CN115786358A - 抗旱相关蛋白IbbHLH118及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗旱相关蛋白IbbHLH118及其编码基因与应用，属于基因工程育种技术领域。本发明公开了IbbHLH118蛋白或调控所述IbbHLH118蛋白编码基因表达的物质或调控所述IbbHLH118蛋白活性或含量的物质在调控植物抗逆性中的应用；所述IbbHLH118蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明发现了IbbHLH118蛋白及其编码基因并应用于调控甘薯抗旱性，为甘薯抗旱机理的研究以及制备抗旱性提高的甘薯提供了思路，对于开发抗旱甘薯具有重要的意义。

Description

抗旱相关蛋白IbbHLH118及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程育种技术领域，具体涉及抗旱相关蛋白IbbHLH118及其编码基因与应用。

背景技术

甘薯(Ipomoea batatas)是一种经济上重要的块根和块茎作物，在世界范围内被广泛用作工业和生物能源。这种作物主要种植在边缘土地上。极端或长期干旱条件会导致甘薯产量显着下降，促使需要提高这种作物的耐旱性。基因工程是提高甘薯耐旱性的有效途径。然而，甘薯对干旱胁迫反应的转录调控机制在很大程度上仍然未知。

bHLH转录因子在植物各种生长发育过程和抗逆网络调控中起着重要作用。研究发现，一些bHLH转录因子能够调控植物的抗逆性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为如何有效提高植物的抗旱性。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种应用，所述应用为下述任一种：

A1)、IbbHLH118蛋白或调控所述IbbHLH118蛋白编码基因表达的物质或调控所述IbbHLH118蛋白活性或含量的物质在调控植物抗逆性中的应用；

A2)、IbbHLH118蛋白或调控所述IbbHLH118蛋白编码基因表达的物质或调控所述IbbHLH118蛋白活性或含量的物质在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；

A3)、IbbHLH118蛋白或调控所述IbbHLH118蛋白编码基因表达的物质或调控所述IbbHLH118蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用；

所述IbbHLH118蛋白为如下P1)或P2)或P3)：

P1)、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

P2)、将P1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与P1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物叶片和/或根部发育和/或植物产量的功能的蛋白质；

P3)、在P1)或P2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

进一步地，上述的应用中，所述IbbHLH118蛋白来源于甘薯。

所述植物育种的目的可为培育抗逆性改变的植物，例如，培育抗旱性增强或者抗旱性降低的植物。

其中，SEQ ID NO.1由298个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST 标签和/或SUMO标签等。

进一步地，上述的应用中，所述调控所述IbbHLH118蛋白编码基因表达的物质或调控所述IbbHLH118蛋白活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述中的任一种：

B1)、抑制或降低所述IbbHLH118蛋白的编码基因的表达的RNA分子或抑制或降低所述IbbHLH118蛋白的活性或含量的RNA分子；

B2)、表达B1)所述RNA分子的DNA分子；

B3)、含有B2)所述DNA分子的表达盒；

B4)、含有B2)所述DNA分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；

B5)、含有B2)所述DNA分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B6)、含有B2)所述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B7)、含有B2)所述DNA分子的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；

B8)、含有B2)所述DNA分子的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B4)所述重组载体的转基因植物器官；

B9)、编码所述IbbHLH118蛋白的核酸分子；

B10)、含有B9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官。

进一步地，上述的应用中，B1)所述RNA分子为由如式(I)所示的DNA分子转录得到的RNA：

SEQ正向-X-SEQ反向(I)；

所述SEQ正向的序列是序列表中序列2的第27-298位；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。

进一步地，上述的应用中，所述双链RNA分子的一条链序列可为核苷酸序列是序列表中序列2的第27-298位的DNA片段转录得到的序列；

进一步地，上述的应用中，

B2)所述DNA分子如式(I)所示：

SEQ正向-X-SEQ反向(I)；

所述SEQ正向的序列是序列表中序列2的第27-298位；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补；

B9)所述核酸分子为如下b1)至b3)任一项所示的DNA分子：

b1)、编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

b2)、与b1)所示的DNA分子具有80％以上的同一性，且编码IbbHLH118蛋白的DNA分子。

本文中，所述同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或 99％的同一性。

扩增所述与甘薯块根和叶片发育相关蛋白IbbHLH118的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

上文中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达蛋白质IbbHLH118的DNA分子，该DNA分子不但可包括启动IbbHLH118基因转录的启动子，还可包括终止 IbbHLH118基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和 BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2) 或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057，422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml 终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell 等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人 (1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151； Ballad等人(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res., 15:9627)。

上文中，所述重组载体可含有SEQ ID NO.2所示的用于编码蛋白质IbbHLH118 的DNA分子。

可用植物表达载体构建含有所述IbbHLH118编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、 pGWB405、pBin438、pCAMBIA1300-GFP、pCAMBIAsuper 1300、pCAMBIA1302、 pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或 pCAMBIA1391-Xb。使用IbbHLH118构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV) 35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS 基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

本发明中，B5)或B10)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。所述根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具体可为根癌农杆菌GV3101菌。

