
D2)编码序列为SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
D3)在严格条件下与D1)或D2)限定的DNA分子杂交，且编码蛋白质IbEGF的DNA分子。
其中，SEQ ID NO.2由252个核苷酸组成，其开放阅读框(ORF)为自5′末端起第1位-第252位，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述相关生物材料中，C2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达蛋白质IbEGF的DNA，该DNA不但可包括启动IbEGF基因转录的启动子，还可包括终止IbEGF基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
上述相关生物材料中，C3)所述重组载体可含有SEQ ID NO.2所示的用于编码蛋白质IbEGF的DNA分子。
可用植物表达载体构建含有所述IbEGF编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1300、pCAMBIA super1300、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用IbEGF构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
在本发明具体的实施方式中，所述重组载体为重组质粒pCAMBIA super1300-IbEGF-GFP。所述重组质粒pCAMBIA super1300-IbEGF-GFP是将载体pCAMBIA super1300-GFP的Xba I和Pst I酶切位点间的片段替换为SEQ ID NO.2所示的DNA分子，且保持其它序列不变得到的重组载体。
上述相关生物材料中，C4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。
上述相关生物材料中，C7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
上述相关生物材料中，C9)所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
上述蛋白质IbEGF或其相关生物材料在植物育种中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述应用中，植物育种中的应用具体可为将含有所述蛋白质IbEGF或所述相关生物材料(如蛋白质IbEGF编码基因IbEGF)的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。
本发明进一步提供了提供一种培育抗旱性高的转基因植物的方法。
本发明培育抗旱性高的转基因植物的方法，包括提高目的植物中蛋白质IbEGF的基因的表达量和/或所述蛋白质IbEGF的含量和/或所述蛋白质IbEGF的活性，得到转基因植物；所述转基因植物的抗旱性高于所述目的植物。
上述方法中，所述提高目的植物中蛋白质IbEGF的基因的表达量和/或所述蛋白质IbEGF的含量和/或所述蛋白质IbEGF的活性的方法为在目的植物中表达或过表达蛋白质IbEGF。
上述方法中，所述表达或过表达的方法为将蛋白质IbEGF的编码基因导入目的植物。
上述方法中，将蛋白质IbEGF的编码基因导入目的植物可通过携带有本发明IbEGF基因的植物表达载体导入目的植物中。携带有本发明基因IbEGF的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
上述方法中，所述蛋白质IbEGF的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的DNA分子。
在本发明具体的实施方式中，所述携带有本发明基因IbEGF的植物表达载体可为pCAMBIA super1300-IbEGF-GFP。具体的，pCAMBIA super1300-IbEGF-GFP利用限制性内切酶Xba I和Pst I将SEQ ID NO.2所示的DNA分子插入至pCAMBIA super1300-GFP载体得到的。
上述方法中，所述抗旱性高主要体现在提高植物的根数、根长和鲜重、提高脯氨酸含量、提高SOD活性、提高抗逆相关激素含量(如油菜素内酯含量、脱落酸含量和茉莉酸甲酯含量)、降低H2O2含量和降低丙二醛含量。
本发明中，所述植物是如下E1)至E7)中的任一种：
E1)双子叶植物；
E2)单子叶植物；
E3)烟草属植物；
E4)烟草；
E5)旋花科植物；
E6)甘薯属植物；
E7)甘薯(Ipomoea batatas)。