本发明中，B7)或B10)所述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。

本发明中，B8)或B10)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

本发明中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。

本发明中，所述抑制或减少或下调所述IbbHLH118蛋白编码基因表达可通过基因敲除或基因沉默实现。

所述基因敲除(geneknockout)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活,包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑 (quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体可为重组质粒pCAMBIA 1300-IbbHLH118-GFP和pCAMBIA1300-SI-X-IbbHLH118。重组质粒pCAMBIA1300-IbbHLH118-GFP的结构为将质粒pCAMBIA 1300-GFP的限制性内切酶Xba I和 Pst I识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO.2所示的DNA分子，保持质粒pCAMBIA 1300-GFP的其他核苷酸序列不变，得到重组表达载体pCAMBIA1300-IbbHLH118-GFP。重组表达载体pCAMBIA 1300-IbbHLH118-GFP表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的IbbHLH118蛋白。重组质粒pCAMBIA1300-SI-X-IbbHLH118 含有如式(I)所示的DNA分子：SEQ正向-X-SEQ反向(I)；所述SEQ正向的序列是序列表中序列2的第27-298位；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，所述X与所述SEQ 正向及所述SEQ反向均不互补；

进一步地，上述的应用中，所述植物为下述任一种：

1)、双子叶植物；

2)、管状花目植物；

3)、旋花科植物；

4)、番薯属植物；

5)、甘薯(Ipomoea batatas)。

为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供上述应用中的所述蛋白质或上述应用中的所述生物材料。

为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供一种调控植物抗旱性的方法，所述方法包括通过调控所述IbbHLH118蛋白编码基因的表达或调控所述IbbHLH118蛋白的活性或含量，来调控植物抗旱性。

进一步地，上述的方法包括M1)和/或M2)：

M1)、包括向受体植物中导入上述应用中所述式(I)所示的DNA分子，抑制或降低或下调所述IbbHLH118蛋白编码基因表达或所述IbbHLH118蛋白活性或含量，得到抗旱性高于所述受体植物的目的植物；

M2)、向受体植物中导入上述应用中B9)所述的核酸分子，促进或提高所述IbbHLH118蛋白编码基因的表达或所述IbbHLH118蛋白活性或含量，得到抗旱性低于所述受体植物的目的植物。

为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供一种制备抗旱性植物的方法，所述方法包括向受体植物中导入上述应用中所述式(I)所示的DNA分子，抑制或降低或下调所述IbbHLH118蛋白编码基因表达或所述IbbHLH118蛋白活性或含量，得到抗旱性高于所述受体植物的目的植物。

上述方法中，所述植物为下述任一种：

1)、双子叶植物；

2)、管状花目植物；

3)、旋花科植物；

4)、番薯属植物；

5)、甘薯(Ipomoea batatas)。

上述方法中，所述抗旱性高主要体现在干旱胁迫条件下，相比于野生型，RNA 干扰植株在干旱胁迫条件下植株的生物量增加；植物脯氨酸含量、超氧化物歧化酶 (SOD)活性、抗逆相关激素含量(脱落酸含量)提高、丙二醛含量和过氧化氢含量降低。

上文中，所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌；如所述细菌可以为农杆菌GV3101菌株。

上文中，所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

上文中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述方法中，所述向受体植物中导入上述应用中所述式(I)所示的DNA分子通过向受体植物中导入含有式(I)所示DNA分子的重组质粒实现。在本发明的一个实施例中，所述含有式(I)所示DNA分子的重组质粒为pCAMBIA1300-SI-X-IbbHLH118。

上述方法中，所述表达或过表达蛋白质IbbHLH118的方法为将蛋白质IbbHLH118的编码基因导入目的植物。

上述方法中，将蛋白质IbbHLH118的编码基因导入目的植物可通过携带有本发明IbbHLH118基因的植物表达载体导入目的植物中。携带有本发明基因IbbHLH118 的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。

上述方法中，所述蛋白质IbbHLH118的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2 所示的DNA分子。

在本发明具体的实施方式中，所述携带有本发明基因IbbHLH118的植物表达载体可为pCAMBIA 1300-IbbHLH118-GFP。所述抗旱性降低主要体现在干旱胁迫条件下，相比于野生型，过表达IbbHLH118蛋白植物的生物量降低，植物脯氨酸含量、 SOD活性、POD酶活性和抗逆相关激素ABA含量降低、活性氧含量升高；所述抗旱性提高主要体现在：干旱胁迫条件下相比于野生型，RNAi干扰IbbHLH118植物的生物量提高，植物脯氨酸含量、SOD活性、POD酶活性和抗逆相关激素ABA含量升高、活性氧含量降低。