本发明发现了IbEGF蛋白及其编码基因，并将IbEGF蛋白的编码基因导入甘薯中，得到过表达IbEGF的转基因甘薯植株。将转基因植株进行干旱胁迫处理，与对照相比，转基因株系抗旱性增强，具体体现在增加了脯氨酸含量、SOD活性、抗逆相关激素含量(如油菜素内酯含量、脱落酸含量和茉莉酸甲酯含量)、降低了丙二醛含量和H2O2含量。因此，本发明所提供的IbEGF基因及其所编码的蛋白在植物抗干旱的过程中起着重要的作用，在提高植物抗旱研究中具有重要的应用价值，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1为甘薯转基因植株的PCR扩增结果；其中，M为DNA分子Marker，W为阴性对照水，P为阳性对照重组质粒，WT为野生型栗子香植株的基因组DNA，L1-L44为甘薯转IbEGF基因阳性植株。
图2为IbEGF基因在甘薯转IbEGF基因阳性植株和野生型栗子香植株(CK)中的表达；其中，CK为野生型栗子香植株的cDNA，L1-L44为甘薯转IbEGF基因阳性植株。
图3为过表达IbEGF转基因甘薯植株和野生型栗子香植株(CK)抗旱性离体鉴定；其中，CK为野生型栗子香植株，L9、L13和L26为过表达IbEGF转基因甘薯植株。
图4为过表达IbEGF转基因甘薯植株和野生型栗子香植株(CK)抗旱性水培鉴定；其中，A1、A2、B1和B2为抗旱性离体鉴定；C为植株的鲜重、根数测定；CK为野生型栗子香植株，L9、L13和L26为过表达IbEGF转基因甘薯植株。
图5为过表达IbEGF转基因甘薯植株和野生型栗子香植株(CK)抗旱性盆栽鉴定及生理生化指标和激素测定；其中，A1、A2、B1和B2为抗旱性盆栽鉴定；C为脯氨酸含量、丙二醛含量、SOD活性和H2O2含量测定；D为抗逆相关激素含量测定；CK为野生型栗子香植株，L9、L13和L26为过表达IbEGF转基因甘薯植株。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
甘薯品系‘徐薯55-2’记载于如下文献：朱虹.甘薯干旱转录组分析及抗旱相关基因IbWRKY2、IbGATA24和IbSDT的克隆与功能鉴定，博士学位论文，中国农业大学，2018。公众经作者同意后，可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验，不可作为其它用途使用。
甘薯品种栗子香(LZX)记载于如下文献：刘德高.过表达IbP5CR、IbERD3、IbELT、IbNFU1基因的甘薯植株的获得及耐盐性鉴定.北京.2014年.中国农业大学博士毕业论文。公众经作者同意后，可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验，不可作为其它用途使用。
克隆载体pMD19-T为宝生物工程(大连)公司产品，产品目录号为6013。
载体pCAMBIA super1300-GFP为武汉淼灵生物科技有限公司产品，产品目录号为L3080。
植物总RNA提取试剂盒为全式金(TransGen Biotech，北京)的Transzol植物总RNA提取试剂盒(目录号：ET111)。
PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara，PR047A)为宝生物工程(大连)有限公司产品。
霍格兰营养液记载于如下文献中：刘德高.过表达IbP5CR、IbERD3、IbELT、IbNFU1基因的甘薯植株的获得及耐盐性鉴定.北京.2014年.中国农业大学博士毕业论文。
实施例1、IbEGF基因的获得
1、cDNA模板的获得
用植物总RNA提取试剂盒提取甘薯品系徐薯55-2试管苗的总RNA，将该总RNA用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒反转录出第一链cDNA。
2、以步骤1获得的cDNA为模板，依据拼接候选的IbEGF基因序列进一步设计并人工合成引物O-F和O-R，以步骤1获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，获得约252bp的PCR扩增产物并测序。
O-F：5′-ATGGCCTCCCATAATGCTT-3′
O-R：5′-TCATGTCGATTCAACCGACT-3′
结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2自5′末端起第1至252位所示，将该基因命名为IbEGF基因，其编码的蛋白命名为IbEGF蛋白或蛋白质IbEGF，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2、IbEGF蛋白在提高植物抗旱中的应用。
一、重组质粒pCAMBIA super1300-IbEGF-GFP的构建