本发明发现了IbbHLH118蛋白及其编码基因，并将IbbHLH118蛋白的编码基因导入甘薯中，得到过表达和RNAi沉默IbbHLH118的转基因甘薯植株。将转基因植株进行干旱胁迫处理，与对照相比，过表达/RNAi沉默转基因株系抗旱性减弱/增强，具体体现在降低/提高脯氨酸含量、POD活性、SOD活性、抗逆相关激素ABA含量、提高/降低了活性氧含量。因此，本发明所提供的IbbHLH118基因及其所编码的蛋白在植物抗干旱的过程中起着重要的作用，通过RNAi或Crispr/Cas9技术，对提高植物抗旱具有重要的应用价值，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为转基因甘薯植株的PCR扩增结果；其中，M为DNA分子Marker，W为阴性对照水，P为阳性对照(pCAMBIA1300-IbbHLH118-GFP和 pCAMBIA1300-35SI-X-IbbHLH118)，WT为野生型甘薯植株的基因组DNA， OEX1-OEX15为过表达株系，RiX1-RiX5为RNAi沉默IbbHLH118甘薯阳性植株。

图2为IbbHLH118基因在转IbbHLH118基因甘薯阳性植株和野生型甘薯植株中的表达；其中，WT为野生型甘薯的cDNA，OEX1-OEX15为过表达株系，RiX1-RiX5 为RNAi沉默IbbHLH118甘薯阳性植株。

图3为IbbHLH118转基因甘薯植株和野生型甘薯植株抗旱性离体鉴定；其中， WT为甘薯野生型，OE-X4、OE-X6和OE-X9为过表达株系，RiX2、RiX3和RiX5 为RNAi沉默IbbHLH118甘薯株系。

图4为过表达IbbHLH118转基因甘薯植株和野生型甘薯植株抗旱性水培鉴定；其中，WT为甘薯野生型，OE-X4、OE-X6和OE-X9为过表达IbbHLH118甘薯株系。

图5为过表达IbbHLH118转基因甘薯植株和野生型甘薯植株抗旱性盆栽鉴定；其中，WT为甘薯野生型，OE-X4、OE-X6和OE-X9为过表达IbbHLH118甘薯株系。

图6为RNAi沉默IbbHLH118转基因甘薯植株和野生型甘薯植株抗旱性盆栽鉴定；其中，WT为甘薯野生型，Ri-X2、Ri-X3和Ri-X4为RNAi沉默IbbHLH118甘薯株系。

图7为过表达IbbHLH118转基因甘薯植株和野生型甘薯植株抗旱性旱池鉴定；其中，WT为甘薯野生型，OE-X4、OE-X6和OE-X9为过表达IbbHLH118转基因甘薯株系。

图8为IbbHLH118转基因甘薯植株和野生型甘薯植株激素和生理生化指标测定；其中，A：ABA含量测定；B和C：ABA敏感度测定；D-H：活性氧积累量测定；I 和J：POD和SOD活性测定；K：脯氨酸测定。WT为野生型甘薯，OE-X4、OE-X6 和OE-X9为过表达植株，Ri-X2、Ri-X3和Ri-X4为RNAi沉默IbbHLH118甘薯株系。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

甘薯品系‘徐薯55-2’为本实验室保存，记载于如下文献中：“朱虹.甘薯干旱转录组分析及抗旱相关基因IbWRKY2、IbGATA24和IbSDT的克隆与功能鉴定，博士学位论文，中国农业大学，2018.”。公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验，不可作为其它用途使用。

甘薯品种“栗子香”为本实验保存，记载于如下文献中“周媛媛.甘薯抗旱相关基因IbAITR5、IbEGF、IbMYB116和IbBT4的克隆与功能鉴定，博士学位论文，中国农业大学，2020”。公众可从中国农业大学农业农村部甘薯生物学与生物技术重点实验室获得，以重复本实验，不可作为其它用途使用。

克隆载体pMD19-T为宝生物工程(大连)公司产品，产品目录号为6013。

载体pCAMBIA1300-GFP由中国农业大学农学院金危危老师惠赠，记载于如下文献中：Luo HS,Meng DX,Liu HB,Xie MJ,Yin CF,Liu F,Dong ZB,Jin WW.EctopicExpression of the Transcriptional Regulator silky3 Causes PleiotropicMeristem and Sex Determination Defects in Maize Inflorescences.PlantCell.2020,32:3750-3773；以下实施例中简称为pCAMBIA1300，公众可从申请人处获得上述生物材料，以重复本实验，不可作为其它用途使用。

pCAMBIA1300-35SI-X购于武汉转导实验室有限公司，在pCAMBIA1300的基础上改造，在MCS处加35S启动子+Intro+NOS终止子，正反向序列分别插入，形成发卡结构。

植物总RNA提取试剂盒为全式金(TransGen Biotech，北京)的Transzol植物总RNA提取试剂盒(目录号：ET111)。

PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara，PR047A)为宝生物工程(大连)有限公司产品。

下述实施例采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Student’s t-test检验，*表示具有显著性差异(P＜0.05)，**表示具有极显著性差异(P＜0.01)，***表示具有极显著性差异(P＜0.001)。下述实施例中，如无特殊说明，处理组均设置三个重复。

实施例1、IbbHLH118基因的获得

1、cDNA模板的获得

用植物总RNA提取试剂盒提取甘薯品系徐薯55-2试管苗的总RNA，将该总RNA 用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒反转录出第一链cDNA。

2、以步骤1获得的cDNA为模板，根据Sweetpotato GARDEN(kazusa.or.jp)网站提供的序列设计引物IbbHLH118-F和IbbHLH118-R。进行PCR扩增，获得约897bp 的PCR扩增产物并测序。引物序列如下：

IbbHLH118-F：5′-ATGCGAATGGATAACTTTCAT-3′

IbbHLH118-R：5′-TCAGTACAGTTGATTAATAGAATCACT-3′

结果表明，PCR扩增产物是核苷酸序列为SEQ ID NO.2的DNA分子，将该序列所示的基因命名为IbbHLH118基因，其编码的蛋白命名为IbbHLH118蛋白或蛋白质 IbbHLH118，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2、IbbHLH118蛋白在提高植物抗旱中的应用。

一、重组质粒pCAMBIA 1300-IbbHLH118-GFP的构建

1、人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的双链DNA分子。以该双链DNA分子为模板，以OE-F-Xba I和OE-R-Pst I为引物进行PCR扩增，得到N端含有限制性内切酶XbaI和C端含有限制性内切酶Pst I的双链DNA分子。

OE-F-Xba I：5'-GCTCTAGA ATGCGAATGGATAACTTTCAT-3'(下划线为限制性内切酶Xba I的识别序列)；

OE-R-Pst I：5'-AACTGCAGGTACAGTTGATTAATAGAATCACT-3'(下划线为限制性内切酶Pst I的识别序列)为引物进行PCR扩增，得到N端含有限制性内切酶XbaI 和C端含有限制性内切酶Pst I的双链DNA分子。

2、用限制性内切酶Xba I和Pst I双酶切载体pCAMBIA 1300-GFP，回收约10783 bp的载体骨架1。

3、将N端含有限制性内切酶Xba I和C端含有限制性内切酶Pst I的双链DNA 分子用限制性内切酶Xba I和Pst I双酶切，回收包含约910bp的片段2。

4、将片段2与载体骨架1连接，得到重组质粒pCAMBIA 1300-IbbHLH118-GFP。

根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA 1300-IbbHLH118-GFP进行结构描述如下：将质粒pCAMBIA1300-GFP的限制性内切酶Xba I和Pst I识别序列间的小片段替换为SEQ IDNO.2所示的DNA分子，保持质粒pCAMBIA1300-GFP的其他核苷酸序列不变，得到重组表达载体pCAMBIA1300-IbbHLH118-GFP。重组表达载体pCAMBIA 1300-IbbHLH118-GFP表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的IbbHLH118蛋白。

二、重组质粒pCAMBIA1300-35SI-X-IbbHLH118的构建

1、人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的双链DNA分子。以该双链DNA 分子为模板，选取基因的27-298bp的序列作为干扰序列，以RNAi-F1-BamH I和 RNAi-R1-Sal I为引物进行PCR扩增，得到正义链，以RNAi-F2-Kpn I和RNAi-R2-Sac I为引物进行PCR扩增，得到反义链。

RNAi-F1-BamH I：5'-GGATCCAAATCCATTCTTTCCCTCGC-3'(下划线为限制性内切酶BamH I的识别序列)；

RNAi-R1-Sal I：5'-GTCGACTCTGCTGCTTCTTCTTTCCCT-3'(下划线为限制性内切酶Sal I的识别序列)

RNAi-F2-Kpn I：5'-GGTACCTCTGCTGCTTCTTCTTTCCCT-3'(下划线为限制性内切酶Kpn I的识别序列)；

RNAi-R2-Sac I：5'-GAGCTCAAATCCATTCTTTCCCTCGC-3'(下划线为限制性内切酶Sac I的识别序列)

2、将上述正义链序列按5'-3′方向克隆进载体pCAMBIA1300-35SI-X的多克隆位点1(5'-BamHⅠ-SalI-3')处，形成pCAMBIA1300-35SI-X-IbbHLH118；

3、测序验证成功后，以上述构建成功的克隆为目标载体，再次将上述反义链序列按5'-3'方向克隆进载多克隆位点2(5'-KpnI-SacI-3')处，测序验证第二次插入成功，即构建完成。

测序结果表明：重组质粒pCAMBIA1300-35SI-X-IbbHLH118含有式(I)所示的 DNA分子：

SEQ正向-X-SEQ反向(I)；

所述SEQ正向的序列是序列表中序列2的第27-298位；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。

三、转基因甘薯植株的获得

1、甘薯品种栗子香胚性愈伤组织的诱导及胚性细胞悬浮系的建立

收获的栗子香薯块用于提供甘薯茎尖，剥取茎尖分生组织接种于2.0mg/L 2,4-D的MS固体培养基上，室温27±1℃，暗培养诱导愈伤组织，然后进行扩繁和继代，建立胚性细胞悬浮系，用于转化。

2、农杆菌的培养

分别用重组质粒pCAMBIA-1300-IbbHLH118-GFP和重组质粒 pCAMBIA1300-35SI-X-IbbHLH118转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌中，将重组农杆菌分别命名为EHA105/pCAMBIA 1300-IbbHLH66-GFP和EHA105/pCAMBIA1300-35SI-X-IbbHLH118。