1、人工合成SEQ ID NO.1自5′末端起第1至249位所示的双链DNA分子。以该双链DNA分子为模板，以OE-F-Xba I：5'-GCTCTAGA ATGGCCTCCCATAATGCTT-3'下划线为限制性内切酶Xba I的识别序列)和OE-R-Pst I：5'-AACTGCAGTGTCGATT CAACCGACT-3'(下划线为限制性内切酶Pst I的识别序列)为引物进行PCR扩增，得到N端含有限制性内切酶XbaI和C端含有限制性内切酶Pst I的双链DNA分子。
2、用限制性内切酶Xba I和Pst I双酶切载体pCAMBIA super1300-GFP，回收约10783bp的载体骨架1。
3、将N端含有限制性内切酶Xba I和C端含有限制性内切酶Pst I的双链DNA分子用限制性内切酶Xba I和Pst I双酶切，回收包含约259bp的片段2。
4、将片段2与载体骨架1连接，得到重组质粒pCAMBIA1300-IbEGF-GFP。
重组质粒pCAMBIA super1300-IbEGF-GFP表达SEQ ID NO.2所示的IbEGF蛋白。
二、过表达IbEGF转基因甘薯植株的获得
1、甘薯品种栗子香胚性愈伤组织的诱导及胚性细胞悬浮系的建立
收获的栗子香薯块用于提供甘薯茎尖，剥取茎尖分生组织接种于2.0mg/L 2,4-D的MS固体培养基上，室温27±1℃，暗培养诱导愈伤组织，然后进行扩繁和继代，建立胚性细胞悬浮系，用于转化。
2、农杆菌的培养：在抗性平板上活化农杆菌菌液，挑取单菌落接种于50mL的已加入对应抗生素的LB液体培养基中，28℃下200rpm振荡培养，直到OD600值在0.4～0.6.范围内。
3、悬浮细胞系的准备和根癌农杆菌的侵染
选择生长8～12周状态良好的悬浮细胞系进行研磨，继代培养3天后，取其中直径约0.7-1.4mm的胚性悬浮细胞团用于农杆菌的侵染转化。
4、共培养和延迟培养
农杆菌侵染后的悬浮细胞系转移至含有30mg/L乙酰丁香酮(AS)和2mg/L 2,4-D的MS固体培养基上进行共培养，黑暗环境，温度为27±1℃。共培养3天后，细胞团用含200mg/L头孢霉素(CS)和2mg/L 2,4-D的MS液体培养基洗1次，用含100mg/L CS和2mg/L 2,4-D的MS液体培养基静置浸泡30min，最后用含2mg/L 2,4-D的MS液体培养基延迟培养1周。培养条件为27±1℃，500Lux光照(每天13小时光照)，100rpm摇晃培养。
5、抗性细胞团的筛选培养
延迟培养后，将细胞团转移到含5.0mg/L潮霉素(Hyg)、100mg/L CS和2mg/L 2,4-D的MS固体培养基上进行暗培养，温度为27±1℃，每2周更换1次新培养基。4周后将抗性细胞团转移到10.0mg/L Hyg、100mg/L CS和2mg/L 2,4-D的MS固体培养基上，培养4～8周，每2周更换1次新培养基。
6、体细胞胚的诱导
将生长状态良好的抗性细胞团转移至含有1.0mg/L ABA和100mg/L CS的MS培养基上，诱导体细胞胚生长。培养条件为27±1℃，3000Lux光照(每天13小时光照)。
7、拟转基因植株的再生和鉴定
将诱导2～4周后在ABA培养基上变绿的成熟体细胞胚连同愈伤组织一起转移到MS固体培养基上，培养至完整植株形成，温度为27±1℃，每天13小时光照，光照强度为3000Lux，获得拟转基因植株。
转基因植株的鉴定使用PCR检测和qRT-PCR检测相结合的方法。
1)PCR检测方法如下：
提取甘薯品种栗子香和拟转基因株系的DNA，进行PCR鉴定。使用pCAMBIAsuper1300-IbEGF载体质粒为阳性对照，水和野生型甘薯品种栗子香为阴性对照，引物如下：
pCAMBIA super1300-F：5'-GACGCCATTTCGCCTTTTCA-3'
pCAMBIA super1300-R：5'-TGAACTTGTGGCCGTTTACGTC-3'
将扩增得到的PCR产物在1％(w/v)的琼脂糖凝胶中进行电泳分离，PCR阳性植株具有一条特异的515bp的电泳条带，记录下PCR阳性植株的株系号。
结果如图1所示，结果显示只有阳性对照和拟转基因株系L1-L44在515bp附近出现了电泳条带，野生型甘薯和阴性对照没有出现条带，初步确定了本发明获得了甘薯转基因阳性植株L1-L44。
2)qRT-PCR
提取甘薯转基因阳性植株的RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR，以LZX为对照CK。
Ibactin基因为内参：
Ibactin-F：5′-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC-3′
Ibactin-R：5′-TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC-3′
IbEGF引物序列为：
IbEGF-qRT-F：5′-AACCGCCACGATCACATCTC-3′
IbEGF-qRT-R：5′-GAAAGATCCCTGGTGGGTCG-3′