在抗性平板上分别活化农杆菌菌液，挑取单菌落接种于5mL的已加入对应抗生素的LB液体培养基中，28℃下200rpm振荡培养，直到OD₆₀₀值在0.4～0.6范围内。

3、悬浮细胞系的准备和根癌农杆菌的侵染

选择生长8～12周状态良好的悬浮细胞系进行研磨，继代培养3天后，取其中直径约0.7-1.4mm的胚性悬浮细胞团用于农杆菌的侵染转化。

4、共培养和延迟培养

将农杆菌EHA105/pCAMBIA1300-IbbHLH66-GFP和EHA105/ pCAMBIA1300-35SI-X-IbbHLH118分别侵染后的悬浮细胞系转移至含有30mg/L乙酰丁香酮(AS)和2mg/L 2,4-D的MS固体培养基上进行共培养，黑暗环境，温度为27±1℃。共培养3天后，细胞团用含200mg/L头孢霉素(CS)和2mg/L 2,4-D的MS液体培养基洗1次，用含100mg/L CS和2mg/L 2,4-D的MS液体培养基静置浸泡30min，最后用含2mg/L 2,4-D的MS液体培养基延迟培养1周。培养条件为 27±1℃，500Lux光照(每天13h光照)，100rpm摇晃培养。

5、抗性细胞团的筛选培养

延迟培养后，将细胞团转移到含5.0mg/L潮霉素(Hyg)、100mg/L CS和2mg/L 2,4-D的MS固体培养基上进行暗培养，温度为27±1℃，每2周更换1次新培养基。 4周后将抗性细胞团转移到10.0mg/L Hyg、100mg/L CS和2mg/L 2,4-D的MS固体培养基上，培养4～8周，每2周更换1次新培养基。

6、体细胞胚的诱导

将生长状态良好的抗性细胞团转移至含有1.0mg/L ABA和100mg/L CS的MS 培养基上，诱导体细胞胚生长。培养条件为27±1℃，3000Lux光照(每天13h光照)。

7、拟转基因植株的再生和鉴定

将诱导2～4周后在含有1mg/LABA的MS培养基上变绿的成熟体细胞胚连同愈伤组织一起转移到MS固体培养基上，培养至完整植株形成，温度为27±1℃，每天13h光照，光照强度为3000Lux，获得拟转基因甘薯植株。

8、转基因植株的鉴定：

使用PCR检测和qRT-PCR检测相结合的方法。

1)PCR检测方法如下：

提取野生型栗子香和拟转基因植株的DNA，进行PCR鉴定。使用pCAMBIA 1300-IbbHLH118和pCAMBIA1300-35SI-X-IbbHLH118载体质粒为阳性对照，水和野生型栗子香为阴性对照，引物如下：

pCAMBIA 1300-F：5'-GACGCACAATCCCACTATCC-3'

pCAMBIA 1300-R：5'-TCAGTACAGTTGATTAATAGAATCACT-3'

pCAMBIA 1300-35SI-F：5'-CGTAAGGGATGACGCACAA-3'

pCAMBIA 1300-35SI-R：5'-GATAATCATCGCAAGACCGG-3'

将扩增得到的PCR产物在1％(w/v)的琼脂糖凝胶中进行电泳分离，PCR阳性植株应该具有一条特异的998bp和471bp的电泳条带，记录下PCR阳性植株的株系号。

结果如图1中(A)和(B)所示，结果显示只有阳性对照和拟转基因甘薯植株 OEX1-OEX15在897bp附近出现了电泳条带，RiX1-RiX5在471bp附近出现了电泳条带，野生型栗子香和阴性对照水没有出现条带，初步确定了本发明获得了甘薯转基因阳性植株OEX1-OEX15和RiX1-RiX5。

2)qRT-PCR

提取阳性甘薯植株的RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR，以野生型栗子香为对照CK。

Ibactin基因为内参：

IbActin-F：5′-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC-3′

IbActin-R：5′-TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC-3′

IbBHLH118引物序列为：

IbBHLH118-qRT-F：5′-AGACATGCTTGGATGGGGTT-3′

IbBHLH118-qRT-R：5′-TGGCCTTGTTGCACCAGTAG-3′

结果如图2所示，结果表明IbbHLH118在转基因甘薯植株中显著差异表达。选取上调表达量高的3个过表达IbbHLH118的转基因甘薯株系OE-X4、OE-X6、和OE-X9 和下调表达量最低的3个RNAi沉默IbbHLH118的转基因甘薯株系Ri-X2、Ri-X3、和Ri-X5扩繁，获得过表达IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系OE-X4、OE-X6、OE-X9、 Ri-X2、Ri-X3、和Ri-X5，进行后续抗逆性试验。

四、过表达IbBHLH118转基因甘薯植株抗逆性鉴定

WT为野生型栗子香，转基因甘薯为过表达IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系 OE-X4、OE-X6、OE-X9、Ri-X2、Ri-X3、和Ri-X5的植株。