结果如图2所示，结果表明IbEGF在转基因甘薯植株显著上调表达。选取表达量最高的三个过表达IbEGF转基因甘薯植株L9、L13、L26进行后续试验。
三、转基因甘薯植株抗逆性鉴定
CK为野生型栗子香，转基因甘薯为过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系L9、L13、L26。
1、过表达IbEGF转基因甘薯植株的抗旱性离体鉴定
具体步骤：将过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系L9、L13、L26的植株和野生型栗子香(CK)分别在含20％PEG6000的MS固体培养基上培养，培养温度是27±1℃，每天13小时光照，光照强度为3000Lux，4周后统计各株系的根长和鲜重，初步鉴定其抗旱性，每个株系3次重复，结果取平均值。
将含20％PEG6000的MS固体培养基替换为正常的MS固体培养基，做同样的试验，作为对照。
结果如图3所示，在正常的MS培养基上培养4周后，转基因甘薯株系L9、L13和L26和野生型栗子香的根长无显著差异。在含有20％PEG6000的MS培养基上胁迫培养4周后，栗子香长势较差，生根困难；过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系L9、L13和L26的生长状态、根长和鲜重均优于栗子香。
离体鉴定结果初步说明IbEGF基因的过表达提高了甘薯植株的抗旱性。
2、过表达IbEGF转基因甘薯植株的抗旱性水培鉴定
将过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系L9、L13、L26和野生型栗子香的试管苗驯化后移栽至隔离大田，生长2个月后剪取25cm的茎段进行水培鉴定。每个株系设置2个重复，每个重复3个植株。
a对照组，即无胁迫处理：霍格兰溶液正常培养条件下生长4周，观察植株生长情况。
b干旱组，即旱处理(20％PEG6000处理)：使用含20％PEG6000的霍格兰溶液干旱处理2周后用霍格兰溶液处理2周，观察植株生长情况。
处理结束后，统计各株系生根情况和生物量。结果如图4所示，对照组在霍格兰溶液正常培养条件下，过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系L9、L13、L26的植株和野生型栗子香长势良好，无显著差异(图4中A1和A2)。干旱组经过含20％PEG6000的霍格兰溶液处理2周后用霍格兰溶液处理2周，栗子香枯萎死亡，而过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系的植株存活，部分叶片保持绿色(图4中B1和B2)，且三个过表达IbEGF转基因甘薯株系的植株的鲜重、根长和根数显著优于栗子香(图4中C)。
3、过表达IbEGF转基因甘薯植株的抗旱性盆栽鉴定
将过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系L9、L13和L26的植株和野生型栗子香的茎段种植于移栽箱中，每个茎段3个茎节以上，蛭石和营养土的比例为1:1，移植后充分灌溉。茎段长出新叶后开始自然干旱胁迫处理，处理8周后，统计各株系生根情况和生物量。
a对照组，即无胁迫处理：霍格兰溶液正常培养条件下生长8周，观察植株生长情况；
b干旱组，即旱处理(自然干旱)：停止灌溉8周，，观察植株生长情况。
结果如图5中A1、A2、B1和B2所示，对照组野生型栗子香和过表达IbEGF转基因甘薯株系L9、L13和L26的植株的生长、根长和根数均无显著性的差异；而干旱组野生型栗子香严重枯萎，而转基因甘薯株系L9、L13和L26的植株的叶片绿色部分还比较多，且根长和根数显著高于野生型栗子香。
该实验结果表明，过表达IbEGF能显著提高甘薯对干旱胁迫的抵抗能力。
4、生理生化指标的测定
(1)脯氨酸含量测定
植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐等胁迫时，游离的氨基酸便会大量积累，并且积累指数和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。
用脯氨酸(PRO)含量试剂盒(苏州科铭生物，目录号：PRO-2-Y)来检测甘薯植株的脯氨酸含量。甘薯植株为采用上述步骤3中a对照组处理4周的甘薯植株和上述步骤3中b干旱组处理4周的甘薯植株。甘薯植株为过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系L9、L13、L26的植株和野生型栗子香(CK)的植株。实验需重复三次，结果取平均值。
结果如图5中C所示，结果表明，转基因甘薯株系L9的植株、L13的植株和L26植株的脯氨酸含量均显著高于野生型栗子香的脯氨酸含量。
(2)丙二醛(MDA)含量测定
丙二醛MDA含量是膜脂过氧化作用的表现，可以来衡量植物中ROS清除系统发挥作用的程度。MDA含量越低，说明植物膜的过氧化程度低，植物遭受的逆境伤害越小。