1、IbbHLH118转基因甘薯植株的抗旱性离体鉴定

具体步骤：对IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系OE-X4、OE-X6、OE-X9、Ri-X2、Ri-X3、和Ri-X5的植株和野生型栗子香(CK)分别在含30％PEG6000的MS固体培养基上培养，培养温度是27±1℃，每天13h光照，光照强度为3000Lux，4周后统计各株系的根长，初步鉴定其抗旱性，每个株系设置3次重复，结果取平均值。

a对照组，即无胁迫处理：MS固体培养基正常培养条件下生长4周，观察植株生长情况；

b干旱组，即旱处理(30％PEG6000处理)：使用含30％PEG6000的MS固体培养基，干旱处理4周后，观察植株生长情况。

结果如图3中(A)和(B)所示，在正常的MS培养基上培养4周后，IbBHLH118 T₁代转基因甘薯株系OE-X4、OE-X6、OE-X9、Ri-X2、Ri-X3、和Ri-X5的植株和野生型栗子香的根长无显著差异。在含有30％PEG6000的MS培养基上胁迫培养4周后，过表达转基因甘薯株系长势较差，生根困难；RNAi沉默转基因甘薯株系的生长状态、根长和鲜重均优于野生型栗子香和过表达IbBHLH118 T₁代转基因甘薯株系。

离体鉴定结果初步说明IbBHLH118基因的过表达降低了甘薯植株的抗旱性。

2、过表达IbBHLH118转基因甘薯植株的抗旱性水培鉴定

将过表达IbBHLH118 T₁代转基因甘薯株系OE-X4、OE-X6和OE-X9和野生型栗子香的试管苗驯化后移栽至隔离大田，生长2个月后剪取20cm的茎段进行水培鉴定。每个株系设置3个重复。

a对照组，即无胁迫处理：霍格兰溶液正常培养条件下生长2周，观察植株生长情况；

b干旱组，即旱处理(15％PEG6000处理)：使用含15％PEG6000的霍格兰溶液，干旱处理1周后用霍格兰溶液处理1周，观察植株生长情况。

处理结束后，统计各株系生根情况和生物量。

结果如图4中(A)、(B)和(C)所示，对照组在霍格兰溶液培养条件下，过表达IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系OE-X4、OE-X6、OE-X9和野生型栗子香长势良好，无显著差异。干旱组经过含15％PEG6000的霍格兰溶液处理1周后，转基因甘薯株系枯萎死亡，而野生型栗子香存活率较高，部分叶片保持绿色(图4中(A))，且野生型栗子香的鲜重(FW)和干重(DW)显著优于过表达IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系(图4中(A)和(B))。

3、过表达IbbHLH118转基因甘薯植株的抗旱性盆栽鉴定

将过表达IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系OE-X4、OE-X6、OE-X9的植株和野生型栗子香的茎段种植于移栽箱中，每个茎段2个茎节以上，蛭石和营养土的比例为1:1，移植后充分灌溉。茎段长出新叶后开始自然干旱胁迫处理，处理4周后，统计各株系生根情况和生物量。

a对照组，即无胁迫处理：霍格兰溶液正常培养条件下生长4周，观察植株生长情况；

b干旱组，即旱处理(自然干旱处理)：停止灌溉4周后，观察植株生长情况。

结果如图5中(A)、(B)和(C)所示，对照组野生型栗子香和过表达IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系OE-X4、OE-X6、OE-X9的植株的干重和鲜重均无显著性的差异；而干旱组转基因甘薯株系严重枯萎，野生型栗子香植株的叶片绿色部分还比较多，且干重(DW)和鲜重(FW)显著低于野生型栗子香。

该实验结果表明，过表达IbbHLH118基因能显著降低甘薯对干旱胁迫的抵抗能力。

4、RNAi沉默IbbHLH118转基因甘薯植株的抗旱性盆栽鉴定

将RNAi沉默IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系Ri-X2、Ri-X3、Ri-X5的植株和野生型栗子香的茎段种植于移栽箱中，每个茎段2个茎节以上，蛭石和营养土的比例为1:1，移植后充分灌溉。茎段长出新叶后开始自然干旱胁迫处理，处理6周后，统计各株系生根情况和生物量。

a对照组，即无胁迫处理：霍格兰溶液正常培养条件下生长6周，观察植株生长情况；

b干旱组，即旱处理(自然干旱处理)：停止灌溉6周后，观察植株生长情况。

结果如图6中(A)、(B)和(C)所示，对照组野生型栗子香和RNAi沉默IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系Ri-X2、Ri-X3、Ri-X5的植株的干重和鲜重均无显著性的差异；而干旱组野生型栗子香甘薯株系严重枯萎，转基因植株的叶片绿色部分还比较多，且干重(DW)和鲜重(FW)显著高于野生型栗子香。

该实验结果表明，RNAi沉默IbbHLH118基因能显著提高甘薯对干旱胁迫的抵抗能力。

5、过表达IbbHLH118转基因甘薯植株的旱池鉴定

将过表达IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系OE-X4、OE-X6、OE-X9的植株和野生型栗子香的茎段种植于旱池中，每个茎段2个茎节以上，每个株系设置20次重复。茎段长出新叶后开始自然干旱胁迫处理，处理3个月后，统计各株系生根情况和生物量。

a对照组，即无胁迫处理：保持土壤相对含水量65％-75％条件下生长3个月，观察植株生长情况；

b干旱组，即旱处理(自然干旱处理)：停止灌溉3个月后，观察植株生长情况。

结果如图7中(A)、(B)和(C)所示，对照组野生型栗子香和过表达IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系OE-X4、OE-X6、OE-X9的植株的干重和鲜重均无显著性的差异；而干旱组转基因甘薯株系地上生物量(AW)和地下生物量(BW)显著低于野生型栗子香。

该实验结果表明，过表达IbbHLH118基因能显著降低甘薯对干旱胁迫的抵抗能力。

6、生理生化指标的测定

(1)ABA含量测定

脱落酸(ABA)在植物逆境胁迫反应中具有重要作用。ABA可以提高植物的耐盐性，缓解盐分过多造成的渗透胁迫和离子胁迫，维持水分平衡，诱导植物渗透调剂物质脯氨酸大量积累，维持细胞膜结构的稳定性，提高保护性酶的活性。旱害胁迫时，ABA能明显减少叶片水分蒸发，降低叶片细胞膜透性，增加叶片细胞可溶性蛋白质含量，诱导生物膜系统保护酶形成，降低膜脂过氧化程度，增强抗氧化能力，提高植物的抗旱性。

测定方法参照参考文献:Yang,J.,Zhang,J.,Wang,Z.,Zhu,Q.,Wang,W.(2001)Hormonal changes in the grains of rice subjected to water stress during grainfilling.Plant Physiol.127:315-323。

甘薯植株为采用上述步骤1中对照组处理4周的甘薯植株和上述步骤1中干旱组干旱处理4周的甘薯植株。甘薯植株为过表达和RNAi沉默IbBHLH118 T₁代转基因甘薯株系的植株和野生型栗子香(CK)的植株。实验需重复三次，结果取平均值。

结果如图8中(A)所示，对照为无胁迫，PEG处理为模拟自然干旱胁迫，结果表明，RNAi沉默IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系的植株的ABA含量均显著高于野生型栗子香，过表达IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系的植株的ABA含量均显著低于野生型栗子香。

(2)ABA敏感度测定

取3个月大田生长的甘薯叶片，侵泡在基本溶液(50mM KCl,10mM MES-KOH,and10mM CaCl2,pH 6.1)中光照3h，使其气孔全部打开，然后将叶片转移到20μM ABA处理液中继续光照处理2h，撕取叶片下表皮，用毛笔轻轻刷去多余叶肉细胞，用到切出约2-3mm²的表皮制片，于显微镜下观察拍照。利用ImageJ 软件测量并统计各材料气孔开度情况，每个材料对照和处理均选取3片叶子撕取下表皮观察，每个表皮选取4-5个视野，测量约80个气孔。

结果如图8中(B)和(C)所示，结果表明，RNAi沉默IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系的植株的ABA敏感度均显著高于野生型栗子香，过表达IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系的植株的ABA敏感度均显著低于野生型栗子香。

(3)DAB染色、NBT染色和H₂O₂含量测定

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H₂O₂发生累积。H₂O₂可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H₂O₂的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。

过氧化氢(H₂O₂)试剂盒(苏州科铭生物，目录号：H₂O₂-2-Y)来检测甘薯植株的H₂O₂积累量，同时利用DAB和NBT染色进一步反应H₂O₂积累量。甘薯植株为采用上述步骤1中对照组处理4周的甘薯植株和上述步骤1中干旱组干旱处理4周的甘薯植株。甘薯植株为IbbHLH118 T₁代转基因甘薯植株和野生型栗子香(CK)的植株。实验需重复三次，结果取平均值。

结果如图8中(D)-(H)所示，对照为无胁迫，PEG为模拟干旱胁迫，结果表明， RNAi沉默IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系植株的H₂O₂积累量显著低于野生型栗子香，过表达IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系植株的H₂O₂积累量显著高于野生型栗子香。

(4)POD活性测定

POD活性可以作为植物抗逆性的一项生化指标。POD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。

用过氧化物酶(POD)试剂盒(苏州科铭生物，目录号：POD-2-Y)来检测甘薯植株的POD活性。甘薯植株为采用上述步骤1中对照组处理4周的甘薯植株和上述步骤1中干旱组干旱处理4周的甘薯植株。甘薯植株为IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系的植株和野生型栗子香(CK)的植株。实验需重复三次，结果取平均值。

结果如图8中(I)所示，对照为无胁迫，PEG为模拟干旱胁迫，结果表明，RNAi 沉默IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系植株的POD活性显著高于野生型栗子香，过表达IbbHLH118T₁代转基因甘薯株系植株的POD活性显著低于野生型栗子香。

(5)SOD活性测定

SOD活性可以作为植物抗逆性的一项生化指标。SOD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。

用超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(苏州科铭生物，目录号：SOD-2-Y)来检测甘薯植株的SOD活性。甘薯植株为采用上述步骤1中对照组处理4周的甘薯植株和上述步骤1中干旱组干旱处理4周的甘薯植株。甘薯植株为IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系的植株和野生型栗子香(CK)的植株。实验需重复三次，结果取平均值。