用丙二醛(MDA)试剂盒(苏州科铭生物，目录号：MDA-2-Y)来检测甘薯植株的MDA含量。甘薯植株为采用上述步骤3中a对照组处理4周的甘薯植株和上述步骤3中b干旱组处理4周的甘薯植株。甘薯植株为过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系L9、L13、L26的植株和野生型栗子香(CK)的植株。实验需重复三次，结果取平均值。
结果如图5中C所示，结果表明，转基因甘薯株系L9的植株、L13的植株和L26植株的MDA含量显著低于野生型栗子香的MDA含量。
(3)SOD活性测定
SOD活性可以作为植物抗逆性的一项生化指标。SOD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。
用超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(苏州科铭生物，目录号：SOD-2-Y)来检测甘薯植株的SOD活性。甘薯植株为采用上述步骤3中a对照组处理4周的甘薯植株和上述步骤3中b干旱组处理4周的甘薯植株。甘薯植株为过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系L9、L13、L26的植株和野生型栗子香(CK)的植株。实验需重复三次，结果取平均值。
结果如图5中C所示，结果表明，转基因甘薯株系L9的植株、L13的植株和L26植株的SOD活性显著高于野生型栗子香的SOD活性。
(4)H2O2含量测定
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H2O2的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。
过氧化氢(H2O2)试剂盒(苏州科铭生物，目录号：H2O2-2-Y)来检测甘薯植株的H2O2积累量。甘薯植株为采用上述步骤3中a对照组处理4周的甘薯植株和上述步骤3中b干旱组处理4周的甘薯植株。甘薯植株为过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系L9、L13、L26的植株和野生型栗子香(CK)的植株。实验需重复三次，结果取平均值。
结果如图5中C所示，结果表明，转基因甘薯株系L9的植株、L13的植株和L26植株的H2O2积累量显著低于野生型栗子香的H2O2积累量。
(5)激素含量测定
ABA在植物逆境胁迫反应中具有重要作用。ABA可以提高植物的耐盐性，缓解盐分过多造成的渗透胁迫和离子胁迫，维持水分平衡，诱导植物渗透调剂物质脯氨酸大量积累，维持细胞膜结构的稳定性，提高保护性酶的活性。旱害胁迫时，ABA能明显减少叶片水分蒸发，降低叶片细胞膜透性，增加叶片细胞可溶性蛋白质含量，诱导生物膜系统保护酶形成，降低膜脂过氧化程度，增强抗氧化能力，提高植物的抗旱性。
茉莉酸类物质(JAs)包括不同的结构形式，主要包括茉莉酸(JA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和茉莉酸-异亮氨酸复合物(JA-Ile)。茉莉酸类物质作为内源信号分子参与植物在机械伤害、病虫害、干旱、盐胁迫、低温等条件下的抗逆反应。茉莉酸类物质能促进气孔关闭，减少水分散失。在植物受到胁迫后，植物体内JA及其衍生物的含量显著增加，诱导一系列与抗逆有关的基因表达，如蛋白酶抑制剂、硫蛋白和苯丙氨酸转氨酶等，提高酯氧合酶活性，同时脯氨酸等抗性物质增加，从而增强植物的抗性。此外，JA与ABA在抑制生长、促进衰老和逆境胁迫的反应上作用极为相似，两者可协同或独立发挥作用，但也有实验表明两者对植物的生理调节也存在一定差异性甚至拮抗作用。
油菜素内酯(BR)是植物体内广泛存在的新型甾醇类植物激素，调节植物生长发育，参与植物抗逆过程。BR主要通过调控植物根系生长、发育提高植物对逆境的响应能力。此外，BR和ABA在调控植物生长和抗逆性方面存在拮抗关系。
测定方法参照参考文献:Yang,J.,Zhang,J.,Wang,Z.,Zhu,Q.,Wang,W.(2001)Hormonal changes in the grains of rice subjected to water stress during grainfilling.Plant Physiol.127:315-323。
甘薯植株为采用上述步骤3中a对照组处理4周的甘薯植株和上述步骤3中b干旱组处理4周的甘薯植株。甘薯植株为过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系L9的植株和野生型栗子香(CK)的植株。实验需重复三次，结果取平均值。
结果如图5中D所示，结果表明，过表达IbEGF T1代转基因甘薯株系L9的植株的ABA、MeJA和BR含量均有显著高于野生型栗子香。