结果如图8中(J)所示，对照为无胁迫，PEG为模拟干旱胁迫，结果表明， RNAi沉默IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系植株的SOD活性显著高于野生型栗子香，过表达IbbHLH118T₁代转基因甘薯株系植株的SOD活性显著低于野生型栗子香。

(6)脯氨酸含量测定

植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐等胁迫时，游离的氨基酸便会大量积累，并且积累指数和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。

用脯氨酸(PRO)含量试剂盒(苏州科铭生物，目录号：PRO-2-Y)来检测甘薯植株的脯氨酸含量。薯植株为采用上述步骤1中对照组处理4周的甘薯植株和上述步骤1中干旱组干旱处理4周的甘薯植株。甘薯植株为IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系的植株和野生型栗子香(CK)的植株。实验需重复三次，结果取平均值。

结果如图8中(K)所示，对照为无胁迫，PEG为模拟干旱胁迫，结果表明， RNAi沉默IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系植株的脯氨酸活性显著高于野生型栗子香，过表达IbbHLH118 T₁代转基因甘薯株系植株的脯氨酸活性显著低于野生型栗子香。

上述结果表明，RNAi沉默IbbHLH118基因可提高甘薯的抗旱性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：

A1)、IbbHLH118蛋白或调控所述IbbHLH118蛋白编码基因表达的物质或调控所述IbbHLH118蛋白活性或含量的物质在调控植物抗逆性中的应用；

A2)、IbbHLH118蛋白或调控所述IbbHLH118蛋白编码基因表达的物质或调控所述IbbHLH118蛋白活性或含量的物质在制备调控植物抗逆性的产品中的应用；

A3)、IbbHLH118蛋白或调控所述IbbHLH118蛋白编码基因表达的物质或调控所述IbbHLH118蛋白活性或含量的物质在植物育种中的应用；

所述IbbHLH118蛋白为如下P1)或P2)或P3)：

P1)、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

P2)、将P1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与P1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物叶片和/或根部发育和/或植物产量的功能的蛋白质；

P3)、在P1)或P2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述IbbHLH118蛋白来源于甘薯。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控所述IbbHLH118蛋白编码基因表达的物质或调控所述IbbHLH118蛋白活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述中的任一种：

B1)、抑制或降低所述IbbHLH118蛋白的编码基因的表达的RNA分子或抑制或降低所述IbbHLH118蛋白的活性或含量的RNA分子；

B2)、表达B1)所述RNA分子的DNA分子；

B3)、含有B2)所述DNA分子的表达盒；

B4)、含有B2)所述DNA分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；

B5)、含有B2)所述DNA分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B6)、含有B2)所述DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B7)、含有B2)所述DNA分子的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；

B8)、含有B2)所述DNA分子的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B4)所述重组载体的转基因植物器官；

B9)、编码所述IbbHLH118蛋白的核酸分子；

B10)、含有B9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：B1)所述RNA分子为由如式(I)所示的DNA分子转录得到的RNA：

SEQ正向-X-SEQ反向(I)；

所述SEQ正向的序列是序列表中序列2的第27-298位；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：

B2)所述DNA分子如式(I)所示：

SEQ正向-X-SEQ反向(I)；

所述SEQ正向的序列是序列表中序列2的第27-298位；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补；

B9)所述核酸分子为如下b1)至b3)任一项所示的DNA分子：

b1)、编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；

b2)、与b1)所示的DNA分子具有80％以上的同一性，且编码IbbHLH118蛋白的DNA分子。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种：

1)、双子叶植物；

2)、管状花目植物；

3)、旋花科植物；

4)、番薯属植物；

5)、甘薯(Ipomoea batatas)。

7.权利要求1或2所述应用中的所述蛋白质或权利要求3-5中任一项所述应用中的所述生物材料。

8.一种调控植物抗旱性的方法，其特征在于：所述方法包括通过调控所述IbbHLH118蛋白编码基因的表达或调控所述IbbHLH118蛋白的活性或含量，来调控植物抗旱性。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法包括M1)和/或M2)：

M1)、包括向受体植物中导入权利要求5中所述应用中所述式(I)所示的DNA分子，抑制或降低或下调所述IbbHLH118蛋白编码基因表达或所述IbbHLH118蛋白活性或含量，得到抗旱性高于所述受体植物的目的植物；

M2)、向受体植物中导入权利要求2或5所述应用中B9)所述的核酸分子，促进或提高所述IbbHLH118蛋白编码基因的表达或所述IbbHLH118蛋白活性或含量，得到抗旱性低于所述受体植物的目的植物。

10.一种制备抗旱性植物的方法，其特征在于：所述方法包括向受体植物中导入权利要求5中所述应用中式(I)所示的DNA分子，抑制或降低或下调所述IbbHLH118蛋白编码基因表达或所述IbbHLH118蛋白活性或含量，得到抗旱性高于所述受体植物的目的植物。

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