上述结果表明，过表达IbEGF基因可提高甘薯的抗旱性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 蛋白质IbEGF及其相关生物材料和应用
<130> GNCFY200078
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 83
<212> PRT
<213> 甘薯（Ipomoea batatas）
<400> 1
Met Ala Ser His Asn Ala Ser Ala Thr Ala Thr Ile Thr Ser Pro Lys
1 5 10 15
Ser Ala Asp Gly Asp Ala Pro Ala Asn Ser Arg Lys Gly His Arg Cys
20 25 30
Leu Cys Ser Pro Thr Thr His Gln Gly Ser Phe Arg Cys Arg Leu His
35 40 45
Arg Ala Gly Pro Thr Pro Ser Val Trp Phe Lys Arg Ser Asn Ser Met
50 55 60
Pro Ala Lys Ala Pro His Gly Leu Gly Ser Leu Ser Pro Lys Ser Val
65 70 75 80
Glu Ser Thr
<210> 2
<211> 252
<212> DNA
<213> 甘薯（Ipomoea batatas）
<400> 2
atggcctccc ataatgcttc tgcaaccgcc acgatcacat ctccgaagag cgccgacggg 60
gacgcgccgg cgaactcgcg gaaggggcac cgctgcctct gctcgccgac gacccaccag 120
ggatctttcc ggtgccgtct tcatcgggcg ggccccaccc cgtcggtgtg gttcaagaga 180
tcaaactcca tgcctgccaa ggccccccac ggcttgggat ctctgtctcc caagtcggtt 240
gaatcgacat ga 252
Claims (15)
1.一种蛋白质或其相关生物材料在下述任一中的应用：
B1）调控植物抗旱性；
B2）制备调控植物抗旱性的产品；
B3）提高植物抗旱性；
B4）制备提高植物抗旱性的产品；
B5）提高干旱胁迫条件下植物的根长；
B6）制备提高干旱胁迫条件下植物的根长的产品；
B7）提高干旱胁迫条件下植物的根数；
B8）制备提高干旱胁迫条件下植物的根数的产品；
B9）提高干旱胁迫条件下植物脯氨酸含量；
B10）制备提高干旱胁迫条件下植物脯氨酸含量的产品；
B11）降低干旱胁迫条件下植物丙二醛含量；
B12）制备降低干旱胁迫条件下植物丙二醛含量的产品；
B13）提高干旱胁迫条件下植物SOD活性；
B14）制备提高干旱胁迫条件下植物SOD活性的产品；
B15）降低干旱胁迫条件下植物H2O2含量；
B16）制备降低干旱胁迫条件下植物H2O2含量的产品；
B19）提高干旱胁迫条件下植物脱落酸含量；
B20）制备提高干旱胁迫条件下植物脱落酸含量的产品；
B21）提高干旱胁迫条件下植物茉莉酸类物质含量；
B22）制备提高干旱胁迫条件下植物茉莉酸类物质含量的产品；
B23）提高干旱胁迫条件下植物油菜素内酯含量；
B24）制备提高干旱胁迫条件下植物油菜素内酯含量的产品；
所述蛋白质为如下A1）或A2）或A3）：
A1）氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；
A2）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
A3）来源于甘薯与A1）所示蛋白质具有98％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
所述相关生物材料为如下任一所示：
C1）编码所述蛋白质的核酸分子；
C2）含有C1）所述核酸分子的表达盒；
C3）含有C1）所述核酸分子的重组载体、或含有C2）所述表达盒的重组载体；
C4）含有C1）所述核酸分子的重组微生物、或含有C2）所述表达盒的重组微生物、或含有C3）所述重组载体的重组微生物；
C5）含有C1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
C6）含有C1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2）所述表达盒的转基因植物组织、或含有C3）所述重组载体的转基因植物组织；
C7）含有C1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2）所述表达盒的转基因植物器官、或含有C3）所述重组载体的转基因植物器官；
C8）含有C1）所述核酸分子的转基因植株、或含有C2）所述表达盒的转基因植株、或含有C3）所述重组载体的转基因植株；
C9）由C8）所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；
C10）由C9）所述组织培养物产生的原生质体。
2.一种蛋白质或其相关生物材料在植物育种中的应用；所述育种的目的为调控植物的抗旱性；
所述蛋白质为如下A1）或A2）或A3）：
A1）氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；
A2）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
A3）来源于甘薯与A1）所示蛋白质具有98％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
所述相关生物材料为如下任一所示：
C1）编码所述蛋白质的核酸分子；
C2）含有C1）所述核酸分子的表达盒；
C3）含有C1）所述核酸分子的重组载体、或含有C2）所述表达盒的重组载体；
C4）含有C1）所述核酸分子的重组微生物、或含有C2）所述表达盒的重组微生物、或含有C3）所述重组载体的重组微生物；
C5）含有C1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
C6）含有C1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2）所述表达盒的转基因植物组织、或含有C3）所述重组载体的转基因植物组织；
C7）含有C1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2）所述表达盒的转基因植物器官、或含有C3）所述重组载体的转基因植物器官；
C8）含有C1）所述核酸分子的转基因植株、或含有C2）所述表达盒的转基因植株、或含有C3）所述重组载体的转基因植株；
C9）由C8）所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；
C10）由C9）所述组织培养物产生的原生质体。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述C1）编码所述蛋白质的核酸分子为如下D1）或D2）：
D1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
D2）编码序列为SEQ ID NO.2所示的DNA分子。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为烟草属植物或旋花科植物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述烟草属植物为烟草；所述旋花科植物为甘薯属植物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述甘薯属植物为甘薯。
8.一种培育抗旱性高的转基因植物的方法，其特征在于：所述方法包括提高目的植物中一种蛋白质的基因的表达量和/或所述蛋白质的含量和/或所述蛋白质的活性，得到转基因植物；所述转基因植物的抗旱性高于所述目的植物；
所述蛋白质为如下A1）或A2）或A3）：
A1）氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；
A2）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
A3）来源于甘薯与A1）所示蛋白质具有98％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述提高目的植物中一种蛋白质的基因的表达量和/或所述蛋白质的含量和/或所述蛋白质的活性的方法为在目的植物中表达或过表达所述蛋白质。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述表达或过表达的方法为将所述蛋白质的编码基因导入目的植物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的DNA分子。
12.根据权利要求8-11任一所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为烟草属植物或旋花科植物。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述烟草属植物为烟草；所述旋花科植物为甘薯属植物。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述甘薯属植物为甘薯。
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